KR20060054196A - 전달가능한 ｄｎａ-결합 단백질 - Google Patents

Abstract

a) 다수의 징크 핑거 도메인; 및 b) 세포막을 통해 단백질을 이동시키는데 효과적인 이종의 단백질 전달 도메인(protein transduction domain; PTD)을 포함하는 키메라 단백질이 개시되었다. 이 키메라 단백질은 배양된 진핵 세포 내로 효과적으로 전달되어 특정 표적 유전자를 조절할 수 있다. 따라서, PTD를 포함하는 인공 전사 인자는 내생 유전자를 조절하는 단백질 약물 및 생체 외 및 생체 내에서 세포의 거동을 변경시키는 단백질 약물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.

Description

전달가능한 ＤＮＡ-결합 단백질 {TRANSDUCIBLE DNA-BINDING PROTEIN}

본 발명은 DNA 결합 단백질에 관한 것이다.

관련된 출원의 상호 참조

본 출원은 2003년 6월 10일에 출원된 미국 출원 제60/477,459호를 우선권으로 주장하며, 이의 내용은 전체가 본 명세서에 인용된다.

DNA에 결합하는 많은 전사 인자는 DNA-결합 도메인 및 효과기(effector) 도메인을 포함하는 모듈(module) 구조를 갖는다. 많은 타입의 DNA-결합 도메인이 존재한다. 징크 핑거 도메인(zinc finger domain)은 진핵 전사 인자 가운데 가장 풍부한 타입의 DNA-결합 도메인 중 하나이다. 징크 핑거 도메인이 모듈성을 갖기 때문에, 이러한 도메인들은 유용한 특성을 갖는 인공 DNA-결합 단백질을 제조하기에 이상적이다.

요약

본 명세서는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain; PTD)을 포 함하는 외생 징크 핑거 단백질이 배양된 포유동물 세포 내로 효과적으로 전달되어 특정 표적 유전자를 조절할 수 있다는 증거를 포함한다. 따라서, PTD를 포함하는 인공 전사 인자는 내생 유전자를 조절하는 단백질 약물, 및 생체 외 및 생체 내에서 세포의 거동을 변경시키는 단백질 약물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 약물의 하나의 잇점은 그들이 한정된 지속성을 갖는다는 것이다. 그들의 농도 및 결과적으로 그의 효과는 조심스럽게 조절되고 제한될 수 있다.

징크 핑거 도메인들은 아연 이온과 배위 결합하고 있으므로, 본 명세서 이전에는 징크 핑거 도메인들이 생물학적 막을 통해 이동(translocation)할 수 있는지, 그리고 그들의 기능을 유지할 수 있는지 분명하지 않았다. 이동 도중에 도메인이 풀리면, 아연 이온이 방출되어 소실될 수 있다. 반대로, 폴딩된 상태는 도메인의 이동을 방해할 것이다. 또한, 세포외 환경의 산화 조건에 징크 핑거 도메인이 노출된다면 시스테인 잔기 사이에 유해한 이황화 결합(disulfide bond)이 형성되어 DNA 결합 활성을 잃게 될 수도 있다. 본 발명자들은 징크 핑거 도메인이 사실상 생물학적 막을 통해 이동할 수 있음을 발견하였다. 또한, 이동 후, 상기 도메인들이 기능을 유지하고 세포 내에서 내생 유전자를 조절할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 한 태양에 있어서, 본 발명은 a) 징크 핑거 도메인; 및 b) 이종의 단백질 전달 도메인을 포함하는 단백질(예, 키메라 및/또는 분리된 단백질)에 관한 것이다. 이 단백질은 다수의 징크 핑거 도메인, 예를 들어, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 징크 핑거 도메인, 또는 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 단백질은 징크 핑거 도메인의 배열(array) 을 포함한다.

단백질은 또한 하나 이상의 다음과 같은 특징들을 포함할 수 있다: 핵 위치 시그날, 이량체화 도메인, 세포 표적화 도메인, 세포 표면 단백질 결합 도메인, 정제 도구 및 효과기 도메인. 단백질은 또한 하나 이상의 비-펩타이드 중심(backbone) 결합 또는 인공 아미노산을 포함할 수 있다. 세포 표적화 도메인은 면역글로불린 가변 도메인, 성장 인자, 바이러스 단백질의 세포 결합 도메인, 또는 세포외 단백질의 세포 결합 도메인을 포함할 수 있다. 정제 도구는 시스테인이 없고 금속과 배위결합할 수 있는 아미노산 서열, 예를 들어 펜타- 또는 헥사-히스티딘을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 징크 핑거 도메인은 천연형, 예를 들어 인간의 것이다. 다른 구현예에서, 그것은 천연형이 아니다. 예를 들어, 많은 비-DNA 결합 잔기들을 인간 징크 핑거 도메인에 있는 상응하는 잔기와 동일하게 변경함으로써 징크 핑거 도메인을 인간화할 수 있다. 한 구현예에서는, 단백질 전달 도메인과 징크 핑거 도메인이 동일한 폴리펩타이드 사슬의 구성요소이다. 단백질 전달 도메인 및 징크 핑거 단백질은 10, 20, 또는 50 아미노산 이상 분리되어 있을 수 있다. 예를 들어, 그들은 유연성 링커, 부위 특이적 프로테아제(예, 부위 특이적 세포내 프로테아제)에 대한 프로테아제 절단 부위, 또는 기능성 도메인 중 하나 이상에 의해 분리될 수 있다.

다른 구현예에서, 그들은 별개의 폴리펩타이드 사슬의 구성요소이다. 예를 들어, 사슬은 환원가능한 결합(예, 이황화 결합) 또는 세포에 들어갈 때 절단되는 다른 결합에 의해 부착되어 있을 수 있다.

한 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 바이러스 서열, 예를 들어, 자연적으로 인간에 감염되는 바이러스, 예를 들어, HIV 바이러스로부터의 서열을 포함한다. 예시적인 단백질 전달 도메인은 HIV TAT 단백질 전달 도메인, 예를 들어, 아미노산 서열: YGRKKRRQRRR (서열번호: 1)이다. 바이러스 서열은 5-50, 또는 8-20 아미노산 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 포유동물 서열, 예를 들어 인간 단백질로부터의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 인공 서열, 예를 들어, 디스플레이 라이브러리에서 전달 도메인으로 동정된 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 세포-특이적 전달 도메인이다. 용어 "이종의"는 단백질 전달 도메인과 징크 핑거 도메인이 동일한 단백질로부터 유래되지 않았음을 나타낸다. 예를 들어, 징크 핑거 도메인은 인공인 반면, 단백질 전달 도메인은 예를 들어 바이러스 단백질로부터 유래될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 단백질은 이 단백질이 세포의 외부와 접촉한 후 세포 내의 하나 이상의 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 단백질은, 예를 들어 세포 표면에서 또는 소낭(vesicle) 형성 후에, 세포의 원형질 막을 통과하여 내부로 들어갈 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 세포의 외부와 접촉한 후 세포 내에서 하나 이상의 내생 유전자, 그러나 세포내 유전자의 1%, 0.01%, 또는 0.001%의 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 단백질에 의해 조절되는 유전자의 수는, 예를 들어 핵산 마이크로어레이를 이용하여 결정될 수 있다. 많은 특별한 경우에, 상기 단백질은 단백질 전달 도메인을 결여하고 있는 것을 제외하고는 동일한 단백질이 조절 하는 것과 동일한 유전자를 조절한다.

통상적으로 상기 단백질은 다른 요소, 예를 들어, 세포 투과 시약(예, 세제)과 같은 인공 인자의 부재 하에 외부 환경으로부터 포유동물 세포 내로 이동할 수 있다.

한 구현예에서, 상기 단백질은 단백질의 다른 도메인의 기능이 외생 화합물의 존재 또는 부재에 따라 달라지도록 상기 기능을 조절하는 조건부 도메인을 포함한다. 예를 들어, 조건부 도메인은 소분자(small molecule), 예를 들어, 스테로이드, FK506 등에 결합한다. "소분자"는 4 kDa 이하의 분자량을 갖는 분자이다. 예를 들어, 조건부 도메인은 FK506 결합 도메인을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 상기 단백질은 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포가 3 x 10⁵ 세포/ml로, 상기 단백질이 100 ㎍/ml의 농도, 또는 100 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 또는 0.50 ㎍/ml 이하의 농도로 세포외 배지에 존재하는 분석법에서 배양된 상기 세포의 50, 75, 80, 90, 또는 95% 이상에 전달될 수 있다.

관련된 구현예에서, 본 발명은 a) 세포 내에서 천연형 표적 부위에 75, 50, 25, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 또는 0.05 nM 이하의 친화도(K_d)로 결합하는 인공 DNA 결합 도메인; 및 b) 분리된 단백질을 세포의 외부 막을 통과하여 세포 내로 들어가게 할 수 있는 이종의 단백질 전달 도메인; 및 c) 핵 위치 시그날을 포함하는 분리된 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 이동가능한 단백질과 약학적으로 허용되는 담 체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 조성물의 산화환원 전위를 안정화시키는 약제, 예를 들어, 단백질의 징크 핑거 도메인의 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합 형성을 감소시키기에 효과적인 양의 환원제, 예를 들어, 디티오트레이톨(DTT) 또는 β-머캅토에탄올을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 아연, 예를 들어, 염화 아연 또는 초산 아연과 같은 아연 염을 추가로 포함한다. 아연의 유용한 농도는 1 μM 내지 5 mM, 1 μM 내지 500 μM, 1 μM 내지 200 μM, 0.05 μM 내지 50 μM, 및 0.5 μM 내지 30 μM을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 실질적으로 아연을 함유하지 않으며, 예를 들어, 아연 농도가 0.5 mM 이하이다.

상기 전달가능한 단백질은 대장균 또는 다른 원핵 세포에서, 예를 들어 봉입체(inclusion bodies)로서 또는 분비 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 예에서, 전달가능한 단백질은 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포에서 발현된다. 전달가능한 단백질은 예를 들어 하나 또는 둘 이상의 정제 단계, 예를 들어, 둘 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제될 수 있다. 단백질은 충분히 순수하고 인간 조직 배양 세포(예, HEK293 세포)에서 0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48 또는 60 시간 이상 안정하다. 단백질은 필요한 기간 이후에 검출될 수 있으면, 예를 들어 실질적인 분해가 쉽게 일어나지 않으면 안정하다고 할 수 있다. 단백질은 10 μg의 단백질이 한 레인에 로딩될 때 그것이 쿠마지(Coomassie) 젤상에서 검출가능한 유일한 밴드인 경우 최소한 충분히 순수하다고 할 수 있다.

본 발명은 또한 약학 조성물을, 예를 들어 대상의 세포 내에서 유전자 발현을 변경시키기에 효과적인 양으로 또는 대상에서 표현형 변화를 일으키기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 조성물을 복수의 투여량으로, 예를 들어, 둘, 셋, 여섯, 열 또는 스무 가지 투여량으로 별도의 시간에 또는 동시에 (예를 들어, 의약 기구 또는 정맥내 전달 시스템을 이용하여) 투여하는 것을 포함한다. 조성물이 다수의 투여량으로 투여되는 경우에, 투여량들은 예를 들어 12, 24, 48, 60, 72 또는 96 시간 이상, 예를 들어, 24 내지 96시간, 또는 120 시간 이상 분리될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 대상에서, 예를 들어 신생물 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상에서, 혈관형성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 단백질은 VEGF-A 유전자 내의 부위에 특이적으로 결합할 수 있고, 예를 들어 VEGF-A 유전자를 억제할 수 있는 억제 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한, 예를 들어 단백질 전달 도메인과 물리적으로 결합된 본원에 기술된 징크 핑거 단백질을 이용하여, 미국 출원 제10/314, 609호 및 제10/669,861호에 기술된 임의의 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 단백질은 예를 들어 상술한 바와 같이 시간적으로 분리된 다수의 투여량으로 투여될 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 내생 유전자를 조절하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세포를 a) DNA-결합 도메인 (예를 들어, 하나 이상의 징크 핑거 도메인); 및 b) 이종 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 방법은 폴리펩타이드를 상기 접촉으로부터 12, 24, 48, 60, 72, 또는 96 시간 이후에 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 세포는 생체 외 또는 생체 내에 있을 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 코딩 서열은 a) 징크 핑거 도메인; 및 b) 이 징크 핑거 도메인에 대하여 이종인 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어 N-말단에 코딩된 폴리펩타이드의 분비를 유도할 수 있는 시그날 서열을 포함할 수 있다. 시그날 서열은, 예를 들어 시그날 펩티다제가 시그날 서열을 제거하기 위한 프로세싱 부위를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 핵산은 하나 이상의 코딩 서열, 예를 들어, DNA 결합 배열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제1 코딩 서열 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제2 코딩 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상술한 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩서열을 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 코딩 서열은 a) 징크 핑거 도메인; 및 b) 이 징크 핑거 도메인에 대하여 이종인 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 폴리펩타이드는 또한 시그날 서열을 포함할 수 있고, 숙주 세포는 예를 들어 시그날 펩타이드의 절단 후에 폴리펩타이드를 분비함으로써 키메라 DNA 결합 단백질을 분비할 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어 약학 조성물에 포함시키기 위한 폴리펩타이드를 생산하는데 유용하다. 숙주 세포는 또한 그 자체가 치료제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 (예, 적합한 섬유아세포 또는 조혈세포)는 대상 내로 도입되어 대상에게 키메라 DNA 결합 단백질을 제공할 수 있다.

또한, 시그날 서열, 다수의 징크 핑거 도메인, 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 세포, 예를 들어 대상 내의 세포에 전달할 수도 있다. 핵산은 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 상피 세포 특이적, B- 또는 T-세포 특이적 프로모터 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 핵산을 전달하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Hollingsworth (1999) Lancet 1999 Apr;353 Suppl 1:SI19-20; Kremer (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44 및 Anderson (1992) Science 256:808-813] 참조.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, (1) a) 유전자와 관련된 표적 부위를 특이적으로 인식하는 DNA 결합 도메인; 및 b) 이 DNA 결합 도메인에 대하여 이종인 단백질 전달 도메인을 포함하는 단백질을 제공하는 단계; 및 (2) 이 단백질을, 단백질이 세포 내로 들어가 유전자의 발현을 조절할 수 있게 하는 조건 하에 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, DNA 결합 도메인은 하나 또는 다수의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 단백질은 효과기 도메인을 포함할 수 있다. 단백질은 본 명세서에 기술된 다른 특징들을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 사용되는 단백질의 양은 100 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 0.50 ㎍/ml, 또는 5 ng/ml 이하일 수 있다.

한 구현예에서, 접촉 후에, 유전자의 발현이 0.5, 1, 2, 2.5, 5, 10, 20 또는 100배 이상 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)된다. 몇몇 단백질들은 다수의 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 어떤 경우에는, 이들 유전자의 일부 또는 모두가 역시 표적 부위와 관련되어 있을 수 있다. 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 또는 1 kb 또는 500, 300, 또는 200 bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 한 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 조절 부위, 예를 들어 내생 인자의 결합 부위와 1 bp 이상 중첩된다. 표적 부위는 또한 인트론 또는 코딩 영역에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서는, 단백질이 결합하는 특정 표적 부위를 알고 있을 필요가 없다. 예를 들어, 단백질이 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 나타내기 위해 다른 특이성 및 기능성 테스트가 사용될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 방법은 세포를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포는 유전자의 발현에 대해 평가될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 표현형, 예를 들어, 유전자의 발현 또는 억제에 의존하는 표현형에 대해 평가된다.

한 구현예에서, 상기 방법은 세포를 대상내로 도입하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 단백질이 MHC 단백질 발현을 감소시킨다면, 세포는 MHC 적합성에 대한 염려 없이 대상내로 일시적 이식을 위해 사용될 수 있다.

다른 태양으로, 본 발명은 세포의 표현형을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (1) a) DNA 결합 도메인; 및 b) 이 DNA 결합 도메인에 대하여 이종인 단백질 전달 도메인을 포함하는 단백질을 제공하는 단계; 및 (2) 이 단백질을, 단백질이 세포 내로 들어가 세포의 표현형 상태를 조절할 수 있게 하는 조건 하에 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, DNA 결합 도메인은 하나 또는 다수의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 단백질은 효과기 도메인을 포함할 수 있다. 단백질은 본 명세서에 기술된 다른 특징들을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 사용되는 단백질의 양은 100 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 0.50 ㎍/ml, 또는 5 ng/ml 이하일 수 있다. 한 구현예에서, 제공 단계는 표현형 스크린을 사용하여 단백질을 세포의 표현형을 조절할 수 있는 단백질로서 동정하는 것을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 접촉 후에, 세포의 정량 가능한 형질이 0.5, 1, 2, 2.5, 5, 10, 20 또는 100배 이상 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)된다. 한 구현예에서, 상기 방법은 세포를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 단백질의 발현에 대해 평가될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 표현형, 예를 들어, 유전자의 발현 또는 억제에 의존하는 표현형에 대해 평가된다.

한 구현예에서, 상기 방법은 세포를 대상내로 도입하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 단백질이 MHC 단백질 발현을 감소시킨다면, 세포는 MHC 적합성에 대한 염려 없이 대상내로 일시적 이식을 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 단백질이 인슐린 발현을 증가시킨다면, 단백질이 대상내의 인슐린 농도를 증가시키도록 세포를 변형시키거나, 단백질에 의해 변형된 세포를 대상에게 투여하여 인슐린 농도를 증가시킬 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 신생물 질환을 가지거나 가질 위험이 있는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암 촉진 유전자, 예를 들어, 발암 유전자 또는 VEGF-A를 조절(예, 억제)할 수 있는 전달가능한 단백질을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 전달가능한 단백질은 징크 핑거 도메인의 배열과 같은 DNA 결합 도메인, 단백질 전달 도메인, 및 임의로 효과기 도메인을 포함한다. 단백질은 신생물 질환의 위험을 감소시키기 위해, 종양의 성장을 감소시키기 위해, 혈관생성을 감소시키기 위해, 또는 신생물 질환의 증상을 하나 이상 완화시키기 위해 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 상기 감소는 검출가능하거나 통계적으로 유의미한 감소이다. 예를 들어, 대상은 인간, 예를 들어, 성인 또는 청소년이다. 예를 들어, 대상은 암종 또는 육종을 가질 수 있다.

다른 태양으로, 본 발명은 대상의 세포 내에서 유전자 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, DNA 결합 도메인 및 이종의 단백질 전달 도메인을 포함하고, 대상이 세포 내에서 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있는 키메라 DNA 결합 단백질을 제공하는 단계, 및 제1 투여량의 DNA 결합 단백질을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 제2 투여량의 DNA 결합 단백질을 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 투여량은 약 6, 12, 18, 24, 48, 96 또는 120 시간 이상 분리될 수 있다. 한 구현예에서, 제1 투여량은 제2 투여량보다 10, 25, 40, 50, 또는 80 % 이상 적다. 다른 구현예에서, 제1 투여량은 제2 투여량과 같다. 또 다른 구현예에서, 제1 투여량과 제2 투여량은 동일하다.

한 구현예에서, 대상은 신생물 질환을 가지거나 가질 것으로 의심되고, DNA 결합 단백질은 그것이 대상의 세포 내에서 혈관생성을 조절하는 유전자 (예, VEGF-A)의 전사를 조절하도록 효과기 도메인을 추가로 포함한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 DNA 결합 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질의 투여량을 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 단백질은 세포에서 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있고, 투여량은 내생 유전자의 전사를 6, 12, 18, 24, 48, 96, 또는 120 시간 이상 조절하기에 효과적이다. 이 방법은 접촉한 지 6, 12, 18, 24, 48, 96, 또는 120 시간 이상 후에, 세포를 제2 투여량의 DNA 결합 단백질과 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 외생 폴리펩타이드를 포함하되 상기 외생 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 포함하지 않는 포유동물 세포에 관한 것으로, 여기에서 상기 외생 폴리펩타이드가 DNA 결합 도메인 및 상기 DNA 결합 도메인에 대해 이종인 단백질 전달 도메인을 포함한다. 외생 폴리펩타이드는 세포 내로 도입된 후 6, 12, 24, 36, 48, 또는 96시간 이상(예를 들어 12 내지 96시간 또는 48 내지 96시간)동안 세포 내에서 내생 유전자의 선택된 하위집합(subset)의 전사를 조절하는 기능이 있다. 한 구현예에서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거 도메인, 예를 들어, 다수의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 예를 들어, 징크 핑거 도메인은 천연형 징크 핑거 도메인, 예를 들어 인간 징크 핑거 도메인이다. 포유동물 세포는 인간 세포, 예를 들어, 섬유아세포, 조혈세포, 신경세포, 내피세포, 또는 표피세포일 수 있다. 포유동물 세포는 이 포유동물 세포가 외생 폴리펩타이드를 포함하지 않았을 경우에는 존재하지 않거나 변경되었을 표현 형질을 특징으로 한다. 예를 들어, 포유동물 세포의 증식 상태는 외생 폴리펩타이드에 따라 달라질 수 있다. 포유동물 세포는 대상 포유동물에 (예, 포유동물 자신의 세포로서 또는 외생적으로 도입된 세포로서) 존재할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포는 인간에 존재할 수 있다. 예시적 인 포유동물 배양 세포는 HEK293 세포이다. 다른 예에서, 포유동물 세포는 대상을 치료하기 위해 사용되는 주요 세포이다. 다른 구현예에서, 외생 폴리펩타이드는 MHC 단백질의 발현을 억제한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 변형된 세포를 포함하는 인간이 아닌 포유동물에 관한 것이다. 세포는 DNA 결합 도메인 및 상기 DNA 결합 도메인에 대해 이종인 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 도입에 의해 변형된다. 변형된 세포는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다. 예를 들어, 상기 포유동물은 상기 외생 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물로 처리되거나 상기 외생 폴리펩타이드와 접촉한 세포로 처리되었을 수 있다. 상기 외생 폴리펩타이드는 세포 내로 도입된 후 6, 8, 12, 24, 36, 48, 또는 96 시간 이상 동안 세포 내에서 기능을 가질 수 있다. 폴리펩타이드는 본원에 기술된 폴리펩타이드일 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 특정 DNA 부위에 75, 50, 25, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 또는 0.05 nM 이하의 친화도로 결합하는 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계; 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 서열을 제1 서열과 해독틀이 맞도록 포함하고, DNA 결합 도메인과 단백질 전달 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하도록 핵산을 변형시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 전달가능한 전사 인자를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

변형 단계는 연결, 생체 외 또는 생체 내 재조합, 및 PCR 증폭 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형 단계는 제1 서열의 한 영역 또는 그의 상보물 및 제1 서열의 한 영역 또는 그의 상보물에 어닐링(annealing)하는 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR 증폭을 포함한다.

상기 방법은 변형된 핵산을 세포 (예, 원핵 또는 진핵 세포)에 도입하고, 세포를 변형된 핵산이 발현되고 융합 단백질이 생산되는 조건 하에 유지하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법은 융합 단백질을 변형된 핵산을 포함하지 않는 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포의 다른 성분들, 예를 들어 세포막으로부터 융합 폴리펩타이드를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포 주위의 배지를 분리하고, 임의로 배지를 가공하여 폴리펩타이드를 배지에서보다 농축된 형태로 얻는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 융합 폴리펩타이드를 물 외의 약학적으로 허용되는 담체와 배합하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 조성물은 물을 추가로 포함할 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 1) a) 징크 핑거 도메인; 및 b) 이종 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열, 및 2) 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 상기 핵산을 폴리펩타이드가 합성되는 조건 하에 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계; 및 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포 주위의 배지로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는, 전달가능한 DNA 결합 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 다수의 핵산을 포함하는 핵산의 라이브러리로서, 다수 중 각 핵산이 징크 핑거 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 라이브러리에 관한 것이다. 다수의 핵산은 각 핵산이 서로 상이한 징크 핑거 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하도록 각 위치에서 다양하게 변한다. 예를 들어, 다수는 10², 10⁴, 10⁶, 또는 10⁸이상의 상이한 구성원을 포함한다. 한 구현예에서, 다수의 구성원들은 징크 핑거 도메인에 상이한 DNA 접촉 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 다수의 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 본원에 기재된 다른 특징들을 포함할 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 폴리펩타이드의 라이브러리로서, 다수의 폴리펩타이드를 포함하고, 다수의 각 폴리펩타이드는 (a) 다수의 다른 폴리펩타이드들과 다양하게 다른 징크 핑거 도메인, 및 (b) 단백질 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리에 관한 것이다. 예를 들어, 다수는 10², 10⁴, 10⁶, 또는 10⁸이상의 상이한 구성원을 포함한다. 다수의 폴리펩타이드는 본원에 기재된 다른 특징들을 포함할 수 있다. 한 구현예에 있어서, 다수의 구성원들은 징크 핑거 도메인에 상이한 DNA 접촉 잔기를 가진다. 관련된 태양에 있어서, 라이브러리는 다수의 폴리펩타이드를 포함하고, 다수의 각 폴리펩타이드는 (a) 다수의 다른 폴리펩타이드와 다양하게 다른 DNA 결합 도메인, 및 (b) 단백질 전달 도메인을 포함한다.

본 발명은 또한 징크 핑거 단백질의 선별 방법에 관한 것이다. 이 방법은 폴 리펩타이드 (예, 본 명세서에 기재된 전달가능한 폴리펩타이드)의 라이브러리를 제공하는 단계; 라이브러리로부터의 다수의 폴리펩타이드를, 다수의 폴리펩타이드가 세포 내로 들어가고 세포들은 각 세포에 들어가는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하지 않도록 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 세포의 특성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 다수 중 각 폴리펩타이드를 상이한 세포와 접촉시키고, 각각의 상이한 세포의 특성을 평가한다. 예를 들어, 평가 단계는 마이크로어레이, RT-PCR, 노던 분석, 또는 웨스턴 분석을 포함할 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 전달가능한 DNA 결합 단백질을 평가하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 전달가능한 DNA 결합 단백질을 제공하는 단계; 전달가능한 DNA 결합 단백질을 대상에게 투여하는 단계; 및 대상을 조사하는 단계를 포함한다. 대상은 전달가능한 DNA 결합 단백질에 의해 영향을 받는 변수에 대해 조사된다. 예를 들어, 대상 내의 하나 이상의 세포, 조직 또는 부위를 평가함으로써 대상을 조사할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조사 단계는 대상을 영상화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 전달가능한 DNA 결합 단백질이, 예를 들어 비-침투성 영상화에 의해 검출가능한 표지, 예를 들어, MRI 검출 가능한 표지로 표지된다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 진핵 세포 내에서 유전자 발현을 변경 (예, 증가 또는 감소)시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 진핵 세포를 징크 핑거 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 키메라 DNA 결합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 단백질은 세포 내에서 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 진핵 세포는 통상적으로 포유동물 세포, 예를 들어, 인간, 설치류, 소 또는 개과 세포이다. 세포는 배양 세포일 수 있으며, 예를 들어 조직 배양으로 유지된다. 어떤 경우에, 세포는 대상, 예를 들어 인간 대상으로부터 얻어지거나 대상 내에 있다. 예를 들어, 접촉은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.

한 구현예에서, 키메라 DNA 결합 단백질은 다수의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 이 단백질은 다수의 징크 핑거 도메인, 예를 들어, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯 개의 징크 핑거 도메인, 또는 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 단백질은 징크 핑거 도메인의 어레이(array)를 포함한다.

단백질은 또한 하나 이상의 다음과 같은 특징들을 포함할 수 있다: 핵 위치 시그날, 이량체화 도메인, 세포 표적화 도메인, 세포 표면 단백질 결합 도메인, 정제 도구 및 효과기 도메인. 단백질은 또한 하나 이상의 비-펩타이드 중심(backbone) 결합 또는 인공 아미노산을 포함할 수 있다. 세포 표적화 도메인은 면역글로불린 가변 도메인, 성장 인자, 바이러스 단백질의 세포 결합 도메인, 또는 세포외 단백질의 세포 결합 도메인을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 바이러스 서열, 예를 들어, 자연적으로 인간에 감염되는 바이러스, 예를 들어, HIV 바이러스로부터의 서열을 포함한다. 예시적인 단백질 전달 도메인은 HIV TAT 단백질 전달 도메인, 예를 들어, 아미노산 서열: YGRKKRRQRRR (서열번호: 1)이다. 바이러스 서열은 5-50, 또는 8-20 아미노산 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 포유동물 서열, 예를 들 어 인간 단백질로부터의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 단백질 전달 도메인은 인공 서열, 예를 들어, 디스플레이 라이브러리에서 전달 도메인으로 동정된 서열을 포함한다. 예를 들어, 단백질 전달 도메인은 서열번호: 69 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 변이된 tat 단백질 전달 도메인, 6 내지 12개의 아르기닌 잔기로 이루어진 폴리아르기닌 올리고펩타이드를 포함할 수 있다.

내생 유전자는 임의의 내생 유전자, 예를 들어, 쥰 B 원암유전자, 단백질 카이네이즈 C, 렉틴, 뇌-특이적 Na-의존성 무기 인산염 공동수송체, 세포 레티노산-결합 단백질 1, 세포 레티노산-결합 단백질 2, 캐드헤린 13, H-캐드헤린(심장), 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF-A), 색소 상피-유래 인자(PEDF), 분화-관련 유전자-1 (Drg-1), 전사 인자 E2F, 초기 성장 반응-1 (EGR-1), 단백질 타이로신 포스파테이즈 1B (PTP-1B), A20, Fas, 흑색종 분화 관련 유전자-7 (MDA-7), 프레세닐린-1 (PS-1), 안지오텐신 전환 효소, 안지오포이에틴-2, b-시크리테이즈 (BACE1), mmp3, CHFR (checkpoint with forkhead associated and ring finger), 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPAR-gamma), TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL), Ku-80, ATM(ataxia-telangiectasia mutated), BRCA, CC-케모카인 리셉터 5 (CCR5), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양괴사인자 알파-유도된 단백질-3 (TNFAIP3)(A20), c-myc, 하이폭시아-유도성 인자-1 알파 (HIF-1알파), 캐스페이즈-3, 세포간 접착 분자 타입 I (ICAM-1), 안지오텐신 II 수용체 1 (AT-1R), 혈소판-유래 성장인자, 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II, 신경 성장인자, aFGF, bFGF, 표피세포 성장인자 (EGF), TNF-α 및 TNF-β, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 뮤 신, 성장 호르몬, 프로인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 티록신, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 인자 VIII, 조혈 성장 인자, 엔케팔리나제, MIS (Mullerian-inhibiting substance), 고나도트로핀-관련 펩타이드, 조직 인자 단백질, 인히빈, 액티빈, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12 및 IL-13일 수 있다.

한 구현예에서, 상기 키메라 DNA 결합 단백질은 표적 유전자에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 키메라 DNA 결합 단백질은 전사 개시 부위의 1000, 500, 300, 100, 70, 50, 20 또는 10 염기쌍 내의 부위, 예를 들어, 상류 또는 하류에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 키메라 DNA 결합 단백질은 TATA 박스의 1000, 500, 300, 100, 70, 50, 20 또는 10 염기쌍 내의 부위에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 키메라 DNA 결합 단백질은 내생 유전자의 조절 영역에서 천연형 전사 인자가 결합하는 부위의 100, 80, 70, 50, 30, 20, 또는 10 염기쌍 내의 부위 또는 상기 결합부위와 중첩되는 부위에 특이적으로 결합한다. 한 구현예에서, 키메라 DNA 결합 단백질은 내생 유전자의 발현을, 예를 들어, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 또는 500% 이상 증가시킨다. 다른 구현예에서, 키메라 DNA 결합 단백질은 내생 유전자의 발현을 예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 2% 미만으로 감소시킨다.

다른 구현예에서, 조사 단계는 대상 내에서 전달가능한 DNA 결합 단백질의 반감기를 결정하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 조사 단계는 대상 내에서 하 나 이상의 세포에 대하여 전사 프로파일(profile)을 결정하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 조사 단계는 대상 내에서 하나 이상의 세포에 대하여 단백질 발현 또는 변형 상태의 프로파일을 결정하는 것을 포함한다.

용어 "해리 상수(dissociation constant)"는 분석중인 폴리펩타이드에 대한 하나의 표적 부위를 포함하는 28-bp 이중 가닥 DNA에 결합하는 폴리펩타이드의 평형(equilibrium) 해리 상수(K_d)를 말한다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 3-핑거 DNA 결합 도메인을 가진다면, DNA는 폴리펩타이드가 특이적으로 인식하는 9-bp 또는 그보다 큰 표적 부위를 포함할 것이다. 해리 상수는 20 mM Tris pH 7.7, 120 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 10% 글리세롤, 0.1% 노니뎃(Nonidet) P-40, 5 mM DTT, 및 0.10 mg/mL BSA(bovine serum albumin), 실온의 조건에서 결합하는 정제된 단백질을 사용한 겔 이동 분석(gel shift analysis)에 의해 결정된다. 더 자세한 것은 하기 실시예 및 레바와 파보의 논문(Rebar and Pabo(1994) Science 263:671-673)에서 제공된다. 28-bp보다 큰 부위에 결합하는 폴리펩타이드는 더 큰 이중-가닥 DNA를 사용하여 분석할 수 있다. 예시적인 해리상수는 10^-7, 10^-8 10^-9, 10^-10, 10^-11 또는 10^-12 M 이하일 수 있다.

용어 "하이브리드"및 "키메라"는 (i) 두 개 이상의 상이한 천연형 서열, 또는 동일한 천연형 서열의 인접하지 않은 영역으로서, 하이브리드 내에서 인접하게 된 것; (ii) 하나 이상의 인공 서열(즉, 천연형이 아닌 서열) 및 하나 이상의 천연 형 서열; 또는 (iii) 두 개 이상의 인공 서열(동일 또는 상이함)에서 유래된 아미노산 서열을 포함하는 비-천연형 폴리펩타이드를 말한다.

서열을 기술할 때, 용어 "천연형"은 천연의 유기체, 즉 분자생물학적 기술에 의해 변형되지 않은 유기체의 세포에 존재하는 서열 (예, 핵산 또는 아미노산 서열)을 말한다. 예를 들어, 유전자전이 마우스는 천연의 유기체가 아니지만, 분자생물학적 기술에 의해 변형되지 않은 고도로 근친교배시킨 마우스는 천연형으로 간주된다. 서열을 기술할 때, 용어 "바이러스성"은 천연형 바이러스, 즉, 분자생물학적 기술에 의해 변형되지 않은 바이러스의 서열을 말한다. 본 발명의 한 구현예는 인간(Homo sapiens), 쥐(Mus musculus), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 초파리(Drosophila melanogaster), 대장균(Escherichia coli), 효모(Saccharomyces cerevisiae), 및 벼(Oryza sativa)로부터의 징크 핑거 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다.

"인공 서열"은 인공적인 수단에 의해 제조된 서열이다. 인공 서열의 예는 부위 특이적 돌연변이 또는 무작위 돌연변이에 의해 생성된 천연형 서열의 변이체 및 새로이(de novo) 고안된 서열을 포함한다.

용어 "융합"은 융합되는 구성요소들을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 말한다. 예시적인 융합 단백질은 DNA 결합 단백질 및 단백질 전달 도메인이다 융합된 성분들은 직접 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 다른 서열(예, 링커 또는 기능성 도메인)이 융합된 요소들 사이에 위치할 수 있다.

용어 "외생 폴리펩타이드" 또는 "외생 단백질"은 인공적으로 세포 내로 도입 된 폴리펩타이드 또는 단백질을 말한다.

용어 "분리된"이란 시료(예, 천연 시료 또는 세포, 예를 들어 재조합 세포) 또는 분리된 조성물이 얻어질 수 있는 합성 반응물의 하나 이상의 성분의 90% 이상으로부터 분리된 조성물을 기술한다. 인공적으로 또는 자연적으로 생산된 본 명세서에 기술된 조성물은 관심 종(species)의 종 또는 집단이 중량 기준으로 각각 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 95, 98, 또는 99 % 이상 순수하면 특정 순도 "이상의 조성물"일 수 있다.

용어 "전달가능한"은 생물학적 막을 통과하여 포유동물 세포로 들어갈 수 있는 조성물을 기술한다. 용어 "단백질 전달 도메인" 및 "PTD"는 생물학적 막, 특히 세포 막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 말한다. 이종 폴리펩타이드에 부착될 때, PTD는 이종 폴리펩타이드의 생물학적 막을 통한 이동을 향상시킨다. 용어 "PTD"는 핵 외피에 있는 기공을 통한 화합물의 수송을 용이하게 하는 핵 위치 시그날을 말하는 것은 아니다. 핵으로 들어가는 단백질들은 실제적인 막 이중층을 통과하지 않는다.

용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 세 개 이상의 아미노산의 중합체를 말한다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 비 천연형 아미노산을 포함할 수 있다. 통상적으로, 폴리펩타이드는 천연형 아미노산만을 포함한다. 용어 "펩타이드"는 3 내지 32개 아미노산 길이인 폴리펩타이드를 말한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 따라서 용어 "단백질"은 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포괄한다. 단백질 또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형, 예를 들어, 천연적 변형 또는 인공적 변형을 역시 포함할 수 있다. 용어 "도메인"은 폴리펩타이드 내의 기능성 단위를 말한다. 도메인의 3차 구조는 접혀있거나 풀려있을 수 있다.

용어 "외생"은 외부로부터 공급된 인자를 말한다. "내생"은 예를 들어 바이러스, 및 염색체 유전자, 예를 들어, 변형되지 않은 세포 내에 존재하는 천연형 염색체 유전자에 의해 도입된 바이러스 유전자를 포함하는, 세포내의 임의의 유전자를 말한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 천연형 내생 유전자, 특히 변형되지 않은 세포 내에 있는 것들을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 내생 유전자를 조절하기 위한 방법은 외생 유전자, 예를 들어, 리포터 유전자 및 가공된 재조합 핵산과 같이 인공에 의해 세포 내로 도입된 유전자를 조절하기 위해 역시 확장될 수 있다.

용어 "라이브러리"는 상이한 분자들의 집합을 의미한다. 라이브러리는 다양한 형태로 저장될 수 있다. 예를 들어, 집합의 각 구성원은 집합의 다른 구성원과 함께, 예를 들어, 집합의 모든 다른 구성원과 함께 용기(container) 내에 존재할 수 있다. 다른 예에서, 집합의 각 구성원은 집합의 다른 구성원으로부터 분리된다. 예를 들어, 라이브러리 구성원들은 배열되거나 웰 또는 바이알에 분리되어 저장될 수 있다. 라이브러리는 특정 성질을 갖는 다수의 구성원을 포함할 수 있다. 그러한 라이브러리는 또한 다른 구성원들, 예를 들어, 특정 성질을 갖지 않는 다른 다수의 구성원을 포함할 수 있다. 라이브러리에 대한 정보, 특히 라이브러리의 구성원에 대한 정보를 컴퓨터 데이터베이스에 저장할 수도 있다.

본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허출원, 및 참고문헌은 그 전체가 인용된다. 다음의 특허 출원 즉, WO 01/60970(Kim 등); 2002년 8월 19일에 출원된 미국출원 제10/223,765호, 2002년 12월 9일에 출원된 미국출원 제10/314,669호, 2002년 12월 9일에 출원된 미국출원 제60/431,892호, 및 2003년 3월 7일에 출원된 미국 출원 제60/453,111호, 미국출원 제60/477,459호는 모든 목적에서 전체로서 명백히 인용된다. 하나 이상의 본 발명의 구현예의 구체적인 내용은 첨부 도면 및 하기 기재에 나타나 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 특징은 본 명세서에 역시 기재된 다른 혼용가능한 특징과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 잇점은 이 기재 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 후의 정제된 TAT-F435-KOX 단백질의 젤을 나타낸다.

도 2는 이온 교환 크로마토그래피 후의 정제된 TAT-F435-KOX 단백질의 젤을 나타낸다.

도 3은 TAT-F435-p65 또는 TAT-F435-KOX에 의한 내생 VEGF 발현의 활성화 또는 억제를 나타낸다.

도 4는 H460 세포에서 TAT-F435-KOX에 의한 VEGF-A 단백질 생산의 억제를 나타낸다.

도 5는 Ni-NTA 정제된 TAT-F435-KOX의 안정성을 나타내는 것으로, A는 배양 배지에서 배양된 단백질을 이용한 웨스턴 블럿의 결과를 나타내고, B는 배양 배지에서 배양하기 전에 프로테아제 저해제 칵테일로 처리된 단백질을 이용한 웨스턴 블럿의 결과를 나타낸다.

도 6은 전달 후 다양한 시점에 H460 세포로부터 검출된 TAT-F435-KOX 단백질을 이용한 웨스턴 블럿의 결과를 나타낸다.

본 발명은 부분적으로, 생물학적 막을 통과할 수 있는 인공 DNA 결합 단백질을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 단백질은 세포외 환경으로 전달되는 치료제로서 사용될 수 있다. 이후, 단백질은 세포 내로 들어가 목적하는 치료효과를 일으킨다. 전달가능한 DNA 결합 단백질은 통상적으로 단백질 전달 도메인(PTD)을 포함한다.

본 발명은 전달가능한 DNA 결합 단백질이 세포 내로 들어가 유전자 발현을 조절할 수 있다는 것을 입증하는 실제적인 결과를 포함한다. 따라서, 전달가능한 DNA 결합 단백질은 단백질성 제제, 특히 세포로 전달될 수 있는 단백질성 약물로서 사용될 수 있다. 이 단백질은 임의의 적용가능한 경로에 의해 또는 다중 경로에 의해 전달될 수 있다. 따라서, PTD-ZFP 융합 단백질과 같은 전달가능한 DNA 결합 단백질은 질환, 질병 또는 다른 이상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 시험관내 및 생체내 연구 도구로 사용될 수 있다.

한 구현예에서, 전달가능한 DNA 결합 단백질은 하나 이상의 징크 핑거 도메인, 예를 들어, 천연형 징크 핑거 도메인을 포함한다. 예를 들어, 천연형 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 징크 핑거 단백질이 포유동물 세포에서 내생 VEGF를 조절하기 위해 고안될 수 있다.

한 구현예에서, 전달가능한 DNA 결합 단백질은 선택된 세포, 조직 또는 기관을 표적으로 한다.

단백질 전달 도메인

"단백질 전달 도메인"또는 "PTD"는 생물학적 막, 특히 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열이다. 이종 폴리펩타이드에 부착되면, PTD는 생물학적 막을 통한 이종 폴리펩타이드의 이동을 촉진할 수 있다. PTD는 전형적으로 이종 DNA 결합 도메인에 (예를 들어, 펩타이드 결합에 의하여) 공유결합 되어 있다. 예를 들어, PTD와 이종 DNA 결합 도메인은 단일 핵산에 의하여, 예를 들어, 공통적인 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 또는 공통 유전자의 하나 이상의 엑손에 의하여 코드될 수 있다. 예시적인 PTD는 10-30개의 아미노산을 포함하며 양친매성 나선을 형성할 수 있다. 많은 PTD들은 염기성 특성을 가진다. 예를 들어, 염기성 PTD는 4, 5, 6, 또는 8개 이상의 염기성 잔기 (아르기닌 또는 라이신)를 갖는다. PTD는 세포벽이 없는 세포 또는 특정 종의 세포, 예를 들어, 진핵세포, 예를 들어, 척추동물 세포, 예를 들어, 인간, 유인원, 쥐, 소, 말, 고양이, 양과 세포와 같은 포유동물 세포 안으로 폴리펩타이드의 이동을 촉진할 수 있다.

PTD는 예를 들어, 유연성 링커 (flexible linker)를 사용하여 인공 전사 인자와 연결될 수 있다. 유연성 링커는 자유 회전을 부여하기 위하여 하나 또는 그 이상의 글라이신 (glycine) 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, PTD는 전사인자의 DNA 결합 도메인으로부터 10, 20, 또는 50개 아미노산 이상 간격을 둘 수 있다. PTD는 DNA 결합 도메인을 기준으로 N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다.

특정 도메인에 대하여 N- 또는 C-말단에 위치하는 것은 그 특정 도메인에 인접할 것을 요구하는 것은 아니다. 예를 들어, DNA 결합 도메인에 대하여 N-말단에 있는 PTD는 스페이서 및/또는 다른 형태의 도메인에 의하여 DNA 결합 도메인으로부터 분리될 수 있다.

PTD는 화학적으로 합성되어 링커 펩타이드의 존재 또는 부재 하에, 별도로 제조된 DNA 결합 도메인에 화학적으로 접합될 수 있다.

인공 전사 인자는 또한 복수의 PTD, 예를 들어 복수의 상이한 PTD 또는 2 카피 이상의 동일한 PTD를 포함할 수 있다.

예시적인 PTD는 안테나페디아(antennapedia) 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP22 단백질 및 HIV TAT 단백질에서 유래한 하기 절편들을 포함한다.

Tat. 인간 면역결핍 바이러스 타입 I (HIV-I)에서 유래한 Tat 단백질은 외부에서 가해질 때 세포 내로 들어가는 놀라운 능력을 가지고 있다 (Frankel A.D. and Pabo C.O. (1988) Cell 55:1189-1193, Mann D.A and Frankel A.D. (1991) EMBO J. 10:1733-1739, Fawell et al. (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:664-668). 최소 Tat PTD는 인간 면역결핍 바이러스 Tat 단백질의 47-57번 잔기를 포함한다:

YGRKKRRQRRR (서열번호: 1)

이 펩타이드 서열은 본 명세서에서 "TAT"으로 언급된다. 이 펩타이드는 시험관 내 및 생체 내에서 100 kDa 이상의 이종 펩타이드 및 단백질을 포유동물 세포 내로 도입하는 것을 성공적으로 매개하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Ho et al. (2001) Cancer Res 61(2):474-7). 슈와르츠(Schwarze) 등은 TAT과 융합된 120 kDa β-갈락토시다제 단백질이 마우스에 복강내로 주입될 때, 융합 단백질이 심지어 혈액-뇌-장벽 때문에 어렵다고 생각되어 온 뇌를 포함한 모든 타입의 세포 및 조직에서 발견되었음을 보였다(Schwarze et al. (1999) Science 285(5433):1466-7).

안테나페디아 ( Antennapedia ). 안테나페디아 호메오도메인도 PTD 펩타이드를 포함한다 (Derossi et al. (1994) J. Bio. Chem . 269:10444-10450). "페네트라틴 (penetratin)"으로도 불리우는 이 펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

AKIWFQNRRMKWKKEN (서열번호: 2)

VP22 . HSV VP22 단백질도 PTD를 포함한다. 이 PTD는 VP22 C-말단 34 아미노산 잔기에 위치한다:

DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (서열번호: 3)

엘리옷 및 오헤어(Elliott and O'Hare, 1997, Cell 88:223-234) 및 미국 특허 제6,184,038호 참조.

인간 PTD . 한 구현예에서, PTD는 인간 또는 다른 포유동물 단백질에서 얻어진다. 예시적인 포유동물 PTD는 WO 03/059940 (인간 SIM-2) 및 WO 03/059941 (Mph)에 기재되어 있다.

세포-특이적 PTD . 몇몇 PTD들은 특정 세포 타입 혹은 상태에 특이성을 갖는다. 세포-특이적 PTD의 한 예는 미국 출원 공개 제2002-0102265호에 기재된 Hn1 합성 펩타이드이다. Hn1은 인간 두경부 편평세포암(head and neck squamous carcinoma) 세포에 의하여 내부로 받아들여지고, 인공전사인자가 두경부 암종과 같은 암종을 표적으로 하는데 사용될 수 있다. Hn1 합성 펩타이드의 서열은 하기 서열 또는 밀접하게 관련된 서열을 포함한다:

TSPLNIHNGQKL (서열번호: 4)

미국 출원 공개 제2002-0102265호는 파아지 디스플레이를 사용하여 세포-특이적 PTD로 기능할 수 있는 다른 펩타이드 또는 단백질을 동정하는 일반적 방법을 역시 기재하고 있다. 뉴 잉글랜드 바이오랩스사 (New England BioLabs; Beverly, Mass.)로부터의 M13 파지 펩타이드 라이브러리 PhD-12와 같은 무작위 펩타이드를 전시하는 파지 디스플레이 라이브러리를 배양 배지에서 표적 세포, 예를 들어 암세포와 함께 배양한다. 내부로 들어간 파지를 TX-100 (1%)으로 37℃에서 30분간 용해시킴으로써 회수하고, 숙주 대장균 균주에서 증폭시킨다. TX-100은 핵산을 용해시키지 않지만, 핵막을 파괴할 수 있는 이온성 세제는 파지를 불활성화시킬 수 있으므로 피한다. 그 후, 분리된 파지를 정상적인 인간 섬유아세포와 같은 비-표적 세포에 대해 대응선별한다. 표적 세포에만 들어가는 파지를 서열분석하고 재시험한다. 다른 예시적인 방법에 대해서는 미국 특허 제6,451,527호 참조.

합성 PTD . 최소 Tat PTD (aa 47-57)은 단백질 전달 능력을 최적화하도록 변형되었다 (Ho et al. (2001) Cancer Res 61(2):474-7). 일련의 합성 PTD와 결합된 FITC가 배양된 T 임파구를 이용하여 시험되었다. 몇몇 합성 PTD는 Tat PTD에 비해 향상된 단백질 전달을 나타내었다. 그러한 PTD로는 다음의 서열이 포함된다:

YARKARRQARR (서열번호: 69 )

YARAARRAARR (서열번호: 70)

YARAARRAARA (서열번호: 71)

YARAAARQARA (서열번호: 72)

특히, 합성 PTD (YARAAARQARA; 서열번호: 72)와 결합된 FITC가 복강내 주사된 마우스에서 전혈(whole blood cells)에 의한 증가된 흡수를 보였다.

6 내지 12개의 아르기닌 잔기로 구성된 폴리-아르기닌 펩타이드 역시 몇몇 경우에 단백질 전달을 매개할 수 있다. 폴리-아르기닌에 대한 추가 정보에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Rothbard JB et al. Nat Med . 2000 6 (11):1253-7; Wender PA et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97(24):13003-8] 참조.

PTD에 대한 추가적 정보를 위하여 미국 출원 공개 제2003-0082561호, 제2002-0102265호 및 제2003-0040038호, Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572; Derossi et al. (1996) J. Biol . Chem . 271:18188; Hancock et al. (1991) EMBO J. 10:4033-4039; Buss et al. (1988) Mol . Cell. Biol . 8:3960-3963; Derossi et al. (1998) Trends in Cell Biology 8:84-87; Lindgren et al. (2000) Trends in Pharmacological Sciences 21:99-103; Kilic et al. (2003) Stroke 34:1304-10; Asoh et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(26):17107-12; Tanaka et al. (2003) J Immunol . 170(3):1291-8를 또한 참조할 수 있다.

PTD 외에도, 세포 흡수 시그날이 사용될 수 있다. 그러한 시그날은 세포 수용체 또는 다른 표면 단백질에 의해 특이적으로 인식되는 아미노산 서열을 포함한다. 세포 흡수 시그날과 세포의 상호작용은 세포 흡수 시그날을 포함하는 인공 전사 인자의 내부도입을 일으킨다. 몇몇 PTD는 또한 세포 수용체 또는 다른 표면 단백질과 상호작용하여 기능할 수 있다.

단백질 전달 분석. 어떤 아미노산 서열이 PTD로서 기능할 수 있는지를 결정하기 위해 다수의 분석법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열을 β-갈락토시다제와 같은 리포터 단백질과 융합시켜 융합 단백질을 형성할 수 있다. 융합 단백질을 배양 세포와 접촉시킨다. 세포를 세척한 후 리포터 활성에 대해 분석한다. 이 분석법의 특정 구현예가 실시예 2(1)에 기술되어 있다.

다른 분석법은 문제의 아미노산 서열 또는 다른 검출가능한 서열, 예를 들어 에피토프 택(tag)을 포함하는 융합 단백질의 존재를 검출한다. 이 융합 단백질을 배양 세포와 접촉시킨다. 세포를 세척한 후 세포에서 검출가능한 서열의 존재를 검출하기 위해 웨스턴 블럿 또는 면역형광에 의해 분석한다. 이 분석법의 특정 구현예가 실시예 2(1)에 기술되어 있다.

또 다른 분석법이 추정 PTD, 문제의 아미노산, DNA 결합 도메인, 및 임의로 효과기 도메인을 포함하는 융합 단백질의 전사 조절 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질과 접촉한 세포를 예를 들어, 마이크로어레이, 질량분석법 및 고효율 기술을 사용하여, mRNA 또는 단백질의 존재 또는 수준에 대해 분석할 수 있다.

인공 전사 인자의 구성요소

인공 전사 인자는 하나 또는 다수의 DNA 결합 도메인, 예를 들어, 다수의 징크 핑거 도메인을 포함하는 DNA 결합 영역을 포함할 수 있다. 전사 인자는 또한 핵 위치 시그날 및 효과기 도메인, 예를 들어, 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다.

DNA 결합 도메인. 다양한 단백질 구조물이 높은 친화도 및 높은 특이성으로 핵산에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이러한 구조물은 핵산 기능을 특이적으로 조절하기 위해 무수한 상이한 단백질에서 반복적으로 사용된다 (이중 가닥 DNA를 인식하는 구조적 모티프에 대한 개설은, 예를 들어 문헌[Pabo와 Sauer (1992) Annu . Rev. Biochem. 61:1053-95; Patikoglou와 Burley (1997) Annu . Rev. Biophys . Biomol. Struct. 26:289-325; Nelson (1995) Curr Opin Genet Dev . 5:180-9] 참조). DNA 결합 도메인의 예는 헬릭스-루프-헬릭스 도메인, 헬릭스-턴-헬릭스 도메인, 호메오도메인, 및 징크 핑거 도메인을 포함한다. 유용한 DNA 결합 도메인을 동정하는 방법은 하기에 논의된다.

징크 핑거 . 징크 핑거 도메인 (ZFD)은 대략 30 개의 아미노산 잔기로 된 작은 폴리펩타이드 도메인으로서, 그 중 시스테인 또는 히스티딘인 4 개의 아미노산 잔기가 적절히 배치되어 아연 이온과 배위 결합을 할 수 있다 (개설에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem . Sci . 12: 464-469 (1987); Evans and Hollenberg, (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett . 234: 245-250; Miller et al., (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:99-102; 및 Rosenfeld and Margalit, (1993) J. Biomol . Struct . Dyn . 11: 557-570] 참조). 따라서, 징크 핑거 도메인은 아연 이온과 배위결합을 하는 잔기의 종류에 따라, 예를 들어 Cys₂-His₂ 류, Cys₂-Cys₂ 류, Cys₂-CysHis 류 등으로 분류할 수 있다. Cys₂-His₂ 징크 핑거에서 아연과 배위결합하는 잔기는 전형적으로 다음과 같이 배치되어 있다:

C-X_{2 -5}-C-X₃-X_a-X₅-ψ-X₂-H-X_{3 -5}-H (서열번호: 5)

여기에서 ψ(프사이)는 소수성 잔기이고(Wolfe et al., (1999) Annu . Rev. Biophys. Biomol . Struct. 3:183-212), "X"는 임의의 아미노산을 나타내고, X_a는 임의의 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌 또는 티로신)을 나타내고, 아래 첨자는 아미노산의 개수를 가리키고, 하이픈으로 연결된 두 개의 아래 첨자는 개입하는 아미노산의 전형적인 범위를 가리킨다. 비록 역평행(anti-parallel) β-시트는 짧고 비이상적이고 존재하지 않을 수 있지만, 전형적으로, 사이의 아미노산은 폴딩되어 α-헬릭스에 대하여 충전되는 역평행 β-시트를 형성한다. 폴딩으로 인해, 아연과 배위 결합하는 측쇄가 아연 이온과 배위결합하기에 적합한 사면체 구조를 갖도록 배치된다. 이러한 폴딩은 염기 접촉 잔기가 DNA 이중 나선에 있는 염기쌍을 특이적으로 인식하기에 적당한 배열에 놓이게 한다.

편의를 위해, 징크 핑거 도메인의 주요 DNA 접촉 잔기는 다음 예에 의거하여, -1, 2, 3 및 6으로 번호를 매겼다.

상기 예에 명기한대로, DNA 접촉 잔기는 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 글루타민(E) 및 아르기닌(R)이다. 상기 모티프는 RDER로 줄여서 표기할 수 있다. 본 명세서에 사용된 그러한 생략 표기는 첫번째 시스테인의 두 개 앞의 잔기(서열번호: 6의 시작 잔기)로부터 마지막의 금속-킬레이팅 히스티딘(서열번호: 6의 마지막 잔기)까지의 특정 폴리펩타이드 서열의 압축형이다. 상기 또는 다른 모티프에서, X_a는 흔히 방향족이고, X_b는 흔히 소수성이다. 두 개의 상이한 서열이 같은 모티프를 가질 때에는 각 서열을 구별하기 위해 숫자를 사용할 수 있다(예: RDER1 또는 RDER2).

문맥에서 분명하게 알 수 있는 경우에, 네 글자 압축형은 일반적인 모티프를 지칭한다. 다시 말해, 모티프는 -1, 2, 3 및 6 번 위치의 아미노산을 특정화하는 반면, 다른 위치는 임의의 아미노산일 수 있으며, 전형적으로, 비-시스테인 아미노산이나 반드시 그럴 필요는 없다. 모티프 앞의 소문자 "m"은 상기 약어가 모티프 (motif)를 지칭한다는 것을 명백히 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, mRDER은 -1 위치에 R, 2 위치에 D, 3 위치에 E, 6 위치에 R이 나타나는 모티프를 지칭한다.

징크 핑거 DNA 결합 단백질은 둘 이상의 징크 핑거 도메인, 통상적으로 셋 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 예를 들어, 이 단백질은 넷, 다섯, 여섯, 여덟, 열둘 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 징크 핑거 도메인은 예를 들어 셋 이상의 징크 핑거 도메인의 직렬식 배열을 포함한다. 직렬식 배열은 서로 10개 아미노산 내에 있고 다른 타입의 기능성 도메인에 의해 분리되지 않은 도메인들을 포함한다.

징크 핑거 도메인은 효모로부터 고등 식물 및 인간에 이르는 다양한 종에서 발견된다. 인간 게놈에만도 수 천가지 이상, 아마도 4,500가지 이상의 징크 핑거 도메인이 존재할 것으로 추측된다. 천연형 징크 핑거 도메인은 징크 핑거 단백질에서 동정되거나 그로부터 분리될 수 있다. 징크 핑거 단백질의 비제한적인 예로는 CF2-II; 크룹펠(Kruppel); WT1; 바소누클린(basonuclin); BCL-6/LAZ-3, 적혈구 크룹펠-유사 전사 인자; 전사 인자 Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4; 전사 억제제 YY1; EGR1/Krox24; EGR2/Krox20; EGR3/Pilot; EGR4/AT133; Evi-1; GLI1; GLI2; GLI3; HIV-EP1/ZNF40; HIV-EP2; KR1; ZfX; ZfY; 및 ZNF7 등이 있다.

활성화 도메인. 효과기 도메인 중 한 타입은 전사 활성화 도메인이다. 전사 활성화 도메인은 유전자의 조절 영역에 도입되었을 때 유전자의 전사량을 증가시킨다. 예시적인 활성화 도메인은 효모의 Gal4 활성화 도메인 및 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 도메인을 포함한다. 전사를 활성화하는 도메인의 효능은 상기 도메인을 알려진 DNA 결합도메인과 융합시키고, 상기 알려진 DNA 결합도메인이 인식하는 부위에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자가 상기 융합 단백질에 의하여 활성화되는지를 측정하여 결정할 수 있다.

하나의 예시적 활성화 도메인은 다음의 p65 도메인이다:

YLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQ (서열번호: 7)

예시적인 Gal4 활성화 도메인의 서열은 다음과 같다:

NFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKEISMAYPYDVPDYAS (서열번호: 8)

박테리아에서, 활성화 도메인의 기능은, 야생형 RNA 중합효소 알파 서브유닛 C-말단 도메인 또는 돌연변이 알파 서브유닛 C-말단 도메인, 예를 들면 단백질 상호작용 도메인에 융합된 C-말단 도메인을 소집하는 도메인에 의해 모방될 수 있다.

억제 도메인. 원한다면, 억제 도메인이 (예를 들어, 활성화 도메인 대신에) DNA 결합 도메인에 융합될 수 있다. 진핵세포 억제 도메인의 예로는 Kid, UME6, 오렌지(ORANGE), 그로우초(groucho), 및 WRPW[Dawson et al (1995) Mol . Cell Biol . 15:6923-31] 유래의 억제 도메인이 포함된다. 전사를 억제하는 도메인의 효능은 상기 도메인을 알려진 DNA 결합도메인과 융합시키고, 상기 알려진 DNA 결합도메인이 인식하는 부위에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자가 상기 융합 단백질에 의하여 억제되는지를 측정하여 확인할 수 있다.

예시적 억제 도메인은 UME6 단백질에서 유래한 다음의 도메인이다:

NSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 9)

다른 예시적 억제 도메인은 Kid 단백질에서 유래한 것이다:

VSVTFEDVAVLFTRDEWKKLDLSQRSLYREVMLENYSNLASMAGFLFTKPKVISLLQQGEDPW (서열번호: 10)

KOX 억제 도메인: 이 도메인은 인간 Kox1 단백질 (징크 핑거 단백질 10; NCBI 단백질 데이터베이스 AAH24182; GI:18848329) 유래의 "KRAB" 도메인, 즉 Kox1의 2-97번 아미노산을 포함한다:

DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSV (서열번호: 11)

또 다른 키메라 전사인자들은 활성화 도메인이나 억제 도메인을 갖지 않는다. 그 대신 이러한 전사인자들은 결합된 내생 전사인자 (예를 들어 활성화 인자 또는 억제 인자)를 대체하거나 그것과 경쟁하여 전사를 변화시킨다.

다른 타입의 효과기 도메인들은 하나 이상의 하기 활성과 관련된 도메인을 포함한다: 히스톤 변형 (예를 들어, 아세틸화, 탈아세틸화, 유비퀴틴화), 크로마틴 구조 패키징, DNA 절단, 토포아이소머레이즈 활성, 및 DNA 메틸화 상태 (예를 들어, 메틸화 또는 탈메틸화) 등이 포함된다.

고안된 전사 인자의 추가적인 특징

링커. DNA 결합 도메인들은 다양한 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커의 유용성과 디자인은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다. 특히 유용한 링커는 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 링커이다. 따라서, 제1 DNA 결합 도메인, 펩타이드 링커, 및 제2 DNA 결합 도메인을 코딩하는 합성 유전자를 제조할 수 있다. 이러한 디자인은 대규모의 합성 다수-도메인 DNA 결합 단백질을 제조하기 위해 반복될 수 있다. 국제특허출원 제WO 99/45132호 및 김 및 파보 (Kim and Pabo, 1998, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 95:2812-7)는 징크 핑거 도메인들을 연결하는 데 적합한 펩타이드 링커의 디자인을 기술하고 있다. 징크 핑거 도메인을 활용한 실시를 위해, 징크 핑거 사이에서 자연적으로 발견되는 펩타이드를 핑거들을 함께 연결하기 위한 링커로서 사용할 수 있다. 그러한 자연적으로 발견되는 링커로서 전형적인 것은 Thr-Gly-(Glu-Gln)-(Lys-Arg)-Pro-(Tyr-Phe)이다.

무작위 코일, α-나선 또는 β-주름의 3차 구조를 형성하는 추가적인 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 적합한 유연성 있는 링커를 형성하는 폴리펩타이드는 이 기술분야에서 잘 알려져 있다 (예를 들어, Robinson 등 (1998) Proc . Natl . Acad. Sci . USA. 95:5929-34 참조). 유연성 있는 링커는 전형적으로 글리신을 포함하는데, 이는 글리신이 측쇄가 결여되어 있어서 회전 자유도가 있는 유일한 아미노산이기 때문이다. 친수성을 증가시키기 위하여 세린 또는 트레오닌을 링커에 삽입할 수 있다. 아울러, 결합 친화도를 증가시키기 위해 DNA의 인산 골격과 상호작용할 수 있는 아미노산이 사용될 수 있다. 이러한 아미노산들의 현명한 사용으로 친화도의 증가와 서열 특이성의 감소 사이의 균형을 잡을 수 있다. 만약, 링커가 엄격한 신장성을 요구한다면 문헌 [Pantoliano et al. (1991) Biochem . 30:10117-10125]에 기술된 나선형 링커와 같은 α-나선 링커를 사용할 수 있다. 또한 링커는 컴퓨터 모델링에 의해 디자인될 수 있다 (미국 특허 제4,946,778호 참조). 분자 모델링을 위한 소프트웨어는 상업적으로 입수할 수 있다 (예를 들어 Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA). 이러한 링커는, 단백질 공학 분야에서 실시되는 표준적인 돌연변이 유도 기술 및 적절한 생물리학적 테스트, 및 본 명세서에 기술된 기능적 분석법을 사용하여, 예를 들어, 항원성을 감소시키고/시키거나 안정성을 증가 등을 위해 최적화된다. 상술한 바와 같이, 유연성 링커는 PTD를 DNA 결합 도메인에 연결시키거나, 인공 DNA 결합 단백질의 다른 도메인에 연결시키기 위해서도 역시 사용될 수 있다.

펩타이드 링커의 대용물은 다른 타입의 화학적 결합을 사용하는 링커이다. 따라서, PTD 및 DNA 결합 도메인은 합성 비-펩타이드성 링커에 의해 연결될 수 있다. PTD를 포함하는 폴리펩타이드는 합성 반응에서 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 결합될 수 있다. 동종(homo)- 또는 이종이기능성(heterobifunctional) 교차링커가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 합성 링커는 세포 내에서 절단된다. 예를 들어, 합성 링커는 환원성 티올 결합을 포함한다. 합성 링커의 예는 BM[PEO]₃ (1,8-비스-말레이미도트리에틸렌글리콜), OCOES (비스[2-(석신이미도옥시카보닐옥시)에틸]설폰), 및 DSG (디석신이미딜 글루타레이트)를 포함한다.

이량체화 도메인. DNA 결합 도메인들을 연결하는 또 다른 방법은 이량체화 도메인, 특히 이종이량체화 도메인 (Pomerantz et al. (1998) Biochemistry 37:965-970 참조)을 사용하는 것이다. 이러한 예에서는 DNA 결합 도메인이 별개의 폴리펩타이드 사슬로 존재한다. 예를 들어, 첫 번째 폴리펩타이드는 DNA 결합 도메인 A, 링커 및 도메인 B를 코딩하는 반면, 두 번째 폴리펩타이드는 도메인 C, 링커 및 도메인 D를 코딩한다. 상기 폴리펩타이드 중 하나 또는 모두는 PTD를 역시 포함할 수 있다.

당업자는 특성이 밝혀진 많은 이량체화 도메인들로부터 하나의 이량체화 도메인을 선별할 수 있다. 동종이량체가 바람직하지 않다면 이종이량체화를 선호하는 도메인이 사용될 수 있다. 특히 적용가능한 이량체화 도메인은 코일화된-코일 모티프, 예를 들어 이량체 평행 또는 역평행 코일화된 코일이다. 우선적으로 이종이량체를 형성하는 코일화된 코일 서열을 또한 이용할 수 있다 (Lumb and Kim, (1995) Biochemistry 34:8642-8648). 이량체화 도메인의 또 다른 종류로 이량체화가 소분자에 의해 또는 신호전달 경로를 통해 유발되는 것이 있다. 예를 들어, FK506의 이량체 형태는 두 개의 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인들을 이량체화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 이량체화 도메인은 추가적인 조절 단계를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

시스테인 잔기들이 이량체화 경계면에서 반대 위치로 처리되는 경우, 이량체화는 이황화 결합에 의해 안정화될 수 있다. DNA 결합 도메인이 이황화 결합에 의해 연결되는 경우, 한 폴리펩타이드 상의 PTD는 파트너 폴리펩타이드를 외부 환경으로부터 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 일단 세포 내에 있으면, 이황화 결합은 환원될 수 있고, 이량체화는 다른 상호작용, 예를 들어, 비-공유적 상호작용에 의해 안정화될 수 있다.

새로운 DNA 결합 단백질의 디자인

인공 DNA-결합 단백질은 혼합-적합 (mixing and matching) 방법에 의하여 특성이 확인된 징크 핑거 도메인들에 의해 표적 서열이 인식되도록 추론적으로 제작될 수 있다. 징크 핑거 도메인들은 다양한 방법들을 이용하여 단리되고 특성이 확인될 수 있다. 인공 DNA-결합 단백질을 제작하기 위한 하나의 공지된 방법은 변경된 DNA-결합 특이성을 가진 징크 핑거 도메인을 선택하기 위해 파지 디스플레이를 사용하는 것을 포함한다(예를 들어, Pomerantz et al. (1998) Biochemistry 37:965-970) 참조). 표적 서열과 상호작용하는 도메인들이 선택되어 표적 서열에 결합하는 DNA 결합 단백질을 제조하기 위해 사용된다.

배 등(Bae KH et al. (2003) Nat Biotechnol . 21(3):275-80)은 세포 내에서 DNA-결합 단백질의 특이성을 평가하는 방법 및 그러한 세포내 분석을 이용하여 새로운 DNA-결합 단백질을 제작하는 방법을 기재하고 있다. 국제특허공개 제WO 01/60970호 및 제WO 03/016571호는 DNA-결합 단백질을 디자인하는 방법을 역시 기재하고 있다. 징크 핑거 도메인의 조립구조들은 새로운 DNA-결합 단백질을 제조하기 위한 이들의 재배열을 용이하게 한다. 천연형 Zif268 단백질 내의 징크 핑거 도메인들은 DNA 이중나선을 따라 직렬로 위치되어 있다. 각 도메인은 독립적으로 3-4 염기쌍의 DNA 부분을 인식한다. 세 개 이상의 징크 핑거 도메인을 연결함으로써, 9-bp 또는 그보다 긴 DNA 서열을 특이적으로 인식하는 DNA 결합 단백질을 제작할 수 있다.

징크 핑거 도메인의 데이터베이스. 국제특허공개 제WO 01/60970호에서 기술된 원-하이브리드 선별 시스템이 가능한 3- 또는 4-염기쌍 결합 부위 각각에 대하여 또는 대표적인 수의 상기 결합 부위에 대하여 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 동정하는 데 사용될 수 있다. 이 과정의 결과는 징크 핑거 도메인과 그의 선호되는 3 또는 4-염기쌍 결합부위(들) 사이의 일련의 연관성으로서 축적될 수 있다. 그러한 연관성의 예가 표 1에 나타나 있다.

그 결과는 예를 들어 상관적인 데이터베이스, 스프레드시트, 또는 텍스트 파일 등의 데이터베이스로 기계에 저장될 수 있다. 그러한 데이터베이스의 각 기록은 징크 핑거 도메인의 표시를 그 도메인의 하나 이상의 선호되는 결합부위의 서열을 표시하는 스트링과 연관시킨다. 데이터베이스의 기록은 각 부위에 결합하는 징크 핑거 도메인의 상대적인 친화성의 표시를 포함할 수 있다. 어떤 실시태양에서, 데이터베이스의 기록은 특정 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산의 실제 위치를 가리키는 정보를 포함할 수 있다. 그러한 실제 위치는, 예를 들어 냉동고에 저장된 마이크로플레이트의 특정 웰(well)일 수 있다.

데이터베이스는 SQL 작동 환경(PERL 또는 MICROSOFT EXCEL　 macro와 같은) 스크립팅 언어, 또는 프로그래밍 언어를 이용하여 질문하거나 필터할 수 있도록 배열될 수 있다. 그러한 데이터베이스는 사용자가 특정 3 또는 4-염기쌍 결합 부위를 인식하는 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 동정할 수 있게 한다. 데이터베이스, 및 데이터베이스 서버에 저장될 수 있는 것과 같은 다른 정보는 어떤 장치에 의해 번역될 수 있는 명령 또는 다른 시그날을 이용하여 각 장치와 의사소통이 되도록 역시 배열 될 수 있다. 이 시스템의 컴퓨터에 기초한 태양은 디지털 전자회로로 또는, 컴퓨터 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어로, 또는 이들의 조합으로 이행될 수 있다. 본 발명의 데이터베이스 서버 등의 기구는 프로그램 가능한 프로세서에 의해 실행하기 위해 기계로 판독 가능한 저장장치에 명백하게 구체화된 컴퓨터 프로그램 산물에 의해 실행될 수 있으며; 방법 동작들은 입력 데이타에 작동하여 출력을 생성함으로써 본 발명의 기능을 수행하기 위한 지시들의 프로그램을 실행하는 프로그램 가능한 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 실행환경의 비제한적 예의 하나는 윈도우즈 XP　또는 윈도우즈 NT4.0　(Microsoft) 또는 그 이상, 또는 솔라리스 2.6 또는 그 이상(Sun Mycrosystems)의 오퍼레이팅 시스템에 의해 작동되는 컴퓨터를 포함한다.

또한 상기 징크 핑거 도메인들의 특이성을 입증하기 위하여 이들을 다수의 상이한 융합 단백질 내에 융합된 상황에서 시험할 수 있다. 더욱이, 소량의 도메인이 이용 가능한 특정 결합 부위는 추가적인 선별 스크리닝의 표적이 될 수 있다. 그러한 선별을 위한 라이브러리는, 유사하지만 뚜렷이 구별되는 부위에 결합하는 징크 핑거 도메인을 돌연변이 시킴으로써 제조할 수 있다. 이용 가능한 도메인을 최대한 활용하기 위해 표적 결합 부위에 대해서 도메인을 엇갈리게 할 수 있으므로, 각각의 가능한 결합 부위에 대한 징크 핑거 도메인의 완전한 매트릭스가 필수적인 것은 아니다. 이러한 엇갈림은 가장 유용한 3 또는 4 염기쌍 결합 부위들에서 결합 부위를 분해하고, 또한 징크 핑거 도메인들 사이의 링커의 길이를 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 디자인된 폴리펩타이드가 선택성 및 높은 친화도를 모두 갖게 하기 위하여는, 원하는 부위에 대해 높은 특이성을 가진 징크 핑거 도메인의 양 옆에 더 높은 친화도를 가지면서 특이성이 떨어지는 다른 도메인을 연결시킬 수 있다. 본 명세서에서 기술된 생체 내 스크리닝 방법은 인위적으로 조립된 징크 핑거 단백질 및 이들의 유도체의 생체 내 기능, 친화도, 및 특이성을 시험하는 데 이용될 수 있다. 유사하게, 본 방법은 예를 들어 다양화된 링커 조성, 징크 핑거 도메인 모듈, 징크 핑거 도메인 조성 등의 라이브러리를 제조함으로써 그러한 조립된 단백질을 최적화하는 데 사용될 수 있다.

표적 부위의 분해. 표적 9-bp 또는 보다 긴 DNA 서열은 3- 또는 4-bp 단편으로 분해된다. 각각의 분해된 3- 또는 4-bp 단편을 인식하는 징크 핑거 도메인을 (예를 들어 상기에서 언급한 데이터베이스로부터) 동정한다. 더 긴 표적 서열, 예를 들어 20 bp 내지 500 bp 서열은 그 안에서 9 bp, 12 bp, 및 15 bp 하위서열을 동정할 수 있으므로, 표적 서열로서 역시 적합하다. 특히, 데이터베이스에 잘 나타나 있는 부위로 분해될 수 있는 하위서열은 최초 디자인 표적으로서 기능할 수 있다.

고안된 특정 키메라 징크 핑거 단백질이 세포 내에서 표적 부위를 인식할 가능성을 추정할 수 있도록 점수제를 사용할 수 있다. 이 점수는 상기 고안된 단백질에서 각 구성 핑거의 선호되는 하위 부위에 대한 친화성, 그 특이성 및 그 성공도의 함수일 수 있다.

컴퓨터 프로그램. 전술한 기계로 판독 가능한 데이터베이스를 사용하기 위해, 표적 부위를 분해하기 위해, 그리고 하나 이상의 키메라 징크 핑거 단백질의 고안을 출력하기 위하여 컴퓨터 시스템과 소프트웨어가 사용될 수 있다.

상기 기술들을 이동 또는 고정 컴퓨터와 같은 프로그램 가능한 기계와, 프로세서, 그 프로세서에 의해 판독 가능한 저장 매체 및 하나 이상의 출력 기구를 포함하는 유사한 기구 상에서 실행되는 프로그램으로 이행될 수 있다. 각 프로그램은 기계 시스템과 의사소통하기 위해 고도의 과정 또는 목적지향적 프로그래밍 언어에 의해 이행될 수 있다. 컴퓨터 언어의 몇 가지 비제한적 예는 C, C++, 자바(Java), 포트란(Fortran), 및 비쥬얼 베이직(Visual Basic)이다.

이러한 각 프로그램은 CD-ROM(compact disc read only memory), 하드 디스크, 자기 디스켓, 또는 그와 유사한 매체 또는 기구 등의 저장매체 또는 기구에 의해 저장될 수 있는데, 이들은 본 명세서에 기술된 과정을 수행하기 위하여 컴퓨터가 저장매체 또는 기구를 판독할 때 기계를 배치하고 작동시키기 위하여 일반적이거나 특정한 목적의 프로그램 가능한 기계에 의해 판독될 수 있다. 이 시스템은 프로그램과 함께 배치된 기계로 판독 가능한 저장매체로 이행될 수 있는데, 이렇게 배치된 저장매체가 기계를 특정적이고 예정된 방식으로 작동하도록 한다.

컴퓨터 시스템은 내부 또는 외부 네트워크에 연결될 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 시스템은 HTTP, HTTPS, 또는 XML 프로토콜을 이용하여 멀리 떨어진 고객 시스템으로부터 요구를 받을 수 있다. 이러한 요구는 알려진 표적 유전자, 또는 표적 핵산의 서열을 대표하는 스트링에 대한 식별자(identifier)일 수 있다. 전자의 경우에는 컴퓨터 시스템이 GenBank와 같은 서열 데이터베이스에 들어가서 표적 유전자의 조절 영역의 핵산 서열을 검색할 수 있다. 이어서, 조절 영역의 서열 또는 직접 받은 표적 핵산 서열은 하위 부위로 분해되고, 전술한대로 키메라 징크 핑거 단백질을 고안한다.

시스템은 멀리 떨어진 고객에게 결과를 통보할 수 있다. 한편, 시스템은 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 실제로 검색하도록 로봇을 조정할 수도 있다. 이 실시태양에서, 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리가 제조되어 냉동 정제 DNA, 또는 핵산을 포함하는 냉동 세균 균주로 저장된다. 로봇은 라이브러리의 특정 어드레스를 찾아냄으로써 컴퓨터 시스템의 시그날에 반응한다. 이어서, 검색된 핵산은 프로세스되고 포장되어 고객에게 배달될 수 있다. 한편, 검색된 핵산을 세포에 삽입하여 분석할 수 있다, 컴퓨터 시스템은 네트워크를 통해 고객에게 분석 결과를 통보할 수 있다.

선택된 모듈로부터 단백질의 제조. 다수의 징크 핑거 도메인들을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 서열을 일단 디자인하면, 디자인된 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산 서열을 합성할 수 있다. 합성 유전자를 제조하는 방법은 이 기술분야에서는 일상적인 것이다. 상기 방법은 주문 합성된 올리고뉴클레오티드, PCR 매개된 클로닝, 및 메가-프라이머 PCR로부터의 유전자 제조를 포함한다. 추가 서열이 고안된 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산에 덧붙여질 수 있다. 추가 서열은 조절기능 또는 원하는 기능의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 제공할 수 있다. 그러한 추가 서열의 예가 본 명세서에 기재된다.

PTD - 융합물의 라이브러리. 각각 징크 핑거 도메인 및 PTD를 포함하는 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 라이브러리를 제조함으로써 다수의 징크 핑거 도메인의 조합을 평가할 수도 있다. 라이브러리는 세포의 변수, 예를 들어, 유전자의 발현 또는 식별가능한 표현형을 변경시키는 다수 중 각 단백질의 능력을 평가함으로써 스크리닝될 수 있다.

표현형질 스크리닝 또는 선별

목적하는 표현형 효과를 산출하는 기능성 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 동정하기 위해 상이한 조합의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산들의 라이브러리를 스크리닝할 수도 있다. 2002년 12월 9일에 출원된 미국 출원 제10/314,669호는 스크리닝 또는 선별에 의해 유용한 징크 핑거 단백질을 동정하는 예시적 방법을 기재한다. 일반적으로, 상이한 조합의 징크 핑거 도메인 및 효과기 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 라이브러리가 제조되고 세포 내로 도입된다. 라이브러리 구성원들을 발현시킨 후, 대조 세포 (예를 들어, 형질전환되지 않은 세포 또는 벡터 핵산으로 형질전환된 세포)에 비해 변경된 표현형을 나타내는 세포를 분리한다. 세포 내의 라이브러리 핵산을 회수하고 특성을 확인한다. 이어서 DNA 결합 도메인 및 PTD를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 생산하도록 핵산을 변형시킬 수 있다.

예시적인 징크 핑거 도메인들

하나의 인공 전사인자는 징크 핑거 도메인의 키메라를 포함할 수 있다. 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 징크 핑거 도메인은 천연형이다. 많은 인간 징크 핑거 도메인의 예가 국제특허공개 제WO 01/60970호, 제WO 03/16571호, 및 미국 출원 제10/223,765호에 기재되어 있다. 또한 아래의 표 1을 참조하라. 마지막 컬럼에 나열된 각 도메인의 결합 특이성이 특정 특이성을 갖는 전사인자를 고안하는데 사용될 수 있다.

유용한 DNA 결합 도메인을 만드는 특정 조합의 징크 핑거 도메인이 기술된 바 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제WO 01/60970호, 제WO 03/16571호, 미국 출원 제10/314,669호, 및 미국 출원 제60/431,892호 참조.

미국 출원 제60/431,892호 및 제10/732,620호는 특히 VEGF 유전자의 조절 서열에 결합하여 VEGF 유전자 전사를 조절할 수 있는 DNA 결합 도메인을 기술하고 있다. F121 및 F475는 VEGF 유전자의 조절 서열에 결합할 수 있는 두 개의 예시적 DNA 결합 도메인이다.

예시적인 F475 단백질은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIHTGEKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPYICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTHTGEK (서열 번호: 67)

예시적인 F121 단백질은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

YKCEECGKAFRQSSHLTTHKIIHTGEKPYKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIHTGEKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEK (서열번호: 68)

징크 핑거 도메인 F475 및 F121에 있는 징크 핑거 도메인의 것들과 동일한 DNA 접촉 잔기를 갖는 적어도 2개의 징크 핑거 도메인(예를 들어, 동일한 각 순서로 두 개 또는 세 개의 도메인)을 갖는 징크 핑거 도메인을 포함하는 DNA 결합 도메인이 역시 사용될 수 있다.

징크 핑거 도메인의 추가의 예는 하기 표 2에 기재된 것들을 포함한다.

표 2에 기재된 징크 핑거 단백질 중 바람직한 것들은 F475, F121, F435, F547, F2825, F109, F2604, F2605, F2607, F2615, F2633, F2634, F2636, F2644, F2646, F2650 및 F2679.

상기의 예시적 단백질들은 적어도 두 개，세 개 또는 네 개의 컬럼 3의 특정 도메인을 포함하는 것들 또는 두 개，세 개 또는 네 개의 컬럼 2의 동일 모티프를 포함하는 것들을 포함한다. 다른 예들은 표적 부위, 예를 들어, VEGF-A 유전자에 결합하기 위해 상기 단백질들과 경쟁하는 단백질들이다.

미국 출원 제10/314,669호는 특히 (1) 분비 단백질(예, 인슐린)의 생산, (2) 스트레스 저항성, (3) 분화 상태 (예, 신경 또는 난형성 분화), 및 (4) 증식을 조절할 수 있는 DNA 결합 도메인을 기재하고 있다.

기능성 분석(Functional Assays) 및 용도

전달가능한 DNA 결합 단백질의 기능은 시험관내 또는 생체 내에서 분석될 수 있다. 인공 전사 인자에 대한 예시적인 기능성 분석은 시험관 내 결합 분석, SELEX, 생체 내 리포터 유전자 조절, 및 전사 프로파일링을 포함한다.

결합 부위 선호도 분석. 각 도메인의 결합 부위 선호도는 EMSA, DNase 풋프린팅(footprinting), 표면 플라스몬 공명법, SELEX, 또는 컬럼 결합과 같은 생화학적 분석법에 의해 확인할 수 있다. 결합을 위한 기질로는 표적 부위를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 분석은 비특정 DNA를 경쟁체로서 또는 특정 DNA 서열을 경쟁체로서 포함할 수 있다. 특정 경쟁체 DNA는 하나, 둘, 또는 세 개의 뉴클레오티드 돌연변이를 가진 인식 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 생화학적 분석으로 소정 부위에 대한 도메인의 친화도 뿐만 아니라 다른 부위에 대한 소정 부위의 상대적 친화도도 측정할 수 있다. 레바 및 파보(Rebar and Pabo, 1994, Science 263:671-673)는 EMSA로부터 징크 핑거 도메인에 대한 K_d 상수를 얻는 방법을 기술하고 있다.

특정 예에서, 본 발명자들은 징크 핑거 단백질을 코딩하는 DNA 절편을 pGEX-4T2 (Pharmacia Biotech)의 SalI 및 NotI 부위 사이에 삽입하였다. 징크 핑거 단백질은 GST (글루타치온-S-전달효소)에 연결된 융합 단백질로서 대장균 균주 BL21에서 발현되었다. 융합 단백질을 글루타치온 친화성 크로마토그래피(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 정제한 후, GST 잔기와 징크 핑거 단백질 사이의 연결 부위를 절단하는 트롬빈으로 절단한다.

다양한 양의 징크 핑거 단백질을 20 mM Tris(pH 7.7), 120 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 10% 글리세롤, 0.1% 노니뎃 P-40(Nonidet P-40), 5 mM DTT 및 0.10 ㎎/㎖ BSA(bovine serum albumin) 함유 완충용액 내에서 방사성 동위원소로 표지된 DNA 탐침과 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상기 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다. 방사성 시그널을 PHOSPHORIMAGER^TM 분석(Molecular Dynamics)에 의해 정량하고, 해리상수(dissociation constant, K_d)는 문헌에 기술된 바에 따라 결정하였다(Rebar 및 Pabo (1994) Science 263:671-673).

DNA 결합 도메인이 PTD와 결합 (즉, 공유결합으로 연결)되어 있던 아니던 DNA 결합 도메인의 DNA 결합 친화도를 결정할 수 있다. 몇몇 실시예를 위해, PTD 존재 하의 도메인의 DNA 결합 친화도를 PTD 부재 하의 친화도와 비교하는 것이 유용하다. 50, 10, 5, 또는 1 nM 미만의 친화도로 결합하는 DNA 결합 도메인이 특히 유용할 수 있다. 70-90 % 동일한 표적 부위와 비-표적 부위를 구별할 수 있는 DNA 결합 도메인이 역시 유용하다. 그러한 도메인은 2-, 5-, 10-, 또는 100-배 이상 구별할 수 있다.

SELEX . SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)는 DNA 결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 핵산을 증식하는 방법이다. 우선, 양 말단에 보존 서열들(conserved sequences)이 인접한 20-뉴클레오티드 길이의 무작위 영역을 포함하는 주형 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 주형 올리고뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편(Klenow fragment) 및 보존된 3' 말단에 어닐링하는 프라이머를 사용한 연장에 의해 이중-가닥 DNA로 전환시킨다. 이어서, 이중-가닥 DNA의 군집을 DNA 결합 도메인과 함께 배양한다. 예를 들어, 100 ㎍의 GST-융합 단백질들을 100 ㎕ 결합 완충용액(25 mM Hepes pH 7.9, 40 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 중에서 10 pmol의 이중-가닥 DNA와 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. GST-수지(10 ㎕)를 상기 혼합물에 첨가한다. 실온에서 30분간 반응시킨 후, 상기 수지를 2.5% 탈지유를 포함하는 결합 완충용액으로 3회 세척한다. 상기 수지를 실온에서 10분간 1 M KCl 100 ㎕와 반응시켜 결합된 이중-가닥 주형 올리고머들을 수지로부터 분리한다. 용출된 물질들을 PCR로 증폭시킨다. 증폭된 핵산을 다음 회의 SELEX에 사용할 수 있다. 예를 들어, 클로닝 및 서열 분석 전에 8회의 SELEX를 수행할 수 있다. 징크 핑거 단백질에 대한 SELEX의 적용은 2002년 12월 9일에 출원된 미국 출원 제60/431,892호에 기재되어 있다.

세포 분석. 전달가능한 DNA 결합 도메인의 기능은 리포터 유전자를 이용하여 생체 내에서 분석될 수 있다. 리포터 유전자는 조절 위치, 예를 들어, 김 및 파보(Kim 및 Pabo, (1997) J. Biol . Chem . 272:29795-29800)의 구조물에서 Zif268 부위의 위치에 상응하는 부위에 DNA 결합 단백질이 특이적으로 인식하는 DNA 표적 부위를 포함하도록 조작된다. 전달가능한 DNA 결합 단백질을 세포와 접촉시킨 후, 루시퍼라제 리포터 활성을 평가한다. 실시예 4를 역시 참조하시오. 단백질의 DNA 결합 및 전사 조절 기능을 특이적으로 분석하기 위하여 세포 내에서 전달가능한 DNA 결합 단백질을 발현시킨 후, 이 단백질이 세포 내로 전달될 수 있는지를 평가하기 위해 다른 분석법을 사용할 수도 있다.

내생 유전자를 조절하는 전달가능한 DNA 결합 단백질의 능력은 세포를 전달가능한 DNA 결합 단백질과 접촉시킨 후, 또는 전달가능한 DNA 결합 단백질을 세포 내에서 발현시킨 후 내생 유전자의 전사를 분석함으로써 역시 평가할 수 있다. 내생 유전자의 전사를 평가하는 방법은 노던 분석, RT-PCR, 및 전사 프로파일링을 포함한다 (하기에 기재함).

내생 유전자를 조절하는 전달가능한 DNA 결합 단백질의 능력을 평가하는 다른 방법은 전달가능한 DNA 결합 단백질을 세포와 접촉시키고 세포의 변수, 예를 들어, 내생 유전자에 의해 영향을 받는 것으로 알려진 변수를 평가하는 것이다. 예를 들어, VEGF 프로모터에 결합하는 전달가능한 DNA 결합 단백질을 세포에 접촉시킨 후 VEGF 생산능에 대해 세포를 평가할 수 있다.

안정성. 전달가능한 DNA 결합 단백질의 세포 내에서의 안정성을 결정하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 (예를 들어, 방사성 동위원소로) 표지한 후 세포와 접촉시킨다. 세포 내에 존재하는 표지의 양을 시간의 함수로 모니터할 수 있다. 각 시점 전에 단백질 분해에 의해 용출되는 표지를 제거하기 위해 세포를 세척할 수 있다. 한편, 접촉 된 세포의 시료를 각 시점에 제조하고, 겔 상에서 전기 영동하여 전장 단백질을 정확하게 검출할 수 있다. 다른 방법으로, 표지되지 않은 단백질을 상이한 시점에, 예를 들어, 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 검출한다. 단백질은 에피토프 택을 포함할 수 있다.

안정한 단백질을 생산하기 위해, 분해 시그널 (예, "PEST" 시그널) 또는 유비퀴틴 부위에 대해 아미노산 서열을 조사하는 것이 유용하다. 이 시그날 및 부위들은 단백질의 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 몇몇 특별한 구현예에서는, 불안정한 단백질을 갖는 것이 바람직할 수 있고, 이 경우에는 상기 시그널 및 부위들을 그대로 유지하거나 정교하게 도입할 수 있다.

키메라 징크 핑거 단백질의 조절 특성의 프로파일링

키메라 징크 핑거 단백질의 특성을 확인하여 이 단백질이 포유동물 세포와 같은 세포의 하나 이상의 내생 유전자를 조절할 수 있는지를 결정할 수 있다. 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 우선 억제 또는 활성화 도메인에 연결한 후, 대상 세포 내로 도입할 수 있다. 적당한 배양 및 코딩 핵산의 발현 유도 후, 세포로부터 mRNA를 추출하고 핵산 마이크로어레이를 통해 분석한다.

핵산 마이크로어레이는 예를 들어 포토리토그래픽 방법(예: 미국 특허 제5,510,270호 참조), 기계적 방법(예: 미국 특허 제5,384,261호에 기재된 직접 흐름 [directed flow] 방법) 또는 핀 기반(pin based) 방법(미국 특허 제5,288,514호에 기재됨) 등의 다양한 방법에 의해 제작될 수 있다. 이 어레이는 발현된 특정 유전자에 대한 핵산을 검출하기에 적합한 특별한 캡쳐 프로브(capture probe)를 각 주소에 갖도록 제작된다.

mRNA는 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons, N.Y]에 기술된대로 DNase를 처리하며 게놈 DNA를 제거하고, 올리고-dT를 붙인 고체 기질에 혼성화하는 것을 포함하는 일반적인 방법으로 분리할 수 있다. 기질을 세척한 다음, mRNA를 용출시킨다. 분리된 mRNA를 미국 특허 제4,683,202호에 기재된대로 rtPCR 등에 의해 역전사시키고 임으로 증식시킨다. 증식 또는 역전사과정 동안 표지된 뉴클레오타이드의 삽입에 의해 핵산을 표지시킬 수 있다. 바람직한 표지의 예는 적색 형광염료 Cy5(Amersham) 또는 녹색 형광염료 Cy3(Amersham)과 같은 형광 표지를 포함한다. 한편, 핵산을 바이오틴으로 표지하고, 스트렙타비딘-파이코에리트린(Molecular Probes) 등의 표지된 스트렙타비딘과의 혼성화로 거출할 수 있다.

이어서 표지된 핵산을 어레이에 접촉시킬 수 있다. 추가로, 대조 핵산 또는 참고 핵산을 동일한 어레이에 접촉시킬 수 있다. 대조 핵산 또는 참고 핵산을 표본 핵산의 표지와는 다른 표지, 예를 들어 상이한 최대 방출(emission) 파장을 가진 표지로 표지할 수 있다. 표지된 핵산을 혼성화 조건에서 어레이와 접촉시킨다. 어레이를 세척한 후, 어레이의 각 주소에서 형광을 검출하기 위해 영상화한다.

이미지를 영상화함으로써 얻은 정보를 프로필을 만드는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 각 주소의 혼성화 정도는 숫자로 표시하여 벡터, 일차원 매트릭스, 또는 일차원 어레이에 저장한다. 벡터 x는 어레이의 각 주소에 대한 값을 갖는다. 예를 들면, 특정 주소에서 혼성화 정도에 대한 수치는 x_a라는 변수로 저장된다. 이 수치는 각 지역의 배경 수준, 표본량 및 다른 변이조건에 맞춰 조정될 수 있다. 대조 표본으로부터 핵산을 역시 준비하고, 동일하거나 상이한 어레이에 혼성화시킬 수 있다. 벡터 y는 벡터 x와 동일하도록 만든다. 예를 들어, 두 벡터의 함수인 수학식을 사용하여 표본 발현 프로필을 대조 프로필과 비교할 수 있다. 이 비교는 두 프로필의 유사성을 나타내는 점수 등의 스칼라(scalar) 값으로 평가할 수 있다. 어레이에 의해 검출되는 상이한 유전자들에 가중치를 부가하기 위하여 상기 벡터들 중 어느 하나 또는 모두는 매트릭스에 의해 변환될 수 있다.

발현 데이터는 데이터베이스, 예를 들어 SQL 데이터베이스(예: 모라클(Oracle) 또는 사이베이스(Sybase) 데이터베이스 환경)와 같은 연관 데이터베이스에 저장될 수 있다. 데이터베이스는 여러 개의 표를 가질 수 있다. 예를 들어, 처리되지 않은(raw) 발현 데이터를, 각 세로줄은 분석되는 유전자(예: 주소 또는 어레이)에 해당하고, 각 가로줄은 표본에 해당하는 하나의 표에 저장할 수 있다. 별도의 표는 식별자, 및 사용한 어레이의 배치(batch) 숫자, 날짜 및 다른 품질 관리 정보 등의 표본 정보를 저장할 수 있다.

유사하게 조절되는 유전자들은 함께 조절되는 유전자들을 동정하기 위해 발현 데이터를 클러스터화(clustering) 함으로써 동정할 수 있다. 이러한 클러스터는 키메라 징크 핑거 단백질에 의해 동등으로 조절되는 유전자 세트를 표시한다. 유전자는 위계적 클러스터화(hierarchical clustering) [예: Sokal and Michener (1958) Univ. Kans . Sci . Bull. 38:1409 참조], 베이시언 클러스터화(Bayesian clustering), 카파 평균 클러스터화(k-means clustering), 및 자체조직 지도(self-organizing maps) [Tamayo et al. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:2907 참조]를 사용하여 클러스터화될 수 있다.

표본 발현 프로필의 대조 발현 프로필(예: 대조 세포)과의 유사성은 예를 들어 표본 발현 수준의 로그를 프리딕터(predictor) 또는 대조 발현 값의 로그와 비교하고, 이 비교 결과를 프로필 내의 예시값의 모든 유전자에 대한 중요도에 의해 조정함으로써 결정될 수 있다.

유전자 조절의 표적

세포 내의 하나 이상의 유전자가 유전자 조절의 표적이 될 수 있다. 예를 들어, 병원체에게 필요한 유전자는 억제될 수 있고, 종양의 증식에 필요한 유전자는 억제될 수 있고, 발현이 잘 안되거나 불안정한 단백질을 코딩하는 유전자는 활성화되거나 과발현될 수 있다. 특정 표적 유전자의 예는 다음의 단백질들을 코딩하는 유전자들을 포함한다: 세포표면 단백질 (예: 당화된 표면 단백질), 암-관련 단백질, 종양 억제제, 사이토카인 (cytokines), 케모카인 (chemokines), 펩타이드 호르몬 (peptide hormones), 신경전달물질 (neurotransmitters), 세포표면 수용체 (cell surface receptors), 세포 표면 수용체 키나제 (cell surface receptor kinases), 7 막관통 수용체 (seven transmembrane receptors), 바이러스 수용체와 보조수용체 (virus receptors and co-receptors)), 세포외 결합 단백질 (extracellular matrix binding proteins), 세포 결합 단백질 (cell-binding proteins), 병원체의 항원 (예를 들어, 박테리아 항원, 말라리아 항원 등). 그 외의 표적 단백질들은 에놀라제 (enolases), 사이토크롬 P450s, 아실트랜스퍼라제 (acyltransferase), 메틸라제 (methylase), TIM 배럴(barrel) 효소, 아이소머라제 (isomerase) 등이 있다.

더 구체적인 예는 다음을 포함한다: 인테그린 (integrins), 세포 부착 분자 (cell attachment molecules) 또는 "CAMs" (예: 캐드헤린 (cadherins), 셀렉틴 (selectins), N-CAM, E-CAM, U-CAM, I-CAM 등); 프로테아제 (예: 서브틸리신, 트립신, 카이모트립신; 플라스미노겐 활성제 (plasminogen activator)(예: 유로키나제 (urokinase), 인간 조직형 플라스미노겐 활성제 등)); 봄베신 (bombesin); 인자 IX, 트롬빈; CD-4; 혈소판-유래 성장인자; 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II; 신경 성장인자; 섬유아세포 성장인자 (예: aFGF and bFGF); 표피세포 성장인자 (EGF); VEGFa; 색소 상피세포-유래 인자 (PEDF); 전환 성장인자 (TGF, 예: TGF-α 및 TGF-β); 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질; 뇌-유래 신경 영양 인자(BDNF); 에리스로포이에틴; 트롬보포이에틴; 뮤신 (mucins); 인간 혈청 알부민; 렉틴; 성장 호르몬 (예: 인간 성장 호르몬); 프로인슐린, 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 티록신 (thyroxine); 여포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone); 칼시토닌; ANP (atrial natriuretic peptides) A, B 또는 C; 황체 호르몬 (leutinizing hormone); 글루카곤; 인자 VIII; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자 (예: TNF-α 및 TNF-β); 엔케팔리나제 (enkephalinase); 쥰 B 원암유전자(jun B proto-oncogene); 단백질 카이네이즈 C; 렉틴; 뇌-특이적 Na-의존성 무기 인산염 공동수송체; 세포 레티노산-결합 단백질 1; 세포 레티노산-결합 단백질 2; 분화-관련 유전자-1 (Drg-1); 전사 인자 E2F; 초기 성장 반응-1 (EGR-1); 단백질 타이로신 포스파테이즈 1B (PTP-1B); Fas; 흑색종 분화 관련 유전자-7 (MDA-7); 프레세닐린-1 (PS-1); 안지오텐신 전환 효소; 안지오포이에틴-2; b-시크리테이즈 (BACE1); mmp3; CHFR (checkpoint with forkhead associated and ring finger); 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPAR-gamma); TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL); Ku-80; ATM(ataxia-telangiectasia mutated); BRCA; CC-케모카인 리셉터 5 (CCR5); 종양괴사인자 알파-유도된 단백질-3 (TNFAIP3); c-myc; 하이폭시아-유도성 인자-1 알파 (HIF-1알파); 캐스페이즈-3; 세포간 접착 분자 타입 I (ICAM-1); 안지오텐신 II 수용체 1 (AT-1R); MIS (Mullerian-inhibiting substance); 고나도트로핀-관련 펩타이드; 조직 인자 단백질; 인히빈 (inhibin); 액티빈 (activin); 호르몬 또는 성장 인자 수용체; 류마티스 인자 (rheumatoid factor); 골유도 인자 (osteoinductive factors); 인터페론 (예: 인터페론-α,β,γ); 콜로니 자극 인자 (CSFs)(예: M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF); 인터류킨 (ILs)(예: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, 및 IL-13 등); DAF (decay accelerating factor); 및 면역글로불린. 몇몇 예에 있어서, 표적 단백질은 예를 들어 암, 감염성 질환, 또는 심혈관계 질환과 같은 질병과 관련되어 있다.

몇몇 표적 유전자는 세포 내로 도입된 외래 게놈 또는 다른 핵산, 예를 들어, 레트로바이러스 게놈, 유전자 치료 벡터, DNA 바이러스 등에 의해 코딩될 수 있다.

전달가능한 전사 인자의 생산

전달가능한 DNA 결합 단백질을 발현하기 위해 표준 재조합 핵산 방법이 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 전달가능한 단백질을 코딩하는 핵산 서열이, 예를 들어, 적당한 시그널 및 프로세싱 서열 및 전사 및 번역을 위한 조절 서열과 함께, 핵산 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 다른 구현예에서는, 단백질은 자동화된 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 단백질 생산을 위한 합성 방법은 예를 들어, 문헌 [Methods in Enzymology, Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis by Gregg B. Fields (Editor), Sidney P. Colowick, Melvin I. Simon (Editor), Academic Press; (November 15, 1997) ISBN: 0121821900]에 기재되어 있다.

전달가능한 단백질을 위한 발현 벡터는, 예를 들어 전달가능한 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 조절서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 비제한적 예는 스테로이드-호르몬 반응성 프로모터 (예, 엑디손(ecdysone)-반응성, 에스트로젠-반응성, 및 글루타코르티코이드-반응성 프로모터), 테트라사이클린 "Tet-on" 및 "Tet-Off" 시스템, 및 금속-반응성 프로모터를 포함한다. 이 구조물은 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 조직 배양 세포 내로 도입될 수 있다. 이 구조물은 또한 모델 대상으로서 유전자 전이 유기체를 생성하기 위해 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 많은 수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고 본 발명의 재조합 구조물을 생성하기 위해 상업적으로 입수할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 적절한 전사/번역 조절 시그날을 포함하는 벡터를 구축하기 위해 공지 방법을 사용할 수 있다. 이 방법들은 생체 외 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기술 참조.

전달가능한 단백질을 생산하기에 적당한 숙주 세포는 세균 세포 및 진핵 세포 (예, 진균, 곤충, 식물 및 포유동물 세포)를 포함한다. 숙주 세포는 동결-해동 반복, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제를 포함하는 임의의 통상적인 방법에 파괴할 수 있다. 문헌[Scopes (1994) Protein Purification: Principles and Practice, New York:Springer-Verlag]은 재조합 (및 비-재조합) 단백질을 정제하기 위한 다수의 일반적인 방법들을 제공한다. 이 방법은 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 선택적 침전, 투석, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 이 방법들은 전달가능한 단백질을 위한 정제 전략을 고안하기 위해 개조될 수 있다. 전달가능한 단백질이 에피토프 택 또는 금속 킬레이팅 서열과 같은 정제 도구를 포함한다면, 친화성 크로마토그래피가 단백질을 고도로 정제하기 위해 사용될 수 있다.

생산된 단백질의 양은 전달가능한 단백질을 (예를 들어, 웨스턴 분석을 이용하여) 직접적으로 또는 (예를 들어, EMSA에 의해 특이적 DNA 결합 활성을 위해 세포로부터의 물질을 분석함으로써) 간접적으로 검출함으로써 평가할 수 있다. 단백질은 정제 전에, 정제 도중 임의의 단계에서, 또는 정제 후에 검출될 수 있다. 어떤 구현예에서는, 정제 또는 완전한 정제가 필요하지 않을 수 있다.

단백질 전달에 사용되는 것 외에, 전달가능한 DNA 결합 단백질은 내생 유전자를 조절하기 위해 대상 세포 또는 대상 유기체 내에서 생산될 수 있다. 전달가능한 DNA 결합 단백질은 상술한 바와 같이 내생 유전자의 영역에 결합하고 전사 활성화 또는 억제 기능을 제공하도록 배열될 수 있다. 강(Kang) 및 김(Kim) (상기 문헌 참조)에 기재된 바와 같이, 고안된 단백질을 코딩하는 핵산은 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터에 대한 유도제의 농도를 조절함으로써 내생 유전자의 발현을 농도 의존적 방식으로 조절할 수 있다.

다른 예에서는, 전달가능한 DNA 결합 단백질이 하나의 세포에 의해 분비 단백질로서 생산되고 이 단백질이 확산되어 다른 세포로 들어가 유전자 조절의 변경을 야기할 수 있다. 확산은 대상 내에서, 예를 들어, 대상의 한 세포로부터 다른 세포로 일어날 수 있다.

세포 표적화 잔기

전달가능한 DNA 결합 단백질은 하나의 특정 세포 타입 (예를 들어, 하나 이상의 특정 분화된 세포 또는 감염된 세포), 또는 하나 이상의 세포 상태 (예를 들어, 증식 상태)에 특이적인 세포 표적화 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 표적화 잔기는 질병 상태, 분화 상태, 또는 증식 상태에 대해 특이적일 수 있다. 세포 표적화 잔기의 예는 항체 또는 수용체 인식 펩타이드와 같은 단백질을 포함할 수 있다.

세포 표적화 잔기에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 몇몇 항원은 종양 또는 암 세포 특이적 항원을 포함한다. 예시적인 항원은 종양-관련 당단백질 (TAG72), 암태아성 항원 (CEA), 180 kDa 당단백질 다형성 상피세포 뮤신 HMFG1 (PEM or MUC1), 상피세포 막 항원 (EMA), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), HER2/c-erb-B2, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), CD33, 및 CD20을 포함한다. 항원 단편은 파지-디스플레이 기술 또는 면역화에 의해 제조할 수 있다. 항체의 다양한 생산, 변형, 분석 및 사용 방법이 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); and Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989)]에 기술되어 있다.

한 구현예에서, 세포 표적화 잔기는 종양 회귀성 펩타이드를 포함할 수 있다. 종양 회귀성 펩타이드의 예는 PCT/US00/01602 및 US 출원공개제2001-0046498호에 기재되어 있다.

한 구현예에서, 세포 표적화 잔기는 세포-특이적 단백질과 상호작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 천연형 폴리펩타이드는 세포 표면 단백질, 예를 들어, 세포 표면 수용체와 특이적으로 상호작용하는 성장 인자, 사이토카인, 또는 다른 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.

약학적 조성물

다른 태양에 있어서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 조제된, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질, 예를 들어, 전달가능한 인공 징크 핑거 단백질 또는 본원에 기재된 다른 단백질을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 "약학적 조성물"은 치료용뿐만 아니라 진단용 조성물을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 또는 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 생리적으로 호환될 수 있는 유사한 것을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추, 상피의 투약 (예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합한 것이다. 투약의 경로에 따라, 활성 물질은 그 물질을 불활성화 할 수 있는 산 혹은 다른 자연적 환경의 작용으로부터 그 물질을 보호하기 위한 재료 내에 코팅될 수 있다.

"약학적으로 허용되는 염"은 원 물질의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 어떠한 바람직하지 않은 독성 효과 (Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19 참조)를 주지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예에는 산부가염 (acid addition salt)과 염기부가염 (base addition salt)을 포함한다. 산부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 3가 인산 등으로부터 유도된 무독성 무기산 뿐 아니라 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐로 치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족 산들, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 무독성 유기산으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기부가염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토금속에서 유도된 것 뿐 아니라 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등의 무독성 유기 아민으로부터 유도된 것을 포함한다.

한 구현예에 있어서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 지속 방출을 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 전달가능한 DNA 결합 단백질은 매트릭스, 예를 들어, 개체에 전달하기 위해 지질-단백질-당 매트릭스 내에 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 전달가능한 DNA 결합 단백질은 작은 입자, 예를 들어, 5 마이크로미터 내지 50 나노미터의 크기로 형성될 수 있다. 상기 지질-단백질-당 입자들은 통상적으로 계면활성제, 인지질, 또는 유사한 소수성 또는 양친성 분자; 단백질; 단순 및/또는 복합 당; 및 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질을 포함한다. 한 예로, 지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)이고, 단백질은 알부민이고, 당은 락토스이다. 다른 예에서, 합성 폴리머가 지질-단백질-당 입자의 적어도 하나의 구성 요소, 예를 들어, 지질, 단백질, 및/또는 당을 대체한다. LPSPs를 제조하기 위해 사용된 화합물들은 천연형이므로 개선된 생체적합성을 가질 수 있다. 입자는 분무 건조를 포함한 당분야에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 출원 공개 제2002-0150621호 참조.

약학 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체 용액 (예를 들어 주사 또는 주입 가능한 용액), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 리포좀 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 제형을 포함한다. 상기 제형은 목적하는 투여의 방법과 치료적 적용에 따라 달라진다. 조성물은, 예를 들어 조성물을 안정화시키기 위해, 음이온성 또는 음전하를 띤 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 폴리A-폴리T DNA 이중나선의 작은 단편을 포함할 수 있다.

통상적인 조성물은 인체에 항체를 투여하기 위해 사용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사 또는 주입 가능한 용액의 형태이다. 통상적인 투여 방법으로 비경구 (예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여가 있다. 한 구현예에서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 정맥내 주입 또는 주사에 의하여 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 근육 내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 예시적인 투여 경로는 경구 투여, 표피 조직(예, 피부) 또는 점막 (예, 눈) 투여, 또는 흡입을 포함한다. 다른 투여 경로가 역시 사용될 수 있다.

본 명세서서 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되다" 라는 문장은 장내 (enteral) 및 국부의 투여를 제외한, 일반적으로 주사에 의한 방법 및 정맥내, 근육내, 동맥내, 간층 (뇌, 척추)내, 포피내, 안와내 (intraorbital), 심장내 (intracardiac), 피부내, 복강내, 호흡관내, 피하내, 상피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

약학적 조성물은 전형적으로 생산과 보관의 조건 하에 무균 및 안정하여야 한다. 약학적 조성물은 또한 투여에 대한 규정 및 산업 표준을 충족시키는지를 보증하기 위해 시험될 수 있다. 예를 들어, 제제 중 엔도톡신의 수준은 USP 24/NF 19 방법에 따라 리뮬러스 아메바양세포 용해물 분석법 (예, Bio Whittaker lot# 7L3790의 킷트를 사용하여 검출한계 0.125 EU/ml)으로 테스트될 수 있다. 약학적 조성물의 무균성은 USP 24/NF 19 방법에 따라 티오글리콜레이트 배양액을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 준비된 시료는 티오글리콜레이트 배양액에 접종하는데 사용하며, 35℃에서 14일 이상 배양한다. 상기 배양액은 미생물의 증식을 검출하기 위하여 주기적으로 검사된다.

상기 조성물은 용액, 미세현탁액, 분산액, 리포좀, 또는 다른 고농도의 약에 적합한 정돈된 구조를 갖도록 제형화될 수 있다. 무균의 주사 가능한 용액은 활성 합성물 (즉, 전달가능한 DNA 결합 단백질)을 필요한 양으로 하나의 성분 또는 위에 열거된 성분들의 조합으로 적절한 용매 내에 혼합하여 제조될 수 있으며 필요에 따라, 필터를 이용하여 살균할 수 있다. 일반적으로, 분산액 (dispersion)은 활성 화합물을 기본적 분산 매질을 포함하는 무균의 운반체 및 위에 열거한 다른 필요한 성분에 혼합하여 준비된다. 무균 주사가능한 용액을 준비하기 위하여 무균 분말을 사용하는 경우, 통상적인 제조 방법은 미리 무균 필터된 용액으로부터 활성 성분과 부가적인 바람직한 성분의 분말을 얻을 수 있는 진공건조 및 동결건조 방법을 포함한다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산의 경우 바람직한 입자의 크기를 유지하고, 계면활성제를 이용함으로 유지될 수 있다. 주사가능한 조성의 장기간 흡수는, 예를 들어 모노스테아린산염 및 젤라틴 같은 흡수를 지연시키는 약품을 성분에 포함시켜 가능하게 할 수 있다.

여러 적용에 있어서 투여의 경로/방법은 정맥 주사 또는 주입이지만, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 공지의 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료적 적용을 위하여, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 30, 20, 10, 5, 3, 1, 또는 0.1 mg/분 이하 속도의 정맥 주입으로 투여되어 1 내지 100 mg/m2 , 7 내지 25 mg/m2, 또는 0.5 내지 15 mg/m2의 양을 투여할 수 있다. 투여의 경로 및/또는 방법은 기대하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 어떤 실시예에 있어서는 활성 성분은 신속한 방출로부터 성분을 보호할 수 있는, 예를 들어 조절성 방출 제형, 즉, 이식, 미세캡슐 전달 시스템과 같은 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머들이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 준비를 위한 많은 방법들이 특허되거나 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978) 참조.

특정 구현예에 있어서, 상기 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 상기 화합물 (및 바람직한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 외피 내에 넣거나, 정제형으로 압축하거나, 또는 대상자의 음식 내에 직접 혼합할 수 있다. 치료용 경구 투여를 위하여, 화합물은 부형제와 함께 혼합되어 소화가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물을 비경구 투여 이외의 방법으로 투여하기 위하여, 화합물을 불활성화를 방지하는 물질과 함께 코팅하거나 또는 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다.

약학적 조성들은 공지의 의료 기구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 미국 특허 제5,399,163호에 개시된 기구와 같은 바늘없는 피하주사 기구로 투여될 수 있다. 본 발명에서 잘 알려진 유용한 이식장치와 모듈은 서방성 속도로 약물을 분산시키기 위한, 이식가능한 미세-주입 펌프 (미국 특허 제4,487,603호); 피부를 통과하여 약을 투여하는 치료기구 (미국 특허 제4,486,194호); 정확한 주입 속도로 약을 전달하기 위한 약물 주입 펌프 (제4,447,233호); 계속적인 약 전달을 위한 가변 유속 이식가능한 주입 장치 (제4,447,224호); 다중 쳄버 분획을 가지는 삼투성 약물 전달 시스템 (제4,439,196호); 및 삼투성 약물 전달 시스템 (제4,475,196호)을 포함한다. 많은 다른 이식체, 전달 시스템, 그리고 모듈도 역시 잘 알려져 있다.

한 구현예에서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 정맥내로 투여되어 신경 세포, 예를 들어, 뇌 세포로 들어간다. 예를 들어, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 신경 세포, 예를 들어, 뇌 세포, 예를 들어, GNDF (glial line-derived neurotrophic factor)에 결합하는 단백질과 물리적으로 연결된다. 다른 구현예에서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 조혈세포, 예를 들어, 임파구, 예를 들어 T 세포와 접촉하여 세포 내에서 유전자 발현을 조절한다. 예를 들어, 단백질은 특정 세포독성 T 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해, 예를 들어, 감염성 질병 및 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

어떤 구현예에서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 생체 내에서의 적절한 분포를 위하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장애 (BBB)는 많은 강친수성 화합물을 배제시킨다. 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질의 BBB 통과를 보장하기 위하여(바람직한 경우), 예를 들어, 화합물은 리포좀 내에 제형화될 수 있다. 리포좀 생산 방법은 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호 및 제5,399,331호에 기재되어 있다. 리포좀은 특정 세포 혹은 기관으로 선별적으로 운반되는 하나 또는 그 이상의 부분을 포함할 수 있으며, 표적화된 약물 전달을 증진시킬 수 있다 (예를 들어, V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685 참조).

투여 처방계획은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 예를 들어 한번의 정제가 투여될 수 있고, 여러 번으로 나누어 오랫동안 투여되거나, 투여량은 치료 상황에서의 필요성에 따라 일정 비율로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 비경구용 조성을 투여 단위 형태로 조제하는 것은 투여의 용이성과 투여량의 일관성을 위하여 특히 이점이 있다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료 대상자에게 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위로; 각 단위는 바람직한 치료효과를 만들기 위하여 계산된, 정량의 활성 혼합물과 필요한 약학적 담체를 포함한다. 투여 단위 형태 설계는 (a) 활성 화합물의 고유한 특성과 성취하고자 하는 특수한 치료효과, 및 (b) 개인별 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 성분을 혼합하는 당분야 고유의 제한점에 달려 있다.

투여량의 값은 완화되거나 예방되어야 하는 질환의 종류와 심각성에 따라 변화될 수 있다는 것을 유념할 필요가 있다. 임의의 특정 대상에 대하여 특이적 투여계획은 개인의 필요와 투여하는 사람 또는 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 충분한 시간을 두고 조정되어야 하며, 본 명세서에서 설명하는 투여량의 범위는 단지 예이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것은 아니다.

약학적 조성물은 "치료적으로 효과적인 양" 또는 "예방적으로 효과적인 양"의 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질을 포함할 수 있다. "치료적으로 효과적인 양"은 투여량 및 필요한 시간 주기에서 바람직한 치료 결과를 얻을 수 있는 유효한 양을 지칭한다. 조성물의 치료적으로 효과적인 양은 개인의 질병의 단계, 연령, 성별, 및 체중에 따라, 그리고 상기 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질이 개인에서 바람직한 반응을 도출하는 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 또한 치료적으로 유익한 효과를 제공하는 것이며, 통상적으로 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 유익한 효과가 더 큰 양이다. 예를 들어, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 측정 가능한 변수, 예를 들어 종양 세포의 성장 속도를 저해할 수 있다. 측정 가능한 변수는 임의의 대상, 예를 들어, 인간들 또는 인간 대상, 예를 들어 환자, 대조군 대상 등에서 약효를 예측할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 한편, 조성물의 이러한 특성은 목적하는 효과, 예를 들어, 세포 성장을 억제하거나 사이토카인 또는 성장 인자와 같은 단백질의 수준을 변경(예, 증가 또는 감소)시키는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있다. 그러한 측정 가능한 변수를 위한 많은 분석법이 숙련자에게 알려져 있다.

"예방적으로 효과적인 양"은 투여량 및 필요한 시간 주기 동안 바람직한 예방적 결과를 달성하기 위하여 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 투여는 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계에서 사용되기 때문에, 예방적으로 효과적인 양은 치료적으로 효과적인 양보다 적을 것이다.

본 발명의 범위에는 전달가능한 DNA 결합 단백질을 포함하는 킷트와 사용법, 예를 들어 처리, 예방 또는 진단 용도의 사용법도 있다. 하나의 구현예에 있어서, 치료적 적용의 사용법은 질환, 질병, 또는 이상을 가지는 환자에 제안되는 투여량 및/또는 투여방법을 포함한다. 상기 킷트는 진단용 또는 치료용 시약과 같은 하나 이상의 추가적 시약을 포함할 수 있는데, 예를 들면 본 명세서에 기재된 진단용 또는 치료용 시약 및/또는 하나 이상의 구별된 약학적 제제에서, 적절히 제형화된 하나 이상의 추가적 전달가능한 제제를 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 순환계, 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 또는 다른 조직에서 이의 안정화 및/또는 유지를 개선하는 잔기와 물리적으로 연결된다. 이 잔기는 순환 반감기를 예를 2배, 4배 또는 6배 이상 개선할 수 있다. 예를 들어, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 폴리머, 예를 들어, 폴리알킬렌 옥사이드 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 실질적으로 비-항원성인 폴리머와 연결될 수 있다. 적당한 폴리머는 분자량에 의해 실질적으로 달라질 수 있다. 수평균 분자량이 약 200 내지 약 35,000인 폴리머가 보통 선택된다. 약 1,000 내지 약 15,000 또는 약 2,000 내지 약 12,500의 분자량이 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리머는 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질이 세포 내로 들어갈 때 절단되는 가역적 결합에 의해 연결된다. 예를 들어, 이황화 결합 또는 다른 티올 결합이 세포 내에서 환원되어 폴리머를 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질로부터 분리한다.

예를 들어, 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질은 수용성 폴리머, 예를 들어, 친수성 폴리비닐 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐피롤리돈에 결합될 수 있다. 그러한 폴리머의 비제한적 예는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥사이드 호모폴리머, 폴리에틸화된 폴리올, 이들의 공중합체 및, 친수성이 유지되는 한, 이들의 블록 공중합체이다. 추가의 유용한 폴리머는 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 및 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체(Pluronics)와 같은 폴리옥시알킬렌; 폴리메타크릴레이트; 카보머; 분지되거나 분지되지 않은 다당류; 락토즈, 아밀로펙틴, 전분, 하이드록시에틸 전분, 아밀로즈, 황산 덱스트로즈, 덱스트란, 덱스트린, 글리코겐 또는 산 뮤코다당체, 예를 들어, 히아루론산의 다당류 서브유닛과 같은 헤테로폴리사카라이드; 폴리소르비톨 및 폴리만니톨과 같은 당 알콜의 폴리머; 헤파린 또는 헤파론을 포함한다. 다른 화합물들이 역시 동일한 폴리머, 예를 들어 표지 또는 표적화제에 부착될 수 있다.

다른 구현예에서, 폴리머는 종종 교차결합 전에 수용성이다. 일반적으로, 교차결합 후, 산물은 수용성이며, 예를 들어, 적어도 약 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 또는 1 mg/ml의 수용성을 나타낸다. 또한, 폴리머는 결합체 형태에서 면역원성이 높지 않아야 하며, 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여될 것이라면 그러한 투여 경로에 부적합한 점도를 가져서도 안된다. 폴리머의 분자량은 약 500,000 달톤(D), 예를 들어, 적어도 약 20,000 D, 30,000 D, 또는 40,000 D에 이를 수 있다.

공유 교차결합이 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질을 폴리머에 부착시키는 데, 예를 들어, N-말단 아미노기 및 라이신 잔기 상의 엡실론 아미노기 뿐만 아니라 다른 아미노, 이미노, 카복실, 설프하이드릴, 하이드록실, 또는 다른 친수성 기에 교차결합시키는데 사용될 수 있다. 전달가능한 인공 DNA 결합 단백질에 부착될 수 있는 기능화된 PEG 폴리머는 시어워터 폴리머사(Shearwater Polymers Inc., Huntsville, Ala)로부터 입수할 수 있다.

전달가능한 인공 DNA 결합 단백질 및 폴리머의 결합체는 예를 들어, 겔 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, HPLC에 의해 미반응 출발물질로부터 분리된다. 이종의 결합체가 동일한 방식으로 서로 정제될 수 있다. 미반응 아미노산의 이온 특성의 차이로 인해 상이한 종(예를 들어, 하나 또는 두 개의 PEG 잔기를 포함)의 분리 역시 가능하다. WO 96/34015 참조.

저장. 다양한 방법들이 정제된 전달가능한 징크 핑거 단백질을 저장하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 하나 이상의 (i) 동결억제제 (예, 글리세롤, 예를 들어, 5-12% 글리세롤), (ii) 아연, 예를 들어, 1 mM 내지 5 mM, 1 mM 내지 500 mM, 1 mM 내지 200 mM, 0.05 mM 내지 50 mM, 및 0.5 mM 내지 30 mM 아연, 및 (iii) 환원제 (예, DTT, 예를 들어, 약 0.05-5 mM, 예를 들어, 0.5-2 mM) 존재 하에 저장될 수 있다. 단백질은 예를 들어 4℃ 미만, 예를 들어, -20℃ 미만, 예를 들어, 약 -60℃ 내지 -90℃에서 저장될 수 있다.

치료(Treatments)

내생 유전자를 조절할 수 있는 전달가능한 DNA 결합 단백질, 특히 VEGF-A 유전자를 조절할 수 있는 단백질은 치료 및 예방 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면, 전달가능한 징크 핑거 단백질은 시험관 내나 생체 외 배양세포에 투여하거나 생체 내에서와 같이 대상에 투여함으로써 암, 특히 전이성 암, 염증성 질환과 혈관생성과 관련된 질병을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 것과 같이, "치료하다" 또는 "치료"는 질병, 질병의 증상 또는 예후들을 치료하거나 상처를 치료, 약화, 감소, 변화, 치유, 제거, 개선 또는 영향을 주기 위하여 징크 핑거 단백질이 세포 내로 들어가서 대상, 예를 들어, 환자의 세포 내에서 유전자 발현을 조절할 수 있도록 징크 핑거 단백질을 가하거나 투여하는 것, 또는 환자와 같은 대상으로부터 분리한 조직이나 세포주와 같은 세포에 약물을 가하거나 투여하는 것으로 정의되는데, 이때 환자는 질병(예: 본문에 사용된 질병)을 가지고 있거나 질병의 증상이나 예후를 보이고 있는 대상을 말한다.

하나의 구현예에 있어서, "세포를 치료하는 것" 또는 "조직을 치료하는 것"은 VEGF-A 생산, 혈관생성 촉진, 세포 증식과 같이 세포의 활성이 적어도 하나 이상 감소되는 것, 또는 과다증식하는 세포 또는 종양과 같은 조직 내나 주변 세포와 같은 세포의 활성을 감소시키는 것을 말한다. 이와 같은 감소에는 세포나 조직 (예: 전이 조직)의 활성이나 세포의 개수나 조직의 크기, 및 조직으로 공급되는 피의 양의 감소, 예를 들어 통계적으로 의미있는 감소를 포함할 수 있다. 활성 감소의 예로는 세포의 이동 (예: 세포외 기질을 통한 이동), 혈관형성의 감소, 또는 세포 분화의 감소가 있다. 다른 예로는 직접 또는 간접적으로 염증이나 염증의 표지를 감소시키는 것이 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 전달가능한 징크 핑거 단백질의 치료에 효과적인 양 또는 "치료효과량"은 세포 치료에서 대상에 단일 투여나 반복 투여를 통해 효과를 나타내는 단백질의 양을 말한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 질병을 예방하는데 효과적인 징크 핑거 단백질의 양 또는 단백질의 "예방효과량"은 단일 투여나 반복 투여를 통해 질병 (예: 암, 혈관생성 관련 질병, 또는 염증 질환)의 발병의 시작을 막거나 연기시키는 효과를 보이는 단백질의 양을 말한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상"은 인간이나 인간 이외의 동물을 포함한다. 예시적 대상은 비정상적인 세포 증식이나 분화로 특징 지워지는 질병을 가지고 있는 인간 환자를 포함한다. "인간 이외의 동물"은 인간 이외의 모든 척추동물, 예를 들면, 비포유동물 (예: 닭, 양서류, 파충류) 및 양, 개, 소, 돼지 등과 같은 인간 이외의 영장류와 같은 포유동물을 포함한다.

하나의 구현예에 있어서, 대상은 인간이다. 하나의 구현예에 있어서, 전달가능한 징크 핑거 단백질의 조성물은 수의학적인 목적이나 인간 질병에 대한 동물 모델로 사용하기 위해 인간 이외의 동물 (예: 영장류, 돼지 또는 생쥐)에 투여될 수 있다. 동물 모델과 같은 후자의 경우는 조성물의 치료효과 (예: 투여량이나 투여시간 추이)를 평가하는데 유용할 수 있다.

하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들면 신생물성 질환을 치료하거나 예방할 만큼 충분한 양으로, VEGF-A 또는 이를 코딩하는 유전자를 조절하는 징크 핑거 단백질과 같은 징크 핑거 단백질로 대상의 세포와 접촉하는 단계들을 포함한다. 단백질은 단백질 전달 도메인을 포함한다. 예를 들면, 이 질병은 발암성 세포, 종양 세포 또는 전이성 세포에 의해서 유발될 수 있다. 이 방법은 시험관 내나 생체 외 배양세포에 사용될 수 있다. 예를 들면, 발암성 세포나 전이성 세포 (예: 신장, 방광, 대장, 직장, 폐, 유방, 자궁 내막, 난소, 전립선, 또는 간의 암 또는 전이성 세포)는 세포 배양액 내에서 시험관 내로 배양될 수 있으며, 접촉단계는 징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 배양액에 넣어 주는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 이 방법은 생체 내 (예: 치료용 또는 예방용) 프로토콜의 일부로서, 대상 (예: 인간)에 존재하는 세포들 (예: 발암성 또는 전이성 세포들)에 적용될 수 있다. 생체 내 실시예의 경우, 접촉단계는 대상 내에서 영향을 주며, 대상의 세포들에 있는 VEGF-A 유전자를 조절하는 효과를 보이는 조건 하에 전달가능한 징크 핑거 단백질을 대상에 투여하는 것을 포함한다.

상기 방법은 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되고 있는 바와 같이, "암", "과다증식", "악성" 및 "신생물성"은 서로 같은 뜻으로 사용되며, 빠른 증식 또는 신생물에 의해 특징 지워지는 비정상적인 상태나 조건을 말한다. 이 용어는 조직병리학적인 형태와 진행정도와 무관하게, 모든 형태의 발암성 성장, 발암 과정, 전이조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관들을 포함한다. "병리학적인 과다증식"세포는 악성 종양 성장으로 특징 지워지는 질병상태에서 나타난다.

"조직신생"이라는 용어의 일반 의학적 의미는 신생물성 세포와 같은 세포에 대한 정상적인 성장조절에 대한 반응이 결손되는 결과를 나타내는 "새로운 세포의 성장"이다. "증생"은 비정상적으로 성장속도가 빨라진 세포를 말한다. 그러나, 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 신생물과 증생은 서로 혼용될 수 있는데, 내용이 나타내는 바와 같이, 일반적으로 비정상적인 세포의 증식속도를 가진 세포를 말한다. 신생물과 증생은 종양을 포함하며, 이는 양성이거나, 악성 전이거나 또는 악성일 수 있다.

암의 예로는 고형암, 연조직암 (soft tissue tumors), 전이성 손상 (lesion) 등을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 고형암의 예로는 폐, 유방, 임파계, 위장 (예; 대장) 및 비뇨기관 (예: 신장, 요도세포), 인두, 전립선, 난소 등의 여러 기관들에 발생하는 육종 (sarcoma), 선암 (adenocarcinomas)과 암종 (carcinomas) 등의 악성종양 (malignancy) 뿐 아니라, 대부분의 대장암, 직장암, 신장세포암, 간암, 비세포성폐암, 소장암 등을 포함하는 선암 (adenocarcinoma)이 포함된다. 앞에서 기술한 암들의 전이성 손상은 본 명세서에 기술된 바 있는 방법 또는 조성물에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.

상기 방법은 폐, 유방, 임파계, 위장 (예: 대장), 그리고 비뇨생식기관 (예: 신장, 요도), 전립선, 난소, 인두 등의 여러 기관들에 발생하는 악성종양 및, 대부분의 대장암, 신장세포암, 전립선암, 고환암, 비세포성폐암, 소장암 및 식도암 등의 악성종양을 포함하는 선암 (adenocarcinoma)을 치료하는데 유용할 수 있다. "암 또는 암종"은 당업계의 숙련자에 의해서 발견될 수 있으며, 호흡계 종양, 위장계 종양, 비뇨기계 종양, 고환 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 내분비계 종양과 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비계 조직의 악성종양을 말한다. 암종의 예로는 장막암과 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 자궁 내막, 머리 및 목, 대장 및 난소 등의 조직으로부터 생성되는 암을 포함한다. 이 용어는 또한 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양 등의 암육종을 포함한다. "선암"은 선조직으로부터 유래한 암이거나 특징적인 선구조를 가지고 있는 암을 말한다. "육종"은 당업계의 숙련자에 의해 발견될 수 있으며, 간엽세포 유래 조직들의 악성종양을 말한다.

상기 방법은 VEGF-A를 발현하는 조혈기관 유래 세포들의 증식을 조절하기 위해서(예를 들어, 증가시키거나 억제하기 위해서) 역시 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 증생/신생 세포들의 증식을 억제하기 위해 사용될 수 있다.

전달가능한 징크 핑거 단백질을 투여하는 방법은 "약학 조성물" 부분에서 기술되었다. 사용되는 물질들의 적정 투여량은 대상의 나이와 체중과 사용되는 특정 약물에 따라 달라진다.

전달가능한 징크 핑거 단백질은 대상에 도입된 후에 대상 내 이미징을 위해 표지물질과 연결될 수 있다. 적당한 표지 물질들로는 MRI에서 검출 가능한 것이나 방사선 표지들을 포함한다.

전달가능한 징크 핑거 단백질은 단독으로 투여되거나 기존에 존재하는 치료법들과 병행하여 투여될 수 있으며, 기존 방법들은 수술을 비롯하여 방사선요법, 화학요법 등을 포함한다. 예를 들어, 전달가능한 징크 핑거 단백질은 다른 혈관신생 억제제와 함께 투여될 수 있다. 예시적인 혈관신생 억제제는 다음의 것들을 포함한다: 2ME2, 안지오스타틴, 안지오자임, 항-VEGF RhuMAb, Apra (CT-2584), 아비신(Avicine), 베네핀(Benefin), BMS275291, 카복시아미도트리아졸, CC4047, CC5013, CC7085, CDC801, CGP-41251 (PKC 412), CM101, 콤브레타스타틴(Combretastatin) A-4 프로드럭, EMD 121974, 엔도스타틴, 플라보피리돌, 제니스테인 (GCP), 녹차 추출물, IM-862, ImmTher, 인터페론 알파, 인터류킨-12, 이레사 (ZD1839), 마리마스타트(Marimastat), 메타스타트(Metastat) (Col-3), 네오바스타트(Neovastat), 옥트레오타이드(Octreotide), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페니실라민(Penicillamine), 포토프린(Photofrin), 포토포인트(Photopoint), PI-88, 프리노마스타트(Prinomastat) (AG-3340), PTK787 (ZK22584), R0317453, 솔리마스타트(Solimastat), 스쿠알라민(Squalamine), SU 101, SU 5416, SU-6668, 수라디스타(Suradista) (FCE 26644), 수라민(Suramin) (Metaret), 테트라티오몰리브데이트(Tetrathiomolybdate), 탈리도마이드(Thalidomide), TNP-470 및 비탁신(Vitaxin). 추가의 혈관신생억제제는 문헌[Kerbel, J. Clin . Oncol . 19(18s):45s-51s, 2001]에 기술되어 있다.

조직신생 질환을 치료하기 위해, 상기 단백질은 다음의 것들 중 하나이상과 함께 배합하여 투여될 수 있다: 다른 치료제의 예는 택솔(taxol), 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티디움 브로마이드, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신(actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 글루코코티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 퓨로마이신(puromycin), 매이탄시노이드(maytansinoids), 예를 들어, 매이탄시놀(maytansinol) 또는 DM1 (미국 특허 제5,208,020호 참조), CC-1065 (미국 특허 제5,475,092호, 제5,585,499호, 제5,846,545호 참조), 칼리케마이신(calicheamicin), 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 본 명세서에서 용어 "배합"은 상이한 약제들이 실질적으로 동시적으로, 동시에 또는 순차적으로 주어지는 것을 의미한다. 순차적으로 주어진다면, 제2 화합물의 투여시에 둘 중 제1 약제는 바람직하게 여전히 치료 부위에서 효과적인 농도로 검출가능하다.

전달가능한 징크 핑거 단백질, 특히 VEGF-A 유전자를 조절 (예: 발현 억제)하는 것은 염증성 질환이나 질병을 치료하기 위해 단독으로 투여하거나 하나 이상의 기존의 치료방법과 병행하여 투여할 수 있다. 대표적인 염증성 질환이나 질병들은 류마티스성 관절염, 청소년 만성 관절염, 건선, 이식편대숙주병 (GVHD), 피부경화증, 당뇨병, 알러지와 같은 급성 및 만성 면역 질환 및 자가면역성 질환들; 천식, 동종이계 이식 (예, 신장이식, 심장이식, 척수이식, 간이식, 췌장이식, 소장이식, 폐이식과 피부이식 등)과 관련된 급성 또는 만성 면역질환; 유육종증, 만성 염증성 장 질병, 궤양성 대장염, 크론 병변이나 질병과 같은 만성 염증성 병변; 파종성 혈관내 응고, 동맥경화, 카와사키 병변 및 맥관염 증후군 (예, 결절성 다발 동맥염, 베게너 육아종, 헤노흐-쇤라인 자반병, 거대세포 관절염및 신장 미세 맥관염 등)의 맥관 염증성 병변; 만성 활성 간염; 쉐그렌 증상; 건선성 관절염; 장질환성 관절염; 반응성 관절염과 염증성 장 질병과 관련된 관절염; 포도막염 등을 포함한다.

염증성 장 질병 (IBD)은 일반적인 만성, 재발성 위장염을 포함한다. IBD는 크론 질병과 궤양성 대장염의 두 특징적인 질병을 말한다. IBD의 임상적인 증상은 간헐적인 직장 출혈, 경련성 복통, 체중감소 및 설사를 포함한다. 궤양성 대장염의 임상 활성 지수 (Clinical Activity Index) 와 같은 임상적 지표가 IBD를 모니터하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Walmsley et al. Gut. 1998 Jul;43(1):29-32] 및 [Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2):164-71] 참조).

전달가능한 징크 핑거 단백질은 앞에서 서술한 질병들 중 하나를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이 단백질은 각각의 질병의 최소한 한 증상을 완화시키는데 효과적인 양이 (국부적 또는 전신적으로) 투여될 수 있다. 이 단백질은 또한 국부 체온, 부종 (예: 측정되는 것), 붉어지는 것, 국부 또는 전신의 백혈구 수, 호중구의 존재 유무, 사이토카인 수준 등과 같은 염증의 표지들과 같은 염증을 완화할 수 있다. 단백질 투여 전, 투여 중, 투여 후에 위에서 말한 대상의 염증 표지들 중 하나 또는 그 이상을 평가할 수 있다.

전달가능한 징크 핑거 단백질, 특히 VEGF-A 유전자를 조절(예: VEGF-A 유전자 발현 활성화)하는 것은 상처 치유를 향상시키는 것과 같이 상처를 치료하기 위하여 단독으로 투여하거나 기존 치료방법들 중 하나 또는 그 이상과 병행 투여할 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 VEGF-A 활성화는 새로운 혈관이나 모세혈관 형성을 증가시킨다. 그 단백질이나 핵산은 수술, 화상, 외상, 궤양, 골절 및 혈관생성을 증가시키는 것이 필요한 다른 질병들을 완화시키는데 사용될 수 있다.

전달가능한 징크 핑거 단백질, 특히 VEGF-A 유전자를 조절(예를 들면, VEGF-A 유전자의 발현 증가)할 수 있는 것은 허혈성 심장질환, 사지동맥질환 또는 심장동맥질환과 같은 심혈관질환의 치료를 위해 단독으로 투여되거나 기존의 치료방법들 중 하나 또는 그 이상과 병행하여 투여될 수 있다. 징크 핑거 단백질을 투여하는 방법은 또한 당뇨성 망막증 또는 심근 경색 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

전달가능한 DNA 결합 단백질의 몇몇 태양들은 하기의 구체적이고 비-제한적인 실시예들에 의해 더욱 상세하게 설명된다.

실시예 1: TAT- ZFP 융합 단백질들의 제작, 발현 및 정제

키메라 3개 혹은 4개의 핑거 단백질을 암호화하는 핵산을 다음과 같이 제조하였다. 포유류 세포들에서 키메라 징크 핑거 단백질을 발현시키기 위하여 벡터 P3 (Toolgen, Inc.)을 사용하였다. P3은 벡터 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego CA)의 변형을 통해서 제작되었다. 연결이 가능한 돌출말단 (overhangs)을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 이중가닥을 HindⅢ 및 XhoI으로 절단된 pcDNA3 벡터에 연결하였다. 상기 이중가닥은 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) 태그 (tag)와 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 이중가닥은 또한 BamHI, EcoRI, NotI 및 BglⅡ 절단부위들 및 정지 코돈을 포함한다. 나아가, 상기에서 생성된 벡터를 XmaI으로 절단하고, 절단부위의 돌출말단을 메운 후, 양 말단을 재연결함으로써, 이 벡터의 SV40 복제기원 내 XmaI 절단부위를 제거하였다.

하기는 상기 표 2에 열거한 바와 같이 다중 징크 핑거 도메인들을 갖는 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드를 제작하는 하나의 예시적인 방법이다. 먼저, 단일 징크 핑거 도메인을 코딩하는 삽입체 (insert)를 하나의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 서열을 갖는 벡터 (P3 벡터)에 삽입하였다. 상기 클로닝의 결과로 두 개의 징크 핑거 도메인들을 갖는 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드가 얻어진다. 두 개의 징크 핑거 도메인으로 구성된 징크 핑거 도메인 삽입체를 상기 방법에 의해 제조한 후 한 개 또는 두 개의 징크 핑거 도메인들을 갖는 AgeI/NotI 절단에 의해 선형화된 벡터 P3에 클로닝하여 3개 또는 4개의 징크 핑거 도메인들로 구성된 징크 핑거 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드를 얻었다.

미리-조립된 ZFPs를 코딩하는 핵산들을 pTAT 플라스미드 (예컨대, Dowdy et al. (1999) Science 285: 1569-1572 참조)에 다음과 같이 삽입하였다. 먼저, KpnI 절단부위들을 5' 서열에 KpnI 부위를 포함하는 정방향 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상기 ZFP-코딩 서열에 부가하였다. 상기 삽입체들과 벡터 (pTAT)는 KpnI 및 XhoI으로 절단하여 준비하였다. 삽입체들과 벡터를 연결한 후, pTAT-ZFPs 구조물들의 서열을 분석하였다. pTAT-ZFP 플라스미드의 삽입 후에, (N 말단에서 C 말단으로) ATG (개시코돈), 6개의 히스티딘 태그, HIV Tat PTD 서열, 핵 위치 신호 (NLS) 및 기능성 도메인 (p65, KRAB 또는 KOX)을 갖는 징크 핑거 도메인들의 배열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 제조된다.

대장균 BL21(DE3) 세포들을 pTAT-ZFP 플라스미드로 형질전환시킨 후 이들의 OD 값이 0.3 내지 0.4에 이를 때까지 선별배지에서 배양하였다. 그 후에, 상기 세포들을 1 mM IPTG로 3시간 동안 처리하여 발현을 유도하였다. TAT-ZFP 단백질 시료들을 제조사의 일반적인 지침에 따라 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen)를 이용하여 제조하였다. 간략하게, 상기 BL21 세포들을 침전시킨 후 세포 펠렛들을 용혈 완충용액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M 유레아, pH 8.0)으로 용해시키고, 10초간의 초음파분쇄 후 30초간의 정지기가 이어지는 10초간의 5회 주기 (Fischer Scientific 550)를 이용하여 초음파분쇄를 수행하였다. 비-정제된 용해물들을 일련의 실험들을 위해 보관하거나 친화컬럼을 이용하여 정제하였다. 상기 용해물들을 40분간 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen)와 함께 배양한 후 세척액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M 유레아, pH 6.3)으로 두 번 세척하였다. 그 후에 단백질을 용출 완충용액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M 유레아, pH 4.5)으로 용출한 후 PBS로 투석하였다. 정제된 단백질을 -70℃에서 10% 글리세롤과 함께 보관하였다.

정제시 각 단계에서 얻은 유출물 (flow-through)과 정제된 TAT-ZFPs를 코마시 블루 염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 용출된 단백질은 약 35 kDa 크기의 밴드로 우세종으로서 이동하였고, 매우 순수하게 정제되었다. 도 1 및 도 2(음이온 교환 컬럼에 의한 2차 정제) 참조.

실시예 2: TAT- ZFP 융합 단백질들의 포유류 세포 배양물로의 전달

(1) TAT 융합 단백질의 전달 효율의 평가

TAT 융합 단백질의 배양된 세포로의 전달 효율을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 정제된 TAT-lacZ 단백질을 사용하였다. 유전적 TAT-lacZ 융합물을 lacZ 오픈 리딩 프레임 DNA를 pTAT-HA 플라스미드들에 삽입함으로써 제조하였다. 예를 들면, 도우디 등의 방법을 참조하라 (Dowdy et al. (1999) Science 285: 1569-1572). 그 후에 상기 융합물은 BL21(DE3)LysS 세균(Novagen)에 형질전환되었다. TAT-lacZ 융합 단백질의 발현을 1 mM IPTG로 3시간 동안 유도하였고, BL21(DE3)LysS 세포들을 침전시킨 후 세포 펠렛들을 용혈 완충용액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M 유레아, pH 8.0)으로 용해시켰으며, 10초간의 초음파분쇄 후 30초간의 정지기가 이어지는 5회의 10초 주기를 이용하여 초음파분쇄를 수행하였다(Fischer Scientific 550). 상기 용해물들을 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen)와 함께 40분간 배양한 후 세척액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M 유레아, pH 6.3)으로 두 번 세척하였다. 상기 단백질을 용출 완충용액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-Cl, 8 M 유레아, pH 4.5)으로 용출한 후 PBS로 투석하였다. 정제된 단백질을 10% 글리세롤과 함께 -70℃에서 보관하였다. 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포들을 24-웰 배양 플레이트에 3×10⁵/㎖ 농도로 접종한 후 TAT 융합 단백질들과 접촉하기 전에 24시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, TAT-lacZ를 발현하는 대장균 배양액으로부터 얻은 총 용해물을 100 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ 범위의 농도로 배양 배지에 첨가하였고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 PBS로 두 번 세척하였고, 2% 파라폼알데하이드로 고정한 후 X-gal로 염색하였다. 관찰된 염색 강도는 농도 의존적이었다. 본 발명자들은 가장 낮은 농도 (100 ㎍/㎖)에서조차도 상기 세포들의 약 100% 전달 효율을 관찰하였다. 이러한 결과들은 TAT-도메인이 lacZ와 같은 고분자 단백질들 (약 120 kD)을 세포들 내로 전달시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

(2) TAT- ZFP 융합 단백질들의 배양된 세포들 내로의 전달

정제된 TAT-ZFP 융합 단백질들이 HEK 293 세포들 내로 전달되는지에 대해서 조사하였다. 상기 HEK 293 세포들을 24-웰 배양 플레이트 상에 3×10⁵/㎖의 밀도로 24시간 동안 예비-배양한 후, 20 ㎍의 TAT-ZFPs를 상기 배양 배지에 첨가하였다. 상기 세포들을 수확하고 PBS로 세 번 세척한 후, 얼음-냉각된 용혈 완충용액을 첨가하였다. 상기 시료들을 SDS-PAGE로 분석한 후 겔을 HYBOND-P^TM　막 (Amersham Pharmacia Biotech)으로 옮겼다. 일차항체로서 마우스 항-HA 항체, 이차항체로서 항-마우스 IgG-HRP를 사용한 웨스턴 블럿팅 분석을 수행하였고 ECL^TM 킷트 (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 결과를 판독하였다. 상기 웨스턴 블럿은 TAT-ZFP 융합 단백질들이 HEK 293 세포들의 내부에서 검출되었음을 명백히 보여주었다.

실시예 3: 리포터 유전자 활성 및 내생 유전자 발현의 TAT- ZFP 매개 조절

전달된 TAT-ZFP 융합 단백질들이 세포 내에서 전사인자로 작용하는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 조사되고 있는 TAT-ZFPs에 특이적인 ZFP-결합 서열들을 포함하는 일련의 초파리 루시퍼라제 리포터들로 세포를 형질감염시켰다. 이 실험에서, 본 발명자들은 VEGF 프로모터에 결합하는 ZFPs를 사용하였다. 2003년 12월 9일자로 출원된 미국 특허출원 제60/431,892호에서, 본 발명자들은 이들 단백질들이 내생 VEGF 유전자를 조절할 수 있음을 보고한 바 있다.

본 발명자들은 다음과 같이 형질감염 세포들을 제조하였다. 인간 배아 신장 293 세포들을 100 단위/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)에서 유지하였다. 루시퍼라제 분석을 위하여, 웰당 10⁴ 세포들을 96-웰 플레이트에서 미리 배양하였다. 293 세포들을 LIPOFECTAMINE^TM　형질감염 킷트 (Life Technologies, Rockville, MD)를 이용하여 25 ng의 리포터 플라스미드로 형질감염시켰다. 상기 리포터 플라스미드는 pGL3-basic (Promega) 내 루시퍼라제 유전자에 융합된 천연의 VEGF 프로모터를 포함한다.

본 발명자들은 상기 세포들을 24시간 동안 배양한 후 TAT-ZFP 단백질들을 포함하는 용해물들이 포함된 배양 배지와 추가로 24시간 동안 접촉시켰다. 상기 배양 배지들은 40 ㎍ 또는 80 ㎍의 용해물을 포함하고 있다. 상기 24시간 경과 후, 본 발명자들은 TD-20/20 조도계 (Turner Designs Inc., Sunnyvale, CA)를 이용하여 이중 루시퍼라제 분석 킷트 (Promega)로 세포들의 리포터 발현에 대해 분석하였다.

상기 TAT-F475-KRAB 용해물은 상응하는 TAT-유일 단백질 (즉, 징크 핑거 도메인들을 포함하지 않는 단백질)의 용해물로 전달된 대조군 배양물에 비하여 1.5배 (40 ㎍이 사용되었을 때) 및 2.0배 (80 ㎍) 리포터 활성을 억제하였다. TAT-F475-KRAB와는 다른 DNA 결합 특이성을 갖는, TAT-F83-KRAB의 용해물들이 리포터 활성을 억제하지 않았기 때문에, 관찰된 억제는 서열 특이적인 DNA 결합에 기인한 것이었다. 본 발명자들의 이전 연구에서 키메라 징크 핑거 도메인 F83이 천연의 인간 VEGF 프로모터 서열을 포함하는 루시퍼라제 리포터의 발현을 변화시키지 않았기 때문에 (Bae et al. Nat Biotechnol . 2003, 21(3): 275-80), 본 실험에서 상기 도메인은 음성 대조군으로 제공되었다. 이와 유사하게, TAT-mF475-KRAB의 용해물은 리포터 활성을 억제하지 않았다. mF475는 두 번째 및 세 번째 징크 핑거 도메인들 내에 DNA 결합을 할 수 없는 돌연변이들 (아르기닌에서 알라닌)을 포함한다. 이는 리포터 유전자 발현의 조절이 TAT 단백질 전달 도메인에 의해서가 아니라, 특이적인 징크 핑거 단백질에 기인한 것임을 나타낸다.

이러한 결과들은 TAT-F475-KRAB의 tat 도메인이 단백질을 세포 내로 효과적으로 전달하고 상기 전달된 단백질은 서열 특이적인 방식으로 이들 세포 내에서 그의 표적 유전자들의 전사를 조절할 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 4: 전사 조절 도메인을 포함하는 단백질들의 전달

본 발명자들은 다음으로 전사 조절 도메인을 포함하는 단백질들 또한 세포 내로 전달될 수 있는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 단백질 전달 도메인, 징크 핑거 도메인들의 배열, 및 p65 전사 활성인자 또는 KRAB 전사 억제인자 도메인을 포함하는 단백질들을 제조하였다. TAT-ZFP 융합 단백질들을 코딩하는 플라스미드를 실시예 1에 지시된 바와 같이 대장균 BL21(DE3) 형질전환체들로부터 발현시켰다. 본 발명자들은 이러한 단백질들을 F475 징크 핑거들이 인식하는 천연의 인간 VEGF 프로모터 서열을 포함하는 루시퍼라제 리포터 구조물 (Bae et al. Nat Biotechnol. 2003, 21(3): 275-80)로 일시적으로 형질감염된 293 세포들과 접촉시켰다. TAT-F475-p65의 용해물들은 (징크 핑거 도메인들을 포함하지 않는 Tat 단백질을 포함하는) 대조군 용해물로 전달된 세포들에 비하여 2.5 (±0.48)배 증가된 리포터 활성을 야기하였다. 정제된 TAT-F121-KRAB는 2.1 (±0.14)배 감소된 리포터 활성을 야기하였다.

실시예 5: 전달된 DNA 결합 단백질들에 의한 내생 유전자들의 조절

본 발명자들은 또한 전달된 DNA 결합 단백질들이 내생 VEGF mRNA 발현을 조절할 수 있는지 여부를 평가하였다. 본 발명자들은 TAT-F475-KRAB 단백질 또는 TAT-F121-KRAB 단백질을 포함하는 용해물들을 24시간 동안 미리 배양된 3×10⁵ 293 세포 배양물 (12-웰 배양 플레이트)에 첨가하였다. 접촉하고 4시간 경과 후에, 상기 용해물들을 포함하는 배양 배지를 신선한 새 배지로 교환하였다. 상기 세포들을 용해물과 접촉시키고 24시간 경과 후에 수확하였다. 총 세포성 RNA를 제조사 (Life Technologies)의 지침에 따라 TRIZOL^TM-용해물을 제조함으로써 상기 세포들로부터 추출하였다.

mRNA를 위한 제1 가닥 합성 프라이머로서 올리고-dT 및 SUPERSCRIPT^TM　제1 가닥 합성 시스템 (Life Technologies) 내에 제공되는 MMLV 역전사 중합효소를 이용하여 4 ㎍의 총 RNA로 역전사 반응들을 수행하였다. mRNA 양을 분석하기 위하여, 상기 RT 반응들로부터 형성된 제1 가닥 cDNAs 1 ㎕ 각각을 VEGF-특이적인 프라이머들을 이용하여 증폭시켰다. RNA의 초기 양을 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GAPDH)-특이적인 프라이머들을 이용한 특이적 증폭에 의해 계산된 GAPDH mRNA 농도로 표준화시켰다. VEGF 및 GAPDH cDNAs의 증폭은 QUANTITECT^TM　SYBR 킷트 (Qiagen, Valencia, CA) 및 ROTORGENE 2000^TM 실시간 사이클러 (Corbett, Sydney, Australia)를 이용하여 실시간으로 관찰되고 분석되었다. mRNA 농도들은 상기 반응물 내에 포함된 표준물질들의 연속적인 희석을 이용하여 정량되었다.

TAT-F475-KRAB 및 TAT-F121-KRAB 모두 TAT 도메인은 포함하지만 징크 핑거 도메인은 포함하지 않는 대조군 단백질에 비하여 내생 VEGF mRNA 수준을 각각 3.1 (±0.4)배 및 1.7 (±0.01)배 억제하였다. 상기 결과는 전달된 ZFPs가 세포 내에서 인공 전사인자들로 작용할 수 있음을 증명하는 것이다.

본 발명자들은 또한 전달된 TAT-ZFP 단백질들이 다른 내생 유전자들의 조절에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 F121-KRAB 및 돌연변이 변형체 mF121-KRAB를 안정적으로 발현하는 세포들에 대한 DNA 미세배열 결과들을 이용하여 얻어진 전사 프로파일들을 비교하였다. mF121-KRAB (QSHT-ASHR-ADHT)는 DNA와 접촉하는 아미노산 부위들에서 F121 (QSHT-RSHR-RDHT)에 비하여 두 개의 아미노산 치환들 (Arg에서 Ala)을 포함한다. 이러한 돌연변이는 DNA 결합의 특이성을 변화시키거나 파괴할 것으로 기대된다.

상기 전사 프로파일들로부터 VEGF mRNA가 F121-KRAB에 의해 하향 조절됨을 확인하였다. 또한, 상기 프로파일들은 F121-KRAB가 아넥신 (Annexin) A3 및 사이클린 (Cyclin) A 유전자를 포함하는 유전자들 그룹의 활성화를 초래함을 입증하는 것이다. mF121-KRAB 처리된 세포들의 전사 프로파일은 아넥신 A3 및 사이클린 A 유전자 활성화의 어떠한 활성도, VEGF mRNA 발현에 있어서의 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 상기와 동일한 결과들이 RT-PCR에 의해서도 얻어졌다. 이러한 결과들은, 최초로, TAT PTD에 융합되고 대장균에서 발현된 키메라 징크 핑거 단백질들이 포유류 세포 내로 성공적으로 전달될 수 있으며 전달 후 전사 조절자로서 작용할 수 있음을 증명하는 것이다.

실시예 6: 효과기 도메인들에 따라 전사 활성인자 및 억제인자로 작용하는 TAT- ZFP 융합 단백질

본 발명자들은 제공된 DNA 결합 도메인이 상기 DNA 결합 도메인에 작동적으로 연결된 효과기 도메인의 특성에 따라 전사의 활성인자 및 억제인자로서 작용함을 관찰하였다. 예를 들면, TAT-F435는 이것이 p65 활성 도메인 또는 KRAB 억제 도메인에 융합되는가에 따라 내생 VEGF-A의 발현을 활성화시키고 억제시킬 수 있다. BL21(DE3)LysS 세균 (Novagen)을 TAT-F435-KRAB 또는 TAT-F435-p65를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 상기 융합 단백질들 TAT-F435-KRAB 또는 TAT-F435-p65를 형질전환체들로부터 발현시켰다. 실시예 1 참조. TAT-F435-p65를 이용한 실험에서, 본 발명자들은 그의 낮은 발현 수준에 기인하여 TAT-F435-p65 단백질을 포함하는 100 ㎍의 세균성 용해물로 293 세포들을 처리하였다. 상기 세포들을 용해물과 함께 3시간 동안 배양한 후에 배양 배지를 신선한 새 배지로 교환하였다. 그러나, 이는 세균성 용해물로 처리되었지만 TAT-F435-p65를 발현하지 않는 세포들에 비하여 전달 후 48시간째에 분비된 VEGF에 의해 측정된 VEGF 발현을 2.5 (±0.5)배 증가시키기에 충분하였다 (도 3의 A 참조).

개별적인 실험들에서는, 400 ㎍/㎖의 정제된 TAT-F435-KRAB 단백질을 293 세포 (12-웰 플레이트)에 3시간 동안 노출시켰다. 상기 세포들을 신선한 배양 배지에서 48시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양 상등액들과 세포들을 VEGF 단백질 생산 및 VEGF mRNA 양을 분석하기 위하여 수확하였다. 본 발명자들은 TAT-F435-KRAB가 PBS 처리된 대조군 배양액과 비교하여 RT-PCR 방법 (GAPDH mRNA 양에 대해 표준화됨)에 의해 측정된 VEGF mRNA 수준을 3.1 (±0.35)배 억제하였음을 관찰하였다 (도 3의 B 참조). VEGF 생산은 또한 PBS로 처리된 대조군 배양액에 비하여 TAT-F435-KRAB로 처리된 배양액에서 2.7 (±0.2)배 감소하였다 (도 3의 C 참조).

실시예 7: 인간 폐암 세포주 H460 에서 VEGF -A 발현을 감소시키는 TAT-F435- KOX 단백질

VEGF-A는 비-소세포 폐암 세포주 H460 및 인간 결장 암세포주 HCT116 및 HM-7과 같이 혈관이 고도로 발달된 발암성 세포주에서 과발현된다. VEGF-A의 발현은 HEK293F 세포들에서의 발현에 비하여 이들 세포들에서 5 내지 10배정도 높다. 암 치료제로서 전달가능한 징크 핑거 단백질들의 일반적인 적응성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 H460 세포들에서 비정상적인 VEGF-A 과발현을 유발하는 암-특이적인 전사 회로를 무효화하는 TAT-F435-KOX 단백질의 능력을 평가하였다. 우리의 관찰들은 또한 TAT-ZFP-KOX 및 이와 관련된 형상들이 내생 유전자들을 조절하기 위한 전달가능 단백질들을 고안하는데 사용될 수 있음을 확인시킨다.

본 발명자들은 H460 세포들을 TAT-F435-KOX 단백질로 처리하였다. TAT-F435-KOX 단백질은 대조군에 비하여 VEGF-A 단백질의 발현 수준을 3배정도 감소시켰다. 상기 H460 세포들을 3시간 동안 40 ㎍/웰의 TAT-F435-KOX 단백질에 노출시켰다. 이어서, 분비된 VEGF-A 단백질의 농도를 다양한 시점에서 측정하였다. 처리된 세포들 주변의 배지 내 VEGF-A 농도는 전달 12시간 후에 비처리 대조군에 비하여 약 3.8배, 24시간 후에는 약 3.4배, 48시간 후에는 약 1.9배 감소하였다. 도 4 참조. 이러한 결과들은 TAT-F435-KOX가 암세포에서 VEGF-A의 발현을 억제할 수 있음을 나타내는 것이다. TAT-F435-KOX의 조절 효과는 단일 시험관내 처리 이후에 적어도 48시간 동안 지속되었다. TAT-F435-KOX는 10 ㎍/웰의 용량으로 사용되었을 때 H460 세포주에서 유사한 효과를 나타내었다.

실시예 8: TAT-F435- KOX 단백질의 안정성

본 발명자들은 무세포 배양 배지에서 TAT-F435-KOX 단백질의 안정성을 연구하였다. 상기 TAT-F435-KOX 단백질을 Ni-NTA 컬럼으로 정제하였다. 그리고 나서, 상기 단백질을 DMEM (10% FBS, 1% NEAA)에서 37℃에서 배양하였다. 상기 혼합물을 HA-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 다양한 시점에서 TAT-F435-KOX 단백질에 대해 평가하였다.

웨스턴 블롯은 TAT-F435-KOX 단백질 (Ni-NTA 컬럼으로 단일 컬럼 단계를 이용하여 정제됨)은 신속히 소실되었고 지속적인 기간동안 그의 활성을 유지할 것 같지 않음을 보여주었다. 도 5의 A 참조. 본 방법에 의해 정제된 단백질의 소실이 프로테아제 활성에 기인한 것인지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 배양 배지에 첨가하기 전에 TAT-F435-KOX 단백질을 프로테아제 억제제 칵테일 (P8849, Sigma)로 처리하였다. 프로테아제 억제제들의 처리는 배양 조건에서 TAT-F435-KOX 단백질의 안정성을 현저히 증가시켰다. 도 5의 B 참조.

본 발명자들은 적어도 두 개의 컬럼을 이용하여 정제된 동일한 단백질의 행동양식에 대한 관찰들을 비교하였다. 이 경우에, Ni-NTA 친화 컬럼 후에, 상기 단백질은 이온-교환 컬럼으로 추가로 정제되었다.

그리고 나서, 본 발명자들은 약 5×10⁵개의 세포와 80 ㎍의 TAT-F435-Kox를 이용하여 H460 인간 결장 암세포들에서 상기 단백질의 안정성을 평가하였다. 세포들을 이와 같이 2차 정제된 TAT-F435-KOX 단백질로 3시간 동안 처리하였다. 배지는 신선한 성장 배지로 교체하였다. 그리고 나서, 세포들을 상기 처리 후 다양한 시점에서 수확하였다. 대조군 세포들은 수확하기 전에 5분 이하로 TAT-F435-KOX 단백질과 함께 배양하였다.

웨스턴 블럿에 의해 검출된 단백질이 세포 내로 유입된 것이 아니라 배지 내에 남아있는 잔존하는 TAT-F435-KOX 단백질이 아니라는 것을 입증하기 위하여, 세포들을 세포 표면에 결합된 단백질들을 제거하기 위하여 트립신으로 처리하였고, 세포 용해물을 제조하기 전에 광범위하게 세척하였다. 80 ㎍의 용해물 각각을 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하고, 겔을 HYBOND-P^TM　막 (Amersham Pharmacia Biotech)으로 옮긴 후, 검출을 위해 항체들과 접촉시켰다. 본래의 TAT-F435-KOX 단백질은 이들 세포 용해물 내에서 검출되었다. 구체적으로, Ni-NTA 친화컬럼 및 이온-교환 컬럼으로 연속적으로 정제된 상기 단백질 (TAT-F435-KOX)은 세포 내에서 적어도 48시간 동안 안정한 것으로 관찰되었다. 도 6 참조.

TAT-F435-KOX 단백질들 (및 본 발명에서 기술된 다른 전달가능 단백질들)은 봉입체들로부터 또는 수용성 단백질로서 발현되고 정제될 수 있다. 본 발명자들은 봉입체들로부터 정제된 TAT-F435-KOX 단백질의 특성들을 수용성 발현 시스템을 이용하여 생산된 동일한 단백질과 비교하였다. 봉입체들 또는 다른 시스템들로부터 얻은 징크 핑거 단백질들은 아연의 존재 하에서 재중첩될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질들은 (예컨대, 유레아와 같은 카오트로프(chaotrope) 내에서) 변성되고 난 후, 아연 함유 완충용액, 예컨대 PBS (20 mM ZnCl₂, 1 mM DTT 함유)로 투석된다. 상기 투석은 2시간마다 완충용액 (4 ℓ) 교환, 예컨대 총 4회 교환으로 수행될 수 있다. 상기 과정은 전형적으로 4℃에서 수행된다.

수용성 발현을 위하여, TAT-F435-KOX를 코딩하는 핵산 서열을 변형된 pET43.1B 플라스미드 (Novagen)에 서브클로닝하였다. 상기 플라스미드는 6개의 히스티딘 택을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 단백질은 대장균 BL21(DE3)에서 His6-NusA-TAT-F435-KOX의 융합 단백질로서 발현되었다. 상기 융합 단백질은 Ni-NTA 컬럼 상에서 정제되었다. 상기 TAT 도메인과 동일 기원의 트롬빈 절단부위 N-말단이 존재하므로, NusA 도메인을 트롬빈 절단에 의해 제거하였다. 방출된 TAT-F435-KOX는 이온 교환 컬럼 상에서 더욱 정제될 수 있다.

293F 세포들을 봉입체들로부터 정제된 TAT-F435-KOX 단백질들 및 수용성 발현 시스템으로부터 정제된 동일한 단백질로 처리하였다. 두 단백질들 모두 VEGF-A 단백질의 생산을 억제하였다. 그러나, 억제 정도에 있어서의 차이는 유의미하지 않았다.

본 발명에 관한 많은 실시 태양을 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않는 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시 태양들도 후술하는 청구항의 범위에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> TOOLGEN, INC, et al. <120> Transducible DNA-Binding Proteins <130> PCA40631-TGI <150> US 60/477,459 <151> 2003-06-10 <160> 72 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> HIV <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 2 Ala Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> HSV <400> 3 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> synthetic <400> 4 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> coordinating residue <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = hydrophobic residue <220> <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12-16, 18-19, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <400> 5 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = hydrophobic residue <220> <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <400> 6 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Glu 1 5 10 15 Xaa Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 7 <211> 260 <212> PRT <213> human <400> 7 Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Ser 20 25 30 Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser 35 40 45 Arg Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe 50 55 60 Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Pro Thr Met Val 65 70 75 80 Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro 85 90 95 Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met 100 105 110 Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro 115 120 125 Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala 130 135 140 Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp 145 150 155 160 Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe 165 170 175 Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn 180 185 190 Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu 195 200 205 Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Ala Gln Arg Pro Pro Asp 210 215 220 Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu 225 230 235 240 Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala 245 250 255 Leu Leu Ser Gln 260 <210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 Asn Phe Asn Gln Ser Gly Asn Ile Ala Asp Ser Ser Leu Ser Phe Thr 1 5 10 15 Phe Thr Asn Ser Ser Asn Gly Pro Asn Leu Ile Thr Thr Gln Thr Asn 20 25 30 Ser Gln Ala Leu Ser Gln Pro Ile Ala Ser Ser Asn Val His Asp Asn 35 40 45 Phe Met Asn Asn Glu Ile Thr Ala Ser Lys Ile Asp Asp Gly Asn Asn 50 55 60 Ser Lys Pro Leu Ser Pro Gly Trp Thr Asp Gln Thr Ala Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Phe Gly Ile Thr Thr Gly Met Phe Asn Thr Thr Thr Met Asp Asp Val 85 90 95 Tyr Asn Tyr Leu Phe Asp Asp Glu Asp Thr Pro Pro Asn Pro Lys Lys 100 105 110 Glu Ile Ser Met Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 90 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 9 Asn Ser Ala Ser Ser Ser Thr Lys Leu Asp Asp Asp Leu Gly Thr Ala 1 5 10 15 Ala Ala Val Leu Ser Asn Met Arg Ser Ser Pro Tyr Arg Thr His Asp 20 25 30 Lys Pro Ile Ser Asn Val Asn Asp Met Asn Asn Thr Asn Ala Leu Gly 35 40 45 Val Pro Ala Ser Arg Pro His Ser Ser Ser Phe Pro Ser Lys Gly Val 50 55 60 Leu Arg Pro Ile Leu Leu Arg Ile His Asn Ser Glu Gln Gln Pro Ile 65 70 75 80 Phe Glu Ser Asn Asn Ser Thr Ala Cys Ile 85 90 <210> 10 <211> 63 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 10 Val Ser Val Thr Phe Glu Asp Val Ala Val Leu Phe Thr Arg Asp Glu 1 5 10 15 Trp Lys Lys Leu Asp Leu Ser Gln Arg Ser Leu Tyr Arg Glu Val Met 20 25 30 Leu Glu Asn Tyr Ser Asn Leu Ala Ser Met Ala Gly Phe Leu Phe Thr 35 40 45 Lys Pro Lys Val Ile Ser Leu Leu Gln Gln Gly Glu Asp Pro Trp 50 55 60 <210> 11 <211> 96 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 11 Asp Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr Phe Lys 1 5 10 15 Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu Asp Thr 20 25 30 Ala Gln Gln Ile Val Tyr Arg Asn Val Met Leu Glu Asn Tyr Lys Asn 35 40 45 Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu Arg 50 55 60 Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp Leu Val Glu Arg Glu Ile His Gln 65 70 75 80 Glu Thr His Pro Asp Ser Glu Thr Ala Phe Glu Ile Lys Ser Ser Val 85 90 95 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 12 Tyr Lys Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Gly Cys Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Gly Arg Thr His 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 13 Tyr Gln Cys Asn Ile Cys Gly Lys Cys Phe Ser Cys Asn Ser Asn Leu 1 5 10 15 His Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 14 Tyr Ser Cys Gly Ile Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Ser Ser Ala Lys 1 5 10 15 Arg Arg His Cys Ile Leu His 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 15 Tyr Thr Cys Ser Asp Cys Gly Lys Ala Phe Arg Asp Lys Ser Cys Leu 1 5 10 15 Asn Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 16 Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn His Ser Ser Asn Phe 1 5 10 15 Asn Lys His His Arg Ile His 20 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 17 Phe Lys Cys Pro Val Cys Gly Lys Ala Phe Arg His Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 18 Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gln Arg His Val Arg Asn Ile His 20 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 19 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Ile Gly Ser Asn Leu 1 5 10 15 Asn Val His Arg Arg Ile His 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 20 Tyr Gly Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Lys Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Met Ile His 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 21 Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Gln Ala Phe Arg Gln Arg Ala His Leu 1 5 10 15 Ile Arg His His Lys Leu His 20 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 22 Tyr Lys Cys His Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Arg Thr His 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 23 Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg His Ile Lys Leu His 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 24 Tyr Ala Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 25 Tyr Lys Cys Gly Gln Cys Gly Lys Phe Tyr Ser Gln Val Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Lys Ile His 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 26 Tyr Ala Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Cys Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 27 Tyr Ala Cys His Leu Cys Ala Lys Ala Phe Ile Gln Cys Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 28 Tyr Val Cys Arg Glu Cys Gly Arg Gly Phe Arg Gln His Ser His Leu 1 5 10 15 Val Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 29 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Thr His Lys Ile Ile His 20 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 30 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Asn Val His Lys Arg Thr His 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 31 Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Ile His Gln Arg Thr His 20 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 32 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Lys His Lys Lys Ile His 20 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 33 Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 34 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 34 Tyr Val Cys Arg Glu Cys Arg Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 35 Tyr Glu Cys Glu Lys Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Lys Ser His 20 <210> 36 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 36 Tyr Glu Cys Asn Thr Cys Arg Lys Thr Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 37 Tyr Val Cys Ser Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Val His Gln Lys Ile His 20 <210> 38 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 38 Tyr Lys Cys Asp Glu Cys Gly Lys Asn Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Val His Lys Arg Ile His 20 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 39 Tyr Glu Cys Asp Val Cys Gly Lys Thr Phe Thr Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gly Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 40 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 40 Tyr Glu Cys Val Gln Cys Gly Lys Gly Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Thr His Gln Arg Val His 20 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 41 Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 42 Tyr Glu Cys Gln Asp Cys Gly Arg Ala Phe Asn Gln Asn Ser Ser Leu 1 5 10 15 Gly Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 43 Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Phe Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Arg Arg Ser His 20 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 44 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Ile Val His 20 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 45 Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ala Gln Asn Ser Thr Leu 1 5 10 15 Arg Val His Gln Arg Ile His 20 <210> 46 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 46 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Gln His Arg Arg Ile His 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 47 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Arg Arg Ile His 20 <210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 48 His Lys Cys Leu Glu Cys Gly Lys Cys Phe Ser Gln Asn Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 49 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 49 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 50 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 50 Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 51 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 51 Tyr Arg Cys Ser Trp Glu Gly Cys Glu Trp Arg Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Phe Arg Lys His 20 25 <210> 52 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 52 Phe Ser Cys Ser Trp Lys Gly Cys Glu Arg Arg Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Ser Arg His Arg Arg Thr His 20 25 <210> 53 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 53 Phe Ala Cys Ser Trp Gln Asp Cys Asn Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Ala Arg His Tyr Arg Thr His 20 25 <210> 54 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 54 Tyr His Cys Asn Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 55 <211> 24 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 55 Phe Leu Cys Gln Tyr Cys Ala Gln Arg Phe Gly Arg Lys Asp His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Met Lys Lys Ser His 20 <210> 56 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 56 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His 20 <210> 57 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 57 Phe Ala Cys Glu Val Cys Gly Val Arg Phe Thr Arg Asn Asp Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ile His Met Arg Lys His 20 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 58 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 59 Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 60 Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 61 Tyr Leu Cys Ser Glu Cys Asp Lys Cys Phe Ser Arg Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 62 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 62 Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Ser Gly Ser Asn Phe 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 63 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Asn Val His Arg Arg Ile His 20 <210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 64 Tyr Thr Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Thr Thr His 20 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 65 Tyr Glu Cys Asn Tyr Cys Gly Lys Thr Phe Ser Val Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 66 <211> 23 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 66 Tyr Arg Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Trp Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Arg Ile His 20 <210> 67 <211> 83 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 67 Tyr Lys Cys Gly Gln Cys Gly Lys Phe Tyr Ser Gln Val Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Lys 20 25 30 Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr 35 40 45 Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg 50 55 60 Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu Ile Arg His Gln Arg Thr His Thr 65 70 75 80 Gly Glu Lys <210> 68 <211> 83 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 68 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Thr His Lys Ile Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Met 20 25 30 Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu Thr Arg His Gln 35 40 45 Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg 50 55 60 Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr 65 70 75 80 Gly Glu Lys <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Synthetic <400> 69 Tyr Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Synthetic <400> 70 Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Synthetic <400> 71 Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Synthetic <400> 72 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10

Claims (81)

1. a) 다수의 징크 핑거 도메인; 및

   b) 세포막을 통해 단백질을 이동(translocation)시키는데 효과적인 이종의 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)을 포함하는,

   키메라 단백질.
2. 제1항에 있어서,

   상기 단백질 전달 도메인이 다수의 징크 핑거 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
3. 제1항에 있어서,

   상기 다수의 징크 핑거 도메인이 3 내지 6개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
4. 제1항에 있어서,

   상기 키메라 단백질이 VEGF-A 유전자의 한 부위에 특이적으로 결합하고, 세포 내에서 VEGF-A 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
5. 제1항에 있어서,

   상기 키메라 단백질이, 하기 단백질들로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 한 부위에 특이적으로 결합하고 세포 내에서 상기 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질:

   쥰 B 원암유전자(jun B proto-oncogene), 단백질 카이네이즈 C, 렉틴, 뇌-특이적 Na-의존성 무기 인산염 공동수송체, 세포 레티노산-결합 단백질 1, 세포 레티노산-결합 단백질 2, 캐드헤린(cadherin) 13, H-캐드헤린(심장), 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF-A), 색소 상피-유래 인자(PEDF), 분화-관련 유전자-1 (Drg-1), 전사 인자 E2F, 초기 성장 반응-1 (EGR-1), 단백질 타이로신 포스파테이즈 1B (PTP-1B), A20, Fas, 흑색종 분화 관련 유전자-7 (MDA-7), 프레세닐린-1 (PS-1), 안지오텐신 전환 효소, 안지오포이에틴-2, b-시크리테이즈 (BACE1), mmp3, CHFR (checkpoint with forkhead associated and ring finger), 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPAR-gamma), TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL), Ku-80, ATM(ataxia-telangiectasia mutated), BRCA, CC-케모카인 리셉터 5 (CCR5), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양괴사인자 알파-유도된 단백질-3 (TNFAIP3)(A20), c-myc, 하이폭시아-유도성 인자-1 알파 (HIF-1알파), 캐스페이즈-3, 세포간 접착 분자 타입 I (ICAM-1), 안지오텐신 II 수용체 1 (AT-1R), 혈소판-유래 성장인자, 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II, 신경 성장인자, aFGF, bFGF, 표피세포 성장인자 (EGF), TNF-α 및 TNF-β, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 뮤신 (mucins), 성장 호르몬, 프로인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 티록신 (thyroxine), 여포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone), 칼시토닌, 인자 VIII, 조혈 성장 인자, 엔케팔리나제 (enkephalinase), MIS (Mullerian-inhibiting substance), 고나도트로핀-관련 펩타이드, 조직 인자 단백질, 인히빈 (inhibin), 액티빈 (activin), 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12 및 IL-13.
6. 제1항에 있어서,

   상기 다수의 징크 핑거 도메인이 표 2의 한 열에 있는 일단의 모티프의 DNA-접촉 잔기에 해당하는 DNA 접촉 잔기를 갖는 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
7. 제1항에 있어서,

   상기 다수의 징크 핑거 도메인이 하기 그룹으로 이루어진 군에서 선택되는 일단의 모티프의 DNA-접촉 잔기에 해당하는 DNA 접촉 잔기를 갖는 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질: mQSHR-mRDHT-mRSNR; mQSHT-mRSHR-mRDHT; mQSHR- mRDHT-mRSHR; mRSHR-mRDHT-mVSNV; mQSHV-mRDHR-mRDHT; mRDER-mQSSR-mQSHT-mRSNR; mDSAR-mRSNR-mRDHT-mVSSR; mQSHT-mDSAR-mRSNR-mRDHT; mRDHT-mVSNV-mQSHT-mDSAR; mRSHR-mDSCR-mQSHT-mDSCR; mQSNR-mQSHR-mRDHT-mRSNR; mCSNR-mRDHT-mRSNR-mRSHR; mRSHR-mQSHT-mRSHR-mRDER; mQSNR-mRSHR-mQSSR-mRSHR; mQSHT-mDSCR-mRDHT-mCSNR; mQSHT-mWSNR-mRSHR-mWSNR; 및 mVSNV-mRSHR-mRDER-mQSNV.
8. 제1항에 있어서,

   핵 위치 시그날을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
9. 제1항에 있어서,

   상기 다수 중 하나 이상의 징크 핑거 도메인이 천연형 징크 핑거 도메인의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
10. 제9항에 있어서,

    상기 다수 중 하나 이상의 징크 핑거 도메인이 인간의 것임을 특징으로 키메라 단백질.
11. 제1항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 바이러스 서열 또는 인간 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
12. 제1항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 HIV tat 단백질 전달 도메인, HSV VP22 단백질, 또는 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
13. 제12항에 있어서,

    상기 HIV tat 단백질 전달 도메인이 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열번호: 1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
14. 제1항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 변이된 또는 합성된 단백질 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
15. 제1항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 서열번호: 69 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 변이된 tat 단백질 전달 도메인, 6 내지 12개의 아르기닌 잔기로 이루어진 폴리아르기닌 올리고펩타이드, 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 HN1 합성 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
16. 제1항에 있어서,

    상기 키메라 단백질이 세포의 막과 접촉한 후 세포 내에서 하나 이상의 내생 유전자를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
17. 제1항에 있어서,

    상기 키메라 단백질이 세포 내에서 하나 이상, 그러나 세포내 유전자의 1 % 미만의 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
18. 제1항에 있어서,

    상기 키메라 단백질이 세포 내에서 하나 이상, 그러나 세포내 유전자의 0.01 % 미만의 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
19. 제1항에 있어서,

    상기 키메라 단백질이 세포 투과 시약의 부재 하에 외부 환경으로부터 포유동물 세포 내로 이동(translocate)할 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
20. 제1항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인과 다수의 징크 핑거 도메인이 동일한 폴리펩타이드 사슬의 구성요소인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
21. 제1항에 있어서,

    세포 표적화(targeting) 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
22. 제21항에 있어서,

    상기 세포 표적화 도메인이 면역글로불린 가변 도메인, 성장 인자, 바이러스 단백 질의 세포 결합 도메인, 또는 세포외 단백질의 세포 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
23. 제1항에 있어서,

    세포 표면 단백질 결합 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
24. 제1항에 있어서,

    정제 도구(handle)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
25. 제24항에 있어서,

    상기 정제 도구가 금속을 킬레이트할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
26. 제1항에 있어서,

    상기 다수의 각 징크 핑거 도메인이 아연 원자에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
27. 제1항에 있어서,

    전사 활성화 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
28. 제27항에 있어서,

    상기 전사 활성화 도메인이 p65 또는 VP16 활성화 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
29. 제1항에 있어서,

    전사 억제 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
30. 제29항에 있어서,

    상기 전사 억제 도메인이 Kid 또는 KOX 억제 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
31. 제1항에 있어서,

    상기 단백질이, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포가 3 x 10⁵ 세포/ml로, 상기 단백질이 100 ㎍/ml의 농도로 세포외 배지에 존재하는 분석법에서, 배양된 상기 세포의 50% 이상에 전달될 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
32. 제1항에 있어서,

    상기 키메라 단백질이 인간 조직 배양 세포에서 0.5 시간 이상 안정한 것을 특징으 로 하는 키메라 단백질.
33. 제1항의 키메라 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
34. 제33항에 있어서,

    상기 단백질의 징크 핑거 도메인의 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합 형성을 감소시키기에 효과적인 양으로 환원제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
35. 제34항에 있어서,

    상기 환원제가 글루타치온 또는 DTT를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제34항에 있어서,

    상기 조성물이 세포 배양 배지와 배합되었을 때, 상기 단백질이 세포 배양 배지에서 12시간 이상 동안 안정한 것을 특징으로 하는 조성물.
37. 제34항에 있어서,

    약 1 μM 내지 500 μM의 염화아연을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
38. 제33항에 있어서,

    신생물 질환, 염증성 질환 또는 혈관생성-기반 질환을 앓고 있거나 앓고 있을 것으로 의심되는 대상(subject)의 치료에 사용되고, 상기 키메라 단백질이 대상의 세포 내에서 VEGF-A 전사를 조절하도록 효과기(effector) 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
39. a) 징크 핑거 도메인; 및 b) 상기 징크 핑거 도메인에 대해 N-말단에 위치한, 이종의 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산.
40. 다수의 징크 핑거 도메인 및 이종의 단백질 전달 도메인을 포함하고, 대상이 세포 내에서 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있는 키메라 DNA 결합 단백질을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 세포 내에서 유전자 발현을 변경시키는 방법.
41. 제40항에 있어서,

    상기 키메라 단백질이 제1 투여량으로 투여되고, 상기 방법이 제2 투여량의 상기 키메라 단백질을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제41항에 있어서,

    상기 제1 및 제2 투여량이 약 48 시간 이상 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제41항에 있어서,

    상기 제1 투여량이 제2 투여량보다 25 % 이상 적은 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제40항에 있어서,

    상기 내생 유전자가 VEGF-A인 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제44항에 있어서,

    상기 대상이 신생물 질환, 염증성 질환 또는 혈관생성-기반 질환을 가지거나 가질 것으로 의심되고, 상기 DNA 결합 단백질이 대상의 세포 내에서 VEGF-A 전사를 조절하도록 효과기 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 다수의 징크 핑거 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하고 세포 내에서 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있는 키메라 DNA 결합 단백질을, 내생 유전자의 전사를 48 시간 이상 조절하기에 효과적인 양으로 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 진핵 배양 세포 내에서 유전자 발현을 변경시키는 방법.
47. 제46항에 있어서,

    상기 접촉으로부터 48시간 이상 후에, 세포를 제2 투여량의 DNA 결합 단백질과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제46항에 있어서,

    상기 내생 유전자가 VEGF-A인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 외생 폴리펩타이드를 포함하되 상기 외생 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 포함하지 않는 진핵세포로서, 여기에서 상기 외생 폴리펩타이드가 다수의 징크 핑거 도메인 및 상기 DNA 결합 도메인에 대해 이종인 단백질 전달 도메인을 포함하고, 상기 외생 폴리펩타이드가 세포 내로 도입된 후 12시간 이상동안 세포 내에서 내생 유전자의 선택된 하위집합(subset)의 전사를 조절하는 기능이 있는 것을 특징으로 하는 세포.
50. 제49항에 있어서,

    상기 다수의 징크 핑거 도메인이 천연형 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제49항에 있어서,

    상기 다수의 징크 핑거 도메인이 인간 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제49항에 있어서,

    상기 외생 폴리펩타이드가 세포 내에서 48시간 이상 동안 기능을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 1) a) 징크 핑거 도메인 및 b) 이종 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열, 및 2) 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;

    상기 핵산을 폴리펩타이드가 합성되는 조건 하에 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계; 및

    상기 숙주 세포 또는 숙주 세포 주위의 배지로부터 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는,

    전달가능한 DNA 결합 폴리펩타이드의 제조 방법.
54. 제53항에 있어서,

    상기 분리가 봉입체(inclusion bodies)의 정제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제53항에 있어서,

    상기 분리가 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
56. 제53항에 있어서,

    상기 분리된 폴리펩타이드를 약학적으로 허용되는 담체와 배합함으로써 약학적 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
57. 진핵 세포를, 다수의 징크 핑거 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하고 세포 내에서 내생 유전자의 전사를 조절할 수 있는 키메라 DNA 결합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 진핵 세포 내에서 유전자 발현을 변경시키는 방법.
58. 제57항에 있어서,

    상기 진핵 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제57항에 있어서,

    상기 진핵 세포가 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
60. 제57항에 있어서,

    상기 진핵 세포가 배양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
61. 제57항에 있어서,

    상기 세포가 대상으로부터 얻어지거나 대상 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
62. 제61항에 있어서,

    상기 대상이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
63. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 다수의 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
64. 제57항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 바이러스 서열 또는 인간 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
65. 제64항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 HIV tat 단백질 전달 도메인, HSV VP22 단백질, 또는 안테나페디아 호메오도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
66. 제65항에 있어서,

    상기 HIV tat 단백질 전달 도메인이 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열번호: 1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
67. 제57항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 변이된 또는 합성된 단백질 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
68. 제57항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인이 서열번호: 69 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 변이된 tat 단백질 전달 도메인, 6 내지 12개의 아르기닌 잔기로 이루어진 폴리아르기닌 올리고펩타이드, 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 HN1 합성 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
69. 제57항에 있어서,

    상기 단백질 전달 도메인과 다수의 징크 핑거 도메인이 동일한 폴리펩타이드 사슬의 구성요소인 것을 특징으로 하는 방법.
70. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 세포 표적화 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
71. 제70항에 있어서,

    상기 세포 표적화 도메인이 면역글로불린 가변 도메인, 성장 인자, 바이러스 단백질의 세포 결합 도메인, 또는 세포외 단백질의 세포 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
72. 제57항에 있어서,

    상기 내생 유전자가 하기 단백질들로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법:

    쥰 B 원암유전자, 단백질 카이네이즈 C, 렉틴, 뇌-특이적 Na-의존성 무기 인산염 공동수송체, 세포 레티노산-결합 단백질 1, 세포 레티노산-결합 단백질 2, 캐드헤린 13, H-캐드헤린(심장), 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF-A), 색소 상피-유래 인자(PEDF), 분화-관련 유전자-1 (Drg-1), 전사 인자 E2F, 초기 성장 반응-1 (EGR-1), 단백질 타이로신 포스파테이즈 1B (PTP-1B), A20, Fas, 흑색종 분화 관련 유전자-7 (MDA-7), 프레세닐린-1 (PS-1), 안지오텐신 전환 효소, 안지오포이에틴-2, b-시크리테이즈 (BACE1), mmp3, CHFR (checkpoint with forkhead associated and ring finger), 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPAR-gamma), TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL), Ku-80, ATM(ataxia-telangiectasia mutated), BRCA, CC-케모카인 리셉터 5 (CCR5), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 종양괴사인자 알파-유도된 단백질-3 (TNFAIP3)(A20), c-myc, 하이폭시아-유도성 인자-1 알파 (HIF-1알파), 캐스페이즈-3, 세포간 접착 분자 타입 I (ICAM-1), 안지오텐신 II 수용체 1 (AT-1R), 혈소판-유래 성장인자, 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II, 신경 성장인자, aFGF, bFGF, 표피세포 성장인자 (EGF), TNF-α 및 TNF-β, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 뮤신, 성장 호르몬, 프로인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사 슬, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 티록신, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 인자 VIII, 조혈 성장 인자, 엔케팔리나제, MIS (Mullerian-inhibiting substance), 고나도트로핀-관련 펩타이드, 조직 인자 단백질, 인히빈, 액티빈, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12 및 IL-13.
73. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 전사 개시 부위의 1000, 500, 300, 또는 100 염기쌍 내의 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
74. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 TATA 박스의 1000, 500, 300, 또는 100 염기쌍 내의 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
75. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 내생 유전자의 조절 영역에서 천연형 전사 인자가 결합하는 부위의 20 염기쌍 내의 부위 또는 상기 결합부위와 중첩되는 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
76. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 내생 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
77. 제57항에 있어서,

    상기 키메라 DNA 결합 단백질이 내생 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
78. 제57항에 있어서,

    상기 세포가 신생물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
79. 코딩 서열 및 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 코딩 서열이 시그날 서열, 다수의 징크 핑거 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
80. 하나 이상의 세포에, 시그날 서열, 다수의 징크 핑거 도메인 및 단백질 전달 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 코딩 서열 및 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산을 도입하여, 세포가 핵산을 발현시키고 키메라 단백질을 생산 및 분비하도록 함으로써, 키메라 단백질이 다른 세포에 들어가 그 세포의 내생 유전자의 발현을 조절할 수 있도록 하는 것을 포함하는, 내생 유전 자의 발현을 변경시키는 방법.
81. 제80항에 있어서,

    핵산이 도입되는 상기 세포가 대상 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.

Images