JPH07505054A

JPH07505054A - ロイシンジッパー

Info

Publication number: JPH07505054A
Application number: JP5516385A
Authority: JP
Inventors: ラント，　カール・ハルトムート; アマテイ，　ブルノ・ベルナルド
Original assignee: インペリアル・キヤンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテツド
Priority date: 1992-03-23
Filing date: 1993-03-22
Publication date: 1995-06-08
Also published as: EP0633933A1; WO1993019176A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ロイシンジッパ一本発明は、ヘリツタスーループーへリックス／ロイシンジッパ−（２ｉｐｐｅｒ）　ドメイン（ＨＬＨ−Ｚ）を介しての関連する産物に対する蛋白質の結合を阻害するペプチド、それらの産生のための処理法、およびに、医療薬におけるそれらの用途に関する。

Ｍｙｃの遺伝子産物の過剰発現は、前骨髄球性白血病、結腸癌、肺の大細胞癌および小細胞癌、およびに、乳癌を初めとする様々な腫瘍に関連している。Ｍｙｃの遺伝子産物は細胞周期を推進させることに関与することが知られているが、その作用機構は未だに明らかにされていない。

Ｍｙｃの遺伝子産物は、ＨＬＨ−Ｚというモチーフを含み、かつ、ＤＮＡに結合する能力を有することも知られている。ＤＮＡに対するＭｙｃの遺伝子産物の配列特異的結合は、最初にＢｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｔ。

Ｃの遺伝子産物の生物学的機能のうちの幾つかのものに起因するのであろうということを仮定している。

ロイシンジッパ−およびヘリックス−ルーブーヘリックスドメインは二つの種類のペプチド配列であり、これらの各々は、０°　５ｈｅａ。

Ｅ、に、ｅ↓　ｌ±　［５ｃｉｅｎｃｅ、２５４．　５３９−５４４（１９９１）］によりその結晶構造が記載されているＧＣＮ４　（ロインンジッパー蛋白質）、および、ヘリックス−ループーへリックス蛋白質であるＭｙｏ　Ｄ　（Ｔａｐｓｃｏｔｔ、　Ｓ、Ｊ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４２．　４０５−４１１　（１９８８））のペプチド配列のように、特異的相互作用によるポリペプチド鎖のへテロもしくはホモダイマー形成を可能にする。ＭｙｃおよびＭａｘの遺伝子産物においては、互いに近接しているヘリツタスールーブーへリックストメインとロイシンジッパ−ドメインとが接触構造（ＨＬＨ−Ｚ）を形成しており、さらに、このＨＬＨ−Ｚドメインのすぐ上流に位置している短い塩基性領域（Ｂ）がＤＮＡ結合性に関与している。

つい最近では、Ｍｙｃの遺伝子産物は、ＨＬＨ−Ｚドメインを介してＭａｘの遺伝子の産物に対して結合することができることが発見されて理学的条件下においては、Ｍａｘ：Ｍａｘホモダイマー形成が可能である一方で、ＭＣｙ：Ｍｃｙホモダイマー形成が不可能であるということを論述する。

本発明者らは、驚（べきことに、Ｍｙｃの発癌性効果を誘導するのはＭｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成であり、そして、この相互作用は、適切なＨＬＨ−Ｚドメインを含むペプチドが、通常ではＭｙｃの過剰発現に関連する腫瘍細胞への細胞の形質転換を減らすもしくは廃止することにより中断することができることを確証した。

本発明は、従って、生理学的条件下においてＭｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成を妨げるように、Ｍｙｃの遺伝子産物もしくはＭａｘの遺伝子産物のいずれかのＨＬＨ−Ｚドメインに特異的に結合するポリペプチドを提供する。

特定の態様においては、本発明のポリペプチドはＨＬＨ−Ｚドメインを含み、かつ、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のいずれかのＨＬＨ−Ｚドメインに対して特異的に結合することが可能である。

本発明の特定のポリペプチドは、Ｍａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対して特異的に結合することができるものと思われる。他のものは、Ｍｙｃの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対して特異的に結合することができると思われ、これらは本発明の好ましい態様である。

ＭｙｃおよびＭａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインの配列がＢｌａｃｋｗｏｏｄ　ｅ工　見上、　上述、により発表されている。Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成を阻害する目的で、これらのモチーフのいずれかに対するポリペプチドの結合を、主に、以下に示す実施例１および２において使用される技術によりテストすることができる。そのポリペプチドと標的であるＨＬＨ−Ｚドメインとの間の結合の特異性は、遺伝子外ＨＬＨ−Ｚを含む蛋白質もしくは随意のポリペプチドも存在するという以外は同じである技術によりテストすることができる。

本発明のポリペプチドは、生理学的条件下においては、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対してのみ結合し、がっ、任の他のＨＬＨ− Ｚドメインに対しては結合しないことが好ましい。本発明のポリペプチドはさらに、生理学的条件下においては、ホモダイマー形成が不可能であることがさらに好ましい。

本発明のポリペプチドは、標的配列に対して結合するために適切なヘリックス状立体配座をとることができるよう充分に長くなければならない。このポリペプチドは、標的配列に対する安定な結合を可能にする充分な数のアミノ酸残基を含んでいなければならない。

このポリペプチドは、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物の、ヘリックス−ループーへりツクストメインあるいはロイシンジッパ−ドメインに対して結合することができる配列を含むことができる。本発明のポリペプチドは、少なくともＭｃｙもしくはＭａｘの遺伝子産物のロイシンジッパ−ドメインに対して結合することが可能である配列を含むことが好ましく、さらに、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインすべてに対して結合することが可能である配列を含むことがより好ましい。ヘリックス−ループ−へリックストメインおよびロイシンジッパ−ドメインのいずれか、あるいは、その両方に対して結合することに加え、本発明のポリペプチドは、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のＢ−領域に対して結合することができる配列を都合良く含むことができる。

従って、実際には、このペプチドは、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のロイシンジッパ−ドメインの内の７つ分のアミノ酸配列を完全に繰り返したことに相当する７つを下回らないアミノ酸残基を含んでいるようである。ポリペプチドの長さについての具体的な上限はないが、経済的事情、および、適当な処置法に課せられている必要条件のような他の事情が、ポリペプチドの長さにおける実質的な拘束を与えるものと思われる。ポリペプチドが５００を上回るアミノ酸残基を含むということはもっともらしくなく、そして、好ましいポリペプチドは通常では２５０残基、−例では１００残基を下回る長さであるものと思われる。ＭＭＣおよびＭａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインは、各々、６７および６６アミノ酸残基の長さがあり、従って、特に好ましいポリペプチドは、９０までのアミノ酸残基の長さを有し、−例では、７０．５０．４０．３０、もしくは、２０のアミノ酸残基までの長さである。

ポリペプチドの配列を、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対する特異的結合以外の必要条件を満たすよう、例えば、薬剤学的な受容性、インビボでの半減期、および、生分解性に関する要望を渦たすようにあつらえることができる。本発明のポリペプチドは、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対する結合機能に関連しない配列をも含むことができる。

Ｍｙｃの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対して特異的に結合することを意図した好ましいポリペプチドは、Ｍａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚモチーフ、もしくは、そのモチーフの内の少なくとも７つの隣接するアミノ酸残基を含むものと思われる。Ｍａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインに対して特異的に結合することを意図した好ましいポリペプチドは、Ｍａｙの遺伝子産物のＨＬ、Ｈ−Ｚモチーフ、もしくは、そのモチーフの内の少なくとも７つの隣接するアミノ酸残基を含むものと思われる。他の好ましいポリペプチドは、標的であるＨＬＨ−Ｚドメインに対して特異的に結合する能力を保持しながらも、特別な位置にあるアミノ酸残基が標的に対するそのポリペプチドの親和性を増強させるように修飾もしくは置換されている、これらのアナログである。このような修飾もしくは置換は、このポリペプチドと、標的ＨＬＨ−Ｚドメインとの間の界面に現われる一つもしくは複数の残基上に存在するものと思われる。

本発明の特に好ましいポリペプチドは、Ｍａｘの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインを標的とし、かつ、Ｍｙｃの遺伝子産物のＨＬＨ−Ｚドメインの内の少なくとも７つのアミノ酸残基を含むものであるか、あるいは、そのアナログである。

本発明のポリペプチドは、細胞を使用しない発現系、あるいは、そのポリペプチドをコード化する発現配列に適切な方法でつなぎ合わされている必要な調節配列を含み、かつ、このポリペプチドの発現を確実に行わせるための適切な条件下において培養されている宿主細胞、のいずわかにおけるコーディングＤ　Ｎ　Ａ配列の発現による、因習的な技術により産生ずることができる。ポリペプチドの発現もしくは合成のための方法はすべて当業者により良く知られており、ここではより詳しい説明を必要とはしないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ＥＦ、、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、（Ｅｄｓ）　”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ″　（２ｎｄ　Ｅｄｎ）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎ、Ｙ、を引用することができる。別の方法では、特により小さいポリペプチドのためには、因習的な技術によるデノボ（ｄｅ　ｎｏｖｏ）合成による産生が便利である。固相もしくは液相合成技術は当該業者に良（知られている。現在では、Ａｔｈｅｒｔｏｎ、Ｅ、および５ｈｅｐｐａｒｄ、　Ｒ，Ｃ，により、　＋５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ＋　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ。

Ｄ、　ａｎｄ　Ｈａｉｎｅｓ、Ｂ、Ｄ、　（Ｅｄｓ）　１９８９　１ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、において記載されているような固相法を使用するのが好ましい。

本発明のポリペプチドは、疾患、特に、Ｍｙｃの遺伝子産物の過剰発現に関連する癌の形態を治療することにおいて使用することができる。

治療は、任意の標準的な規定により、そのペプチドの有効な非毒性量を投与することにより行うことができる。経口経路、局所経路、および、非経口経路は特に便利であり、そして、特にポリペプチドでの全身治療に関しては、胃腸管を通過することにより分解されたり、あるいは、胃腸管から吸収されなかったりするらしく、例えば、血管内、腹膜内、筋肉内、皮膚内、もしくは、皮下への注射もしくは注入のような非経口的投与が好ましい。別の方法で（Ｊ、このポリペプチドを、例えば、弱毒化させた細菌として投与したＤＮＡもしくはＲＮＡの適切なコーディング患者への投与のためには、このポリペプチドは、例えば、注射のための水のような、薬剤学的に容認される希釈剤もしくは担体を含んでなり、かつ、随意に、抗酸化剤、保存料、抗生物質、緩衝化剤、張度、塩濃度、もしくは、粘度を調節するための試薬、およびに、他の因習的な賦形剤を含む、適切な薬剤学的処方薬内に存在するものと思われる。これらの処方薬は、錠剤、カプセル、クリーム、乳液、ペースト、粉末、およびに、水性の溶液、コロイド溶液、もしくは、懸濁液のような単位用量もしくは複式用量形態として存在することができる。注射もしくは注入に関しては、この処方薬は、注射可能な水性の溶液もしくは懸濁液として、あるいは、注射のための水、滅菌水、もしくは、発熱物質を含まない水を使用して水性の溶液もしくは懸濁液として再構成させるのための凍結乾燥粉末として存在することが好ましい。

本発明の特別な態様においては、ポリペプチドは、治療する予定の腫瘍細胞を標的とする。このことは、単に、腫瘍自体の中への注射により、あるいは、腫瘍細胞の表面抗原に対する抗体を、ポリペプチドもしくはポリペプチドを封入しである物質に対して結合させることのような、適切な標的設定手法の利用により実行することができる。このような技術は当業者には一般的に良（知られており、かつ、Ｍｙｃの遺伝子産物を過剰発現する腫瘍細胞を本ポリペプチドの標的に設定するために容易に応用することができる。

投与すべきポリペプチドの用量は、患者の年齢、体重、性別、および、容体、治療の対象となる腫瘍のサイズ、特性、および、位置、ならびに、選択する投与経路によって決まるものと思われる。一般的な基準としては、各用量は、１ｍｇから１ｇ、例えば１０ｍｇから１００ｍ、ｇのポリペプチドのような範囲内であることができ、約５０ｍｇのポリペプチドであることが好ましい。このような用量は、腫瘍を治療する目的で、−日当たり数回、そして、数日間、数週間、もしくは、数カ月間さえ繰り返すことができる。従って、約７５ｋｇの標準的なヒト成人のための日用量は、典型的には、１ｍｇから１０ｇであると思われ、約５０ｍｇから２ｇの範囲内にあることが好ましい。

他の態様において、本発明は、以下に示す、（ａ）本発明のポリペプチドをコード化する配列を有する核酸（−重鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ）であって、当該物質は、追加的な、コーディング配列および／または非コーディング配列、そのコーディング配列の発現を確実に行わせるのに必要な調節配列、遺伝標識、連結部位およびスプライシング部位、制限エンドヌクレアーゼ切断部位および＼または認識部位を含むことができ、かつ、環状もしくは直鎖状であることができ、さらに後者の場合には、粘着性末端もしくは平滑末端を有することができる、上記核酸、（ｂ）（ａ）において記載されている核酸を含んでなる発現ベクターもしくはクローニングベクターであって、当該ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌のゲノム核酸、もしくは、イーストの人工的な染色体、あるいは、本来知られているベクターであることができる、上記発現ベクターもしくはクローニングベクター、（Ｃ）（ａ）に記載されている異種の核酸、もしくは、（ｂ）に記載されているベクターを含む、形質転換させたもしくはトランスフェクションさせた細胞、（ｄ）前駆体アミノ酸誘導体からの合成、もしくは、（ａ）に記載されている核酸の発現により、本発明のポリペプチドを産生ずるための方法、（ｅ）ヒトもしくは動物の体において実施される治療の方法における用途のための本発明のポリペプチド、（ｆ）ヒトもしくは動物の体において実施される治療の方法、特に、Ｍｙｃの遺伝子産物の過剰発現に関連する腫瘍の治療における用途のための医療薬の産生における、本発明のポリペプチドのための用途、（ｇ）本発明に記載されているポリペプチドおよびそのポリペプチドのための希釈剤もしくは担体を含んでなる薬剤学的組成物、（ｈ）本発明のポリペプチド、もしくは、本発明のポリペプチドおよびそのポリペプチドのための希釈剤もしくは担体を含んでなる薬剤学的組成物を、Ｍｙｃの遺伝子産物の過剰発現に関連する腫瘍を有するヒトもしくは動物に対して投与することを含んでなる治療の方法、（ｉ）Ｍｙｃ　：Ｍａｘヘテロダイマー形成を妨害することを意図する治療用試薬の候補物をスクリーニングするための処理法であって、この処理法が、Ｍｙｃ＋Ｍａｘヘテロダイマー形成を妨害する試薬によりその発現が増強もしくは減少されるレポーター遺伝子を含む細胞をその治療用試薬の候補物と接触させるか、あるいは、その治療用試薬の候補物がペプチドである場合には、随意にそのペプチドを細胞内で発現させること、および、その細胞によるレポーター遺伝子の発現のレベルを観察することを含んでなる、上記処理法、を提供する。

本方法ρある態様においては、治療用試薬の候補物であるペプチドを、（ａ）転写活性化ドメインをも含むＭｙｃ構築物もしくはＭａｘ構築物のいずれか（しかし、両方ではない）、および、（ｂ）Ｍｙｃ構築物もしくはＭａｘ構築物の転写活性化ドメインにより調節されるレポーター遺伝子をも発現する細胞内において発現させる。候補物であるペプチドをコード化する構築物のライブラリーを発現させることが好ましい。さらなる評価のための候補物を、ペプチドと、発現されたＭｙｃ構築物もしくはＭａｘ構築物とのヘテロダイマーがもたらす、良好なレベルのレポーター遺伝子の発現を基にして選択する。使用する細胞は相同のＤＮＡからＭｙｃもしくはＭａｘを発現しないものが適する。

本方法の他の態様においては、治療用試薬の候補物を、好ましくは、異種ＤＮＡからのみＭｙｃもしくはＭａｘを発現する細胞内におけるＭｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成により調節されるレポーター遺伝子の発現を廃止する能力についてスクリーニングする。この技術は、異種ＤＮＡから細胞内に発現されるペプチドをスクリーニングするため、あるいは、ペプチドであろうとなかろうと、例えば、細胞に投与することができる合成ペプチドのアナログのような任意の試薬候補物をスクリーニングするために使用することができる。このスクリーニング技術において用いられる細胞はイースト細胞であり、かつ、このスクリーニングを本発明は、ここで、以下に示される図面の図を引用することにより説明される。

図１は、ＭｙｃおよびＭａｘの遺伝子産物、およびに、本発明のＭＹｃ９２ポリペプチドの様々なドメインをダイアダラム形態において示す。

図２は、本発明のＭｃｙ９２ポリペプチドをコード化する二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列、および、Ｍｙｃ９２ポリペプチドのアミノ酸残基配列を示す。

図３は、実施例２において使用される、ヒトのｃ−ＭｙｃＳＭａｘ。

および、Ｍａｘ欠損誘導体、およびに、ＣＡＣＧＴＧ−ＣＹＣｌ−ＬａｃＺレポーター遺伝子の図式表示である。

図４は、イースト細胞におけるＭｙｃおよびＭａｘによる活性のレベルを示す。

図５は、特定の融合蛋白質の図式表示を提示し、そして、イースト細胞における活性化のレベルを示す。

図６は、ＭｙｃとＭａｘの相互作用および機能を説明するダイアダラムである。

図１においては、ＭｙｃおよびＭａｘの遺伝子産物の、塩基性（Ｂ）ドメイン、および、ヘリックス−ループーへリックス（ＨＬＨ）　ドメイン、および、ロイシンジッパ−（Ｌ　Ｚ）　ドメインを、ドメイン間の境界についてのアミノ酸残基数と共に示している。ＭｙｃおよびＭａｘの遺伝子産物を、Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成を阻害するＭｙｃ９２ポリペプチドと並べて示している。

図２においては、Ｍｙｃ９２ポリペプチドのアミノ酸残基配列を示すが、その残基には全長を有するＭｙｃ蛋白質におけるアミノ酸残基に相当する位置に従った番号を付しである。Ｍｙｃ９２ポリペプチドをコード化する二本鎖ＤＮＡ配列も示している。国際的に認められている１文字コードを、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸残基の両方に関して使用している。

本発明は、以下に示す実施例によりさらに詳しく説明されるが、この実施例は、いかなる点においても本発明の制限として捕らえるべきではない。

実施例ＩＭｙｃ遺伝子蛋白質のＢ−ＨＬＨ−Ｚドメインに相当する配列を含むポリペプチドＭｙｃ９２（図１を参照せよ）を、ＭｙｃおよびＲａｓの発癌性蛋白質の同時発現について記載されているのと同じ方法［Ｌ　ａ　ｎｄ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　３０４．　５９６−６０２（１９８３）］により、ラットの胚細胞（ＲＥ　Ｃ）中において、ＭｙｃおよびＲａｓの発癌性蛋白質を同時発現させた。ＲＥＣ中におけるＭｙｃおよびＲａｓの発癌性蛋白質のみの同時発現は、その細胞の悪性な形質転換を誘導する一方、この活性はＭｙｃ９２も発現される場合には抑制される。この作用は、細胞性Ｍａｘ蛋白質との相互作用に関するＭｙｃとの競合を通して行われる。

実施例２Ｃ−Ｍｙｃ蛋白Ｉｔ（Ｍｙｃ）は、アミノ末端転写活性化ドメイン１、およびに、Ｍｙｃとそのパートナ−であるＭａｘとのダイマー形成およびＣＡＣＧＴＧコア共通配列ト９を含む部位に対するＤＮＡ結合を指令するカルボキシル末端塩基／ヘリックス−ループ−へリック入／ロイシンジッパ−（ｂＨＬＨ−Ｚ）　トメインド５を含んでいる。これらの特性、および、Ｍｙｃが遺伝子発現を調節することができるという意見４．ｓ。

ＩＯにもかかわらず、転写因子としてのＭｙｃもしくはＭａｘに関する直接的な役割は全く立証されていない。インビボでのモデル系としてサツカロマイセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　旦且工ｅヱ１ｓｉａｅ）を使用して、我々は、Ｍｙｃ蛋白質が、ＤＮＡ結合がＭａＸとのダイマー形成に厳密に依存する配列特異的転写活性化因子であることを示している。転写活性化にはＭｙｃのアミノ末端ドメインが介在している。Ｍａｘホモダイマーは、Ｍｙｃ／Ｍａｘと同じＤＮＡ配列に対して結合するが、我々のアッセイにおいては転写活性を示さず、そのため、Ｍｙｃ／Ｍａｘ機能と拮抗することができる。我々は、ＭａｘのＨＬＨ−Ｚドメインが、それ自体に関するものよりも、ＭｙｃのＨＬＨ−Ｚドメインに関してより高い親和性を有することを示し、このことにより、平衡状態においてはヘテロダイマーであるＭｙｃ／Ｍａｘ活性化因子が優先的に形成されることが示唆される。

哺乳類細胞中におけるＭｙｃ蛋白質およびＭａｘ蛋白質による転写調節の分析は、内在性のＭｙｃおよびＭａｘにより混乱させられてしまう。

Ｓ、　セレビシェ内においてはＭｙｃとＭａｘとが相同であるという証拠が存在しないため、この生物体はこのような研究にとっては優れた系であると思われる。イースト細胞中における、ヒトのＭｙｃと、Ｍａｘｌ、Ｍ　ａ　ｘ　２、もしくは、幾つかのＭａｘ欠損誘導体（図３）の同時発現はＣＡＣＧＴＧ−ＣＹＣＩ −ＬａｃＺレポーターから転写活性化を誘導するー・方、ＭｙｃもしくはＭａｘのみの場合には活性化は観察されない（図４、ａ、ラインｂ）。ＭＹＣもし２（はＭａｘのみでは転写活性化を起こさないということがＤＮＡに対して結合する能力がないことに起因するか否かを論じるために、我々は、それらをｖｐ１６の転写活性化ドメイン１：、対して融合させてそれらの機能をテストした（図４ｂ）。Ｍｙｃを使用した場ｊ−（二観察されるように、ＶＰ１６−Ｍｙｃ△Ｎ（ＭｙＣの残２ｉＳ］、８０−４３９を保持している）は、Ｍａｘと一緒に共同発現された場合にのみ転写活性化を示す。これは、ＤＮＡ結合、従ってＭＭＣによる転写活性化は、Ｍａｘ（ＭａｘｉもしくはＭ、　ａ、　ｘ　２のいずれか）、あるいは、少なくともＭａｘのｂ　ＨＬ　Ｈ−Ｚドメイン（Ｍａｘ８５、図３および４ａ）を必要とするという概念に矛盾しないが、観察される効果において、関連性を有するイースト蛋白質１が関与しているという可能性を排除することができない。ＶＰ１５−Ｍｙｃ△Ｎとは異なり、Ｍａｘ　１０３−ＶＰ　１６はそれ自身でＣＡＣＧＴ（、−ＣＹＣ１プロモーターを転写活性させる（図４ｂ）。従って、ＭａｘはＭｙｃが存在しない場合にＤＮＡに結合することができるが、異種の転写活性化ドメインをイ」加させない限り、我々の系においては転写を有意に活性化することはない。従って、テスｌ−したずべてのＭａｘ蛋白質は（図３を参照せよ）、近年細菌により発現されるＭａｘについて報告されているよう１コ２゜＋３イースト抽出物中に含まれるホモ−オリゴマー（引用文献９、データ未公開）としてＤＮＡに結合する。ＣＡＣＧＴＧ−ＣＹＣ１プロモーターの転写活性化は配列特異的であるが、これは、ＣＴＣＧＴＧ結合部位を欠損している対照としてのレポーターからは、Ｍｙｃ／Ｍａｘ（図４ａ１ラインａ）　、ＶＰ１６−ＭｙｃΔＮ１もしくは、Ｍａｘ１０３−ＶＰ−１６（図４ｂ）によってはかなり低い転写活性化が観察されるか、あるいは、そのような活性化が全く観察されないためである（図４ａの説明文も参照せよ）。

これらが転写活性を明らかに欠損しているｌ。−め、我々は、Ｍａｘ／Ｍａｘダイマーが、同じＤＭＡ標的部位に関する競合を通して、Ｍｙｅ／Ｍａ、ｘによる転写活性化に拮抗すること予測した。この概念に矛盾することな（、細胞内への追加的なＭａｘプラスミドの導入により、Ｍｙｃ／Ｍａ、ｘもしくはＭｙ　ｃ／Ｍａ、　ｘ　８５による転写活性化の減少が誘導される（図４ｃ）。一方で、追加的なＭｙｅプラスミドを導入するとＭａｘもしくはＭ　ａ　ｘ　８５の存在下における転写活性化レベルが上昇しく図４ｃ）、このことは、Ｍｙｃが活性化ドメインを提供するという結論を支持する。従って、異なる種類のＭｙｃ／Ｍａｘダイマーの活性は、主に、それぞれの絶対的な効果よりはむしろ、Ｍ　ｙ　ｃ　／　Ｍ　ａ　ｘ複合体とＭａｘ／Ｍａｘ複合体との間の平衡状態を反映している（図４、説明文も参照せよ）。例えば、Ｍａｘ△Ｃ蛋白質およびＭ　ａ　ｘ　８５蛋白質は全長を有するＭａｘと比較するとＭｙｃ／Ｍａｘ機能をより良（することができるようである（図４ａ）一方、すべてのＭａｘ蛋白質は類似するレベルで発現されている（未発表）。切断された蛋白質の両方共はカルボキシル端の核輸入配列１２．１４を欠損しており、そのため、ホモダイマー競合物としてはさほど有効ではないかもしれないが、一方で、Ｍｙｃとのヘテロダイマーの各々は効率良く核内に輸送される目。

Ｍａｘは自分自身およびＭｙｃの両方と相互作用することができるという前提の元に、我々は次に、インビボでの蛋白質−蛋白質相互作用を記録するイーストのアッセイ１５．１を使用して、自分同士および互い同士についてのＭｙｃおよびＭａｘのＨＬ　Ｈ−Ｚドメインの比較親和性を調査した（図５ａ）。我々は、効率の良いＭｙｃ／ＭａｘのＨＬＨ−Ｚ相互作用を観察したが、Ｍｙｃ／ＭｙｃのＨＬＨ−Ｚ相互作用は観察されず、そして、Ｍａ　ｘ／Ｍａ　Ｘ、（７）ＨＬＩ −１−Ｚ相互作用は弱かった（図５ｂ）。イーストにおいて我々が取得した結果は哺乳類細胞における類似する観察結果に匹敵するものであるが、そちらの観察結果においてはＭａｘ／Ｍａｘ相互作用は検出されていない１２゜ＭｙｃおよびＭａｘのＨＬＨ−Ｚドメインのダイマー形成についての比較親和性は、Ｊｕｎのロイシンジッパ−とＦｏｓのロイシンジッパ−との間の相互作用を暗示させるものである（引用文献１７において総説が掲載されている）。我々は、ＪｕｎとＦＯ８ＩＳ、１Ｇとに関してと同様に、ＭｙｃとＭａｘとは平衡状態において優先的にヘテロダイマー複合体を形成するであろうと考えている。

Ｍｙｃの機能的なドメインを、様々なＭｙｃ変位体とＳＦＲ−ＭＡｘ７２とのダイマー形成、および、Ｍａｘを添加した際のそれらの変位体のＤＮＡ結合特性を測定することにより分析した（図５ｃ）。塩基性領域における変位体（３６ＯＮ／Ｐおよび３６４．６．７Ｒ／Ａ）はＣＡＣＧＴＧレポーターを転写活性化させることができないが、ダイマー形成活性は保持している。従って、他のｂ　ＨＬ　Ｈ蛋白質２０．２１と同様に、Ｍｙｃの塩基性領域はＤＮＡ結合にとっては不可欠なものであるが、ＨＬ　Ｈ−Ｚドメインのみにより仲介されるダイマー形成にとっては必ずしも必要なものではない（図５ｂ）。この概念に矛盾することなく、ＨＬＨドメインもしくはＬＺドメインのいずれかの欠損体はいずれの活性をも示さなかったが、これらの変位体に関しては陽性対照を使用することはできない（未発表）。Ｍｙｃの転写活性化ドメインは地図上では１７７のアミノ末端残基に相当し、このことは、哺乳類細胞におけるＧＡＬ４−Ｍｙｃキメラ体内に存在するこのドメインの地図上の位置鵞と一致する。欠損変位体ＭｙｃΔＮ（残基１７８から４３９を保持する）は、ダイマー形成アッセイおよびＤＮＡ結合アッセイの両方において活性化を示さないが（図５ｃ）　、Ｍａｘ−ＶＰ１６によっては転写活性化が効率よく増強される（図４ｂ）。このことは、ＭｙｃΔＮはダイマー形成を行い、かつ、ＤＮＡに結合することができるが、転写活性化は行わないことを示している。このＭｙｃ転写活性化ドメインも、異種のＤＮＡ結合性ドメイン（ＬｅｘＡ−Ｍｙｃ”および１−２３５Ｍｙｃ−８ＦＲ。

未発表）に対して融合させた場合には、イースト内において機能を示す。

本報告書において論議されているこれらの観察結果を図６にまとめた。

イーストにおいては、ＤＮＡ結合、従ってＭｙｃによる転写活性は、ＭａＸとのダイマー形成に依存している。転写活性化とｂＨＬＨ−Ｚドメインとの両方がＭｙｃの機能にとって不可欠であるため（引用文献２３−２５、および、図５０）、我々の結果は、さらに、Ｍｙｃの成長調節活性および発癌活性は、Ｍｙｃ／Ｍａｘダイマーによる配列特異的転写活性化に依存している可能性があることを示唆している。Ｍａｘのホモ−オリゴマーも検出可能な程の転写活性を示さないものの、同じＤＮＡ配列に対して結合すことができ、かつ、ＤＮＡ結合部位の閉鎖を通じてＭｙｃ／Ｍａｘの機能と拮抗することができる。これらの所見は、哺乳類細胞においてはＧＡＬ４−Ｍａｘ融合体は転写活性化を欠損しているという所見１２に一致している。しかしながら、Ｍａｘに関する転写活性化機能を完全に排除することはできない。Ｍｙｃ蛋白質およびＭａｘ蛋白質は優先的にヘテロダイマー形成を行うことが予期される。Ｍｙｃとは異なり、Ｍａｘは休止細胞およびに成長細胞において発現される安定な蛋白質である（引用文献２６、Ｔ、Ｄ、Ｌ、、　Ｄ、Ｈａｎｃｏｃｋ　ａｎｄ　Ｇ、１．　Ｅ、　、未発表）。従って、我々は、Ｍｙｃ発現のマイトジェン誘導２７が、平衡状態をＭａｘ／Ｍａｘ−ダイマーからＭｙｃ／Ｍａｘヘテロダイマーへと移動させるのであろうと考えている。この変換則は重要な成長調節段階を意味する可能性があり、それというのも、ＭｙｃおよびＭａｘの活性もやはりリン酸化によって調節されている可能性があるものの、Ｍｙｃの活性化は細胞を細胞周期１０もしくは細胞消滅回路２５内に受け渡すのに充分なものであるためである。

実施例２のための引用文献１、　Ｋａｔｏ、　Ｇ、Ｊ、　Ｂａｒｒｅｔ、　Ｊ、、　Ｖｉｌｌａ、　Ｇ、Ｍ、　＆　Ｄａｎｑ、　Ｃ，Ｖ、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌＥｉｏｌ　１０．５９１４− ５９２０　（１９９０１２、Ｍｕｒｒｅ、　Ｃ，、ＭｃＣａｗ、　Ｐ、Ｓ、　＆　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｄ、　Ｃｅ１ｌ　５６．７７７−８：１（１９８９］　。

：１．　Ｌａｎｄｓｃｈｕｔｚ、　ｗ、Ｈ，Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐ、Ｆ、＆　ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ、Ｌ、！；ｃｉｅｎｃｅ２４０、１７５９−１７６４　（１９８Ｂ）４、　Ｐｅｎｎ、　Ｌ、Ｊ、Ｚ、、Ｌａｕｆｅｒ、Ｅ、Ｍ、＆　Ｌａｎｄ、Ｈ−ｉｎ　Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　１ｎＣａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ｅｄｓ、　Ｊｏｎｅｓ、　Ｎ、ｌ　Ｖｏｌ　ｌ、　６９−８０　（Ｓａｕｎｄｅｒｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　１９９０）５、　Ｌｕ５ｃｈｅｒ、　Ｂ、　＆　Ｅｉｓｅｎｍａｎ、　Ｒ，Ｎ、　にｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　４．２０２５−２０１５（１９９０１。

６、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　Ｔ、に、、　Ｋｒｅｔｚｎｅｒ、　Ｌ、、　Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ、　Ｅ、Ｍ、、　Ｅｉｓｅｎｍａｎ。

Ｒ，Ｎ、＆　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｈ，５ｃｉｅｎｃｅ　２５０．　１１４９− １１５１　（１９９０）。

７、　Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ、　Ｅ、Ｍ、　＆　Ｅｉｓｅｎｍａｎ、　Ｒ，Ｎ−５ｃｉｅｎｃｅ　２５１．１２１１−７（１９９１）。

８、　Ｐｒｅｎｄａｒｇａｓｔ、　Ｇ、Ｃ，、Ｌａｗｅ、　Ｄ、　＆　Ｚｉｆｆ、　Ｅ、Ｂ、　Ｃｅ１ｌ　６５．３９５−４０７（１９９１）。

９、　Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ、　Ｔ、Ｄ、、　Ａｍａｔｉ、　Ｂ、、　Ｌａｎｄ、　Ｈ−＆　Ｅｖａｎ、　Ｇ、■。

Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　７．　１７１Ｄ−１７９２（１９９２）。

１０、　Ｅｉｌｅｒｓ、　Ｍ、、　Ｓｃｈｉｒｍ、　Ｓ、　＆　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｊ、Ｍ、　Ｅｒｎｂｏ　Ｊ　１０．１３：ｌ−１４１（１９９１）。

１１、Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｆ、、　Ｊａｙａｒａｍａｎ、　Ｐ、Ｓ、　＆　Ｇｏｄｌｉｎｇ、　Ｃ，Ｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　６゜１０９９−１１０４　（１９９１）。

１２、　Ｋａｔｏ、　Ｇ、Ｊ、　Ｌｅｅ、　Ｗ、Ｍ、Ｆ、、　Ｃｈｅｎ、　Ｌ、　＆　Ｄａｎｇ、　Ｃ，Ｖ、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ６．８１−９２　（１９９２）。

１３、Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ、　Ｓ、　＆　Ｃｏ１ｅ、　Ｍ、Ｄ、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　６．１６６−１７６　（１９９２）。

１４、　Ｍａｋｅｌａ、　Ｔ、Ｐ、、　Ｋｏｓｋｉｎｅｎ、　Ｐｊ、、　Ｖａｓｔｒｉｋ、ニー　＆　Ａ１１ｔａｌｏ、　Ｋ−ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６．　３７３−１７７　（１９９２）。

１５、　Ｄａｌｔｏｎ、　Ｓ、　＆　Ｔｒｅｉｓｍａｎ、　Ｔ、　Ｃｅ１ｌ　６Ｂ、　５９７−６１２　（１９９２）。

１６、　Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｓ、　＆　Ｓｏｎｇ、　Ｏ，Ｎａｔｕｒｅ　３４０．２４５−２４６　（１９Ｂ９）。

１７−　Ｒａｎ５ｏｎａ、　Ｌ、Ｊ、　＆　Ｖｅｒｎａ、工Ｍ、　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ−ｏｌ　ｇ、　５３９−５５７（１９９０１。

１８、　０’５ｈｅａ、Ｅ、に、、Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ、Ｒ，、５ｔａｆｆｏｒｄ、Ｗ、Ｆ、ＩＩＬ、＆　Ｋｉｍ。

ｐ、ｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．６４６−８　（１９８９）。

１９、　Ｓｍｅａｌ、　Ｔ、、　Ａｎｇｅｌ　Ｐ、、　Ｍｅｅｋ　Ｊ、　＆　Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、　にｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　３゜２０９１−２１００　（１９８９）。

２０、　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｃｈｅｎｑ、Ｐ、Ｆ、、　Ｌａ５ｓａ’ｒ、　Ａ、Ｂ、＆　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、　Ｈ。

Ｃｅ１ｌ　６０．　７ココー７４６　（１９９０）。

２１、　Ｖｏｒｏｎｏｖａ、Ａ、＆　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７．４２７７−４７２６　（１９９０）。

２２、Ｌｅｃｈ、　Ｋ、、　Ａｎｄａｒｓｏｎ、　Ｌ　＆　Ｂｒｅｎｔ、　Ｒ，Ｃｅ１ｌ　５２．１７９−１８４（１９８Ｂ）。

２：１．　５ｔｏｎｅ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　７．　１６９７−４７０９　（１９Ｂ？）２４、　Ｐｅｎｎ、Ｌ、Ｊ、Ｚ、、ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　１０．　４９６１−４９６６（１９９０）。

２５、Ｅｖａｎ、　Ｇ、■、、　ｅｅ　ａｉ　Ｃｅ１ｌ　６９．１−２０　（１９９２）。

２６、Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ、　Ｅ、Ｍ、、　Ｌｕ５ｃｈｅｒ、　Ｂ、　＆　Ｅｉｓｅｎｍａｎ、　Ｒ，Ｎ、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ６．７１−８０　（１９９２）２７、　Ｋｅｌｌｙ、Ｋ、＆　５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ、Ｕ、Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｒｎｍｕｎｏｌ　４．　３１１−］コＢ８１９８６）。

２８、Ｇｕａｒｅｎｔｅ、　Ｌ、　＆　Ｍａｓｏｎ、　Ｔ、　Ｃｅ１ｌ　３２．１２７９−１２８６　（１９８３）。

２９、Ｇｒｅｑｏｒ、　Ｐ、Ｄ、、　Ｓａｗａｄｏｇｏ、　Ｍ、　＆　Ｒｏｅｄｅｒ、　Ｒ，Ｇ、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ＜、１７３０−１７４０　（１９９０）コｏ、　Ｓｍ１ｔｈ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、ｃｅｌｌ　１６．　７５］−７６１（１９７９）。

コ１．　Ｈａｒｓｈｍａｎ、Ｋ、Ｄ、、Ｍｏｙｅ、Ｒ，Ｗ、＆　Ｐａｒｋｅｒ、Ｃ，Ｓ、Ｃｅ１ｌ　５３．　１２１−３１０　（１９８８１゜図面の説明文図３　ヒトのｃ−Ｍｙｃ、Ｍａｘ、および、Ｍａｘ欠損変位体、および、本研究に使用したＣＡＣＧＴＧ−ＣＹＣＩ−１ａｃＺレセプター遺伝子のｃ−Ｍｙｃ図解表示。ＭｙｃおよびＭａｘ（ｉＤｂＨＬＨ−Ｚドメインを並べである。ＭａｘｉおよびＭ　ａ　ｘ　２は、各々、９つのアミノ酸挿入断片を有さない、および、それらの断片を有する天然に存在するＭａＸ変種である７゜Ｍａｘ△ＣおよびＭ　ａ　ｘ　８５変位体はＭｙｃのカルボキシル端に相当するＭａｘ内での位置で切断されている。

方法、Ｍａｘ２、Ｍ　ａ　ｘ　ｌ△Ｃ，Ｍｘ’；ｌ△ｃ１および、Ｍａｘ８５は、Ｍ　ａ　ｘ　１のｃＤＮＡ鋳型（Ｄ、Ｇｌｌｌｅｓｐｉｅ氏がら贈与された）から適切なプライマーを使用するＰＣＲにより作製した。すべてのコーディング領域を、選択的遺伝標識としてＴＲＰＩ、ＬＥＵ２、もしくは、ＨＩＳ３のいずれかを有するｐｓＤ系統のイーストの発現ベクター＋５のガラクトース誘導可能なＣＥＮ−ＡＲＳプラスミド内へサブクローン化させた。ＣＹＣｌのＡＴＧ開始コドンを使用したことにより、以下に示すアミノ末端伸長部分が蛋白質の前についている。ＭＴＧＦＰＧＬＱＥＦＥＬＡＰＴＭ　（Ｍｙｃ）　、ＭＴＧＦＥＬＥ　（ＭａｘｉおよびＭａｘ１０３−ＶＰ１６、図４を参照せよ）　、ＭＴＧＦＴ　（Ｍａｘ２、Ｍａｘｌ△Ｃ，Ｍａｘ２△ｃ）、および、ＭＴＧＦＴＭＧ　（Ｍａｘ８５）、および、ＭＴＧＰＦ　（ＭｙｃΔＮ１図４を参照せよ）。それぞれの固有の開始コドンで開始させた蛋白質を使用する追加的な実験により、伸長部分はＭｙｃ、Ｍａｘｉ、Ｍ　ａ　ｘ　２、Ｍａｘｉ△ｃ１および、Ｍａｘ２△Ｃの性質を有意に変化させたりはしないということが示された（未発表）。キメラ融合体およびＰＣＲで作製した挿入断片はすべてＤＮＡ配列決定により確認した。レポーター遺伝子として、我々は、Ｓｍａ要な後期プロモーター（ＭＬＰ）成分であるＣＴＡＧＧＣＣＡ、ＣＧＴＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴ　（引用文献２９）を含むｐＬＧ△３１２（引用文献２８）に由来する２ｕ−ＣＹＣＩ　プロモーター −ＬａｃＺプラスミドを使用した。他の２つのＭｙｃ結合配列（ＣＭＩ、引用文献６、および、Ｐ　ＨＯ４ブロモ−クーＩＩ）も同様の結果を示した。

図４　イーストにお↓ブるＭｙｃおよびＭａｘによる転写の活性化。

ａ、　表示される蛋白質およびレポーターを含む細胞におけるβ−ガラクシダーゼ単位（Ｕ）。対照であるレポーターの残存性転写活性化は、かわらず、Ｍｙｃ／ＭａｘＳＭａｘ１、もしくは、Ｍａｘ２によるＤＮＡ結合を可能にする唯一のハーフサイトチェンジ（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅｃｈａｎｇｅ）である（引用文献１２、Ｄ、　Ｓｏｌｏｍｏｎ、　Ｂ。

Ａ、、　ａｎｄ　Ｈ，Ｌ、　、データ未発表）。全てのＭａｘ蛋白質が類似するレベルで発現されたため、Ｍ　ａ　ｘ　ｌもしくはＭａｘ△Ｃと比較して、Ｍａｘ２、Ｍａｘ２△Ｃ１もしくは、Ｍ　ａ　ｘ　８５が添加されている場合にはＭｙｃはかなり高めの効果を示すが、これは一部にはＤＮＡに関する親和性の違いに起因するものと思われる（引用文献９、および、データ未発表）。

１）、ＭａｘもしくはＭｙｃ△Ｎを添加した場合のＶＰ１６−Ｍｙｃ△ＮおよびＭａｘ１０３−ＶＰ１６による転写活性化。ＰＶ１６−ＭｙｃΔＮおよびＭａｘ１０３−ＶＰ１６の活性は、それらの比較発現レベルが明らかにされていないため、直接的には比較することができないことに留意せよ。ｃ、　ＣＡＣＧＴＧレポーターの転写活性化における第３のＭｙｃもしくはＭａｘプラスミドの効果。

（ａ）におけるものとは異なる遺伝子標識を有するＭｙｃプラスミドをＭｙｃ＋ＭａｘおよびＭｙｃ＋Ｍａｘ８５に関して使用した（ａにおいてはＬＥＵ２を、プラスミド３においてはＨＩＳ３を使用した）。

方法、Ｍａｘ１０３−ＶＰ１６は、ｐＳＤ、０６ａからのｖｐ１６断片（残基４１０−４９０）でＭａｘの３゛配列のコドン１０３を置換することにより作製した。ＶＰ１６−ＭＶＣ△Ｎは、Ｍｙｃのコドン１８０から４３９の上流に存在するｖｐ１６断片を含む。ＭｙｃΔＮはコドン１７８から４３９を保持している。

ＭｙｃおよびＭａｘプラスミドポータープラスミドを同質遺伝子株Ｗ３０３−ＩＡ　（ＭＡＴａ）内に形質転換させた。蛋白質／レポーターの組換え体を、交差形質転換体により作製した。ガラクトースで１２時間誘導させた培養物中に含まれるβ−ガラクトシダーゼの比較単位（Ｕ）を、既に記載したように３１測定し、そして、Ｕ＝１０００Ａ４２０／　（ＣＴｖ）として細胞数ニ対シテｔｌ［単化させるが、式中、Ａ４２０は４２０ｎｍにおける吸光度であり、Ｃは細胞懸濁液の密度（６００／ｍｌ中に含まれる）であり、■は細胞懸濁液の容積（ｍｌ）であり、かつ、ｔは総計のインキュベーション時間（分）である。

図５．　インビボでのＭ　ｙ、　ｃ　／　Ｍ　ａ　ｘ相互作用。ａ、ＭｙｃのＭＬＨ−ＺドメインとＭａｘのｌ−Ｔ　ＯＨ−Ｚドメインとの間の相互作用についてのアッセイ。このアッセイ１５においては、５ＲＥ−ＬａｃＺレポーター遺伝子の活性化は、各々がＳＲＦのＤＮＡ結合性ドメインとｖｐ１６の転写活性化ドメインとを含むキメラ蛋白質同士の間のトランス方向における相互作用に厳密に依存する。使用した融合蛋白質およびレポーター遺伝子の図式標示を示しである。５ＲＥ−ＣＹＣＩ−ＬａｃＺレポーター遺伝子を、インディケータ−であるイースト株５６２Ｌのゲノム内に取り込ませた（引用文献１５）。ｂ、　標示される蛋白質を発現する５６２Ｌ細胞内に含まれるβ−ガラクトシダーゼの比較単位（図式４において提議されているものと同一）。使用した相反する組換え体により、融合蛋白質の発現についての機能上の内部樟準が提供される。その上、ここで使用したＳＲＦ誘導体は、すべてＳＲＦ部分部分−５して結合する５ＡＰＩ− ＶＰ１６融合蛋白質の示す活性ををどれも良好に回復させている（未発表）。Ｃ野生型のＭｙｃおよび標示されている変位体誘導体を、ＳＲＦ−Ｍａｘ７２を添加した場合のダイマー形成を介する５ＲＥ−ＣＹＣＩ−ＬａｃＺの転写活性化、およびに、Ｍａｘを添加した場合のダイマー形成およびＤＮＡ結合を介するＣＡＣＧＴＧ−ＣＹＣ−１−ＬａｃＺの転写活性活性化についてアッセイした。両方のアッセイにおける各Ｌｙｃ蛋白質の活性を、野生型Ｍｙｃ活性（１００％）に対して標準化させる。野生型ＭｙｃはＳＲＦを単独で添加した場合には相互作用を行わない（未発表）。

方法、Ｍｙｃ９２、Ｍｙｃ７３、および、Ｍａｘ７２−をコード化するＤＮＡ断片を、各々、ベクターｐＳＤ、０６ａおよびｐＳＤ、０８内に含まれるｖｐ１６もしくは５ＲＦ４１２　（ＳＲＦの残基１−４１２）の下流にある枠内にサブクローン化させたＩ５゜単独の５ＲＦ４１２は、ｐＳｏ、０８の改編板から発現させた。Ｍｙｃ点突然変異体は、標準的な方法を用いる部位特異的突然変異により作製した。全ての融合体の読み取り枠、点突然変異、および、ＰＣＲで作製した全ての挿入断片をＤＮＡ配列決定により確かめた。

図６．　ＭｙｃとＭａｘの相互作用および機能の図式的一覧。ＭｙｃおよびＭａｘはＤＮＡが存在しない場合に安定なヘテロダイマーを形成する（溶液中において）。Ｍａｘ／Ｍａｘの弱い相互作用も検出することができるが、インビトロもしくはインビボでの生理学的濃度においてはＭｙｃ／Ｍｙｃは形成されない。Ｍｙｃ／ＭａｘおよびＭａｘ／ＭａＸの両方ともが同じＤＮＡ配列に対して結合する。しがしながら、Ｍｙｃ　／　Ｍ　ａ　ｘへテロダイマーのみが、イーストにおける配列特異的転写活性化因子として機能する。

配　列　表（１）一般的な情報（ｉ）出願者（Ａ、）氏名　Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｒｒ＋、１ｔｅｄ（Ｂ）街路名：５ａｒｄｉｎｉａ　Ｈｏｕｓｅ、　５ａｒｄｉｎｉａ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市：Ｌｏｎｄｏｎ（Ｅ）国・ＣＢ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＷＣ２Ａ　３ＮＬ（Ａ）氏名：、ＬＡＮＤ、　Ｋａ　ｒ　ｌ　Ｈａ　ｒ　ｔｍｕ　ｔ（Ｂ）街路名：Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄ　Ｌｉｎｃｏｌｎｓ　Ｉｎｎ　Ｆｉｅｌｄｓ（Ｃ）市：Ｌｏｎｄｏｎ（Ｅ）国・ＧＢ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＷＣ２（Ａ）氏名：ＡＭＡＴｌ、　Ｂｒｕｎｏ　Ｂｅｒｎａｄ。

（Ｂ）街路名　Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄ　Ｌｉｎｃｏｌｎｓ　Ｉｎｎ　Ｆｉｅｌｄｓ（Ｃ）市：Ｌｏｎｄｏｎ（Ｅ）国：ＧＢ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＷＣ２（１、発明の名称　ロイシンジッパ− （ｉ　ｉ　ｉ）配列数、８（ｉｖ）コンピューター解読可能形態。

（Ａ）メディウムの種類、フロッピーディスク（Ｂ）：Ｉンビューター：ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）作動システム　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５（ＥＰＯ）（Ｖ）現行の出願年月日。

出願番号：ＷＯＰＣＴ／ＧＢ９３１００５８２（２）配列番号１についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ・１６（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類、ペプチド（ｘｉ）配列Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔｌ　Ｓ　ｎｏ　ｌ５（２）配列番号２についての情報（２）配列番号７についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ、２７９（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数・二本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ＩＸ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　ＣＤ５（Ｂ）位置・１　２７９（ｘ　ｉ）配列（２）配列番号８についての情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ＝９３− ＣＢ）配列の型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（１１）配列の種類、蛋白質（Ｘｌ）配列Ａｓｐ　Ｇｌｎ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｆ’ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａ１Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ工ｌ＠Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎＵつＦｉｇ、５ｃ溶液中　ＤＮＡ上　（イーＦｊ、ｇ、６田整嗜審幅牛ＰＣＴ／ＧＢ　９３１００５８２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／１９　８８２８−４Ｂ／／Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ｚ　９４５３−４Ｂ（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：６４５）（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：６４５）（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＪＰ、ＵＳＩ（７２）発明者　アマティ、　ブルノ・ベルナルトイギリス国ロンドン・リンカンズインフイールズ（番地なし）・インペリアル・キャンサー・リサーチ・ファント内

Claims

【特許請求の範囲】

１．生理学的条件下においてＭｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成を妨げるように、Ｍｙｃの遺伝子産物もしくはＭａｘの遺伝子産物のいずれかのヘリックスールーブーヘリックス／ロイシンジッパードメインに対して特異的に結合するポリペプチド。
２．請求の範囲１に記載されているポリペプチドであって、生理学的条件下において、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のヘリックスーループーヘリックス／ロイシンジッパードメイン以外の任意のへリックスーループーヘリックス／ロイシンジッパードメインに対しては結合しない、上記ポリペプチド。
３．請求の範囲１もしくは請求の範囲２に記載されているポリペプチドであって、ＭｙｃもしくはＭａｘの遺伝子産物のヘリックスーループーヘリックス／ロイシンジッパードメイン全体に対して特異的に結合する、上記ポリペプチド。
４．請求の範囲１から３の内の任意のものに記載されているポリペプチドであって、生理学的条件下においてホモダイマーを形成しない、上記ポリペプチド。
５．請求の範囲１から４の内の任意のものに記載されているポリペプチドであって、Ｍａｘの遺伝子産物のヘリックスーループーヘリックス／ロイシンジッパードメインに対して特異的に結合する、上記ポリペプチド。
６．請求の範囲１から４の内の任意のものに記載されているポリペプチドであって、Ｍｙｃの遺伝子産物のヘリックスーループーヘリックス／ロイシンジッパードメインに対して特異的に結合する、上記ポリペプチド。
７．請求の範囲１から６の内の任意のものに記載されているポリペプチドであって、標的用抗体に対して結合させてある、上記ポリペプチド。
８．請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチドをコード化する配列を有する核酸。
９．請求の範囲８に記載されている核酸を含んでなる発現ベクターもしくはクローニングベクター。
１０．請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチドをコード化する配列を有する異種の核酸、もしくは、請求の範囲９に記載されているベクターを含む、形質転換させたもしくはトランスフェクトさせた細胞。
１１．請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチドを産生するための処理法であって、請求の範囲８に記載されている核酸、の、アミノ酸前駆体からの合成もしくは発現を含んでなる、上記処理法。
１２．請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチドであって、ヒトもしくは動物の体において実施する治療の方法における用途のための、上記ポリペプチド。
１３．請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチドの用途であって、Ｍｙｃの遺伝子産物の過剰発現に関連する腫瘍の治療のために、ヒトもしくは動物の体において実施する治療の方法における用途のための医療薬の調製法における、上記用途。
１４．請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチド、およびに、そのポリペプチドのための希釈剤もしくは担体を含んでなる薬剤学的組成物。
１５．Ｍｙｃの遺伝子産物の過剰発現に関連する腫瘍を有するヒトもしくは動物に対して、請求の範囲１から７の内の任意のものに記載されているポリペプチドの腫瘍低減的非毒性的量、もしくは、請求の範囲８に記載されている薬剤学的組成物を投与することを含んでなる治療の方法。
１６．Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成を妨害することを意図する治療用試薬の候補物をスクリーニングするための処理法であって、この処理注が、Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマー形成を妨害する試薬によりその発現が増強もしくは減少されるレポーター遺伝子を含む細胞をその治療用試薬の候補物と接触させるか、あるいは、その治療用試薬の候補物がペプチドである場合には、随意にそのペプチドを細胞内で発現させること、および、その細胞によるレポーター遺伝子の発現のレベルを観察することを含んでなる、上記処理法。