DE69925271T2

DE69925271T2 - Angiostatin-bindendes protein

Info

Publication number: DE69925271T2
Application number: DE69925271T
Authority: DE
Inventors: Lars Holmgren; Boris Troyanovsky
Original assignee: Bioinvent International AB
Current assignee: Bioinvent International AB
Priority date: 1998-06-15
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2019-06-12
Also published as: CZ20004671A3; CN1170931C; NO20006192L; WO1999066038A1; KR20010052887A; CY1105675T1; AU2004201999A1; AR019862A1; EP1088069B1; HUP0102758A2; TWI243852B; IL139873A; JP2002518008A; PT1088069E; CN1626552A; CA2330228A1; AU2004201999B2; AU769933B2; ID28136A; EP1088069A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Angiogenese und insbesondere neue Moleküle wie Proteine und Peptide, wodurch neue antiangiogene Substanzen entwickelt werden können. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Entwicklung solcher Substanzen.
Hintergrund
Fast das gesamte Gewebe eines Säugetierkörpers umfaßt ein feines Netz aus sehr dünnen Blutgefäßen, von denen jedes dünner als ein menschliches Haar ist. Gewöhnlich nehmen weder die Anzahl noch die Größe dieser Gefäße zu, da die Teilung der Endothelzellen, die die Gefäße bedecken, langsam ist, tatsächlich bis zu mehreren Jahren. Ausnahmen bestehen zum Beispiel während der Wundheilung und Menstruation, wenn die Gefäße schnell wachsen. Jedoch ist dies während eines beschränkten Zeitraums, und die Zellteilung hört danach auf.
Die Erzeugung neuer Blutgefäße aus bestehenden wird als Angiogenese bezeichnet. Angiogenese wurde mit Krebs und der Bildung von Tumoren sowie mit anderen Zuständen wie Diabetes, Retinopathie, rheumatoider Arthritis und sogar einigen inflammatorischen Zuständen in Verbindung gebracht. Entsprechend wird eine beträchtliche Forschungsanstrengung weltweit unternommen, um Wege zur Prävention und Inhibierung des angiogenen Prozesses zu finden. Falls dies möglich wäre, könnten das Tumorwachstum bekämpft und nützliche Therapien in bezug auf die oben genannten Zustände entwickelt werden.
Es existieren zahlreiche Beweisstücke, die zeigen, daß Tumoren von der neuen Bildung von Blutgefäßen zur Ausdehnung über eine Masse von einigen wenigen mm³ abhängen. Die Angiogenese wird durch Faktoren ausgelöst, die von den Tumorzellen sezerniert werden. Es wurde kürzlich festgestellt, daß Tumore durch eine ungezügelte proteolytische Aktivität Peptidfragmente erzeugen, die antiangiogene Aktivitäten zeigen. Ein Beispiel ist das Molekül Angiostatin, das ein Fragment von Plasminogen ist.
Plasminogen ist eine Substanz im Blutplasma, die bei Aktivierung Plasmin oder Fibrinolysin bildet, ein Enzym, das an der Blutgerinnung beteiligt ist. Plasminogen selbst fehlt jede nachweisbare antiangiogene Aktivität. Es wurde festgestellt (Judah Folkman et al., Harvard Medical School, Boston), daß ein Teil dieses endogenen Proteins, insbesondere die ersten vier Kringle-Domänen, die Teilung von Endothelzellen verhindern können. Dieser Teil von Plasminogen wurde als Angiostatin bezeichnet, und ein Großteil der Forschung auf diesem Gebiet zentriert sich um dieses Molekül. Der Stand der Technik hat gezeigt, daß Angiostatin Endothelzellen spezifisch in vitro inhibiert und die Angiogenese in vivo blockiert. Systemische Behandlungen mit subkutanen Injektionen von Angiostatin induzieren einen Ruhezustand in vivo in einem großen Bereich von Tumoren in SCID-Mäusen (O'Reilly et al., Nature Med., Bd. 2, S. 689, 1996). Keine nachweisbare Toxizität wurde in diesen Tieren selbst nach Monaten der Behandlung detektiert. Angiostatin zeigt zwei Grade der Spezifität: es induziert Apoptose spezifisch in Endothelzellen in vitro (Claesson-Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 95, S. 5579, 1998) und beeinflußt nur in der Angiogenese aktive Endothelzellen in vivo. Es hat keine negative Beeinflussung von Zellen in bestehenden Gefäßen gezeigt.
Angiostatin weist tatsächlich gewisse vorteilhafte Eigenschaften auf, unter anderem da es eine endogene Substanz ist. Jedoch können die mit seiner möglichen Verwendung für medizinische Zwecke verbundenen Nachteile nicht verneint werden. Einer besteht darin, daß seine Halbwertzeit sehr kurz ist, sie kann in Stunden gezählt werden, wodurch eine häufige Verabreichung erforderlich ist. Soweit hat sich seine Wirksamkeit als sehr gering erwiesen, wobei diese Tatsache die Verwendung großer Dosen davon erfordert. Diese zwei Nachteile sind als solche starke Motive, um weitere Forschung auf das Auffinden von alternativen, kleineren und/oder effizienteren Molekülen zur Verwendung als Medikamente zu richten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst die mit Angiostatin verbundenen Probleme wie oben definiert durch Bereitstellen eines humanen Proteins, das als "ABP-1" bezeichnet worden ist, definiert durch seine Fähigkeit zur Bindung eines Fragments von Plasminogen, bevorzugt der ersten vier Kringle-Domänen (K1–K4) davon, wobei das Fragment durch antiangiogene biologische Aktivität gekennzeichnet ist.
ABP-1 umfaßt eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzhomologie von mehr als wenigstens 80% mit SEQ ID NO: 2.
Auch umfaßt in der vorliegenden Erfindung sind die Homologen von ABP-1 in anderen Arten, speziell in anderen Säugetieren, mit einer Sequenzhomologie von mehr als wenigstens 80% mit SEQ ID NOs.: 2, 3 oder 4.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die eine Sequenz umfassen, die für ABP-1 oder für ein im wesentlichen mit ABP-1 ähnliches Polypeptid codieren, d.h. mit einer Sequenzhomologie von mehr als wenigstens 80% mit SEQ ID NOs.: 2, 3 oder 4.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung einer Verbindung ein, die mit ABP-1 oder seinen Varianten und Fragmenten wechselwirken kann. Das Durchmusterungsverfahren kann in jeder Konfiguration sein, die den Fachleuten gut bekannt ist.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Antikörper bereitzustellen, die gegen Epitope gerichtet sind, die in ABP-1 oder seinen Varianten und Fragmenten vorhanden sind, sowie Zellen, die den Antikörper erzeugen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Vektor bereitzustellen, der die Nukleotidsequenz von ABP-1 oder seinen Varianten und Fragmenten umfaßt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zelle bereitzustellen, die den obigen Vektor enthält.
Definitionen
In der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe in den nachfolgend definierten Bedeutungen verwendet.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Angiogenese" die Erzeugung von neuen Blutgefäßen in einem Gewebe oder Organ. wie oben erwähnt wurde, erfahren Menschen und Tiere unter normalen physiologischen Bedingungen nur Angiogenese in sehr spezifischen beschränkten Situationen. Zum Beispiel wird Angiogenese normalerweise in der Wundheilung, fötalen und embryonalen Entwicklung und Bildung des Corpus luteum und der Plazenta beobachtet.
Der Begriff "Endothel" betrifft die dünne Schicht von flachen Epithelzellen, die seröse Hohlräume, Lymphgefäße und Blutgefäße auskleiden. Der Begriff "endotheliale inhibierende Aktivität" betrifft die Fähigkeit der Inhibierung des Wachstums von endothelialen kapillaren Endothelzellen.
Der Begriff "ein Angiogenese-assoziiertes Protein" betrifft ein Protein, das in der Angiogenese wechselwirken kann, wie zum Beispiel einen Rezeptor, der eine antiangiogene Substanz bindet.
Der Begriff "im wesentlichen ähnlich" bei Verwendung in bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4 bedeutet eine Aminosäuresequenz mit einem hohen Grad an Sequenzhomologie mit SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4. Ein hoher Homologiegrad bedeutet wenigstens ca. 80% Aminosäurehomologie, bevorzugt wenigstens ca. 90% Aminosäurehomologie, besonders bevorzugt wenigstens ca. 95% Aminosäurehomologie und am meisten bevorzugt wenigstens ca. 98% Aminosäurehomologie.
Der Begriff "spezifisch hybridisieren mit" bezeichnet das Binden, Duplexieren oder Hybridisieren eines Moleküls nur mit einer besonderen Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn die Sequenz in einer komplexen Mischung (z.B. vollzellulär) aus DNA oder RNA vorhanden ist. Der Begriff "stringente Bedingungen" betrifft Bedingungen, unter denen eine Sonde mit ihrer Zieluntersequenz hybridisieren wird, aber nicht mit anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden sich unter unterschiedlichen Umständen unterscheiden. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Allgemein werden stringente Bedingungen ausgewählt, um ca. 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH zu sein. Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der mit der Zielsequenz komplementären Sonden mit der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren. (Da die Zielsequenzen allgemein im Überschuß vorhanden sind, werden bei Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Typischerweise werden stringente Bedingungen diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als ca. 1,0 M Na-Ionen, typischerweise ca. 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen (oder andere Salze), bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens ca. 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und wenigstens ca. 60°C für längere Sonden ist. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie Formamid erreicht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Bindung von ¹²⁵I-markiertem Angiostatin und Plasminogen an bovine mikrokapillare Endothelzellen in vitro. Einheiten an der Abszisse stellen den x-fachen molaren Überschuß von kaltem Angiostatin bzw. Plasminogen dar.
2 zeigt die Strategie zur Isolierung von Angiostatin-bindenden Proteinen.
3 zeigt das Wachstum von positiven Hefeklonen unter selektiven Bedingungen.
4 vergleicht die Bindung von rekombinantem "Big-3" an Angiostatin bzw. Plasminogen.
5 ist eine Karte über "Big-3".
6 zeigt das offene Leseraster (Raster 2) des Gens, das den Angiostatinrezeptor gemäß der Erfindung codiert. Die anderen möglichen Raster erzeugen keinerlei mutmaßliches Protein.
7 zeigt die Expressionsmuster von fötaler und adulter mRNA sowie von Endothelzellen.
8 zeigt die relative Bestimmung der ABP-1-Genexpression in unterschiedlichem Gewebe. Siehe experimenteller Abschnitt für weitere Einzelheiten.
9 veranschaulicht (A) die zelluläre Lokalisierung von GFP-markiertem ABP-1-Rezeptor in transient transfizierten HeLa-Zellen und (B) die Reorganisation von GFP-markiertem ABP-1 nach Inkubation mit Angiostatin. 9C zeigt die Bindung von Angiostatin an ABP-1. Siehe experimenteller Abschnitt für weitere Einzelheiten. 9D ist eine Immunanfärbung von ABP-1 in humanen Endothelzellen aus Nabelschnur (HUVE) zusammen mit einer Anfärbung gegen F-Actin mit Rhodamin-markiertem Phalloidin. ABP-1 befindet sich in fokalen Adhäsionen und Membranfaltungen (Pfeile).
10 veranschaulicht die Abregulation von ABP-1-assoziierter Kinaseaktivität nach Addition von Angiostatin.
11 ist eine Autoradiographie eines SDS-PAGE, das zeigt, daß ABP-1 die Angiostatin-induzierte fokale Adhäsionskinaseaktivität vermittelt. Siehe experimenteller Abschnitt für weitere Einzelheiten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes humanes Angiogenese-assoziiertes Protein, das ein Fragment von Plasminogen binden kann, bevorzugt ein N-terminales Fragment wie die Kringle-Domänen 1 bis 4 und/oder Kringle 5. So wirkt das Protein der Erfindung als ein Rezeptor für Plasminogenfragmente, insbesondere als Rezeptor für Angiostatin und/oder die Kringle-Domäne 5 von Plasminogen. Das Protein der Erfindung kann durch biologische oder chemische Verfahren (z.B. rekombinante Genexpression und Peptidsynthese) synthetisiert werden. Rekombinante Techniken schließen die Genklonierung oder -amplifikation durch In-vitro-Verfahren ein, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR), das Amplifikationssystem auf Transkriptionsbasis (TAS) oder das selbsterhaltende Sequenzvervielfältigungssystem (SSR). Eine große Vielzahl von Klonierungs- und In-vitro-Amplifikationsmethodiken sind den Fachleuten allgemein bekannt. Beispiele für diese Techniken werden zum Beispiel gefunden in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152, Academic Press Inc., San Diego, CA (Berger). Die vorliegende Erfindung schließt Proteine ein, die Aminosäuresequenzen umfassen, die im wesentlichen ähnlich denjenigen sind, die in SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4 gezeigt sind. Ein Vergleich der Proteinsequenz von SEQ ID NO. 2 mit den in allen verfügbaren Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte eine Homologie von 23,7% mit einem hypotetischen Protein von Caenorhabditis elegans, das durch ein mutmaßliches offenes Leseraster codiert wird, das sich im zentralen Cluster von Chromosom III dieses Organismus befindet (beschrieben in R. Wilson et al., Nature, Bd. 368, 3. März 1994, S. 32–38). Keine Funktion wurde diesem hypotetischen Protein zugewiesen.
Gemäß der oben angegebenen Definition versteht es sich, daß alle Polypeptide, die ein Fragment von Plasminogen binden können und eine Aminosäuresequenz haben, die wenigstens ca. 80% Sequenzhomologie, bevorzugt ca. 90% Sequenzhomologie, besonders bevorzugt ca. 95% Sequenzhomologie und am meisten bevorzugt ca. 98% Sequenzhomologie mit SEQ ID NOs. 2, 3 oder 4 hat, als in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen betrachtet werden. Diese varianten Formen können z.B. aus einer alternativen Spleißung oder differentiellen Expression in unterschiedlichem Gewebe des gleichen Ursprungsorganismus resultieren. Die varianten Formen können zum Beispiel durch eine Aminosäureinsertion, -deletion oder -substitution gekennzeichnet sein. Eine bevorzugt variante Form von ABP-1 ist in SEQ ID NO. 3 veranschaulicht (siehe unten).
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein als Big-3 bezeichnetes Fragment von ABP-1, das in weiteren Einzelheiten nachfolgend beschrieben wird und die Angiostatin-bindende Domäne von ABP-1 einschließt (SEQ ID NO. 4).
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit, die wenigstens ca. 5, bevorzugt wenigstens ca. 10 zusammenhängende Aminosäurereste von SEQ ID NO. 2 oder jeder Variante oder jedem Fragment davon umfassen. Jedoch wird die am meisten vorteilhafte Größe des Peptids von seiner beabsichtigten zukünftigen Verwendung abhängen, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf die oben angegebene Anzahl von Aminosäureresten beschränkt.
Auch eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung sind Homologe von ABP-1 und Big-3 in anderen Arten, insbesondere in anderen Säugetieren. Der Begriff "Homolog" bezeichnet Proteine, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion der Proteine der Erfindung ausüben, unabhängig von der zwischen den entsprechenden Aminosäuresequenzen bestehenden Homologie.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenz umfassen, die für die Proteine und Peptide der Erfindung codiert, einschließlich der Varianten, Fragmente und Homologe wie oben definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Nukleinsäuremolekül die Sequenz von SEQ ID NO. 1. Diese Sequenz stellt eine 5'- (von Nukleotid 1 bis Nukleotid 796) und eine 3'- (von Nukleotid 2825 bis Nukleotid 6463) untranslatierte Region dar. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat das Nukleinsäuremolekül die Sequenz von Nukleotid 797 bis Nukleotid 2824 von SEQ ID NO. 1. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert die Nukleinsäuresequenz das als Big-3 bezeichnete ABP-1-Fragment (veranschaulicht in SEQ ID NO. 4), und sie umfaßt die Nukleotidsequenz von Position 2180 bis Position 2608 von SEQ ID NO. 1. Alle Nukleotidsequenzen, die die Polypeptide der Erfindung codieren und sich von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder einem Fragment davon aufgrund der Entartung des genetischen Codes unterscheiden, werden als Teil der Erfindung betrachtet. Die Sequenzierungsanalyse hat die Gegenwart einer möglichen Polymorphie im Codon 1199-1201 von SEQ ID NO. 1 gezeigt, worin ein Codon für Asn, Ser oder Asp vorhanden sein kann. Es wurde festgestellt, daß eine weitere Region, die den Nukleotidpositionen 1238 bis 1246 von SEQ ID NO. 1 entspricht, für das Tripeptid Glu-Leu-Ala oder für das Tripeptid Thr-Trp-Pro codiert. Diese Variationen in der Aminosäuresequenz von ABP-1 sind in SEQ ID NO. 3 veranschaulicht, die ein anderes bevorzugtes Protein der Erfindung darstellt. Auch eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung sind Nukleotidmoleküle, die ein Homolog von ABP-1 oder Fragment davon codieren.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Nukleinsäure, die spezifisch unter stringenten Bedingungen mit einem beliebigen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle der Erfindung hybridisieren kann.
Wenn die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Sonden verwendet werden sollen, ist es häufig wünschenswert, die Sequenzen mit detektierbaren Markern zu markieren. Solche Marker können jede Zusammensetzung einschließen, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar ist. Die Marker können durch jedes einer Anzahl von Mitteln aufgenommen werden, die den Fachleuten allgemein bekannt sind. Verfahren zum Detektieren solcher Marker sind ebenfalls allgemein fachbekannt und in der Literatur offenbart. Die Sonden finden eine nützliche Anwendung in der diagnostischen Anwendung, zum Beispiel zur Detektion und Messung der ABP-1-Biosynthese in Geweben und Zellen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Durchmusterungsverfahren oder -tests bereit, worin auf Moleküle durchmustert wird, die die gleichen Eigenschaften wie Angiostatin und/oder Kringle 5 aufweisen. In einem typischen Durchmusterungsverfahren wird eine Verbindung, die den Angiostatin-Signalübertragungsweg aktivieren kann, durch eine Hochdurchsatzdurchmusterung auf Zellbasis identifiziert. Eine solche Durchmusterung beruht auf einem Reportergen, das durch ein auf Angiostatin reagierendes Element angetrieben wird, das stabil in eine auf Angiostatin ansprechende Zellinie transfiziert ist. Das reagierende Element ist mit einem Reportergen verbunden, zum Beispiel dem Gen für Luciferase; bei Bindung der Verbindung an das Protein der Erfindung wird der intrazelluläre Reaktionsweg aktiviert, wodurch eine Zunahme der Reportergenaktivität verursacht wird, die nachgewiesen werden kann.
Die durch das hier beschriebene Durchmusterungsverfahren identifizierten Verbindungen sind im Umfang der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind bevorzugt Moleküle peptidischer oder nicht-peptidischer Natur mit geringem Molekulargewicht. Dank ihrer geringen Größe sind sie praktischer zur Verwendung für medizinische Zwecke im Vergleich mit Angiostatin. Diese Moleküle und ihre Verwendungen werden in größerem Detail nachfolgend beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Proteine und Peptide können unter Verwendung von standardmäßigen chemischen Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden. Für die Festphasensynthese siehe z.B. Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, S. 3–284, The Peptides: Analysis, Synthesis Biology, Bd. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Teil A.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Proteine, Peptide und Polypeptide unter Verwendung rekombinanter DNA-Methodik synthetisiert, die allgemein die Erzeugung einer DNA-Sequenz, die das Protein oder Peptid codiert, das Einsetzen der DNA in eine Expressionskassette unter der Kontrolle eines besonderen Promotors, das Exprimieren des Proteins oder Peptids in einem Wirt, das Isolieren des exprimierten Proteins oder Peptids und, falls erforderlich, das Renatuieren des Produkts beinhaltet. Sobald sie exprimiert sind, können die rekombinanten Peptide oder Proteine gemäß fachlichen Standardverfahren gereinigt werden. Somit ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Vektor, wie ein Virus oder ein Plasmid, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt. Ferner umfaßt die Erfindung auch eine rekombinante Zelle, die mit dem Vektor transformiert oder transfiziert ist, der das vorliegende Protein oder Peptid exprimiert, sowie eine rekombinante Zelle, die den vorliegenden Antikörper exprimiert, der nachfolgend in größerem Detail definiert wird. Vektoren, die die erfindungsgemäßen Peptide und Proteine codieren, sind nützlich in der Expression dieser Moleküle, um Immunogene für die Antikörpererzeugung bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind auch nützlich zur Transformation von Zellen in vitro oder in vivo, um die vorliegenden Peptide und Proteine zu exprimieren. Zellen, die eine beliebige der vorliegenden Nukleinsäuren exprimieren, wie zum Beispiel das durch SEQ ID NO. 1 definierte Gen, können in einer großen Vielzahl von Zusammenhängen verwendet werden und sind auch im Umfang der vorliegenden Erfindung. Solche Zellen können eukaryontisch oder prokaryontisch sein.
Die erfindungsgemäßen Proteine und Peptide können als Antigene zur Erzeugung von Antikörpern gegen dieselben verwendet werden. Entsprechend umfaßt die Erfindung auch einen Antikörper, der spezifisch ein erfindungsgemäßes Peptid bindet. Solche Antikörper sind nützlich für Immunoassays, z.B. zur Isolierung von Peptiden oder Polypeptiden. Die erfindungsgemäßen Peptide können auch in Assays (Tests) verwendet werden, wie zum Beispiel spezifischen Amplifikationstests, immunologischen Assays etc.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und schließen individuelle, allelische, Stamm- oder Artvarianten oder Fragmente davon ein, sowohl in ihren natürlich vorkommenden Formen (voller Länge) als auch in rekombinanten Formen. Zusätzlich werden die Antikörper gegen die vorliegenden Peptide oder Polypeptide in entweder ihrer nativen Konfiguration oder in nicht-nativen Konfigurationen erzeugt. Antiidiotypische Antikörper können auch erzeugt werden. Viele Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind den Fachleuten bekannt. Für Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper siehe zum Beispiel Stiites et al. (Hrsg.), Basic and Clinical Immunology (4. Auflage), Lange Medical Publications, Los Altos, CA und darin zitierte Literaturstellen. Für Techniken, die die Selektion von Bibliotheken rekombinanter Antikörper in einem Phagen oder ähnlichen Vektoren beinhalten, siehe z.B. Huse et al. (1989), Science 246: 1275–1281.
Die erfindungsgemäßen Moleküle können in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden, speziell zur Behandlung und/oder Prävention von Angiogenese-bezogenen Störungen. Entsprechend betrifft die Erfindung ein(en) erfindungsgemäße(s/n) Peptid, Polypeptid, Protein oder Antikörper zur Verwendung als Medikament sowie die Verwendung der Moleküle in der Herstellung eines auf eine Angiogenese-bezogene Krankheit oder Störung gerichteten Medikaments. Die Erfindung betrifft auch eine pharmakologische Zubereitung, die ein erfindungsgemäßes Molekül zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Die als erfindungsgemäße Medikamente verwendeten Moleküle können jedes/jeden der oben beschriebenen Peptide, Polypeptide, Proteine oder Antikörper sowie jede neue Substanz sein, die in einem Durchmusterungsverfahren unter Verwendung derselben und oben beschriebenen identifiziert werden.
Entsprechend ist die am meisten bevorzugte Verwendung der vorliegenden Moleküle in Assays (Tests), worin auf neue Substanzen durchmustert wird. Verbindungen können identifiziert werden, die ähnliche antiangiogene Wirkungen wie Angiostatin und/oder Kringle 5 aufweisen, die aber kleiner sind, wirksamer sind und bevorzugt eine längere Halbwertszeit in einem menschlichen oder tierischen Körper als Angiostatin aufweisen. Die kürzere Halbwertszeit kann aufgrund einer geringeren Tendenz zum Abbau durch Proteasen bestehen. Wenn eine organische Verbindung konstruiert wird, wird ein erfindungsgemäßes Molekül als "Leit"-Verbindung verwendet. Die Konstruktion von Mimetika für bekannte pharmazeutisch wirksame Verbindungen ist ein allgemein bekannter Ansatz in der Entwicklung von Pharmazeutika auf Basis solcher "Leit"-Verbindungen. Die mimetische Konstruktion, Synthese und Untersuchung werden allgemein verwendet, um eine zufällige Durchmusterung einer großen Anzahl von Molekülen auf eine Zieleigenschaft zu vermeiden.
Somit werden solche neuen Moleküle bevorzugt als Medikamente verwendet, die in viel geringeren Dosen als Angiostatin verabreicht werden können und weniger häufig verabreicht werden können, wie zum Beispiel nur alle 14 Tage, was mit der Halbwertszeit von Angiostatin verglichen werden muß, die ca. 10-mal kürzer ist. In einer besonderen Ausführungsform sind die durch die erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren identifizierten neuen Moleküle organische Moleküle mit geringem Molekulargewicht, wobei in diesem Fall eine pharmazeutische Zubereitung davon zur oralen Aufnahme hergestellt werden kann, wie z.B. in Tabletten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können jedoch für jeden Verabreichungsweg hergestellt werden, z.B. oral, intravenös, kutan oder subkutan, nasal, intramuskulär oder intraperitoneal. Die Natur des Trägers oder der anderen Bestandteile wird vom spezifischen Verab reichungsweg abhängen (Beispiele für Techniken und Protokolle, die nützlich in diesem Zusammenhang sind, werden u.a. gefunden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.), 1980).
Die Dosierung dieser Verbindungen mit geringem Molekulargewicht wird von der Krankheit oder dem Zustand, die/der behandelt werden soll, und anderen klinischen Faktoren wie Gewicht und Zustand des Menschen oder Tieres und vom Verabreichungsweg der Verbindung abhängen. Zur Behandlung von Menschen oder Tieren können zwischen ca. 0,5 und 500 mg/kg Körpergewicht der Verbindung verabreicht werden.
Die vorliegenden Verbindungen und Verfahren werden vorteilhaft in bezug auf alle Arten von Angiogenese-bezogenen Störungen und/oder Krankheiten verwendet, wie zum Beispiel Tumorzustände, Diabetes, rheumatoide Arthritis und sogar einige entzündliche Krankheiten wie Psoriasis, chronische Entzündungen der Eingeweide, Asthma etc. Es wird auch vorgeschlagen, daß sie zur Behandlung und Heilung oder Verhinderung von Fettsucht verwendet werden können.
In einer besonderen Ausführungsform werden die vorliegenden Moleküle in der Gentherapie verwendet. Für eine Übersicht zu Gentherapieverfahren siehe z.B. Anderson, Science (1992), 256: 808–813.
Eine weitere vorteilhafte Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung von Verfahren zur Regulation der Signalleitung des vorliegenden Angiostatin- und/oder Kringle 5-Rezeptors im Körper, und deshalb betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Patienten, der an einer Angiogenese-bezogenen Krankheit oder Störung leidet, sowie Verfahren zur Prävention solcher Zustände.
Experimenteller Abschnitt
Nachfolgend wird die Erfindung in größerem Detail unter Bezugnahme auf die Zeichnungen offenbart.
Alle Literaturverweise in der vorliegenden Offenbarung und oben werden in die vorliegende Anmeldung hierdurch eingeführt.
Nachweis, daß Angiostatin an Endothelzellen bindet
Durch kompetitive Bindungstests zwischen Angiostatin und den angiogenen Faktoren, VEGF und bFGF, haben die Autoren der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß Angiostatin nicht die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung dieser Moleküle beeinflußt. Die gleiche Bindungsstärke konnte in Gegenwart oder Abwesenheit von unmarkiertem Angiostatin nachgewiesen werden. Daher kann ausgeschlossen werden, daß Angiostatin durch Blockieren der Wechselwirkung von angiogenen Faktoren mit Endothelzellen wirkt.
Die direkte Bindung von Angiostatin und seinem Vorläufer Plasminogen wurde durch Bindungstests unter Verwendung iodierter Proteine und Analyse ihrer Wechselwirkung mit bovinen mikrokapillaren Endothelzellen untersucht, siehe 1.
Insbesondere wurde humanes Angiostatin (Kringle-Domänen 1–4) oder Plasminogen mit ¹²⁵Iod durch die Iodogen-Methode gemäß Herstellerprotokoll (Pierce Inc.) markiert. Das markierte Protein wurde dann an einer G50-Sepharosesäule (Pharmacia Inc.) gereinigt. Die spezifische Aktivität wurde auf 90 000 cpm/ng Protein abgeschätzt. Für die Bindungstests wurden bovine kapillare Endothelzellen zur Konfluenz in Platten mit 12 Vertiefungen gezüchtet. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, das 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. Die Zellen wurden dann mit 10 ng/ml radiomarkiertem Angiostatin oder Plasminogen inkubiert. Die Bindung wurde konkurriert mit zunehmenden Konzentrationen von unmarkiertem Ligand. Die Zellen wurden auf Eis für 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann 5-mal mit PBS + 1 mg/ml BSA gewaschen. Die Zellen wurden mit 1% Triton X100 in PBS lysiert, und die Radioaktivität wurde in einem Gammazähler gemessen. Dissoziationskonstante und Rezeptoranzahlen wurden unter Verwendung des RBINDING-Programms abgeschätzt (E. J. van Zoelen, Anal. Biochem., Februar 1992, 1: 200 (2): 393–9).
Identifizierung von Angiostatin-bindenden Molekülen unter Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems
Angiostatin behält Aktivität selbst nach Reduktion bei, was nahelegt, daß die dreidimensionale Faltung nicht vital für Bindung und Aktivität ist. Dies begünstigt Durchmusterungsverfahren, in denen eine große Anzahl von Klonen durchmustert werden können, obwohl die Proteinneufaltung weniger genau sein mag.
Das Hefe-Zwei-Hybrid-System wurde eingesetzt, um auf Moleküle zu durchmustern, die die Kringle-Domänen 1–4 von Plasminogen binden. Dies wird weiter unten unter Bezugnahme auf 2 offenbart. Ca. 2 × 10⁶ Klone aus einer Zwei-Hybrid-cDNA-Bibliothek aus menschlicher Plazenta zum Geburtszeitpunkt (Stratagene) wurden durchmustert. Positive Klone wurden auf die folgende Weise identifiziert:

(1) Durchmusterung unter selektiven Bedingungen (His-, Leu- und Trp-) erzeugte 37 positive Klone in Hefestamm CG1945.
(2) Sieben von 37 Klonen zeigten hohe β-Galactosidaseaktivität nach Inkubation mit ONPG (Sigma) bei 30°C für 2 h.
(3) Die DNA aus den sieben Kolonien, die hohe β-Gal-Aktivität enthielten, wurde gereinigt und in Hefestamm Y190 retransfiziert. Drei von den sieben Kolonien behielten Aktivität im neuen Hefestamm bei. Sequenzierungsanalyse dieser Klone zeigte, daß sie aus dem gleichen Gen stammten.
(4) Wachstum in Gegenwart von 50 mM 3-Aminotriazol (3) sowie β-Gal-Aktivität (siehe nachfolgende Tabelle) wurden in Big 3-Klonen bewertet und mit positiven und negativen Kontrollen verglichen.

Sequenz von Big 3 (Angiostatin-bindende Domäne)
Nach Isolierung des Big3-Klons aus einer Plazenta-Hefe-Zwei-Hybrid-Bibliothek (Stratagene, Inc.) sequenzierten wir direkt das cDNA-Insert aus dem pGAD-Aktivierungsdomänenvektor mit GAL4 AD-Sequenzierungsprimern. Das cDNA-Insert wurde in den pUC18-Vektor unter Verwendung von EcoR1-Orten aus Adaptern rekloniert, und die Sequenzierung wurde unter Verwendung von universellen und reversen Primern wiederholt. Die Sequenzen wurden in einem automatisierten ALF-Sequenzierer (Pharmacia) analysiert. Die Sequenz von Big 3 ist in SEQ ID NO. 4 gezeigt.
Expression und Reinigung von Big3 und Big3-GST-Fusionsprotein
Die Big3-Sequenz wurde in E. coli als Fusionsprotein mit der Glutathion S-Transferase (GST)-Domäne aus Schistosoma japonicum exprimiert.
– Vektorkonstruktion
Big3-Fragment (429 bp) wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von pUC18-Big3-Plasmid als Matrize erhalten. Die Primersequenzen waren:
BamHI-NH₂ 5' TAC GGA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 3' (SEQ ID NO. 5)
XhoI-COOH 5' ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG AGT TGG AGC CA 3' (SEQ ID NO. 6)
Das verwendete Kreislaufprotokoll war:
Tag-Polymerase: native Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene)
PCR-Fragment wurde mit BamHI und XhoI verdaut, gereinigt und mit PGEX-6P-2-Plasmid (Pharmacia Biotech), das mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wurde, ligiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation von XL1-Blue-Zellen (Stratagene) verwendet. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse und automatisierte Sequenzierung verifiziert.
– Expression und Reinigung:
DH5α-Zellen (Clontech) wurden mit einem als pGEX-Big3 bezeichneten verifizierten Klon transformiert und für 6 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,1 mM IPTG induziert.
Die Fermentationsbouillon wurde mit 4000 U/min für 15 min zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in 10% G/V Lysepuffer (50 mM TRIS·HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 20 mM DTT, 1 mM EDTA, Proteaseinhibitormischung) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Das gesamte Lysat wurde mit 15000 × g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Der geklärte Überstand wurde auf eine Glutathion-Sepharosesäule (1 ml für 20 ml Lysat) aufgetragen, die mit Lysepuffer voräquilibriert worden war. Das Harz wurde mit 10 Säulenvolumina (CV) Lysepuffer gewaschen, und das Fusionsprotein wurde mit 3 CV Elutionspuffer (100 mM Tris·HCl pH 8,0, 20 mM reduziertes Glutathion) eluiert.
Das Protein GST-Big3 kann durch Inkubation des Glutathion-Sepharosegebundenen Fusionsproteins mit 20 μl/ml Harz von PreScission-Protease in PS-Puffer gespalten werden, der 50 mM TRIS·HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 1 mM PMSF enthält.
Die eluierten Proteine verhalten sich wie ein einzelner Peak im Umkehrphasen-HPLC (10–90% Gradient von Acetonitril in Wasser plus 0,1% TFA), zeigen die erwartete molekulare Größe gemäß Massenanalyse (Elektrospray) und die korrekte NH2-Sequenz. Im SDS-PAGE erscheint eine Verunreinigung bei dem scheinbaren MW von 80 kDa; es wurde als DnaK, ein bakterielles Chaperon, nachgewiesen, das durch Durchlaufen einer Ionenaustauscherchromatographie auf einer HiTrapQ-Säule eliminiert werden kann.
Die aus 1 l Fermentation erhaltenen Ausbeuten sind ca. 10 mg Fusionsprotein GST-Big3 und ca. 3 mg des gespaltenen Big3.
In-vitro-Bindung von rekombinantem GST-markiertem Big3 an Angiostatin
Das zur Bindung verwendete Protokoll wird hier nachfolgend beschrieben.
Eine Kolonie der pGEX-Big3-Transformante wurde in 10 ml LB-Medium plus Ampicillin übergeimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet.
Die Übernachtkultur wurde 1:10 in 100 ml frischem Medium verdünnt, und nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM hinzugegeben und die Inkubation für 3 bis 7 Stunden fortgesetzt.
Die Kultur wurde dann mit 5000 g für 10 Minuten zentrifugiert, das Pellet wurde in 3–5 ml eiskaltem PBS resuspendiert, und die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert. Triton X100 wurde auf eine Endkonzentration von 0,5–1% hinzugegeben, und 1,5 ml/Teilmengen der Suspension wurden mit 14000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert.
0,1–0,3 ml einer 50%igen Aufschlämmung von Glutathion-Agarose-Perlen wurden zum Überstand gegeben und für 3–5 Stunden bei 4°C vermischt. Die Perlen wurden dann durch Zentrifugieren aufgefangen und 5-mal mit eiskaltem PBS und 2-mal mit Bindungslösung (B. S.) gewaschen, die aus 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT und 1 mM PMSF bestand.
Bindungstest: 0,7 ml B. S., 0,1% Kälberserum und 500 ng Angiostatin wurden mit 30–50 μl einer 50%igen Aufschlämmung von Big3-immobilisierten Glutathion-Agarose-Perlen für 1–3 Stunden bei 4°C vermischt.
Das Harz wurde 5- bis 7-mal mit eiskaltem B. S. gewaschen und dann für die Western-Blot-Analyse unter Verwendung von anti-humanen Plasminogen-Antikörpern (Dako Inc.) verwendet.
4 zeigt, wie gereinigtes rekombinantes Big3 Angiostatin in vitro bindet. Interessanterweise konnte die Bindung von Plasminogen auch detektiert werden, aber nur nach Reduktion von Disulfidbindungen durch Behandlung mit DTT.
Klonierung der Sequenz voller Länge
5 veranschaulicht das Schema zur Klonierung der Sequenz von ABP-1 voller Länge. Das gesamte Gen wurde durch Durchmusterung einer Plazenta-cDNA-Phagenbibliothek mit einer Big3-Sonde (mit entfernten repetitiven Sequenzen) zusammen mit 5'-RACE-PCR (Gibco) unter Verwendung von mRNA aus humanen Nabelschnur-Endothelzellen kloniert. Die vollständige Sequenz des cDNA-Klons wird in SEQ ID NO. 1 offenbart, wohingegen das codierte Protein in SEQ ID NO. 2 gezeigt wird. Einzelheiten des experimentellen Protokolls sind wie folgt. 10 Millionen Klone einer Plazenta-lambda-Phagenbibliothek (Stratagene Inc.) wurden unter Verwendung eines HinfI-Fragments von Big3 als Sonde durchmustert. DNA-Isolierung und Southern-Blot-Verfahren wurden gemäß etablierten Protokollen durchgeführt (Sambrook et al., 1989). Wir isolierten die Klone (7-1, 7-2, 8-2, 9-3, 9-5) mit Sequenzen, die mit Big3 überlappen. Die 5'-Sequenz des 7-2-Klons wurde zur Schaffung von Genspezifischen Primeren (GSP) für 5'-RACE-PCR (Gibco Life Technologies, Inc.) verwendet. Aus humanen Nabelschnur-Endothelzellen isolierte mRNA wurde zur Identifizierung von 5'-Sequenzen verwendet. Die verwendeten Primer für die erste RACE-PCR:
Primer: GSP1 – (5' zu 3') GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT (SEQ ID NO. 10)
GSP2 – (5' zu 3') CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA (SEQ ID NO. 11)
GSP3 – (5' zu 3') TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTTCCG (SEQ ID NO. 12)
RACE-Prozeduren wurden zur Amplifikation und Klonierung unbekannter Sequenzen zwischen dem GSP2 und GSP3 und dem 5'-Ende der mRNA ABP-1 verwendet. Diese Sequenz wurde dann zur Schaffung neuer Primer für den nächsten Satz von RACE-PCR verwendet.
Primer: GSP1 – (5' zu 3') GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC (SEQ ID NO. 13)
GSP2 GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA (SEQ ID NO. 14)
GSP3 GAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA (SEQ ID NO. 15)
Klone A2-2, A2-1 und A1-C mit überlappenden Sequenzen wurden isoliert. Die A2-1-Sequenz wurde als Sonde für die zweite Durchmusterung der Plazenta-Phagenbibliothek verwendet. Aus dieser Durchmusterung isolierten wir zwei weitere Klone (7-10 und 6-5). Wie in 6 gezeigt wird, ist aus den sechs möglichen Rastern das einzige, das ein vollständiges offenes Leseraster erzeugt, Raster 2, das ein mutmaßliches Protein mit 675 Aminosäureresten liefert.
mRNA-Expressionsmuster
mRNA-Blots (2 mg mRNA/Vertiefung) aus kommerziell (Clontech, Inc.) erhaltenem multiplem humanem adultem und fötalem Gewebe (#7760-1 und #7756-1) wurden auf ABP-1 sondiert. Die Blots wurden mit der ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Clontech, Inc.) gemäß Herstellerprotokoll hybridisiert. Die Blots wurden mit dem 7-2 5'Pst/Fragment sondiert. 7 zeigt die Ergebnisse des Experiments; die Größen sind 9,5 und 7,5 kb.
ABP-1 wurde auch in humanen Nabelschnur-, bovinen Aorta- und bovinen mikrokapillaren Endothelzellen detektiert. Wenig oder keine Expression wurde in der unsterblich gemachten Endothelzellinie EaHy926 und in humanen fötalen Fibroblasten detektiert. Keine der Zellinien spricht auf Angiostatin an oder weist eine Bindung FITC-markiertem Angiostatin auf.
Echtzeit-RT-PCR
Der 5'-Nukleasetest (TaqMan-Test) verwendet eine nicht-verlängerbare Oligonukleotid-Hybridisierungssonde (TaqMan Probe). Die TaqMan-Sonde besteht aus einem Oligonukleotid mit einem 5'-Reporterfarbstoff und einem 3'-Löschungsfarbstoff. Wenn die Sonde intakt ist, führt die Nähe des Reporterfarbstoffs zum Löschungsfarbstoff zur Unterdrückung der Reporterfluoreszenz, primär durch eine Energieübertragung vom Foster-Typ. Währen der PCR hybridisieren Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit einer spezifischen Sequenz der Ziel-DNA. Die TaqMan-Sonde hybridisiert mit einer Zielsequenz innerhalb des PCR-Produkts. Die Taq-Polymerase spaltet die TaqMan-Sonde mit 5'-3'-Nukleaseaktivität. Der Reporterfarbstoff und Löschungsfarbstoff werden bei Spaltung getrennt, was zu einer erhöhten Fluoreszenz des Reporters führt.
Echtzeit-RT-PCR-Analyse
RNA-Zubereitung
Isolierung und Reinigung von gesamter RNA aus den nachfolgend aufgeführten Geweben und Zellen wurden unter Verwendung des Ultraspec-RNA-Isolierungssystems (Biotex) durchgeführt.
cDNA-Synthese
Die RT-Reaktion wurde unter Verwendung von TaqMan Reverse Transcription Reagent (PE Applied Biosystems) mit statistischen Hexameren als RT-Primer durchgeführt. Das Reaktionsvolumen für den reversen Trans kriptionsschritt betrug 100 μl, und die Gesamt-RNA-Menge betrug 1 μg für die Probe.
RT wurde unter Verwendung der folgenden Kreislaufparameter durchgeführt:
10 min bei 25°C
45 min bei 48°C
5 min bei 95°C
PCR-Reaktion
Nach einer Primer-Konzentrationsoptimierung wurde die PCR-Reaktion an 10 ng der cDNA unter Verwendung von TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems) und der folgenden Oligonukleotide durchgeführt:

– ABP-1 Vorwärts-Primer: 5' GTTTGACCTGCAATCCAGACAA 3' (SEQ ID NO. 7); Endkonzentration 300 nM
– ABP-1 Reverser Primer: 5' CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3' (SEQ ID NO. 8); Endkonzentration 900 nM
– ABP-1 TaqMan-Sonde: 5' (FAM-Farbstoff)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRA-Farbstoff) 3' (SEQ ID NO. 9); Endprobenkonzentration 200 nM

Die Kreislaufprotokolle waren:
2 min bei 50°C; 10 min bei 95°C, 1 Zyklus
15 s bei 95°C; 1 min bei 60°C, 40 Zyklen
Relative Bestimmung der Genexpression
Das Vergleichsverfahren verwendet eine arithmetische Formel zum Erreichen des Ergebnisses für die relative Bestimmung ohne Notwendigkeit für eine Standardkurve.
Das in 8 dargestellte Ergebnis zeigt, wie vielfach die Probe X das Ziel relativ zum Kalibrator exprimiert, der die Probe ist, die den geringsten Expressionsgrad des Ziels zeigt. In diesem Experiment wurde die Probe EaHY936 als Kalibrator gewählt.
Antikörper gegen Big-3
Zur Immunisierung von Kaninchen "New Zealand White" wurden 100 μg Big3-GST-Fusionsprotein in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, homogenisiert mit 1 ml vollständigem Freund-Adjuvans (Gibco). Die resultierende Emulsion wurde subkutan am Tag Null injiziert, und diese Behandlung wurde an den Tagen 15 und 28 wiederholt. Blut wurde aus den Kaninchen am Tag 35 entfernt und über Nacht bei 4°C gerinnen gelassen und das resultierende Serum bei –20°C gelagert.
Zur Reinigung von spezifischen Antikörpern wurde Harz-immobilisierter Ligand wie folgt hergestellt: Big3-Polypeptid wurde in 0,1 M Natrium bicarbonat, 0,5 M NaCl, pH 8,3 mit einer Konzentration von 5 mg/ml in einem Gesamtvolumen von 2 ml verdünnt. Dies wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 2 ml Cyanogenbromid-aktiviertem Sepharose CL-4B-Harz (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Harz dreimal in 10 Volumina 100 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7,5 gewaschen. Immunserum wurde mit dem Affinitätsharz für zwei Stunden bei 4°C inkubiert, worauf das Harz in einer 5 ml Glaschromatographiesäule (Bio-Rad, Richmond CA) mit 25 Volumina 100 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7,5 gewaschen wurde. Spezifische Antikörper wurden in 1 ml-Teilmengen mit 100 mm Glycin/HCl, pH 2,8 eluiert. Die Elution von Antikörper wurde durch Überwachen der optischen Dichte bei 280 nm (OD280) verfolgt, und Fraktionen mit einem OD280 von mehr als 1 wurden gesammelt und für 36 Stunden bei 4°C gegen 1 l PBS mit drei Wechseln von Puffer dialysiert (Slide-A-lyzer-Kassetten, Pierce).
Bindung und Signalleitung von Angiostatin über das ABP-1-Protein
9A und 9B zeigen Daten der Bindung von FITC-markiertem Angiostatin an ABP-1-transfizierte HeLa- und EaHy926-Zellen, die mit der Vektorkontrolle transfiziert sind. Insbesondere zeigt 9A die zelluläre Lokalisierung von ABP-1, das an grünes Fluoreszenzprotein (GFP) in transient transfizierten Zellen fusioniert ist. Das Protein kann im endoplasmatischen Retikulum und der Zellmembran nachgewiesen werden. DABP-1 enthält eine 500 bp-Deletion im 5'-Ende des Gens, die die zuvor beschriebene Lokalisierung von ABP-1 unterbricht.
9B zeigt HeLa-Zellen, die mit ABP-1-GFP transfiziert sind. Inkubation mit 2,5 mg Angiostatin für 60 Minuten bei 0°C und anschließende Inkubation für 15 Minuten bei 37°C induziert eine Aufnahme von ABP-1-GFP.
9C zeigt die Bindung von Angiostatin an ABP-1. Wir haben gezeigt, daß Fluoreszeinisothiocyanat-(FITC)-markiertes Angiostatin spezifisch an Endothelzellen bindet (Daten nicht gezeigt). wir haben HeLa-Zellen entweder mit dem ABP-1-Expressionskonstrukt oder der Vektorkontrolle (pRC/CMV, InVitrogen Inc.) transfiziert. Wir inkubierten lebende HeLa-Zellen mit FITC-markiertem Angiostatin (10 μg/ml) in DMEM + 10% fötales Kälberserum bei 0°C für 10 Minuten. Die Zellen wurden dann bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, um gebundenes Angiostatin zu aggregieren. Die Bindung wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die Bindung von Angiostatin wurde in ABP-1-transfizierten Zellen detektiert, aber nicht in der Vektorkontrolle.
9D zeigt die Immunanfärbung von ABP-1 in humanen Nabelschnur-Endothel-(HUVE)-zellen zusammen mit einer Anfärbung gegen F-Actin mit Rhodamin-markiertem Phalloidin.
– Immunanfärbungsprotokoll
HUVE-Zellen wurden in 4% Formaldehyd fixiert, in PBS gewaschen und in 5% Pferdeserum vorgeblockt. Die Blockierungslösung wurde entfernt und durch polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen die Angiostatin-Bindungsdomäne Big3, verdünnt in 5% Pferdeserum, ausgetauscht. Eine positive Anfärbung wurde mit einem Fluoreszenz-markierten sekundären Antikörper (Dako, Inc.) sichtbar gemacht. Rhodamin-konjugiertes Phalloidin (Molecular Probes, Inc.) wurde gleichzeitig mit dem sekundären Antikörper (nach Permeabilisierung mit 1% Triton X100 für 1 Minute) angefärbt. Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen grünes Fluoreszenzprotein wurden als Negativkontrolle verwendet. Zusätzlich konnte keine positive Anfärbung in humanen Fibroblasten nachgewiesen werden.
Wie in 9D ersichtlich ist, ist ABP-1 in fokalen Adhäsionen und Membranfaltungen lokalisiert (Pfeile).
In-vitro-Kinase-Daten
HUVE-Zellen wurden subkonfluent in 5 cm-Petrischalen ausplattiert. Angiostatin wurde mit 2,5 mg/ml zu unterschiedlichen Zeitpunkten am folgenden Tag hinzugegeben. Alle Platten, einschließlich der Kontrollen, wurden gleichzeitig geerntet. Die Zellen wurden in eiskaltem PBS gespült und in 1 ml Lysepuffer inkubiert. Die Zellen wurden in ein Eppendorfröhrchen überführt und mit 14 000 U/min für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein weiteres Eppendorfröhrchen überführt, und 2 μg polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen Big 3 wurden hinzugegeben. Die Proben wurden für 60 min bei 4°C inkubiert, und anschließend wurden 50 μl einer Protein A-Sepharose-Aufschlämmung (Pharmacia, Inc.) hinzugegeben und für weitere 60 min in einem rotierenden Inkubator inkubiert. Die Immunausfällungen wurden durch kurzes Zentrifugieren aufgefangen und zweimal in Lysepuffer, einmal in Waschpuffer und einmal in Kinasepuffer gewaschen. Verbleibender Puffer wurde mit einer Spritze entfernt, und 25 μl Kinasepuffer wurden in jedes Röhrchen zusammen mit 1 μCi gammaATP (Amersham, Inc.) hinzugegeben. Die Proben wurden bei RT für 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 × SDS PAGE-Probenpuffer beendet. Die Proben wurden unter denaturierenden Bedingungen gekocht und anschließend durch SDS-PAGE analysiert. Die in 10 dargestellten Daten zeigen, daß die Zugabe von Angiostatin die ABP-1-assoziierte Kinase aktivität innerhalb von 30 Minuten abreguliert. Dies ist ein direkter Beweis, daß Angiostatin die Signalleitungsstoffwechselwege beeinflußt, die durch ABP-1 vermittelt werden.
ABP-1 vermittelt die Angiostatin-induzierte fokale Adhäsion-Kinaseaktivität
Die durch 11 dargestellten Daten zeigen, daß die Zugabe von 2,5 μg/ml Angiostatin die FAK-Aktivität innerhalb von 1 Stunde nach der Zugabe aufreguliert.
EaHy926-Zellen wurden subkonfluent in 5 cm-Petrischalen ausplattiert. Angiostatin wurde mit 2,5 μg/ml zu unterschiedlichen Zeitpunkten am folgenden Tag hinzugegeben. Alle Platten, einschließlich der Kontrollen, wurden gleichzeitig geerntet. Die Zellen wurden in eiskaltem PBS gespült und in 1 ml Lysepuffer inkubiert. Die Zellen wurden in ein Eppendorfröhrchen überführt und mit 14 000 U/min für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein weiteres Eppendorfröhrchen überführt, und 1 μg monoklonaler FAK-Antikörper (Transduction Lab. Inc.) wurde hinzugegeben. Die Proben wurden für 60 min bei 4°C inkubiert, und anschließend wurde Kaninchen-Anti-Maus-IgG + 50 μl einer Protein A-Sepharose-Aufschlämmung (Pharmacia, Inc.) hinzugegeben und für weitere 60 min in einem rotierenden Inkubator inkubiert. Die Immunausfällungen wurden durch kurzes Zentrifugieren aufgefangen und zweimal in Lysepuffer, einmal in Waschpuffer und einmal in Kinasepuffer gewaschen. Der verbleibende Puffer wurde mit einer Spritze entfernt. 25 μl Kinasepuffer wurden in jedes Röhrchen zusammen mit 1 μCi γATP (Amersham, Inc.) hinzugegeben. Die Proben wurden bei RT für 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer beendet. Die Proben wurden unter denaturierenden Bedingungen gekocht und anschließend durch SDS-PAGE analysiert.
Wie in 11 ersichtlich ist, aufreguliert die Zugabe von Angiostatin die FAK-Aktivität innerhalb einer Stunde. Des sollte bemerkt werden, daß EaHy926-Zellen kein ABP-1 exprimieren, wie es durch eine reverse Transkriptase-PCR-Analyse gezeigt wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Säugetier-Angiostatin-bindendes Protein-1 (ABP-1), das die Kringle-Domänen 1 bis 4 und/oder 5 von Plasminogen binden kann und eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzhomologie von mehr als zumindest 80% mit SEQ ID NOs. 2, 3 oder 4 umfasst.
Protein gemäß Anspruch 1, worin das Protein ein humanes Protein ist.
Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 90% Sequenzhomologie mit SEQ ID NOs. 2, 3 oder 4 aufweist.
Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 95% Sequenzhomologie mit SEQ ID NOs. 2, 3 oder 4 aufweist.
Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 98% Sequenzhomologie mit SEQ ID NOs. 2, 3 oder 4 aufweist.
Protein gemäß Anspruch 5, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 2 umfasst.
Protein gemäß Anspruch 5, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 3 umfasst, worin der Aminosäurerest in Position 135 Asn, Ser oder Asp ist und die drei Aminosäurereste in den Positionen 148 bis 150 das Tripeptid Glu-Leu-Ala oder das Tripeptid Thr-Trp-Pro sind.
Protein gemäß Anspruch 5, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 4 umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die für ein Protein oder Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, das das Protein gemäß Anspruch 6 codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, das das Protein gemäß Anspruch 7 codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, das das Protein gemäß Anspruch 8 codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, das zumindest die Sequenz von Nukleotid 2177 bis Nukleotid 2608 von SEQ ID NO. 1 umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, das die Sequenz von Nukleotid 797 bis Nukleotid 2824 von SEQ ID NO. 1 umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 14, das aus der Sequenz von SEQ ID NO. 1 besteht.
Vektor, der eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 16, der ein Plasmid ist.
Vektor gemäß Anspruch 16, der ein Virus ist.
Rekombinante Zelle, die mit dem Vektor gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18 transformiert oder transfiziert ist.
Antikörper oder Antikörperfragment, der/das spezifisch ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 bindet.
Antikörper gemäß Anspruch 20, der ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Antikörper gemäß Anspruch 20 oder 21 zur Verwendung als Medikament.
Rekombinante Zelle, die den Antikörper gemäß Anspruch 20 oder 21 exprimiert.
Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die mit einem Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 wechselwirken kann.
Proteine, Moleküle, Antikörper oder Antikörperfragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, 9 bis 15 oder 20 bis 21 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung der Proteine, Moleküle, Antikörper oder Antikörperfragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, 9 bis 15 oder 20 bis 21 in der Herstellung eines Medikaments, das auf eine Angiogenese-bezogene Krankheit oder Störung gerichtet ist.
Pharmazeutische Zubereitung, die ein Protein, ein Molekül, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, 9 bis 15 oder 20 bis 21 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.