TWI243852B - Angiogenesis related molecules - Google Patents

Description

1243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（l ) 技術範疇 本發明係關於血管生成之範疇，更特定而言，係關於諸 如蛋白質及肽等新穎分子，藉此開發出新穎抗血管生成物 質。本發明亦關於開發此等物質之方法。 背景 哺乳動物之所有組纖幾乎皆包含極薄血管所形成之綑篩 ，該極薄血管比人類毛髮遷要細。既然包覆血管之内皮細 胞分裂緩慢，此等血管之數目及尺寸事實上可達數年不增 加。傷口癒合及月經等期間則為例外，在該時期血管生長 迅速。不過，這只在有限期間如此，此期間之後細胞分裂 將停止。 從既有血管產生新血管謂之血管新生。已知血管新生與 癌症及腫瘤之生成Μ及其他病症（諸如糖尿病性視網膜病 變、類風濕性關節炎、甚至一些發炎病症）有關。所Μ全 世界正進行可觀的研究，W圖找出預防及抑制血管新生過 程之方法。若此可行，將可控制腫瘤生長及開發出上述病 症之有用治療法。 已有許多證據顯示腫瘤要擴張到超過數mm3之質量取決 於血管之新生成。血管新生藉腫瘤細胞分泌之因子而發動 。新近已發現腫瘤經由不受束縛的蛋白分解活性而產生肽 片段，該肽片段顯示抗血管新生活性。其中之一例為血管 靜止素分子，其為纖維蛋白溶酶原（plasminogen)之一片 段。 纖維蛋白溶酶原為血漿中之一種物質，當其被活化時， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 A7 __B7____ 五、發明說明（2 ) 生成纖維蛋白溶酶（plasinin)或血纖維蛋白溶酶 (fibrolysin)(—種參與血液凝結之酶）。纖維蛋白溶酶 原本身缺乏任何可被檢測之抗-血管新生活性。已發現（第 1頁第28行）該内因性蛋白質之一部份，更特定而言，最初 之四個克林格（kringle)區域能阻止內皮细胞分裂。纖維 蛋白溶酶原之該部分被稱為血管靜止素K及在此領域之許 多研究皆係以此分子為中心。先前技藝顯示血管靜止素在 試管內會特異性抑制内皮细胞K及在活體內會封阻血管新 生。對於SCID小鼠之廣範圍腫瘤，Μ皮下注射之血管靜止 素進行之全身性治療會誘生活體內休止狀態（O’Reilly et al.,Nature Med., vol.2, p.689，1 996)。在此等動物體 内，甚至於治療數月後，皆未檢測到毒性。血管靜止素顯 示二程度之特異性：在試管中，會特異性地在内皮细胞内 誘發细胞自滅（apoptosis) (Claesson-Welsh et a 1.,

Proc· H a t1. A c a d♦ Sci., USA, v o1. 95, p♦5 5 7 9 , 1 998 ) ; M及在活體内只會影響在血管新生方面為活性之 内皮细胞。對於已生成血管之细胞未曾顯示不利的影響。 血管靜止素由於為内生性物質，的確顯示一些有利性質 ，但不可忽略與其可能之醫療用途有關之不利性質。其中 之一為其半生期非常短（M小時計），因此需要經常給藥。 又其效率被證明頗低，因此需要使用大劑量。此二不利性 質本身為促使進一步研究之強烈動機，Μ圖找出可做為藥 劑之較小及/或較有效之替代分子。 發明之簡要說明 ______—--5~=-- 本紙張尺度適用中國國家標·準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂---------線 _----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 A7 _^_B7__五、發明說明（3 ) 本發明藉著提供一種被稱為「ABP-1」之人類蛋白質而 解決前文定義之血管靜止素之相關問題，該人類蛋白質 ΑΒΡ-1係藉其與纖維蛋白溶酶原之片段（較佳其之最初四個 克林格區域Κ1-Κ4)結合之能力而被界定，該片段之特激為 具有抗-血管生成生物活性。 ΑΒΡ-1包含一與序列鑑別編號2虢所示者大體相同之胺基 酸序列。ΑΒΡ-1之變型及片段被涵蓋在本發明之中。 ΑΒΡ-1在其他物種（尤其是其他哺乳動物）中之類似物亦 被涵蓋在本發明之中。 本發明之再一方面提供一種被單離之核酸分子，其包含 編碼ΑΒΡ-1之序列或編碼與ΑΒΡ-1大體相似之多肽（包括其 變型、片段及類似物）之序列。 本發明之另一目的為提供核酸探子，其之序列衍生自序 列鑑別編號1號；此等探子可被用做研究工具Κ及用於診 斷方法中，Μ例如檢測及測量組織及细胞中之ΑΒΡ-1生合 成0 測 檢 中 胞 細 及 織 組 在 種1 供 提 為 的 巨1 之 明 發 本 所 法 方 斷 診 之 量 及 在 存 之 段 片 及 型 變 其 或 P 選 B Sr A 鋪 與該 能。 定法 鑑方 • mHI 8 遵 ο 一 篩式 括之方 包物何 亦合任 明化之 發之知 本用熟 作所 互 交 段 片 及 型 變 其 或 者 藝 技 本 於 精 為 可 法 方 一 節 一 再調再 之能之 明其明 發，發 本物本 合 供 提 為 的 巨

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公釐） 1243852 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _B7__五、發明說明（4 ) 篩選方法鑑定出之化合物Μ做為活性成分。 本發明之又一目的為提供一種能對抗ΑΒΡ-1或其變型及 片段中存在之抗原決定部位之抗體，Μ及製造該抗體之細 胞0 本發明之再一目的為提供一種包含ΑΒΡ-1或其變型及片 段之核苷酸序列之載體。 本發明之再一目的為提供一種含有該上述載體之细胞。 定義 在本申請案，下列術語被用於以下定義之意義中。 在本文中，術語「血管生成」係關於新血管長入組織或 器官中。如上逑，於正常生理條件下，人類及動物只於非 常特定之限制條件下發生血管生成。舉例言之，血管生成 通常係於傷口癒合、胎兒及胚胎發育Κ及黃體及胎盤之形 成時被觀察到。 術語「內皮」係關於内襯漿膜腔、淋巴管及血管之扁平 上皮細胞之薄層。術語「内皮抑制活性」係指具有抑制微 血管内皮细胞生長之能力。 術語「血管生成相關蛋白質j係關於在血管生成中能交 互作用之蛋白質，諸如會與抗-血管生成物質結合之受器。 術語「大體相似」，當用於序列鑑別編號2號，序列鑑 別編號3號及序列鑑別編號4號方面時，意指與序列鑑別編 號2號，序列鑑別編號3號及序列鑑別編號4號具高度序列 類似性之胺基酸序列。高度類似性意指至少約80¾胺基酸 類似，較佳至少約90¾胺基酸類似，更佳至少約95¾胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 一欠一 (請先閱讀背面之注咅心事項再填寫本頁)

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1243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 五、發明說明（5) 類似，最佳至少約9 8 S；胺基酸類似。 術語「特異性雜交」係指當序列K D N A或R N A之複合物混 合物（例如全细胞者）存在時，於嚴苛條件下一分子只與特 定核苷酸序列結合、形成雙倍體或雜交。術語「嚴苛條件 」係指一探子與其標靶序列雜交，但不會與其他序列雜交 之絛件。嚴苛絛件視序列而定Μ及在不同情況將有所不同 。較長之序列在較高溫度下特異性雜交。一般而言，嚴苛 條件係選擇在規定離子強度及ΡΗ值下，比特定序列之熱融 化溫度（Tib)約低5°C之溫度。Tm為平衡時與標靶序列互補 之探子中有50 %與標靶序列雜交之溫度（在界定之離子強度 、pH及核酸濃度下）。（由於標靶序列通常K過量存在，所 Μ在Tib下，於平衡時50¾探子被佔據）。嚴苛條件典型為： 於pH 7.0至8.3下，鹽澹度為低於約1.0M之Na離子，典型 為約0*01至1.0 Μ之Na離子（或其他鹽）；以及對短探子（ 例如1 0至5 0個核苷酸）而言至少為約3 0 °C及對較長探子而 言至少為約6 0 1C。嚴苛條件亦可藉添加不安定化劑諸如甲 醯胺而達成。 圖式之簡單說明 圖1顯示在試管中^ I-標記之血管靜止素及孅維蛋白溶 酶原結合至牛顯微血管内皮細胞上。在橫座標上之單位分 別代表冷血管靜止素及纖維蛋白溶酶原之莫耳過量倍數。 圖2顯示將血管靜止素結合蛋白質單離之策略。 圖3顯示於選擇條件下陽性酵母菌純系（cl〇ne)之生長。 圖4比較重組「Big-3」分別與血管靜止素及纖維蛋白溶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X‘297公釐） _衫- _ n i^i mmmmK 一一· n ϋ I ϋ a^i ^1· ϋ i^i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1243852 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _ B7_五、發明說明（6 ) 酶原之结合。 圖5為「Big-3」之圖譜。 圖6顯示編碼本發明之血管靜止素受器之基因之開放譯 碼區（譯碼區2)。其他可能的譯碼區不會產生任何推定之 蛋白質。 圖7顯示胎兒及成人之inRN A之表琨模式Μ及内皮細胞。 圖8顯示在不同組織中ΑΒΡ-1基因表現之相對定量。綑節 見實驗一節。 圖9例示說明（Α)在被暫時轉染之海拉（HeLa)綑胞中被 GFP標記之ABP-1受器之細胞定位，K及（B)與血管靜止素 一起培育後，GFP標記之ABP-1之重新定位。圖9C顯示血管 靜止素與ABP-1之結合。實驗一節有更詳细之說明。圖9D 為在人類臍帶内皮（HUVE)细胞中ABP_1之免疫染色，K及 用若丹明-標記之鬼筆鹼（rhodaiain-labelled phalloidin)染色之F-肌動蛋白（F - actin)。ABP-1被定位 於局灶性黏附物及膜摺紋中（如箭頭所示）。 圖10例示說明加入血管靜止素後，ABP-1相關之激酶活 性向下調整。 圖11為SDS-PAGE之自動放射照相證明ABP-1媒介血管靜 止素-誘發之局灶性黏附激酶活性。詳细說明見實驗一節 Ο 發明之詳细說明 本發明係關於被單離之人類血管生成-相關蛋白質*其 能結合纖維蛋白溶酶原之片段，較佳Η-終端片段，諸如克 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

訂--- 線_----- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） 9 Ϊ243852 A7 B7 五 、發明說明（ 7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 林格區域1至4及/或克林格5。因此，本發明之蛋白質可做 為纖維蛋白溶酶原片段之受器，尤其是倣為血管靜止素及 /或纖維蛋白溶酶原之克林格5區域之受器。本發明之蛋白 質可藉生物或化學方法（例如重組基因表琨及肽合成法）合 成。重組技術包括藉試管内方法進行基因選殖或擴增，諸 如聚合酶鏈反應（PCR)、粘結酶鏈反應（LCR),基於轉錄之 擴增系統（TAS)或自持序列複製糸統（SSR)。廣泛種類之選 ®及試管内擴增方法為精於本技藝者所熟知。此等技術之 例子例如Berger and Kimmel，分子選殖技術之導引， Methods in Enzyroology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)所逑者°本發明包括包含與序列 鑑別編號2號、序列鑑別編虢3號及序列鑑別編號3號所示 者實質相似之胺基酸序列。序列鑑別編號2號之蛋白質序 列與所有現有資料庫中存在之序列之比較，顯示與新小桿 線蟲（(^661101"1136(1丨1：丨5 61€83115)之推定蛋白質具23.7%類 似性，該蛋白質由位於該生物之染色體III之中央群集中 之推定開放譯碼區編碼（記載於R.Wilson et al., Nature vol. 368， 3 March 1994, ρ· 32-38中）。該推定之蛋白 質沒有功能。 按照上述之定義，當了解所有能與纖維蛋白溶酶原之片 段結合且具有與序列鑑別編號2，3或4號至少約80¾序列類 似性（較佳約90¾序列類似性，更佳約95¾序列類似性K及 最佳約9 8 序列類似性）之胺基酸序列之肽皆被涵蓋在本發 明之內。此等變型可能來自，例如，在相同來源生物之不 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂---- 線----- 1243852 A7 B7 五、發明說明（8 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 同組織中之替代性拼接或表現差異。變型之特微例如為胺 基酸插入、刪除或取代。ABP-1之較佳變型以序列鑑別編 號3號（見下文）例示說明。 本發明之特佳具體例係被稱為Big-3之ABP-1之片段，其 包括ABP-1之血管靜止素-結合區域（序列鑑別編號4號）， 其將於下文被更詳細地說明。 在本發明之另一具體例中，本發明提供包含序列鑑別編 號2號或其任何變型或片段之至少約5個（較佳至少約10個） 連續胺基酸殘基之肽。不過該肽之最有利尺寸視其未來意 欲之用途而定Μ及本發明不限於上述數目之胺基酸殘基。 ΑΒΡ-1及Big-3在其他物種（尤其是哺乳動物）中之類似物 亦被包括在本發明之內。術語「類似物」係指能發揮與本 發明蛋白質簧質相同之生物功能者，而不管對應胺基酸序 列間是否存在類似性。 另一方面，本發明係關於被單離之核酸分子，其包含編 碼本發明之蛋白質及肽（包括上文界定之變型、片段及類 似物）之序列。在一較佳具體例中，核酸分子具有序列鑑 別編號1號之序列。該序列存在有5 ’未轉譯區（核苷酸1至 核苷酸7 96 )及3’（核酸2825至核f酸6 463)未轉譯區。在 另一較佳具體例中，核酸序列編碼被稱為Big-3之ABP-1片 段（K序列鑑別編號4號例示說明）Μ及其包含序列鑑別編 號1號之位置2180至位置2608之核苷酸序列。編碼本發明 之多肽且藉簡併遺傳密碼子而與序列鑑別編號丨號之核苷 酸序列不同之所有核苷酸序列皆被視為本發明之一部份。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

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V 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]0 X 297公釐） 1243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（9 ) 序列鑑定分析顯示在序列鑑別編號1號之密碼子1 199-1 201 中可能存在多形性，其中Asn，Ser或Asp之密碼子可能存 在；另一對應於序列鑑別編號1號之核苷酸位置1 23 8至 1246之區域已被發現編碼三肽Glu-Leu-AU或三肽Thr-Trp 〜Pro。在ABP-1之胺基酸序列中之此等變異Μ序列鑑別編 號3號例示說明，該序列為本發明之另一較佳蛋白質。編 碼ΑΒΡ-1之類似物或其片段之核酸分子亦被包括在本發明 之中。 本發明尚包含於嚴苛條件下，能與上述本發明之任一核 酸分子特異性雜交之核酸。 在本發明之核酸被用作探子之情況，常期望用可檢測之 標記標示該序列。此等標記包括任何可被光譜學、光化學 、生化學、免疫化學、電學、光學或化學方法檢測之組合 物。此等標記可藉精於本技藝人士熟知之諸多方式之一納 人。檢測此等標記之方法亦為本技藝所熟知且被揭示於文 獻中。探子在診斷應用方面有用，例如可被用於檢測及測 量在組織及细胞中之ΑΒΡ-1生合成。 在另一方面，本發明提供一種篩選方法或測定方法，其 中顯示與血管靜止素及/或克林格5栢同性質之分子被篩選 出。在一典型之篩選方法中，能活化血管靜止素訊號轉導 途徑之化合物藉Μ細胞為基礎之高通量篩選法鑑定。該篩 選法依賴被穩定轉染入血管靜止素_反應性细胞中且由血 管靜止素反應性成分所驅動之指示子基因（reporter r gene)。該反應性成分被鐽結於指示子基因（例如螢光素酶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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V 本紙張尺度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -12 - 1243852 A7 __B7__ 五、發明說明（10 ) 基因）；當化合物與本發明之蛋白質結合時*綑胞内途徑 被活化，因此使得可被檢測之指示子基因活性增加。 經由上逑篩選方法鑑定之化合物在本發明之範圍之内。 此等化合物較佳為肽類或非肽類之低分子量分子。歸功於 小尺寸，其比血管靜止素在醫藥用途方面更具實用性。此 等分子及其用途將在下文中被更詳細地說明。 依照發明之蛋白質及肽可使用化學肽合成技術合成。固 相合成見Barany and Merrifield所著之固相肽合成（肽之 合成、分析及生物學第2卷：肽合成之特殊方法，部分A， 3-284頁。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依照本發明之蛋白質、肽及多肽較佳用重組DN A方法合 成，其通常涉及創建一編碼蛋白質或肽之DN A序列，將該 DNA置於由特殊啟動子控制之表現匣中，在宿主中表琨該 蛋白質或肽，簞離被表現之蛋白質或肽，以及若需要將該 產物恢復原狀。重組肽或蛋白質一旦被表琨，可依照本技 藝之標準方法純化。因此，本發明之另一方面為載體，諸 如包含本發明之核酸之病毒或質體。再者，本發明亦涵蓋 用表現本發明蛋白質或肽之載體轉形或轉染之重組细胞， Μ及表現展現抗體之重組细胞，其將在下文中被更詳细界 定。編碼本發明之肽及蛋白質之載體在表現此等分子Μ提 供製造抗體之免疫原上有用。依照本發明之載體亦被用於 在活體内或試管中轉形细胞，以表現本發明之肽及蛋白質 。表現本發明核酸之任一者（諸如序列鑑別編號1號）之細 胞種類廣泛且亦在本發明之範圍内。此等细胞可為原核綑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 1 3 : 1243852 B7

玉、發明說明（11 ) 胞或真核細胞。 f衣照本發明之蛋白質及肽可被用做抗原*以誘生對抗其 本身之抗體ϋ所以本發明亦涵蓋與肽胃胃•结合 體。此等抗體可被用於例如供簞離肽或多肽之免疫測 $中。依照本發明之肽亦可被用於諸如擴増特異性測定及 兔疫測定等含量測定中。 .依照本發明之抗體可為單株或多株，以及包括個體、等 位基因、条或種之變型或其片段’彼等可為天然（全長）形 式及重組形式二者。此外’抗體可被原始構形或非原始構 形之本發明肽或多肽誘生。亦可產生抗-遣傳型抗體。許 多製造抗體之方法為精於本技藝人士所已知。就製備單株 抗體之技術而言’例如見Stiites et al (eds), Basic and Clinical Immunology (4th ed), Lange Medical Publications， Los Altos，CAM及其中引證之參考文獻 。關於在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體庫之技術，例 如見 Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281。 依照本發明之分子可被用於醫藥製劑中，尤其是用於治 (請先閱讀背面之注音〖事項再填寫本頁) 訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印^^ 及發 療本 將 於 關 係 明 發 本 K 所 ο 者 常 異 關 相 成 生 管 血 防 預 或 途 用 之 劑 藥 做 用 體 抗 或成 質生 白管 蛋血 、 抗 肽對 多造 、 製 肽在 之子 明分 等 此 常 異 或 病 疾 關 相 上 劑 藥 之 之上 明為 發可 本子 含分 包 之 其劑 , 藥 物明 合發 組本 藥為 醫做 薄ο 一 劑 於載 關之 亦許 明允 發藥 本醫 。 及 途 Μ 用子 之分 法 方 選 篩 述 上 在 及 Μ 者 1 任 之 體 。 抗質 或物 質穎 白新 蛋何 、 任 肽之 多出 、 定 肽 逑 中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐）

V A7 1243852 _B7_ 五、發明說明（12 ) 所以本發明之最佳用途為用於篩選新穎物質之測定中。 顯示與血管靜止素及/或克林格5相似之抗血管生成作用， 但與血管靜止素相比，較小、較有效率及較佳在人體或動 物體中顯示較長半生期之化合物可被鑑定出。較長之半生 期可能係由於被蛋白酶降解之傾向較低。當一有機化合物 被設計時，本發明之分子被用做「指引」化合物。已知醫 藥活性化合物之模擬物之設計，為根據「指引」化合物開 發藥劑之熟知途徑。常使用模擬物之設計、合成及測試， 如此可避免為尋找標靶性質而隨機篩選大量分子。 因此，此等新穎分子較佳被用做藥劑且此等藥劑可Μ遠 低於血管靜止素之劑量投與且可以較少頻率投與，諸如14 天1次，而血管靜止素之半生期約短10倍。在一特別具體 例中，依照本發明之篩選方法鑑定出之新穎分子為低分子 量有機分子，在該例中醫藥組合物可被製成供口腋者，諸 如錠劑。 不過，依照本發明之醫藥組合物可被製備成供任何途徑 給藥者，例如供口服、靜脈内、皮廢或皮下、鼻内、肌内 或腹膜腔內給藥者。載劑或其他成分之性質視特殊投藥途 徑而定。（在此範圍有用之技術及方法之例子見 Remington !s Pharmaceutical Science, 16^ edition, 0 s o 1 . A (ecL)，1980)ΰ 此等低分子量化合物之劑量視欲被治療之病態或病症M 及其他臨床因子諸如人類或動物之體重及狀況Μ及化合物 之投與途徑而定。為了治療人類或動物，化合物之投與劑 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2】0 X 297公釐) - 15 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 線丨^----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1243852 B7 一-^ 五、發明說明（13 量在約0*5« $ 7公# 11 S $ 500胃& /公#胃S & K 〇 之化合物及方法利於用在所有與血管生成相關之 胃MS：/或疾病上，諸如腫瘤、糖尿病、類風濕性關節炎 > 些發炎疾病，諸如乾癖、腸之慢性炎症及氣喘等 #胃_示彼等可被用於治療、治癒或預防肥胖。 在特殊具體例’本發明分子被用於° 因療法之總 I? ’ Μ $B 見 Anderson, Science (1992) 256: 808-8 1 3。 本發明之再一優點為開發在身體内調節血管靜止素及/ 或克林格5受器之傳信’活性之方法’所Μ本發明亦台 療罹患血管生關疾病或異常2人胃患、^去 ，以及預防此等病症之方法。 實驗 在下文中，本發明將參照圖式被更詳细之說明。 在本說明書中之所有參考文獻皆被納入本申請案中。 血管靜止素與内皮細胞結合之證據 藉著血管靜止素與血管生成因子VEGF及bFGF間之競爭性 結合測定，本發明者已證明血管靜止素不會影響此等分子 之配位體-受器交互作用。於存在或不存在未被標記之血 管靜止素下檢測到相同量之结合。因此，可K排除血管靜 止素會封阻血管生成因子與內皮细胞之交互作用之可能性。 血管靜止素及其先質纖維蛋白溶酶原之直接結合曾藉使 用碘化蛋白質之結合測定而被研究Μ及用牛微血管内皮细 胞分析其交互作用，見圖1。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4·規格（210 X 297公爱1 一 1 6二 - ------------V!备-------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 線一----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（u) 更特定而言，將人類血管靜止素（將克林格卜4)或纖維 蛋白溶酶原按照廠商（皮爾斯公司）之說明書藉10008611法 用破125標記。然後將被標記之蛋白質在G50瓊脂糖管柱（ 皮爾斯公司）中純化。特異性活性以90 000 CPID/ng蛋白質 評估。為進行結合测定，將牛微血管內皮细胞在12凹穴平 皿中生長至匯合程度。將該细胞用含1毫克/毫升牛血清 白蛋白（BSA)之PBS沖洗。然後將细胞與1〇毫微克/毫升放 射線-標記之血管靜止素或纖維蛋白溶酶原一起培育。以 增加濃度之未被標記配位體競爭該结合。將該细胞在冰上 培育2小時。然後將細胞用P&S + 1毫克/毫升BSA沖洗5次。 將细胞用在PBS中之1¾ Triton X 1〇〇溶裂Μ及在伽瑪記數 器中測量放射活性。用RBINDING程式評估解離常數及受器 數目（van Zoelen EJ. Anal. Biochem* 1992 Feb* 1； 200 (2 ) ：39 3-9 ) 〇 使用酵母菌二雜交系統鑑定血管靜止素結合分子 血管靜止素甚至於遷原後仍維持活性，此暗示三度空間 摺疊對於結合及活性並不重要。此利於大數目純系被篩選 之篩選方法，惟蛋白質再交叠可能較不精確。 酵母菌二雜交系統被用於會篩選結合纖維蛋白溶酶原之 克林格區域1-4之分子。在下文將參照圖2進一步揭示該糸 統。從得自人類胎盤之二雜交eDN A庫篩選出約2x1 個純 系（史崔特基因公司）。陽性純系Μ下列方式鑑定： (1)在選擇條件（His-，Leu-及TrP-)下篩選，在酵母菌 菌株C G 1 9 4 5中得到3 7陽性純系。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） 一 17 - --------訂·--------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 五、發明說明（15) (2) 37純糸中之7個純系與ONPG(西格瑪公司）於30 °C培育 2小時後，顯示高/S -半乳糖苷酶活性。 (3) 將得自該含高冷-半乳糖苷酶活性之7個純糸之DNA純 化及再轉染入酵母菌菌株Y190中。該7個純系中之3個在新 穎酵母菌菌株中保持活性。此等純系之定序分析顯示其衍 生自相同基因。 (4)在Big3纯系中評估於存在50 fflM 3-胺基三唑時之生 長（圖3)K及高泠-半乳糖苷酶活性（見下表），並與陽性及 陰性對照組比較。 結合區域 活化區域 高/9 -半乳糖 苷酶活性 血管靜止素+結合區域 B i g -活化區域 15 ^ 血管靜止素+結合區域 單獨的活化區域 < 0.04// 單獨的結合區域 B i g -活化區域 0.07 u p 5 3 +結合區域 B i g _活化區域 0 · 0 5 w p53 +結合區域 SV40LT-活化區域 90 u

Big 3 (血管靜止素-結合區域）之序列 從胎盤酵母菌二-雜交庫（史崔特基因公司）簞離Big 3純 系後，吾人用GAL4 AD定序引子直接決定得自PGAD活化區 域載體之cDN A插子之序列。將cDN A插子用得自接頭之 EcoR I部位再選殖入PUC18載體中以及用通用及反向引子 反覆決定序列。KALF自動定序器（法瑪西亞公司）分析序 列。B i g 3之序列被示於序列鑑別編號4號中。

Big 3及Big 3-GST融合蛋白質之表現及純化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]0 X 297公爱1 - 18 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 1243852 _B7__ 五、發明說明（16)

Big 3序列在大腸桿菌中，Μ與得自日本血吸蟲之穀胱 甘肽移轉酶（GST)區域之融合蛋白質形式被表現。 ♦載體構築： 用pUC18-BU 3質體做為模板，K PCR擴增法獲得Big 3 片段（429 bp)。引子序列為：

BamHI-HHz 5' TAC GCA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 31 (序列鑑別編號5號） XhoI~C00H 5 1 ΑΤΑ CTC GAG TCA TGG AGC TGG ACT TGG AGC CA 3， (序列鑑別編號6號） 所用之循 環方案為： 94¾ 3， ，60oC 1 1 * 72V 1 1 1循環 94¾ 30 ’ *，60 t： 1 ·，721C 2 ’ 30循環 9 4°C 30 '1 · 60 °C 72 V 5 ' 1循環

Tag聚合物酶：原始Pfu DN A聚合物酶（史崔特基因公司）。 PCR片段用BainHI及 X h ο I消化，純化及粘接於用相同限 制酶消化之PGEX-6P-2質體（法瑪西亞生物科技公司）上。 粘接混合物被用於轉形XU-Blue細胞（史崔特基因公司）。 重組質體藉限制酶分析及自動序列決定證明。 •表現及純化： 將DH5oc細胞（克隆技術公司）用一被命名為PGEX-Big3之 已被證明之純系轉形，以及於室溫用0. 1 ϊπΜ IPTG誘生6小 時。 將發酵培養液於4000 r pm離心15分鐘Μ及將细胞小丸再 懸浮於10¾ w/v溶裂用緩衝液中（50 inM TRIS HC1 ρΗ8.0， 才、紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐一 1 9 一 ___________! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 111111. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 線一----- A7

1243852 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（17) inM “Cl, 20 mM DTT，IroM EDTA，蛋白酶抑制劑混合 物），Μ及藉超音波溶裂。將全部溶裂物於1 5000 χ 8及4 °C離心20分鐘。將澄明之上清液加到以溶裂用緩衝液預先 平衡之穀胱甘肽-瓊脂糖管柱中（對於20毫升溶裂物’用1 氅升）。將樹脂用10管柱體積（cv)之溶裂緩衝液沖洗以及 融合蛋白質用3CV之溶析緩衝液TRIS HC1 pH 8.0 ’ 20ιπΜ遷原穀胱甘肽）溶析。 GST-Big3蛋白質可藉著將穀胱甘肽-瓊脂糖結合之融合 蛋白質與20微升/毫升PreScission蛋白酶之樹脂在含50 πιΜ TR IS HC 1 pH 7 · 0，NaC 1，IfflM EDTA ’ IibMDTT * 1 ffi Μ P M S F )之P S緩衝液中培育而斷裂得到。 被溶析出之蛋白質在γρ-HPLC(10-9 0!i：梯度之乙腈/水 + 0.UTFA)中之行為如同簞峰，此顯示質量分析（電子噴霧 )所預期之分子尺寸Μ及正確的Nfk序列。在SDS-PAGE中， 一污染物在80 kD之擬似分子量處出現，其被證明為DnaK ’ DnaK為一種细菌唇基（chaperone)，其可藉著在HiTrap 管柱上進行離子交換層析而去除。 從1公升發酵物得到之產量為約10毫克之GST-Big3融合 蛋白質及約3毫克之斷裂Big 3。 1試管中重組GST-標記之Big 3與血管靜止素之結合 用於結合之方案被逑於下文。 PGEX-Big 3轉形體之一群落被接種入1〇毫升LB培養基+ 安比西林中，並於37¾培育整夜。 將隔夜之培養物用100毫升新鮮培養基稀釋成i : 10，於 ί紙張尺^適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公H ~ 2 0 - " -I n n ϋ —.1 n ϋ i.— i^i 1· mu —a— 1^1 aa_i I a^i 1 ϋ · n ϋ ϋ ϋ ϋ I I I —.1 ϋ· in (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（18) 3 7°C培育1小時後，加入IPTG並使最終濃度為〇. 5 mM，然 後繼續培育3至7小時。 繼而將培養物於5000g離心10分鐘，將小丸再懸浮於3 - 5 毫升Μ冰冷卻之PBSM及细胞藉超音波溶裂。加入Triton X 至終濃度為0.5-1¾，以及將1.5毫升份之懸浮液於14000 rpin離心10分鐘。 將榖胱甘肽-瓊脂糖珠粒之50¾流漿0 , 1-0 . 3毫升加到上 清液中並於4 °C混合4-5小時。然後藉離心收集珠粒Μ及用 冰-冷卻之PBS沖洗5次Κ及用結合溶液（B.S.)沖洗二次， 其中結合溶液由 50 mM TRIS pH 7,5，150 inM NaCl , 0,5mM EDTA， lmM DTT及 lmM PMSF組成。 結合測定：將0.7毫升B.S.，0,1¾牛血清及500毫微克血 管靜止素與Big3-固定之榖胱甘肽-瓊脂糖珠粒之50 Γ流漿 3 0-50微升於4°C混合1-3小時。 將樹脂用冰冷卻之B.S.沖洗5-7次，然後用於採用抗-人 類纖維蛋白溶酶原抗體（達寇公司）之西方氐吸潰分析。 圖4顯示在試管中純化之重組Big3如何與血管靜止素結 合。令人感到興趣者，亦檢測到纖維蛋白溶酶原之结合， 但只有在用DTT處理使二硫鐽遷原後才會檢測到。 全長序列之選殖 圖5例示說明選殖ABP-1之全長序列之圖式。完整基因藉 用Big3探子（反覆序列已被移除）篩選胎盤cDNA噬菌體庫Μ 及用來自人類肚臍内皮綑胞之mR ΝΑ進行5 ’ RACE PCR (吉伯 可公司）而選殖。CD ΝΑ純系之全長被揭示於序列鑑別編號1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 一 21 - 1243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

五、發明說明（19 ) 號*而被編碼之蛋白質被示於序列鑑別編號2號。實驗方 法被詳綑說明於下。 具1000萬個純系之胎盤λ噬菌體庫（史崔特基因公司）用 Big3之Hinfl片段做為探子。DNA分離及南方氏吸濱方法按 照已確立之方法進行（Sambrook et al 1989)。吾等單離 得5株具有與Big3交叠之序列之純系（7-1，7-2，8-2，9-3 ，9-5)。7-2純糸之5 序列被用於設計供5 ’ RACE PCR用 之基因-特異性引子（GSP)(吉伯可生命技術公司）。單離自 人類肚臍內皮细胞之mRN A被用於鑑別V序列。 第一次RACE PCR所用之引子： 引子：GSPl-(5,至 3，） GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT (序列鑑別編號10號） GSP2-(5，M3，）CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA (序列鑑別編號1 1號） GSP3-（5,至 3，）TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTT CCG (序列鑑別編號12號） RACE方法被用於擴增及選殖GSP2及GSP3與mRNA ABP-1之 5 端間之未知序列。該序列然後被用於設計下一組RACE PCR之新穎引子。 引子：GSPl-(5*至 31) GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC (序列鑑別編號13號） GSP2-（5,至 3，）GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA (序列鑑別編號14號） GSP3-(5,至 SJGAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-------- 線_丨！ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 一 22 - 1243852 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適闬中國國家標準（CNSM4規格（2〗0 X 297公釐） A7 B7_ 五、發明說明（2〇) (序列鑑別編號1 5號） 單離具有重疊序列之純系A2-2，A2-1及A1-C。A2-1序列 被用做第二次篩選胎盤噬菌體庫之探子。從該篩選吾等單 離得另外2純糸（7_10及6-5)。如圖6所示，在6個可能之譯 碼區中，唯——個產生完整開放譯碼區者為譯碼區2,其 得到具有67 5個胺基酸殘基之推定蛋白質。 jnRNA表現模式 探索市售（克隆技術公司）之多個人類成人及胎兒組織 (#7760-1及#7756_l)aiRHA吸瀆物是否具有ABP-1。按照廠 商之方案將吸濱物與Ex press Hyb雜交溶液（克隆技術公司） 雜交。吸潰物用7-2 5*Pst/片段探索。圖7顯示實驗之結果 ;尺寸為9, 5及7 , 5kb。 在人類肚臍、牛主動脈及牛微血管内皮綑胞中亦撿测到 ABP-1 〇在不死化内皮细胞糸EaHy926及人類胎兒纖維母綑 胞中未撿測到表規或檢測到極微表琨。沒有任何一個細胞 系回應血管靜止素或顯示FITO標記之血管靜止素之任何 結合。

iA_a 1 time RT-PCR P核酸酶測定（TaqMari測定）使用不可擴展的寡核f酸雜 交探子（Ta<?Man探子）。TaqMan探子由具有5，-報信子染料 及3’-制止子染料之寡核苷酸組成。當探子完整時，報信 子染料與制止子染料之接近性造成報信子螢光之抑制（主 要藉Foster型能量移轉）。在PCR期間，正向及逆向引子雜 交於標靶DHA之特異性序列上。TaqMan探子與PCR產物中之 - 23 二 .ϋ I I ϋ 1 ·ϋ^OJ· t— 1 ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線一---- 1243852 A7 B7 五、發明說明（2 1) 標靶序列雜交。Taq聚合酶藉其5 ’ -3 ’核酸酶活性打斷 TaqMan探子。斷裂時，報信子染料與制止子染料分離，而 造成報信子之螢光增加。

Rea 1 t i sie RT-PCR 分析 RMA製備 f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·111111 線—華 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 來自下表所列組織及细胞之全部RNA之分離及純化用 Ultraspec RHA單離系統（Biotex)進行。 HDMEC/2 人類真皮微血管EC Poly A + A2780 人類卵巢癌 全部 A375 人類黑色素瘤 全部 HDF 人類真皮纖維母细胞 全部 海拉 人類子宮頸癌 全部 DU145 人類前列腺癌 全部 HU VEC 人類臍靜脈EC 全部 ECV304 不死化EC 全部 CEM 人類急性淋巴球白血症 全部 K562 人類紅白血症 全部 JURKAT 人類急性T-细胞白血症 全部 THP - 1 人類單核球急性白血症 全部 EaHy926 人類真皮细胞 全部 S35/K9 人類結腸癌 全部 腦 人類正常組織 全部 結腸 人類正常組織 全部 前列腺 人類正常組織 全部 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公爱） 五、發明說明（22 ) 人類正常組織 全部 子宮 人類正常組織 全部 胎盤 人類正常組織 全部 cDNA合成 RT反應用TaqMan反向轉錄試劑（PEJB用生物斧、統）進行’ 其中Μ隨機六聚體為RT引子。反向轉錄步驟之反應體積為 100微升以及全部RNA之量為1微克’其被做為樣品° RT用下列循環參數進行： 於 251C 1〇， 於 48¾ 45， 於 9 5 Ό 5 ’ PCR反應 引子濃度最適化後，用TaqMan通用PCR主混合物 (Ta q Ma n Universal PCR Master Mix’ ΡΕ應用糸統）及下 列寡核苷酸對l〇毫微克cDNA進行PCR反應。 .ABP-1正向引子：5，GTTTGACCTGCAATCCAGACAA3f (序 列鑑別編號7號），終濃度：300 nM。 ♦ ABP-1逆向引子·· 5fCCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3’ (序列鑑別編號8號），終濃度：900 η Μ ♦ ΑΒΡ- 1 TaqMan探子： 5f (FAM染料）-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRA染料）3^ (序列鑑別編號9號），最終探子濃度：200 η Μ 〇 循環方案為： -2 5 .丨丨丨丨丨丨丨·丨丨丨丨丨丨丨· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 __B7_ 五、發明說明（23 ) 於50°C 2,及於95°C 1(Γ，1循環 於 95°C 15 "及於 601C 1 *，40循環 基因表現之相對定量 比較方法使用算數式，Κ於不使用標準曲線下達到相對 定量之結果。 結果（被示於圖8中）Κ樣品X表現標靶之程度為校正子表

I 現標靶程度之倍數來表示，其中校正子為顯示最低度標靶 表現之樣品。在該實驗中，EaHY926樣品被選做為校正子。 對抗Big-3之抗體> 為了將紐西蘭白兔免疫，將100微克Big3-GST融合蛋白 質溶於磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)l毫升中，並用1毫升福勞 德（Freunds)完全佐劑（吉伯可公司）均質化。於第〇日皮 下注射生成之乳液Μ及於第15及28日重覆該治療。於第35 日將血液從兔中移出，謅其於41C凝固整夜Μ及生成之血 清被貯存於-20°C。 為了純化特殊抗體，如下述製造被樹脂-固定之配位體 :Big3多肽用0.1M碳酸氫鈉，0.5M NaCl，pH 8.3稀釋， 以使2毫升總體積中之濃度為5毫克/毫升。將其與2毫升溴 化氮-活化之瓊脂糖CL-4B樹脂（密蘇里卅聖路易市西格瑪 化學公司）於室溫反應2小時。反應後，將樹脂用10體積之 100 inM Tris，500 inM NaCl, pH 7·5 沖洗 3次。將免疫血 清與親和樹脂於4 1C培育2小時，之後，將該樹脂在5毫升 玻璃層析管柱（加卅里其蒙市Bio-Rad公司）中用25體積之 ΙΟΟιηΜ Tris，500 mM NaCl, pH7.5沖洗。特殊之抗體用 紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗〇χ 297公釐) - 26 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1243852 經濟部智慧財產局員工消費合作社印則衣 五、發明說明（24 ) 100 ΗϊΜ甘胺酸/ HC1’pH2.8溶析出’得到1毫升份。抗體 之溶析藉監測280 η Μ之光密度（0D280)而追蹤’以及將 0D280大於1之溶析份匯集及於對1公升之PBS透析36小 時（使用皮爾斯公司之S1丨de - A-lyzer cassettes) ’其中 更換緩衝液3次。 血管靜止素經由ABP-1蛋白質之結合及傳信 圖9A及9B顧示FITC-標記之血管靜止素與用ABP-1轉染之 海拉及用載體對照組轉染之EaHy 926綑胞之结合資料。尤 其圖9A顯示在被暫時性轉染之细胞中與錄色螢光蛋白質 (GFP)融合之ABP-1之细胞定位。蛋白質可在內質網W及细 胞膜中被檢測到。DABP-1在基因之5’端含有500 bp刪除部 位，該部位會干擾ABP-1之前逑定位。 圖9B顯示用ABP-1GFP轉染之海拉细胞。於0°C與2·5毫克 血管靜止素一起培育60分鐘，繼而於371C培育15分鐘，此 誘使ABP_1-GFP之内部化。 圖9C顯示血管靜止素與ΑΒΡ-1之結合。吾人曾證明螢光 異硫氟酸酯（FITC)-標記之血管靜止素與内皮细胞特異性 結合（未顯示其數據）。吾等曾用ΑΒΡ-1表現構築體或載體 對照組（pRC/CMV，In Vitrogen， Inc.)轉染海拉细胞。 吾等於Ot：下在DMEM + ΙΟίϋ牛胎血清中培育活海拉细胞FITC-標記之血管靜止素（10微克/毫升）歷60分鐘。然後將细胞 於37 1C培育15分鐘K凝聚結合之血管靜止素。結合用螢光 顯微鏡分析。血管靜止素之結合在被ABP_1轉染之綑胞中 檢測到，但在載體對照組中未被檢測到。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 一 一 ------------^-----訂---------線丨^^· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 A7 ^_B7__ 五、發明說明（25) 圖9D顯示在人類臍帶内皮（HUVE)細胞中ABP-1之免疫染 色’ Μ及K F-肌動蛋白為背景用若丹明—標記之鬼筆鹼免 疫染色。 •免疫染色方案： 將HUVE细胞用4¾甲醛固定，用PBS沖洗及用5¾馬血清預 封胆。將封阻溶液移除Μ及用對抗血管靜止素-接合區域 Big3之兔多株抗體（用5¾馬血清稀釋）置換。用螢光-標記 之第二抗體（達寇公司）使陽性染色顯現。若丹明-標記之 鬼筆鹼（分子探子公司）同時用第二抗體染色（在用1¾ Triton X 1〇〇使之可滲透化後進行）。對抗綠色螢光蛋白 質之兔多株抗體被用做陰性對照組。此外，在人類纖維母 ®胞中未檢測到陽性染色。 如在圖9D中所見，ABP-1被定位於局灶性黏附物及膜摺 &中（如箭頭所示）。 中之激酶數據 將Huve细胞平面接種於5釐米佩曲皿中並讓其生長至尚 未達匯合之程度。於次日，在不同時點加入2.5毫克/毫升 之血管靜止素。同時收取所有包括對照組之平皿。將綑胞 用冰冷之PBS清洗K及在1毫升溶裂用緩衝液中培育。將细 @移至愛潘道夫管（eppendorf t u b e )中Μ及於1 40 0 0 r p m 及4 °C離心5分鐘。將上清液移至另一愛潘道夫管中M及加 λ2微克之Big3兔多株抗體。將樣品於4 °C培育60分鐘，繼 $加入50微升之蛋白質Α瓊脂糖流漿（法瑪西亞公司）並在 _轉培育器中再培育60分鐘。免疫沉澱物藉短暫雛心收集 本、·氏張尺’足適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 2 8 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 1243852 _B7___ 五、發明說明（26 ) K及Μ溶裂緩衝液沖洗二次，K洗滌緩衝液沖洗一次及Μ 激酶緩衝液沖洗一次。殘餘緩衝液用注射統移除。將25微 升激酶緩衝液連同lwCi7 -ΑΤΡ (愛默夏姆公司）加到各試 管中。將樣品於室溫培育20分鐘。該反應藉加入2 X SDS PAGE樣品媛衝液終止。將樣品於變性條件下沸騰K及繼而 藉SDS PAGE分析。 圖10記載之數據顯示血管靜止素之添加在30分鐘内向下 調節ABP-1相關之激酶活性。此為血管靜止素影響ABP-1媒 介之傳信途徑之直接證據。 ABP-1媒介血管靜止素-誘發之局灶性黏附激酶活性 圖11所記載之數據顯示添加2.5微克/毫升之血管靜止素 在添加後1小時内向下調節FAK活性。 將EaHy 926细胞平面接種於5釐米佩曲皿中並讓其生長 至尚未達匯合之程度。於次日，在不同時點加入2.5毫克/ 毫升之血管靜止素。同時收取所有包括對照組之平皿。將 细胞用冰冷之PBS清洗以及在1毫升溶裂用緩衝液中培育。 將細胞移至愛潘道夫管（eppendorf tube)中Μ及於14000 rp π»及4 °C雛心5分鐘。將上清液移至另一愛潘道夫管中Μ 及加入1微克之FAK單株抗體（轉導實驗公司）。將樣品於4 °C培育60分鐘，繼而加入兔抗-鼠IgG + 50微升之蛋白質A 瓊脂糖流漿（法瑪西亞公司）並在旋轉培育器中再培育6 0分 鐘。免疫沉澱物藉短暫離心收集K及K溶裂用鍰衝液沖洗 二次，K洗滌媛衝液沖洗一次及Μ激酶緩衝液沖洗一次。 殘餘緩衝液用注射統移除。將25微升激酶緩衝液連同1/i 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） _ 29 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·11111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 線«·-------- [243852 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（27 C i 7 -ATP (愛默夏姆公司）加到各試管中。將樣品於室溫 培育20分鐘。該反應藉加人2 X SDS PAGE樣品緩衝液終止 。將樣品於變性條件下沸騰Μ及繼而藉SDS PAGE分析。 如圖11所示，血管靜止素之添加在1小時內向下調節FAK 活性。應注意如反向轉錄酶PC ϋ分析所證明者，Ea H y9 2 6 细胞未表現ABP-1。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅心事項再填寫本頁)

30 1243852 A7 A7 B7 五、發明説明（28) 序列表 <110> :法瑪西亞及厄普約翰瑞典公胃 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <12〇>血管生成相關分子 <130> pctphal856 <140> <141> . <150> SE9804372-2 <151> 1998-12-17 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6463 <212> DNA <213>人類 <220> <221> CDS <222> (797).. (2824) <400> 1 ccaggagctg ccttggcagt cacgcccctt tggtagaccc cctgaattac tcctccatct tctctccgcc tccccctcaa ctaccaccac tgctccaccc tctggcccgg tatcctgcct agcagcgagg aggggagcag ccgggagttg ggcccgggac cgaagccact tgagcgagca agggagctgc taagaaggac aaataagata aggaaggctg agaaactaaa ggccagcgca ctcgcagcct cacagcccta cttcttctct atctccacca tccactagat tgtctcctgc ccattcagct cacctgccta ggccgcagca ggatcattac cgtctctccc aacctggcct ccttccgagg ccgctctctt ctccagtcag gtccgctgcc gggcttcccc gagagtcgtc gcagagtgaa ggacatctca gacctctggg ccgacacccc gcatttcctt gagtcagcag agctttctgg tcgcctcctc tctcgcctcc accaaggaga cctgcccatc accttgtctt agagcttttg ttgccattgt gggtccttgc ttggtcccaa cctaatcagg cagcagcaac ctgcctaaac 60 ttctcttagt 120 ggctatccgc 180 gcccggacgg 240 cctggccgct 300 ctttgccttc 360 tctccttaga 420 cagccaggaa 480 ccttgctaca 540 accagggaga 600 ctcaccaggg 660 agcagcagca 720 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇X297公釐） -31 - 五、發明説明（29 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 A7 B7 gcaccatcat caccatcacc accaacaaca gcagcagcag cagccacagc agcagccagg 780 agaagcctat tcagct atg cct egg get cag cca tee tet get tet tat cag 832 Met Pro Arg Ala Gin Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gin 15 10 cca gtg cca gca gac cct ttt gee att gtt tee aga gee cag cag atg 880 Pro Val Pro Ala Asp Pro Phe Ala lie Val Ser Arg Ala Gin Gin Met 15 20 25 gtt gag ate etc tea gac gag aac egg aac ttg agg caa gag ttg gaa 928

Val Glu lie Leu Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Ara Gin Glu Leu Glu 30 35 40 gga tgc tat gag aag gtg gca aga ctg cag aag gtg gag aca gaa ate 976

Gly Cys Tyr Glu Lys Val Ala Arg Leu Gin Lys Val Glu Thr Glu lie 45 50 55 60 cag ege gtc teg gag gca tat gag aac etc gtg aag tea tee tee aaa 1024 Gin Arg Val Ser Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys 65 70 75 aga gag gee eta gag aaa gee atg aga aac aag eta gag ggc gag att 1072 Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu lie 80 85 90 c99 a99 atg cat gat ttc aac agg gat ctg aga gag cgt eta gag act 1120

Arg Arg Met His Asp Phe Asn Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr 95 100 105 gee aac aag cag ett gca gag aag gaa tat gag ggg tea gag gac acc 1168 Ala Asn Lys Gin Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr 110 115 120 asa acc ate teg cag etc ttt gca saa aaa gsa sgc cag cgt 1216

Arg Lys Thr lie Ser Gin Leu Phe Ala Lys Asn Lys Glu Ser Gin Arg 125 130 135 140 gag aag gag aag ctg gaa geg gag ctg gee act gee cgt tet acc aat 1264 Glu Lys Glu Lys Leu Glu Ala Glu Leu Ala Thr Ala Airg Ser Thr Asn 145 150 155 gag gac caa aga ega cac ate gaa ate ega gat cag gee ctg agt aat 1312 Glu Asp Gin Arg Arg His lie Glu lie Arg Asp Gin Ala Leu Ser Asn 160 165 170 gee cag gee aag gtg gta aag ctg gaa gaa gag ctg aaa aag aag caa 1360 Ala Gin Ala Lys Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gin 175 180 185 本紙張尺度適用中國國家標準（CpS ) A4規格（210X297公釐） -32 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1243852 A7 B7 五、發明説明（30 ) gtg tac gtt gac aag gtg gag aag atg cag cag gcc ctt gta cag etc 1408

Val Tyr Val Asp Lys Val Glu Lys Met Gin Gin Ala Leu Val Gin Leu 190 195 200 cag gca gca tgt gaa aaa cgt gag cag eta gag cac cgt etc egg aca 1456

Gin Ala Ala Cys Glu Lys Arg Glu Gin Leu Glu His Arg Leu Arg Thr 205 210 215 220 ega ctg gag agg gaa ctg gaa tee ctg aga ate cag cag cgt cag ggc 1504

Arg Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ser Leu Arg lie Gin Gin Arg Gin Gly 225 230 235 aac tgt cag ccc acc aac gtt tea gaa tac aat get gcc gca ctg atg 1552

Asn C!ys Gin Pro Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met 240 245 250 gag etc ctt egg gag aaa gag gag agg att ctg get ctg gaa get gat 1600

Glu Leu Leu Arg Glu Lys Glu Glu Arg lie Leu Ala Leu Glu Ala Asp 255 260 265 atg aca aag tgg gag cag aaa tat ttg gag gag aat gtg atg aga cat 1648

Met Thr Lys Trp Glu Gin Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His 270 275 280 ttt get ctg gat get get gca act gtg get get cag agg gac aca aca 1696

Phe Ala Leu Asp Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gin Arg Asp Thr Thr 285 290 295 300 gtc ate agt cac tet cct aac acc age tat gac aca get eta gaa get 1744

Val lie Ser His Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala 305 310 315 ege ate cag aaa gag gag gaa gaa ate ttg atg gcc aat aag cgt tgc 1792

Arg lie Gin Lys Glu Glu Glu Glu lie Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys 320 325 330 ctt gac atg gag ggc agg att aag acc etc cat gcc cag att att gag 1840

Leu Asp Met Glu Gly Arg lie Lys Thr Leu His Ala Gin lie lie Glu 335 340 345 aag gat gcc atg ate aaa gta etc cag cag cgt tee egg aag gag ccg 1888

Lys Asp Ala Met lie Lys Val Leu Gin Gin Arg Ser Arg Lys Glu Pro 350 355 360 age aag aca gag cag ctg teg tgc atg egg cca geg aag tet ctg atg 1936

Ser Lys Thr Glu Gin Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met 365 370 375 380 tee att tee aat get gga tea ggc ttg etc tee cac tea tee acc ctg 1984

Ser lie Ser Asn Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu 385 390 395 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IOX297公釐） / (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 A7 B7 五、發明説明（31) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) act ggc tcc ccc ate atg gaa gaa aag ega gac gac aag age tgg aag 2032 Thr Gly Ser Pro lie Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys 400 405 410 ggg age eta ggc att etc ctg ggt gga gac tac cgt get gaa tat gtc 2080 Gly Ser Leu Gly He Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val 415 420 425 ect tec aca ccc teg cct gtg cca ccc teg act ccc ctg etc teg get 2128 Pro Ser Thr Pro Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala 430 435 440 cac tec aag aca ggc age ega gac tgc agt acc caa act gaa cgt ggg 2176 His Ser Lys Thr Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gin Thr Glu Arg Gly 445 450 455 460 aeg gaa teg aac aaa act gca get gtt get ccc ate tet gtt cct get 2224 Thr Glu Ser Asn Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro lie Ser Val Pro Ala 465 470 475 cca gtt get get gee gee act get gee gee ate act gee act get gee 2272 Pro Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala lie Thr Ala Thr Ala Ala 480 485 490 acc ate acc acc acc atg gta get get get cca gtt get gtt get get 2320 Thr He Thr Thr Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala 495 500 505 get get get cca get get get get gee ccg tet cca gee act gee get 2368 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala 510 515 520 get act get get get gtt tet cca get get get ggt cag att cca get 2416 Ala Thr Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gin lie Pro Ala 525 530 535 540 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 get gee tet gtt gee tea get get gee gtt get cct tet get get get 2464 Ala Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala 545 550 555 get get get gtt cag gtt get cca get get ccg get cca gtt cca get 2512 Ala Ala Ala Val Gin Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala 560 565 570 ccg get ctg gtt ccg gtt cca get cca gca geg get cag get tet get 2560 Pro Ala Leu Val Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gin Ala Ser Ala 575 580 585 cct get cag act cag gca cca act tea get ccg get gtg get cca act 2608 Pro Ala Gin Thr Gin Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr 590 595 600 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（32) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243852 A7 B7 cca get cca act cca act cca get gtg get cag get gag gtt cct gca 2656

Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ala Val Ala Gin Ala Glu Val Pro Ala 605 610 615 620 agt cca get acc ggt cct gga cca cat cgt ttg tet ata cca agt ttg 2704

Ser Pro Ala Thr Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser He Pro Ser Leu 625 630 635 acc tgc aat cca gac aaa aca gat ggg cct gtg ttc cac tee aat act 2752 T3ir Cys Asn Pro Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr 640 645 650 ctg gaa aga aaa act ccc att cag ate ctg gga caa gag cct gat gca 2800

Leu Glu Arg Lys Thr Pro lie Gin lie Leu Gly Gin Glu Pro Asp Ala 655 660 665 gag atg gtg gaa tat etc ate taa acggccaaat caagagctgc agattatcag 2854 Glu Met Val Glu Tyr Leu lie 670 675 caaaaatgct tttaatcatt ttcccccttt tattggttct tgttttgagg gtgaggacaa 2914 gggttgtggg gaggggatgt tttttaacag gaettitttat tggaacaatg tactacttga 2974 gtaataccat gtgaacacca gtctattttg gtatgettag ggagtacctc taaagacaga 3034 ttaatcagaa tgtgctctaa agettattgt ttgaatttat acgaatactg ggactgttaa 3094 caggtggcta tacatcgacg ttttcaatgt gcttaaattt gtttaaattt tccatattct 3154 agatcatttt ttattgaaga gcacagtatg tgtggaagac agtgtataac acgtagtttg 3214 gaagtgggaa getagagaga attgagtgtg tgctgttttg tatagttact atcctgtgca 3274 gcagctggag aaagcactca cctcaggctt acaaaaggga atagtttcag gagctatgta 3334 agctggaaaa aaggtaggga gttttggggt gcagaagggt actggagcta attttttctt 3394 ccagtttccc agctaccctg ccccagggaa ttgtgtttgt cttcatttca gtggtgcttt 3454 ggaaatggat tcttttggtt ccctcctgga ggttcataca ttcatatata tgctctggag 3514 taatttatgc atttggataa ttaatatatt gctttcagat gctgggagag tacattaact 3574 gagtgatgcg caacttcctc tetettaggg aattagacca tcagaggcct tgatggagag 3634 ttgcatgggg tgctatatgc agacttccat ggtttgtgtg tagccatgaa cacagcttgc 3694 ttgcatttag taagaccaat cagcttagtg tttatttctt ctacagcaca gattcactgg 3754 ctgggtctcc agtctcaaat tgccaatcat ttgcaaagtg aggaaggatc tttgttgaca 3814 本紙張尺度適用中國國家標準（CpS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1243852 A7 B7 五、發明説明（33 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggttgaatgc ctaagcatat cccaaagtac cttctcactg gtgggtagag cacagaagga aggtgagaaa gggaagtggg aaccagatta gaactttagc aggttcagtg ttattttggg tccagggaat aactactgaa gatctgcatt tctaggagat atccttccta acataaagga tcatgttaca gcagttgtgt atagtagaag aaacactttt tgggagccat gtggtagcca actattttga caatccccga tttgaatttc gtcttaaaag tatgctgcag tcagtgacac atcaaaggag tgccagttgc tctgcagata gggtgttagg atagaagagt aatatagccc actttttgaa aaactcttta atgtatcttg tttctgtctt tcaacataga tgggtatctt attatcttcc gggtgatgtg tacacattag taagactctt cagcaagtag cacctactcc gattttaatc tctctttaga actttccaga taatttgcta tggtgactac tttgaaataa cttgttttgt ttgtcaaatt 3874 gcatttttga ctatcacctc caagggaata gcttgagaaa 3934 tc99999a9a ggtggattgc agcagtatcc tcaactacct 3994 catcttggaa tacctttggg aagcagcagg aaatgtgcat 4054 gcaatggctc caagccttgc catagggctg cctccaagga 4114 cacaggtccc tgccctgtgt cacctgtctg cccttcatta 4174 gcatcattaa gatcagtttt aaggggtata gggagggtga 4234 taagggttgg gggtagaggt tttgggatgt cttagttaga 4294 aggcctgata tattacatca tgagccatag tggtgggaaa 4354 tacctcctca ttttagtgat gaggaatctg agaactggag 4414 agtcatacaa cacagctaac cattatgcca atcaccatgc 4474 tcttttttaa attccatttt atgaaaaggc atcttcatgg 4534 taaaatgtac ctggttggag tagcttgtcc agtcttgaca 4594 gcctctcctt cagtgccttt taaaaggttt tcccttttct 4654 gtcacataaa tgtccccctg agaaaccaat cccacttctt 4714 agataatctt ttggggttcc tctgtgagta taggaatggt 4774 aaaggaatta ttttgtgtgt gtgcctgtgt gtgtgtagag 4834 attttcagct agtcctttca cattttcaat aatgaggtaa 4894 tcctcagtta taaagtgaat ctcagataga aattaaaagt 4954 tcatactacc ctttagtcat aaggagaaaa aaacactcaa 5014 caaacttcag gagagctact ttctatccaa ataatttaaa 5074 tttcatggtt ataacacatt ggcagacttt ttgctggctc 5134 acattctgca aggtgacaaa tgtcatacat tccacattgt 5194 ctcatgtgtt ttggggaaag gaagaagttc ttggctgagt 5254 accctctcac accagagaca gttcttctct gttcagtttc 5314 aaataacatt gtacatccaa gagagggaag aagagtatgt 5374 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1243852 A7 B7 五、發明説明（34 ) cagtatatta caaaaattca taacatttgg aaaggagggt attcagttgt atatgaaact aaatcatgta ttcaaggtaa acccagagac gaaaatgaac aatgcggcag tgttagctac aaaacgtgtg gccaccaatt cagtaggaca gagccatgaa tagctggggt cctaatgatt tttaaatcc tgcagaagat agtttatggg gggatctttc gaccaggttg accccagtgt cctattaaca tcttgattgt taggacagca ccatcatgtt aaactgattg cttaaagtgt acagtctcct cattcttact tcagcctgcc agtgtcggga acctccttct tggcagatgg gtgaccccat agatacagcc agaaatctca tggactccta tcttagcttg tccatgtata gtcttttttt tgatttaatg ggaacctaaa ctctttttgt attgtgcaaa atacatatgc attatctcaa gaaaatgttt acgattcttg gtttgtttat ggcctccctt ctagagaaga tctgtaatca ttttcagaag attagccacc cctatctgtg tactgcttgg gaaaaacttc gaaataaaaa aaggatttcc atatctgcca tgttacactg ctacttttta actaactttg ttgcttatgt tcaaaggaag gaaatatgtc ttttttccag gtgattaatg atcgcctttg actgagctag atctccacta gtttttgttc 5434 ttttcacagt tgtgtggata 5494 cattttaccg gcacctcagg 5554 tgatctctga ggaccttcta 5614 attagaacaa actttacttg 5674 gtagcttgag ctttctttta 5734 ttttaatgct gcttttgagc 5794 tcatctgcca taggaaagat 5854 tt999t999t ataacaattg 5914 tgacaagcct aaaccctcat 5974 atcaattata ttctcatatc 6034 gcatatggaa tatgttactt 6094 gtatcagctg tgggctaatt 6154 ttccaagtgc catccatcat 6214 tagcaacgat gggttacatg 6274 gcatgtgttt gtaaaatgga 6334 gtttaaaatg tatgtggtcc 6394 ttccaataaa gttaagcagg 6454 6463 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 2 <211> 675 <212> PRT<213>人類 <400> 2 Met Pro -1

Ala Gin Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gin Pro Val Pro Ala 5 10 15

Asp Pro Phe Ala lie Val Ser 20

Ala Gin Gin Met Val Glu lie Leu 25 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37 - 1243852 A7 B7 五、發明説明（35) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製_

Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Axg Gin Glu Leu Glu Gly cys Tyr Glu 35 40 45 Lys Val Ala Arg Leu Gin Lys Val Glu Thr Glu lie Gin Arg Val Ser 50 55 60 Glu Ala Tyx Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu lie Arg Arg Met His 85 90 95 Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr Ala Asn Lys Gin 100 105 110 Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr Arg Lys Thr lie 115 120 125 Ser Gin Leu Phe Ala Lys Asn Lys Glu Ser Gin Arg Glu Lys Glu Lys 130 135 140 Leu Glu Ala Glu Leu Ala Thr Ala Arg Ser Thr Asn Glu Asp Gin Arg 145 150 155 160 Arg His lie Glu lie Arg Asp Gin Ala Leu Ser Asn Ala Gin Ala Lys 165 170 175 Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gin Val Tyr Val Asp 180 185 190 Lys Val Glu Lys Met Gin Gin Ala Leu Val Gin Leu Gin Ala Ala Cys 195 200 205 Glu Lys Arg Glu Gin Leu Glu His Arg Leu Arg Thr Arg Leu Glu Arg 210 215 220 Glu Leu Glu Ser Leu Arg lie Gin Gin Arg Gin Gly Asn Cys Gin Pro 225 230 235 240 Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met Glu Leu Leu Arg 245 250 255 Glu Lys Glu Glu Arg lie Leu Ala Leu Glu Ala Asp Met Thr Lys Trp 260 265 270 Glu Gin Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His Phe Ala Leu Asp 275 280 285 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gin Ajcg Asp Thr Thr Val lie Ser His 290 295 300 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1243852 A7 B7 五、發明説明（36 )

Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala Arg lie Gin Lys 305 310 315 320 Glu Glu Glu Glu lie Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys Leu Asp Met Glu 325 330 335 Gly Arg lie Lys Thr Leu His Ala Gin lie lie Glu Lys Asp Ala Met 340 345 350 lie Lys Val Leu Gin Gin Azg Ser Arg Lys Glu Pro Ser Lys Thr Glu 355 360 365 Gin Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met Ser lie Ser Asn 370 375 380 Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Pro 385 390 395 400 lie Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys Gly Ser Leu Gly 405 lie Leu Leu Gly Gly Asp 420 Ser Pro Val Pro Pro Ser 435 Gly Ser Arg Asp Cys Ser 450 410 415 455

Arg Ala Glu Tyr Val Pro Ser Thr Pro 425 430 Pro Leu Leu Ser Ala His Ser Lys Thr 440 445 Gin Thr Glu Arg Gly Thr Glu Ser Asn 460 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro lie Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Ala 465 470 475 480 Ala Ala Thr Ala Ala Ala lie Thr Ala Thr Ala Ala Thr lie Thr Thr 485 490 495 Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala 515 520 525 Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gin lie Pro Ala Ala Ala Ser Val 530 535 540 Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val 545 550 555 560 Gin Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Leu Val 565 570 575 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39 - 1243852 A7 B7 五、發明説明（37)

Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gin Ala Ser Ala Pro Ala Gin Thr 580 585 590 Gin Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Pro Ala Pro Thr 595 600 605 Pro Thr Pro Ala Val Ala Gin Ala Glu Val Pro Ala Ser Pro Ala Thr 610 615 620 Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser lie Pro Ser Leu Thr Cys Asn Pro 625 630 635 640 Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr Leu Glia Arg Lys 645 650 655 Thr Pro lie Gin lie Leu Gly Gin Glu Pro Asp Ala Glu Met Val Glu 660 665 670 Tyr Leu lie 675 <210> 3 <211> 675 <212> PRT <213>人類 <220><221>變型 <222> ()..) <223> 殘基 135 = Asn, Ser or Asp <220> <221>變型 <222> () . . (150) <223> _ 基 148-150 = Glu-Leu-Ala or Thr-Thr-Pro <400> 3 -----0Ψ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Met Pro Arg Ala Gin Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gin Pro Val Pro Ala 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ala lie Val Ser Arg Ala Gin Gin Met Val Glu lie Leu 20 25 30 Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gin Glu Leu Glu Gly Cys Tyr Glu 35 40 45 Lys Val Ala Arg Leu Gin Lys Val Glu Thr Glu lie Gin Arg Val Ser 50 55 60 Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Leu 65 70 75 80 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1243852 A7 B7 五、發明説明（38)

Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu He Arg Arg Met His 85 90 95 Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr Ala Asn Lys Gin 100 105 110 Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr Arg Lys Thr He 115 120 125 Ser Gin Leu Phe Ala Lys Xaa Lys Glu Ser Gin Arg Glu Lys Glu Lys 130 135 140 Leu Glu Ala Xaa Xaa Xaa Thr Ala Arg Ser Thr Asn Glu Asp Gin Arg 145 150 155 160 Arg His He Glu He Arg Asp Gin Ala Leu Ser Asn Ala Gin Ala Lys 165 170 175 Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gin Val Tyr Val Asp 180 185 190 Lys Val Glu Lys Met Gin Gin Ala Leu Val Gin Leu Gin Ala Ala Cys 195 200 205 Glu Lys Arg Glu Gin Leu Glu His Arg Leu Arg Thr Arg Leu Glu Arg 210 215 220 Glu Leu Glu Ser Leu Arg lie Gin Gin Arg Gin Gly Asn Cys Gin Pro 225 230 235 240 Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met Glu Leu Leu Arg 245 250 255 Glu Lys Glu Glu Arg lie Leu Ala Leu Glu Ala Asp Met Thr Lys Txp 260 265 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製-

Glu Gin Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met 275 280 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gin Arg Asp 290 295 270 His Phe Ala Leu Asp 285

Val He Ser His 300

Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala Arg lie Gin Lys 305 310 315 320 Glu Glu Glu Glu lie Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys Leu Asp Met Glu 325 330 335 Gly Arg lie Lys Thr Leu His Ala Gin lie lie Glu Lys Asp Ala Met 340 345 350 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210 X 297公釐） 1243852 A7 B7 五、發明説明（39 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

He Lys Val Leu Gin Gin Arg Ser Arg Lys Glu Pro Ser Lys Thr Glu 355 360 365 Gin Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met Ser lie Ser Asn 370 375 380 Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Pro 385 390 395 400 lie Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys Gly Ser Leu Gly 405 410 415 He Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val Pro Ser Thr Pro 420 425 430 Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala His Ser Lys Thr 435 440 445 Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gin Thr Glu Arg Gly Thr Glu Ser Asn 450 455 460 Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro lie Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Ala 465 470 475 480 Ala Ala Thr Ala Ala Ala lie Thr Ala Thr Ala Ala Thr lie Thr Thr 485 490 495 Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala 515 520 525 Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gin lie Pro Ala Ala Ala Ser Val 530 535 540 Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val 545 550 555 560 Gin Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Leu Val 565 570 575 Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gin Ala Ser Ala Pro Ala Gin Thr 580 585 590 Gin Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Pro Ala Pro Thr 595 600 605 Pro Thr Pro Ala Val Ala Gin Ala Glu Val Pro Ala Ser Pro Ala Thr 610 615 620 ----------ΜΨ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 42 - 1243852 A7 B7 五、發明説明（40 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser lie Pro Ser Leu Thr Cys Asn Pro 625 630 635 640

Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr Leu Glu Arg Lys 645 650 655

Thr Pro lie Gin lie Leu Gly Gin Glu Pro Asp Ala Glu Met Val Glu 660 665 670

Tyr Leu lie 675 <210> 4 <211> 143 <212> PRT <213>人類 <400> 4

Glu Ser Asn Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro lie Ser Val Pro Ala Pro 15 10 15

Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala lie Thr Ala Thr Ala Ala Thr 20 25 30 工le Thr Thr Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala 35 40 45

Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala 50 55 60

Thr Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gin lie Pro Ala Ala 65 70 75 80

Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala 85 90 95

Ala Ala Val Gin Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro 100 105 110

Ala Leu Val Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gin Ala Ser Ala Pro 115 120 125

Ala Gin Thr Gin Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr 130 135 140 <210> 5 <211> 31 <212> DNA. <213>人邊序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1243852 A7 B7 五、發明説明（41 ) <220> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <223>人造序列之說明：PCR反應之寡核芽酸引子 <400> 5 tacggatccg aatcgaacaa aactgcagct g 31 <210> 6 <211> 32 <212> DNA. <213>人造序列 <220> <223> 人造序列之說明：PCR反應之寡核苷酸引子 <400> 6 atactcgagt catggagctg gagttggagc ca 32

<210> 7 <211> 22 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：PCR反應之寡核苷酸引子 primer for PCR reaction <400> 7' gtttgacctg caatccagac aa 22

<210> 8 <211> 21 <212> DNA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

<213>人造序列 I <220> ' <223>人造序列之說明；PCR反應之寡核苷酸引子 <400> 8 cccaggatct gaatgggagt t 21 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <2ih人造序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇X297公釐） 1243852 Α7 Β7 五、發明説明（42) <220><223>人造序列之說明 PCR反應之寡核苷酸引子 <400> 9 cagatgggcc tgtgttccac tccaa 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA<213>人造序列 <220><223>人造序列之說明 RACE PCR反應之寡核V酸引子 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 10 gctgacagtt gccctgacgc tgct 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213>人造序列 <220><223> 人造序列之說明 RACE PCR反應之寡核芽酸引子 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製· <400> 11 cggagacggt gctctagctg ctca <210> 12 <211> 27 <212> DNA人造序列 <220> 24 人造序列之說明：RACE PCR反應之募核苷酸引子 <400> 12 tccttccaac tcttgcctca agttccg <210> 13 <211> 24 <212> DNA<213，人造序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •線

2Ί 1243852 A7 B7 五、發明説明（43 ) <220> <223>人造序列之說明：RACE PCR反應之寡核苷酸引子 <400> 13 ggtggcagcg gacaggcagg atac 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：RACE PCR反應之寡核苷酸引子 <400> 14 gaggcggaga gaactaagag aaga 24 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：RACE PCR反應之寡核苷酸引子 <400> 15 gagcggagat ggaggagtaa ttca 24 訂 •線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46 一

Claims (1)

1. 公告本 A8 B8 C8 D8 94· 8· 3(1* 替換本1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 1 . 一種被單離之人類血管生成-結合蛋白質d ( ABP - 1 )， 其能結合纖維蛋白溶酶原N端包含之克林格（k r i ng 1 e )區 域1- 4及/或5，並包含與序列鑑別編號2，3或4號序列 類似性超過95%之胺基酸序列。 2 ·如申請專利範圍第1項之蛋白質，其中該胺基酸序歹!] 與序列鑑別編號2，3或4號具有98%之序列相似性。 3 .如申請專利範圍第1項之蛋白質，其包含序列鑑別編 號2號之胺基酸序列。 4 .如申請專利範圍第1項之蛋白質，其包含序列鑑別編 號3號之胺基酸序列，其中在位置1 48 - 1 50之胺基酸殘基 爲三肽 Glu-Leu-Ala 或三肽 Thr-Trp-Pro。 5 .如申請專利範圍第1項之蛋白質，其包含序列鑑別編 號4號之胺基酸序列。 6 . —種被單離之核酸分子，其包含編碼申請專利範圍第 1至5項中任一項之蛋白質或肽之序列。 7 ·如申請專利範圍第6項之被單離之核酸分子，其編碼 申請專利範圍第3項之蛋白質。 8 ·如申請專利範圍第6項之被單離之核酸分子，其編碼 申請專利範圍第4項之蛋白質。 9 .如申請專利範圍第6項之被單離之核酸分子，其編碼 申請專利範圍第5項之蛋白質。 1 〇 ·如申請專利範圍第7至9項中任一項之被單離之核酸 分子，其至少包含序列鑑別編號1號之核苷酸21 77至核苷 酸2608之序列。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公s〉 -----------—ί』—訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 8888 ABCD 1243852 六*、申請專利範圍 1 1 .如申請專利範圍第6項之被單離之核酸分子，其包含 序列鑑別編號1號之核苷酸7 9 7至核苷酸2 8 2 4之序列。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之被單離之核酸分子，其由 序列鑑別編號1號之序列組成。 13. —種抗體或抗體片段，其與申請專利範圍第1至5 項中任一項之蛋白質或肽特異性結合。 1 4 ·如申請專利範圍第1 3項之抗體或抗體片段，其爲單 株抗體或抗體片段。 1 5 ·如申請專利範圍第1 3或1 4項之抗體或抗體片段，其 被用做藥劑。 1 6 ·如申請專利範圍第1至5項中任一項之蛋白質，其被 用做藥劑。 1 7 ·如申請專利範圍第6至9項中任一項之核酸分子，其 被用做藥劑。 18.—種用於治療或預防血管生成-相關疾病或異常之醫 藥組合物，其包含申請專利範圍第1至5項中任一項之蛋 白質、第6至1 2項中任一項之核酸分子，或第1 3至1 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------tf---------線

   經濟部智慧財產局員工消賣合作社印製 劑 載 之 許 允 上 藥 醫 及 以 段 片 體 抗 或 體 抗 之 項 1 任 中 項 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 2