KR100766952B1 - 조절성 징크 핑거 단백질 - Google Patents

Abstract

내생 유전자를 조절할 수 있는 키메라 징크 핑거 단백질이 개시되었다. 그러한 단백질의 예는 VEGF-A 발현을 조절할 수 있는 단백질을 포함한다. 상기 단백질과 이를 코딩하는 핵산은 혈관생성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

Description

조절성 징크 핑거 단백질{REGULATORY ZINC FINGER PROTEINS}

본 발명은 전사인자와 같은 DNA 결합 단백질에 관한 것이다.

관련된 출원의 상호 참조

본 출원은 2002년 12월 9일에 출원된 미국 출원 제60/431,892호를 우선권으로 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.

대부분의 유전자들은 보통 프로모터 또는 인핸서 영역 내에 있는 그 유전자 내 특정 DNA 부위에 결합하는 폴리펩타이드 전사 인자에 의해 전사 수준에서 조절된다. 이 단백질들은 프로모터 부위에서 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시를 활성화 또는 억제함으로써 표적 유전자의 발현을 조절한다. 활성화 인자(activator)든 억제 인자(repressor)든 많은 전사 인자는 구조적으로 모듈(module)성을 갖는다. 그러한 모듈은 구조적으로 독특한 도메인으로 폴딩이 가능하며, DNA 결합, 이량체화(dimerization) 또는 전사 기구(transcriptional machinery)와의 상호작용과 같은 특정 기능을 가진다. 활성화 도메인 또는 억제 도메인과 같은 효과기(effector) 도메인들은 이종 전사 인자의 DNA-결합 도메인에 연결되어도 그 기능을 유지한다 (Brent 및 Ptashne, (1985) Cell 43:729-36; Dawson et al., (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31). 징크 핑거 도메인(zinc finger domain), 호메오도메인(homeodomain) 및 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 도메인을 포함하는 많은 DNA-결합 도메인의 3차 구조가 NMR 및 X-선 결정 데이터로 결정되어 있다.

징크 핑거 도메인들은 기능에 있어서 모듈성을 갖는 구조 도메인의 한 타입이다. 징크 핑거 단백질들(ZFPs)은 전사를 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 킴(Kim)과 파보(Pabo)는 Zif268 단백질이 표적 유전자의 전사개시 부위 근처에 결합하여 VP16에 의하여 활성화된 표적 유전자의 전사를 효과적으로 억제하였다고 보고하였다(Kim and Pabo (1997) J Biol Chem 272:29795-29800). 류(Liu) 등은 부위-특이적 돌연변이에 의하여 제조된 가공 징크 핑거 단백질들을 이용한 VEGF-A의 활성화를 보고하였다(Liu et al. (2001). J. Biol. Chem. 276, 11323-11334).

요약

하나의 태양에 있어서, 본 발명은 DNA 결합 도메인을 포함하며 진핵생물 세포와 같은 세포 내에서 유전자의 발현을 조절할 수 있는 폴리펩타이드를 제공한다. 하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 유전자 내의 표적 DNA에 결합한다. DNA 결합 도메인은 전형적으로 3개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다.

하나의 실시예에 있어서, 하나, 두 개, 또는 세 개 이상의 징크 핑거 도메인들은 자연형 징크 핑거 도메인이다. 예를 들어, 이 도메인들은 다른 자연형 단백질들의 징크 핑거 도메인들과 동일할 수 있거나, 자연형 단백질들에서 유래하는 인접 하지 않는 징크 핑거 도메인들과 동일할 수 있다. 모든 징크 핑거 도메인들은 자연형일 수 있다.

다른 예에서, 하나, 두 개, 또는 세 개 이상의 징크 핑거 도메인은 자연형 징크 핑거 도메인들의 변형체, 예를 들어 하나 내지 네 개 혹은 두 개 내지 다섯 개의 아미노산 잔기가 다른 도메인일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 자연형 징크 핑거 도메인 및 변형 도메인의 조합을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 임의의 유전자를 조절할 수 있다. 조절은 폴리펩타이드가 표적 유전자 내의 표적 부위와 상호작용하는 경우와 같이 직접적일 수 있다. 예를 들어, 유전자는 세포 내의 내생 유전자(예: 자연형 유전체 내의 유전자), 이종 유전자 (예: 전이 유전자) 또는 바이러스성 유전자일 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 내생 유전자는 분비되는 폴리펩타이드, 또는 분비되는 인자 예를 들어 분비성 폴리펩타이드의 생산에 관여하거나 생산을 조절하는 폴리펩타이드를 코드하고 있다. 하나의 실시예에 있어서, 내생 유전자는 세포 증식, 세포 이동, 또는 조직 형태형성 (예를 들어, 혈관형성)을 조절한다.

하나의 실시예에 있어서, 내생 유전자는 호르몬 생산, 호르몬 또는 성장인자를 조절하는 폴리펩타이드를 코드한다. 예시적인 성장 인자는 성장 인자의 VEGF 범주(family)를 포함한다.

VEGF-A는 이 범주의 하나이다. 하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 VEGF-A 유전자의 조절 부위 내의 표적 부위, 예를 들어, VEGF-A 유전자의 -950 내지 +450 사이에 위치하는 부위를 인식한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 인간 VEGF- A 프로모터의 -680, -677, -671, -668, -665, -633R, -632R, -631, -630, -606, -603, -554, -536, -495, -475, -468, -465, -462, -455, -395R, -394R, -393R, -392, -391R, -385R, -382R, -358R, -314R, -282, -206, -203, -184, -181, -137, -124, -90R, -85, -30, 77, 244R, 283R, 342, 357, 366, 434, 435, 혹은 474R 부근, 또는 상기 부위들에서 60, 50, 20, 10, 5, 또는 3 뉴클레오타이드 내의 부위를 인식할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 위치들은 문자 "R"이 없는 한, 프로모터의 순방향 가닥 상의 전사 개시 부위로부터 5' 끝의 뉴클레오타이드의 위치를 나타낸다. "R" 문자가 표시된 경우, 위치들의 번호는 역방향 가닥에서 5' 끝의 뉴클레오타이드의 위치를 표시한다. 예를 들어, F435 (-90R)의 표적 서열은 역방향 가닥 상에서 5': -90 내지 3': -98이다 (순방향 가닥의 전사 개시 부위로부터는 5': -98 내지 3'-90 위치임). 하나의 실시예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 VEGF-A 유전자 내의 표적 부위에 결합하기 위하여 본 명세서 내에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드와 경쟁한다.

하나의 실시예에 있어서, 내생 유전자의 조절 영역에 있는 표적 부위는 DNase 민감 부위와 중첩되거나 내생 전사 인자의 결합 부위와 중첩된다. 다른 예서, 표적 부위는 이러한 부위 또는 영역으로부터 700, 500, 300, 200, 50, 20, 10, 5, 또는 3 염기쌍 거리 내에 있다. 하나의 실시예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 표적 부위에 20, 7, 5, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.05 nM 이하의 해리상수로 결합한다.

하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 내에 있을 때, 내생 유전자의 전사를 1.25, 1.5, 1.7, 1.9, 2.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 또는 100 배 이상 변화(예 를 들어, 억제 또는 활성화)시킬 수 있다. 폴리펩타이드는 생체 내의 세포 내에서 유사한 효능을 가질 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, DNA 결합 도메인은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5의 단일 행에 열거되는 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하거나, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 또는 표 5의 단일 행에 열거되는 두 징크 핑거 도메인과 동일한 DNA 접촉 잔기를 갖는 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다.

폴리펩타이드는 전사 활성화 또는 억제 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 추가로 세포 전달(transduction) 도메인, 예를 들어, HIV tat 전달 도메인을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 포유동물 세포에서 저산소 조건에 의하여 유도된 VEGF-A 생산을 억제한다. 상기 억제는 예를 들어 VEGF-A 수준이 폴리펩타이드를 포함하지 않는 차이만을 가지는 동일 세포에서 저산소 조건에 의하여 유도된 단백질 수준의 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3, 2, 1, 또는 0.1 % 이하가 되도록 하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서 내에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 및 그 핵산을 포함하는 세포 (예를 들어, 원핵세포, 진핵세포, 예를 들어, 포유동물 세포)를 제공한다. 세포는 핵산을 발현할 수 있고 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 세포는 시험관 내(in vitro)에서 배양된다. 세포는 면역-분리되거나 캡슐화될 수 있다. 본 발명은 폴리펩타이드가 생산되고 그 폴리펩타이드에 의하여 내생 유전자가 조절되는 하나 이상의 세포들을 포함 하는 생물체를 역시 제공한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 세 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계로서, 상기 폴리펩타이드는 내생 유전자의 표적 DNA 부위에 결합하는 것인 단계; 및 인공 폴리펩타이드가 생산되고 표적 DNA 부위에 결합하고, 내생 유전자를 조절하는 조건 하에서 세포 내에서 코딩 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 내생 유전자를 조절하는 방법을 제공한다. 하나의 실시예에 있어서, 징크 핑거 도메인들 중의 2 개 이상은 자연형 징크 핑거 도메인이다. 예를 들어, 두 개의 징크 핑거 도메인들은 상이한 자연형 단백질들의 징크 핑거 도메인들과 동일할 수 있거나, 동일한 자연형 단백질의 서로 이웃하지 않는 징크 핑거 도메인일 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 인공 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인 혹은 전사 억제 도메인을 포함한다. 내생 유전자는 억제되거나 또는 활성화될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 세포는 이를 핵산 전달 운반체 (vehicle), 예를 들어 리포좀, 바이러스, 또는 바이러스성 입자와 접촉시킴으로써 제공된다. 하나의 실시예에 있어서, 세포는 생물체, 예를 들어 포유 동물 내의 세포이다. 상기 방법은, 발현 전에 대상 생물체에 세포를 도입하거나, 세포를 캡슐화하고 대상 생물체에 캡슐화된 세포를 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

폴리펩타이드의 예는 두 개 이상의 징크 핑거 도메인, 예를 들어, 하기 표의 특정 행의 두 개, 세 개, 또는 네 개의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

하나의 태양에 있어서, 본 발명은 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. DNA 결합 도메인은 다수의 징크 핑거 도메인을 갖는다. 폴리펩타이드는 세포 내에서 VEGF-A의 발현 또는 생산을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 세포의 정상적 반응을 VEGF-A의 생산 또는 발현을 증가시키거나 감소시키는 신호로 변화시킬 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 VEGF-A의 생산 또는 발현이 유도되는 조건 하에서 세포 내 VEGF-A의 생산 또는 발현의 유도를 억제할 수 있다. 예를 들어, 상기 억제는 VEGF-A 단백질 또는 mRNA 양이 폴리펩타이드를 포함하지 않는 동일 세포에서 유도되는 양에 비하여 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3, 2, 1, 또는 0.5 % 이하가 되게 하는 정도일 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 상기 조건은 저산소 조건을 포함한다.

상기 조건들은, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 특히 인간 배아 신장세포 293F에서 결정될 수 있다.

폴리펩타이드는, 예를 들어 배양 중인 인간세포에서 또는 인간 또는 비-인간 포유동물과 같은 생체 내에서 매우 다양한 용도에 사용될 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 인간 VEGF-A 유전자 내의 부위에 결합한다. 다른 예에서, 상기 폴리펩타이드는 간접적으로 작용하며, 예를 들어, 다른 유전자의 부위에 결합한다.

하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 억제 도메인을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 본 명세서 내에 기재된 다른 특징들을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 대상(subject)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상에서 혈관생성을 감소시키는 데 효과적인 양으로, 예를 들어 대상의 환부(즉, 신생조직)의 부근에, 또는 대상의 전신에 투여될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 대상은 전이성 암을 가지고 있거나 가질 것으로 예측되는 인간이다.

임의의 제공된 폴리펩타이드와 관련하여, 폴리펩타이드는 이종 서열, 예를 들어, 핵 위치 시그날(nuclear localization signal), 소분자 결합 도메인(예: 스테로이드 결합 도메인), 에피토프 태그(tag) 또는 정제 도구, 촉매 도메인(예: 핵산 수정 도메인, 핵산 절단 도메인, 또는 DNA 복구 촉매 도메인), 전사기능 도메인(예: 활성화 도메인, 억제 도메인 등), 단백질 전달(transduction) 도메인(예: HIV tat 유래) 및/또는 조절부위(예: 인산화 부위, 유비퀴티네이션 부위 또는 단백질 분해효소 절단 부위)를 추가로 포함할 수 있다.

폴리펩타이드는 예를 들어 하나 이상의 추가적 성분들과 함께 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 조성물 또는 폴리펩타이드는 다른 물질 또는 예를 들어 치료용 사용법과 같은 사용 지시문을 역시 포함하는 키트에 포함될 수 있다.

폴리펩타이드는 비드, 매트릭스 또는 평면 어레이 등의 고체 지지체에(공유 또는 비공유 결합으로) 결합될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 방사성 화합물, 형광 화합물, 다른 감지 가능한 물질, 또는 감지시스템의 성분(예: 화학발광 시약)과 같은 표지에 결합될 수 있다.

본 발명은 전술한 폴리펩타이드의 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산을 역시 포함한다. 핵산은 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및/또는 선택 마커 등을 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 랜티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스 또는 아데노바이러스 등 포유동물 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 등의 바이러스 내에 포장될 수 있다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 세포를 추가로 제공한다. 세포는 대상 생물체의 조직에 있거나 배양체일 수 있다. 세포는 동물세포(예: 포유동물세포(예: 인간 또는 비-인간 세포)), 식물세포, 또는 미생물세포(예: 균류 또는 세균 세포)일 수 있다. 세포는 폴리펩타이드를 세포 혹은 모세포에 도입하거나, 핵산을 세포나 모세포에 도입하여 제조할 수 있다. 상기 핵산은 세포 내에서 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 생쥐, 래트, 돼지, 토끼, 젖소, 염소 또는 양과 같은 사람이 아닌 유전자이식(transgenic) 포유동물을 추가로 포함할 수 있다. 유전자이식 포유동물의 유전적 보충물은 전술하거나 본 명세서의 다른 곳에서 설명한 키메라 징크 핑거 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 예를 들어 핵산을 발현하여 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및, 예를 들어 세포 내의 내재 유전자 또는 바이러스 유전자를 조절하기 위해 폴리펩타이드를 사용하는 방법을 포함한다.

본 명세서에서 VEGF-A를 조절하는 임의의 폴리펩타이드와 관련하여, 폴리펩타이드는 세포 내에서 VEGF-A 발현을 조절하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 폴리펩타이드 혹은 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 리포좀을 이용하여 또는 단백질 전달 도메인과 융합시킴으로써 도입될 수 있다. 핵산은 형질감염(transfection) 혹은 바이러스성 전달에 의하여 도입될 수 있다.

본 발명은 조성물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 VEGF-A를 조절하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 VEGF-A 발현을 억제할 수 있고, 조성물은 예를 들어, 대상에서 혈관생성을 감소시키는 데 효과적인 양으로, 예를 들어 대상의 환부(즉, 신생조직)의 부근에, 또는 대상의 전신에 투여될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 대상은 전이성 암을 가지고 있거나 가질 것으로 예측되는 인간이다.

다른 예에서, 폴리펩타이드는 VEGF-A의 발현을 증가시킬 수 있으며, 조성물은 대상에서 혈관생성을 증가시키는 데 효과적인 양으로 대상에 투여된다. 예를 들어 증가된 혈관생성은 혈관형성, 배 발생, 체세포 성장, 신경계의 분화, 임신의 유지, 상처의 치유 등에 필요할 수 있다. 혈관생성인자 (VEGF-A)는 내피 세포에 특이적으로 작용하는 성장인자 중의 하나이며, 내피 세포의 성장과 분화를 조절하는 주요 인자이다.

VEGF 혹은 그의 이형체(isoform)인 VEGF₁₆₄ 와 VEGF₁₈₈가 충분치 않을시 생후 혈관형성, 빈혈성 심장 질환이 유발된다. VEGF-A의 활성화는 말초동맥 및 관상동맥 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상은 상처 (내부, 외부), 임신, 신경성 이상, 배 분화 이상, 심혈관 질환 (예를 들어, 허혈성 심장질환, 말초동맥질환, 관상동맥질환)을 가지거나 가질 것으로 추측되는 인간일 수 있다.

최소 5종의 VEGF-A 단백질의 이형체가 상이한 스플라이스 변형체 (splice variants)로부터 생산된다. 이들 이형체는 혈관생성에서 상이한 효능을 갖는다. 본 명세서에 기재된 단백질과 같은 징크 핑거 단백질에 의한 VEGF-A의 활성화는, 어떤 실행에서 바람직한 임상적 결과를 위하여 중요한 전체 또는 특정 스플라이스 변형체의 상승 조절이 가능하도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 징크 핑거 단백질은 모든 스플라이스 변형체의 발현을 조절하거나 또는 스플라이스 변형체의 한 하부 셋트, 예를 들어, 하나 이상의 스플라이스 변형체의 발현을 조절할 수 있다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 생체적합성 물질로 이루어진 캡슐화 층을 포함하는 캡슐화된 조성물과, 세포인자, 예를 들어 분비성 인자, 또는 세포질 단백질과 같은 비분비성 인자의 생산을 조절하는 이형 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포를 제공한다. 하나의 실시예에 있어서, 생체적합성 물질은 10, 20, 30, 또는 40 kDa 이상의 분자량을 가지는 단백질들을 투과시키는 것이다. 생체적합성 물질은 50, 100, 120, 또는 200 kDa 이상의 큰 단백질을 가두어 둘 수 있다.

본 발명은 키메라 단백질 (예를 들어 전사인자)을 확인하고, 제조할 수 있는 신속하고 측정 가능한 세포-기반 방법을 제공한다. 이러한 전사인자들은, 예를 들어, 생의학적 및 생물공학적 응용에서 내생 유전자의 발현을 변화시키기 위하여 사용될 수 있다. 전사인자들의 활성은 생체 내에서 및 배양 세포, 즉, 온전하고 살아있는 배양 세포에서 측정될 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 징크 핑거 단백질과 같은 키메라 징크 핑거 단백질의 특징을 구명하는(characterizing) 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음을 포함한다: 단백질을 코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계; 핵산의 발현단계; 및 표적 유전자의 발현을 평가하는 단계. 예를 들어, 측정은 세포 내에서 내생 유전자의 발현 프로필을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 발현 프로필은 다수의 값을 포함하는데, 각 값은 상이한 유전자, 또는 한 유전자의 스플라이스 변형체 또는 대립유전자(allelic) 변형체의 발현(즉, mRNA 수준)이나 번역산물의 양(즉, 단백질 수준)에 대응한다. 그 값은 유전자의 발현수준 또는 유전자의 번역산물의 정성적 또는 정량적 척도가 될 수 있으며, 즉 1) 유전자로부터 전사된 mRNA 또는 2) 유전자로부터 코드된 폴리펩타이드의 양의 척도일 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 특정 표적 부위에 결합할 수 있는 키메라 징크 핑거 단백질을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 자연형 인간 징크 핑거 도메인(예: 인간 징크 핑거 도메인)에 대한 식별자(identifier)를, 그 식별자에 의해 대조되는 징크 핑거 도메인에 의해 인식되는 3- 또는 4-염기쌍 하위 부위(subsite)와 연결시키는 각 기록을 포함하는 자료 기록의 제공 단계; 표적 부위를 두 개 이상의 3- 또는 4-염기쌍 하위 부위로 분해하는 단계; 각 하위 부위에 대해 그를 인식하는 징크 핑거 도메인에 대한 식별자를 포함하는 한 세트의 식별자를 자료 기록으로부터 검색하는 단계; 및, 각 하위 부위에 대한 세트로부터 식별자에 의해 대조되는, 각 하위 부위에 대한 징크 핑거 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 고안 단계.

자료 기록은 목적 징크 핑거 도메인을 확인시키는 기록을 포함할 수 있다. 상기 방법은 시험관 내(in vitro)에서 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 합성 및/또는 폴리펩타이드의 합성 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 방법은 또한, 예를 들어 시험관 내 결합 분석 또는 리포터 유전자 발현에 대한 분석과 같은 생체 내(in viro) 분석을 이용하여 표적 부위에 대한 폴리펩타이드의 결합을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 합성된 폴리펩타이드는 억제 또는 활성화 도메인을 추가로 포함할 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 내생 유전자의 발현을 변경시키는 폴리펩타이드의 능력을 평가하는 것을 추가로 포함한다. 상기 평가는, 예를 들어 핵산 마이크로어레이를 사용하여 복수의 내생 유전자, 또는 단일 또는 한정된 수의 유전자의 발현을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 예를 들어 시험관 내에서 폴리펩타이드를 표적 부위를 포함하는 DNA와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

다른 예에서, 이 방법은 제1 및 제2 징크 핑거 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 각 핵산을 포함하는 어드레스(address) 지정된 핵산 라이브러리로부터 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 검색하는 것을 추가로 포함한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 특정 폴리펩타이드와 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어 하나, 둘, 셋, 네 개의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있으며, 본 명세서에 제시된 특정 아미노산 서열을 갖는 참조 폴리펩타이드와 연관이 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 하나, 둘, 셋, 네 개 이상의 징크 핑거 도메인에서 참조 폴리펩타이드의 각각의 징크 핑거 도메인 내의 DNA-접촉 잔기와 동일한 DNA-접촉잔기를 가질 수 있다. 다른 예로, 폴리펩타이드의 3개의 징크 핑거 도메인에서, DNA 접촉잔기 (3x4)의 9, 10, 11개 이상은 참조 폴리펩타이드 내의 각 징크 핑거 도메인들의 DNA 접촉잔기와 동일하다. 다른 예로, 폴리펩타이드의 네 개의 징크 핑거 도메인에서, DNA 접촉잔기(4x4)의 12, 13, 14, 15개 이상은 참조 폴리펩타이드 내의 각 징크 핑거 도메인들의 DNA 접촉잔기와 동일하다. 폴리펩타이드는 참조 폴리펩타이드와 동일한 위치에 결합하여 동일한 내생 유전자를, 예를 들어 참조 폴리펩타이드에 비해 0.1 내지 10배 또는 0.5 내지 1.5배의 활성으로 조절할 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 하나 이상 (또는 전부)의 징크 핑거 도메인의 아미노산 서열은 자연형 서열이다. 하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 표적 유전자, 예를 들어 세포의 내생 유전자, 예를 들어 참조 폴리펩타이드와 동일한 표적 유전자, 예를 들어 VEGF-A를 조절할 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 정제된 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 징크 핑거 도메인과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 93%, 95%, 96%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 DNA 접촉 잔기에 해당하는 아미노산 위치가 본 명세서 내에 기재된 징크 핑거 도메인과 동일할 수 있다. 이와 달리, 폴리펩타이드들은 폴리펩타이드의 DNA 접촉 잔기에 해당하는 하나 이상의 잔기가 본 명세서에 기재된 징크 핑거 도메인과 다르다. 예를 들어, 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 징크 핑거 도메인들은 DNA 접촉잔기 상의 보존적인 치환을 포함한다.

폴리펩타이드는 하나, 둘, 또는 세 개 이상의 잔기들, 예를 들어 DNA 접촉 잔기 이외의 잔기들에서 다를 수도 있다. 예를 들어, 주어진 징크 핑거 도메인 내에서, 폴리펩타이드는 위에서 참조된 서열과 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 아미노산이 다를 수 있다. 차이점은 본 명세서에서 정의한 보존적 치환에 기인할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 위의 참조 서열과 관련한 아미노산의 차이는 아연을 배위결합하는 두 번째 시스틴(cystein)과 -1 위치의 DNA 접촉 위치 (아래 명시된 DNA 접촉 위치의 번호부여 방법을 참조) 사이에 위치한다.

서열의 비교 및 두 아미노산 서열간의 동일성 퍼센트는 수학적 알고리즘을 사용하여 구할 수 있다. 특히, 두 아미노산 서열간의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램에 포함된 니들맨(Needleman) 과 운쉬(Wunsch) ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)의 알고리즘을 사용하여, 차이 벌점 12, 차이 연장 벌점 4, 프래임시프트 벌점 5를 적용하는 블로섬(Blossum) 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 계산될 수 있다.

정제된 폴리펩타이드들은 다음에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: 이종 DNA 결합 도메인, 핵 위치 신호, 소분자 결합도메인 (예: 스테로이드 결합 도메인), 에피토프 태그 (epitope tag) 또는 정제 표지, 촉매도메인 (예를 들어, 핵산 변환 도메인 (nucleic acid modifying domain), 핵산 절단 도메인 (nucleic acid cleavage domain), 및/또는 DNA 수선 촉매도메인 (DNA repair catalytic domain)), 전사 작용 도메인 (예를 들어, 활성화 도메인, 억제 도메인 등). 하나의 실시예에 있어서, 폴리펩타이드는 제2 징크 핑거 도메인, 예를 들어 본 명세서에 기재된 서열을 갖는 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 징크 핑거들의 배열을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 하나 이상의 도메인들(예: 각 도메인)은 본 명세서에 기재된 모티프, 예를 들어, mCSNR, mDSAR, mDSCR, mISNR, mQFNR, mQSHV, mQSNI, mQSNK, mQSNR, mQSNV, mQSSR, mQTHQ, mQTHR, mRDER, mRDHT, mRDKR, mRSHR, mRSNR, mVSNV, mVSSR, mVSTR, mWSNR, mDGNV, mDSNR, 및 mRDNQ에 따른 서열을 가질 수 있다. 나아가, 각 도메인은 본 명세서에 제공된 서열을 가질 수 있다. 아래에 기재된 바와 같이, 소문자 "m"은 상기 나열된 네 개의 아미노산들이 DNA 접촉 잔기의 모티프를 표시한다는 것을 의미한다.

본 발명의 핵산들은 전술한 폴리펩타이드들을 코딩하는 핵산들을 포함한다. 본 발명의 핵산은 이종 핵산서열, 예를 들어 유도성 프로모터 (스테로이드 호르몬 유도성 프로모터, 소분자 조절 프로모터, 테트라사이클린 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템과 같은 공학처리된 유도 시스템)에 의하여 작동가능하게 조절될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 프로모터는 포유동물 세포에서 유도될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드는 세포 내에서 생산될 수 있으며, 세포 내에서 각 징크 핑거 도메인이 인식하는 하위부위를 포함하는 표적 부위에 결합하여 유전자, 예를 들어, 내생 유전자를 조절할 수 있다. 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다.

본 발명은 이종 핵산결합 도메인과 융합된, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 발현하는 방법을 추가로 포함한다. 상기 방법은 세포에 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다.

다른 태양에 있어서, 본 발명은 캡슐화된 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 생체적합성 물질로 이루어진 캡슐화 층과 재조합 포유동물 세포를 포함한다. 상기 세포는 세포 내에서 다른 핵산, 예를 들어, 이종핵산 또는 내생핵산의 생산을 조절하는 이종 징크 핑거 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 세포는 분비성 폴리펩타이드를 코드하거나, 분비성 인자, 예를 들어 분비성 폴리펩타이드의 생산을 조절하거나 생산에 관여하는 유전자를 조절할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 분비성 폴리펩타이드는 인슐린, 인슐린-유사 성장인자, VEGF-A, HGF, 인터페론, 인터루킨, 또는 섬유아세포 성장인자이다.

캡슐화층은 전형적으로 적어도 분자량 10 kDa을 갖는 단백질, 예를 들어, 분자량이 약 10, 20, 30, 40, 50, 또는 70 kDa인 단백질을 투과시킨다. 상기 캡슐화 층은 상기 분자량보다 큰, 예를 들어 100 kDa 이상의 단백질에 대하여 비투과성일 수 있다. 추가적 캡슐화 층이 존재할 수 있다. 키메라 징크 핑거 단백질은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다.

"징크 핑거 단백질"이란 용어는 징크 핑거 도메인을 포함하는 모든 단백질을 지칭한다. 단백질은 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 예시적 징크 핑거 단백질은 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 전형적으로 상기 단백질은 단일사슬이다. 그러나, 몇몇 예에서, 단백질은 복수의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 이종이량체 (heterodimeric) 또는 동종이량체 (homodimeric) 단백질일 수 있다.

용어 "염기 접촉 위치", "DNA 접촉 위치", 또는 "핵산 접촉 위치"는, ZIF268의 알기닌 73, 아스파르트산 75, 글루탐산 76, 및 알기닌 79의 위치에 구조적으로 대응되는 징크 핑거 도메인의 네 개의 아미노산 위치를 지칭한다.

Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser

1 5 10 15

Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys

20 25 30

Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His

35 40 45

Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys

50 55 60

Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His

65 70 75 80

Thr Lys Ile His Leu Arg Gln Lys Asp (서열번호:129)

85

이 위치들은 또한 -1, 2, 3, 및 6번 위치로 지칭되기도 한다. 문의 서열 내에서 염기 접촉 위치에 상응하는 위치를 동정하기 위해서는, 문의 서열의 시스테인 및 히스티딘 잔기가 Zif268의 핑거 3의 시스테인 및 히스티딘 잔기와 정렬되도록 문의 서열을 관심 징크 핑거 도메인과 정렬시킨다. 유럽 생물정보 연구소(European Bioinformatics Institute)의 ClustalW WWW 서비스(http://www2.ebi.ac.uk/clustalw; Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)은 간편한 서열 정렬 방법을 제공한다.

보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환 가능성을 말한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 지닌 아미노산 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌; 아마이드-함유 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 알기닌 및 히스티딘; 산성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파르트산 및 글루탐산; 그리고 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 상황에 따라 동일 그룹 내의 아미노산들은 상호 교환될 수 있다. 몇몇 추가적인 보존적 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-류신-이소류신; 페닐알라닌-타이로신; 라이신-알기닌; 알라닌-발린; 아스파르트산-글루탐산; 및 아스파라긴-글루타민.

용어 "이종 (heterologous) 폴리펩타이드"는 비-자연형 서열을 갖는 폴리펩타이드(예, 하이브리드 폴리펩타이드), 또는 자연형 폴리펩타이드와 동일하나 자연적으로는 존재하지 않는 방식으로 존재하는 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 자연적에서는 서로 융합되어 있지 않은 두 개의 자연형 폴리펩타이드의 융합은 하나의 폴리펩타이드가 상대에 대하여 이종인 폴리펩타이드를 만들게 된다.

용어 "혼성"은 (i) 두 개 이상의 상이한 자연형 서열; (ii) 하나 이상의 인공 서열(즉, 비-자연형 서열) 및 하나 이상의 자연형 서열; 또는 (iii) 두 개 이상의 인공 서열(동일 또는 상이함) 중 어느 하나에서 유래하는 아미노산 서열을 함유하는 비-자연형 폴리펩타이드를 지칭한다. 인공 서열의 예로는 천연형 서열의 돌연변이 및 새로이 설계된 서열이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "엄격한 조건 하의 혼성화"는, 45℃에서 6X 염화 나트륨/구연산 나트륨(SSC) 중에서 혼성화시키고, 이어서 65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS로 2회 세척하는 조건을 말한다. 본 발명은 엄격한 조건 하에서 핵산들을 본 명세서에 기재된 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 혼성화하는 것을 역시 제공한다.

용어 "결합 선호도(binding preference)"는 폴리펩타이드가 다른 결합 부위에 비해 하나의 핵산 결합 부위를 선택하는 식별력을 지칭한다. 예를 들어, 두 개의 상이한 핵산 결합 부위에 비해 폴리펩타이드가 양적으로 제한적일 때, 본 명세서에 기재된 생체 내 또는 생체 외 분석법에서 다른 부위에 비해 선호되는 부위에 더 많은 양의 폴리펩타이드가 결합할 것이다.

본 명세서에 사용된, "해리 상수(dissociation constant)"는 관심있는 표적 부위에 결합하는 단백질(예: 징크 핑거 단백질)의 평형(equilibrium) 해리 상수를 말한다. 9 내지 18 염기쌍의 표적 부위를 인식하는 징크 핑거 단백질의 경우에 있어서, 결합은 28 염기쌍의 이중가닥 DNA와 관련하여 평가되었다. 해리 상수는 20 mM Tris pH 7.7, 120 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 10% 글리세롤, 0.1% 노니뎃(Nonidet) P-40, 5 mM DTT, 및 0.10 mg/mL BSA(bovine serum albumin), 실온의 조건에서 결합하는 정제된 단백질을 사용한 겔 이동 분석(gel shift analysis)에 의해 결정된다. 더 자세한 것은 실시예 1 및 레바와 파보의 논문(Rebar and Pabo(1994) Science 263:671-673)에서 제공된다. 해리상수는 10^-6, 10^-7, 10^-8 또는 10^-9 M 이하일 수 있다.

하나의 폴리펩타이드("경쟁 폴리펩타이드")는 다른 ("관심 폴리펩타이드")와 결합 부위에 결합하기 위하여 "경쟁"을 한다. 표적 부위를 갖는 탐침분자를 사용한 시험관내 실험에서 경쟁 폴리펩타이드가 관심 폴리펩타이드의 농도의 10배 이내라면, 관심 폴리펩타이드에 의하여 결합된 탐침 분자의 수는 25% 이상 감소되었다. 상기 실험들은 탐침 분자에 대한 관심 폴리펩타이드의 Kd값의 약 50 배에서 실행되었다.

Zif268의 핑거 1 및 2와 어떤 주어진 징크 핑거 도메인을 포함하는 키메라 단백질이 Zif268의 핑거 1 및 2가 인식하는 5'-GGGCG-3'의 5-염기쌍 서열과 주어진 3-염기쌍 DNA 부위를 모두 포함하는 표적 부위에 5 nM 이하의 친화도를 가지면, 주어진 징크 핑거 도메인은 주어진 3-염기쌍 DNA 부위에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. 용어 "인식한다"와 "특이적으로 결합한다"는 상호 교환적으로 사용되며, 상기 zif268 융합 분석에서 징크 핑거 도메인에 의한 결합 부위(binding site)의 구별을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "축중 올리고뉴클레오티드"란 (a) 각각 특정 아미노산 서열을 코딩하는 상이한 올리고뉴클레오티드들의 집단, 및 (b) 하나 이상의 서열에 결합할 수 있는 단일 종의 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 이노신과 같은 비-자연형 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드, 둘 다를 의미한다.

"분리된 조성물"이란 세포시료 또는 반응혼합물의 하나 이상의 성분의 90% 이상으로부터 분리된 조성물을 의미한다. 인공적으로 또는 자연적으로 생산된 조성물은 관심 종(species)의 종 또는 집단이 중량 기준으로 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 또는 99 % 이상 순수하면 특정 순도 "이상의 조성물"일 수 있다. 본 명세서에 기재된 어떤 단백질 또는 핵산 조성물도 분리된 형태로 제공될 수 있다.

징크 핑거 도메인을 이용하는 것은 특히 유리하다. 첫째, 징크 핑거 모티프는 매우 다양한 DNA 서열을 인식할 수 있지만, 임의의 특정 징크 핑거는 특정 서열에 고도의 특이성을 가질 수 있다. 둘째, 자연형 징크 핑거 단백질의 구조는 모듈성이다. 예를 들면, "Egr-1"으로도 불리는 Zif268 징크 핑거 단백질은 세 개의 징크 핑거 도메인이 나란히 배열되어 이루어진다. 파블레티치와 파보는 징크 핑거 단백질 Zif268의 일부에 대한 엑스레이 결정구조를 발표하였다(Pavletich and Pabo (1991) Science 252: 809-817). 이 구조에서 세 개의 Zif268 핑거들은 DNA와 결합하고 있다. 각 핑거는 독립적으로 DNA 인식 부위의 3-4 염기쌍과 접촉한다. 동일한 폴리펩타이드 사슬 내에서 여러 개의 징크 핑거 모듈이 협동 효과를 발휘함으로써 고 친화도 결합이 달성된다.

본 발명은 인간 게놈을 비롯한 다른 모든 게놈에 존재하는 모든 징크 핑거 도메인에 대해 규정하고 있다. 징크 핑거들은 영겁에 걸쳐 진화해 왔기 때문에 게놈 상에 존재하는 징크 핑거를 확보하는 것이 매우 유리하다. 더욱이 숙주 종에서 유래하는 도메인을 사용하게 되면, 본 명세서에서 기술하고 있는 유전자 치료용 징크 핑거 단백질을 제조하였을 때 호스트에 의한 면역작용의 가능성을 낮출 수 있게 된다. 물론 인간 또는 포유동물 징크 핑거 도메인의 변종이나 완전히 인공적인 징크 핑거 도메인과 같은 비-자연형 징크 핑거 도메인을 사용할 수도 있다.

특정 서열을 인지하는 DNA 결합 도메인을 선택할 수 있게 되면 세포내의 내생 유전자와 같은 표적 유전자를 특이적으로 조절하는 신규 단백질을 고안할 수 있다. 많은 예에서, 이러한 단백질들은 치료용으로 또는 산업용으로 활용될 수 있다. 또한 다른 응용도 가능하다.

본 발명은 또한 특정 예를 이용하여 징크 핑거 단백질이 암에 대한 치료제로 사용될 수 있음을 입증하는 다수의 실시예를 포함한다. 실시예는 징크 핑거 단백질이 VEGF-A 발현의 강력한 억제인자로 작용할 수 있음을 보여준다. VEGF-A는 종양조직의 혈관생성에 주요한 역할을 하기 때문에, VEGF-A를 조절(예: 억제)하는 징크 핑거 단백질들은, 예를 들어 종양 주위나 종양 내부의 혈관생성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허출원, 및 참고문헌은 그 전체가 인용된다. 다음의 특허 출원 즉, WO 01/60970(Kim 등); 미국출원공개 제2002-0061512호, 제2003-165997호, 및 제2003-194727호와 미국 출원 제 10/669,861호, 제60/431,892호, 및 제60/477,459호는 모든 목적에서 전체로서 명백히 인용된다. 하나 이상의 본 발명의 실시예의 구체적인 내용은 첨부 도면 및 하기 기재에 나타나 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 잇점은 이 기재 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1a, 1b, 및 1c는 인간 VEGF-A 유전자의 예시적 영역의 핵산 서열 (서열번호: 120)을 나타낸다. 상기 영역은 프로모터를 포함한다. 상기 서열은 GENBANK® 등재번호 AF095785.1로부터 얻어졌다. 전사개시 부위는 뉴클레오타이드 2363번 부근에 있다. 번역개시 코돈은 뉴클레오타이드 3401번 부근에 있다.

도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 및 2f는 인간 형질전환 단백질(human transforming protein; FGF4) 유전자의 예시적 영역의 핵산 서열 (서열번호: 121)을 나타낸다. 상기 영역은 프로모터를 포함한다. 상기 서열은 GENBANK® 등재번호 J02986.1 과 AP006345.2 (인간 유전체 DNA, 염색체 11번 클론:RP11-186D19, 완성된 서열)로부터 얻어졌다. 전사개시 부위는 3731번 뉴클레오타이드 부근에 있다. 번역개시 코돈은 3959번 뉴클레오타이드 부근에 있다.

도 3a, 3b, 3c, 3d 및 3e는 인간 간세포 성장인자 (hepatocyte growth factor; HGF) 유전자의 예시적 영역의 핵산 서열 (서열번호: 122)을 나타낸다. 상기 영역은 프로모터를 포함한다. 상기 서열은 GENBANK® 등재번호 AC004960.1 (인간 PAC 클론 RP5-1098B1, 7q11.23-q 유래)로부터 얻어졌다. 전사개시 위치는 4389번 뉴클레오타이드 부근에 있다. 번역개시 코돈은 4454번 뉴클레오타이드 부근에 있다.

도 4는 VEGF-A 프로모터의 모식도이다.

도 5a는 KRAB 도메인을 갖는 징크 핑거 단백질의 발현을 위한 예시적 핵산 구조체의 모식도이다.

도 5b는 VEGF-A 프로모터를 포함하는 예시적 루시퍼라제 리포터의 모식도이다.

하나 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 키메라 징크 핑거 단백질들은 세포 내에서 유전자의 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 징크 핑거 단백질은 두 개 이상의 자연형 징크 핑거 도메인들을 포함할 수 있다. 일단의 예에서, 키메라 징크 핑거 단백질들은 포유동물 세포에서 VEGF-A 유전자를 조절하기 위하여 사용된다.

키메라 징크 핑거 단백질들은 다양한 방법에 의하여 얻어질 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 이 단백질들은 표적 DNA 부위를 인식하도록 고안된다. 유용한 표적 부위는 표적 유전자의 조절 영역, 또는 표적 유전자의 조절 영역의 1 kb 또는 500 bp 이내의 부위들을 포함한다. 예를 들어, 표적 부위는 TATA 박스 또는 유전자의 전사개시 부위로부터 1 kb 또는 500 bp 이내에 존재할 수 있다. 징크 핑거 단백질을 고안하는 하나의 방법은 표적 부위를 각 징크 핑거 도메인에 의하여 인식될 수 있는 3 또는 4 염기쌍 서열로 나누는 것이다. 그런 후 나누어진 요소들에 해당되는 연속적인 징크 핑거 도메인을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 구조체를 제조한다. 후보 단백질들을 코딩하는 상이한 다수의 핵산 구조체들이 만들어지고, 숙주 세포에서 발현된다. 표적 유전자의 발현은 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 하나 이상의 후보 단백질들을 식별하기 위하여 평가된다.

다른 예에 있어서, 키메라 징크 핑거 단백질은 징크 핑거 도메인의 라이브러리로부터 세포 내에서의 표현형질에 대한 효과에 근거하여 선택된다. 예를 들어, 무작위 키메라 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 핵산의 라이브러리를 배양된 포유동물 세포에 도입시킨다. 라이브러리의 핵산들을 세포 내에서 발현시킨다. 세포들을 관심있는 표현형질에 대하여 평가하고, 대조군과 비교하여 표현형질이 변화된 세포들을 분리한다. 이러한 세포들 내의 라이브러리 핵산을 회수하고, 이렇게 회수된 핵산에 의하여 코드되는 징크 핑거 단백질들을 추가적으로 특성을 확인하거나, 사용하거나, 또는 변형한다.

징크 핑거 도메인들

징크 핑거는 대략 30 개의 아미노산 잔기로 된 작은 폴리펩타이드 도메인으로서, 그 중 시스테인 또는 히스티딘인 4 개의 아미노산 잔기가 적절히 배치되어 아연 이온과 배위 결합을 할 수 있다 (검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12: 464-469 (1987); Evans and Hollenberg, (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett. 234: 245-250; Miller et al., (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:99-102; 및 Rosenfeld and Margalit, (1993) J. Biomol. Struct. Dyn. 11: 557-570] 참조). 따라서, 징크 핑거 도메인은 아연 이온과 배위결합을 하는 잔기의 종류에 따라, 예를 들어 Cys₂-His₂ 류, Cys₂-Cys₂ 류, Cys₂-CysHis 류 등으로 분류할 수 있다. Cys₂-His₂ 징크 핑거에서 아연과 배위결합하는 잔기는 전형적으로 다음과 같이 배치되어 있다:

C-X_2-5-C-X₃-X_a-X₅-ψ-X₂-H-X_3-5-H (서열번호: 123)

여기에서 ψ(프사이)는 소수성 잔기이고(Wolfe et al., (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 3:183-212), "X"는 임의의 아미노산을 나타내고, 아래 첨자는 아미노산의 개수를 가리키고, 하이픈으로 연결된 두 개의 아래 첨자는 개입하는 아미노산의 전형적인 범위를 가리킨다. 많은 징크 핑거 도메인에서, 처음의 시스테인 (cystein) 앞에는 페닐알라닌 또는 타이로신이 오고, 그 다음에 시스테인이 아닌 아미노산이 온다. 비록 역평행(anti-parallel) β-시트는 짧고 비이상적이고 존재하지 않을 수 있지만, 전형적으로, 사이의 아미노산은 폴딩되어 α-헬릭스에 대하여 충전되는 역평행 β-시트를 형성한다. 폴딩으로 인해, 아연과 배위 결합하는 측쇄가 아연 이온과 배위결합하기에 적합한 사면체 구조를 갖도록 배치된다. 염기 접촉 잔기는 한 쌍의 금속-킬레이팅 잔기들 사이의 루프(loop) 영역 내에 있다.

편의를 위해, 징크 핑거 도메인의 주요 DNA 접촉 잔기는 다음 예에 의거하여, -1, 2, 3 및 6으로 번호를 매겼다.

-1 1 2 3 4 5 6

C-X_2-5-C-X₃-X_a-X-R-X-D-E-X_b-X-R-H-X_3-5-H (서열번호: 124),

상기 예에 명기한대로, DNA 접촉 잔기는 알기닌(R), 아스파르트산(D), 글루타민(E) 및 알기닌(R)이다. 상기 모티프는 RDER로 줄여서 표기할 수 있다. 본 명세서에 사용된 그러한 생략 표기는 첫번째 시스테인의 두 개 앞의 잔기(서열번호: 124의 시작 잔기)로부터 마지막의 금속-킬레이팅 히스티딘(서열번호: 124의 마지막 잔기)까지의 특정 폴리펩타이드 서열의 압축형이다. 상기 또는 다른 모티프에서, X_a는 흔히 방향족이고, X_b는 흔히 소수성이다. 두 개의 상이한 서열이 같은 모티프를 가질 때에는 각 서열을 구별하기 위해 숫자를 사용할 수 있다(예: RDER1 또는 RDER2).

문맥에서 분명하게 알 수 있는 경우에, 네 글자 압축형은 일반적인 모티프를 지칭한다. 다시 말해, 모티프는 -1, 2, 3 및 6 번 위치의 아미노산을 특정화하는 반면, 다른 위치는 임의의 아미노산일 수 있으며, 전형적으로, 비-시스테인 아미노산이나 반드시 그럴 필요는 없다. 모티프 앞의 소문자 "m"은 상기 약어가 모티프 (motif)를 지칭한다는 것을 명백히 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, mRDER은 -1 위치에 R, 2 위치에 D, 3 위치에 E, 6 위치에 R이 나타나는 모티프를 지칭한다.

징크 핑거 DNA-결합 단백질은 통상적으로 직렬로 배치된 세 개 이상의 징크 핑거 도메인으로 구성될 수 있다.

징크 핑거 도메인("ZFD")은 가장 흔한 진핵생물 DNA-결합 모티프 중 하나로서, 효모로부터 고등 식물 및 인간에 이르는 다양한 종에서 발견된다. 인간 게놈에만도 수 천가지 이상, 아마도 4,500가지 이상의 징크 핑거 도메인이 존재할 것으로 추측된다. 징크 핑거 도메인은 징크 핑거 단백질에서 동정되거나 그로부터 분리될 수 있다. 징크 핑거 단백질의 비제한적인 예로는 CF2-II; 크룹펠(Kruppel); WT1; 바소누클린(basonuclin); BCL-6/LAZ-3, 적혈구 크룹펠-유사 전사 인자; 전사 인자 Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4; 전사 억제제 YY1; EGR1/Krox24; EGR2/Krox20; EGR3/Pilot; EGR4/AT133; Evi-1; GLI1; GLI2; GLI3; HIV-EP1/ZNF40; HIV-EP2; KR1; ZfX; ZfY; 및 ZNF7 등이 있다.

하나의 인공 전사인자는 이용가능한 징크 핑거 도메인의 키메라를 포함할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 하나 이상의 징크 핑거 도메인은 자연형이다. 많은 인간 징크 핑거 도메인의 예가 미국출원공개 제2002-0061512호, 제2003-165997호, 및 미국 출원 제60/431,892호에 명시되어 있다. 또한 아래의 표 6을 참조하라. 각 도메인의 결합 특이성들은 특정 특이성을 갖는 전사인자를 고안하는데 사용될 수 있다.

징크 핑거 도메인의 추가적 예에는 다음의 모티프들이 포함된다: mCSNR, mDSAR, mDSCR, mISNR, mQFNR, mQSHV, mQSNI, mQSNK, mQSNR, mQSNV, mQSSR, mQTHQ, mQTHR, mRDER, mRDHT, mRDKR, mRSHR, mRSNR, mVSNV, mVSSR, mVSTR, mWSNR, mDGNV, mDSNR, 및 mRDNQ.

다른 타입의 DNA 결합도메인, 즉 징크 핑거가 아닌 하나 이상의 도메인들을 사용할 수도 있다. 본 발명은 상이한 결합 특이성을 가지는 핵산결합 도메인들의 모음을 사용한다. 다양한 단백질 구조들이 높은 친화력과 높은 특이성으로 핵산과 반응하는 것으로 알려져 있다. 이중가닥 DNA를 인식하는 구조 모티프들의 개관을 이해하기 위하여, 예를 들어, 문헌{Pabo 및 Sauer (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:1053-95; Patikoglou 및 Burley (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:289-325; Nelson (1995) Curr Opin Genet Dev. 5:180-9] 참조. 징크 핑거 도메인 이외의 핵산결합 도메인의 몇 개의 비한정적 예는 호메오도메인 (homeodomains), 헬릭스-턴-헬릭스 도메인 (helix-turn-helix domains), 윙드 헬릭스 도메인 (winged helix domains), 그리고 헬릭스-루프-헬릭스 도메인 (helix-loop-helix domains) 이 포함된다.

전사 인자의 특징

DNA 결합 도메인에 부가적으로, 전사 인자는 조절 도메인, 핵 위치신호, 또는 본 명세서에 설명된 다른 특징을 추가로 포함할 수 있다.

활성화 도메인. 본 발명에서 사용될 수 있는 전사 활성화 도메인은 효모의 Gal4 활성화 도메인 및 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 도메인을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 전사를 활성화하는 도메인의 효능은 상기 도메인을 알려진 DNA 결합도메인과 융합시키고, 상기 알려진 DNA 결합도메인이 인식하는 부위에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자가 상기 융합 단백질에 의하여 활성화되는지를 측정하여 확인할 수 있다.

하나의 예시적 활성화 도메인은 다음의 p65 도메인이다:

YLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQ (서열번호: 73)

예시적 Gal4 활성화 도메인의 서열은 다음과 같다:

NFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKEISMAYPYDVPDYAS (서열번호: 74)

박테리아에서, 활성화 도메인의 기능은, 야생형 RNA 중합효소 알파 서브유닛 C-말단 도메인 또는 돌연변이 알파 서브유닛 C-말단 도메인, 예를 들면 단백질 상호작용 도메인에 융합된 C-말단 도메인을 소집하는 도메인을 융합시킴으로써 모방될 수 있다.

억제 도메인. 원한다면, 활성화 도메인 대신에 억제 도메인이 DNA 결합 도메인에 융합될 수 있다. 진핵세포 억제 도메인의 예로는 Kid, UME6, 오렌지(ORANGE), 그로우초(groucho), 및 WRPW[Dawson et al (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31] 유래의 억제 도메인이 포함된다. 전사를 억제하는 도메인의 효능은 상기 도메인을 알려진 DNA 결합도메인과 융합시키고, 상기 알려진 DNA 결합도메인이 인식하는 부위에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자가 상기 융합 단백질에 의하여 억제되는지를 측정하여 확인할 수 있다.

첫 번째 예시적 억제 도메인은 Kid 단백질 (Witzgall R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91(10): 4514-8)에서 유래한 "KRAB" 도메인이다:

VSVTFEDVAVLFTRDEWKKLDLSQRSLYREVMLENYSNLASMAGFLFTKPKVISLLQQGEDPW (서열번호: 75)

두 번째 예시적 억제 도메인은 KOX 억제 도메인이다. 이 도메인은 인간 Kox1 단백질 (징크 핑거 단백질 10; NCBI 단백질 데이터베이스 AAH24182; GI:18848329) 유래의 "KRAB" 도메인, 즉 Kox1의 2-97번 아미노산을 포함한다:

DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSV (서열번호: 72)

세 번째 예시적 억제 도메인은 UME6 단백질에서 유래한 다음의 도메인이다:

NSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 119)

WRPW 도메인은 억제 도메인의 또 다른 예이다.

또 다른 키메라 전사인자들은 활성화 도메인이나 억제 도메인을 갖지 않는다. 그 대신 이러한 전사인자들은 결합된 내생 전사인자 (예를 들어 활성화 인자 또는 억제 인자)를 대체하거나 그것과 경쟁하여 전사를 변화시킨다.

다른 기능성 도메인들. 다른 기능성 도메인들의 예에는 히스톤 변형효소 (예를 들어, 히스톤 아세틸화효소, 하스톤 탈아세틸화효소), DNA 변형효소 (예를 들어, 메틸화효소) 등이 포함된다.

단백질 전달 도메인은 징크 핑거 단백질과 융합될 수 있다. 단백질 전달 도메인은 전달 도메인과 그에 부착된 폴리펩타이드를 세포 내로 들어가게 한다. "단백질 전달 도메인"또는 "PTD"는 생물학적 막, 특히 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열이다. 이종 폴리펩타이드에 부착되면, PTD는 생물학적 막을 통한 이종 폴리펩타이드의 전위를 촉진한다. PTD는 전형적으로 이종 DNA 결합 도메인에 (예를 들어, 펩타이드 결합에 의하여) 공유결합 되어 있다. 예를 들어 PTD와 이종 DNA 결합 도메인은 단일 핵산에 의하여 코드될 수 있다. 예를 들어, 공통적인 전사 해독 프레임 (open reading frame) 또는 공통 유전자의 하나 이상의 엑손에 의하여 코드될 수 있다. 예시적인 PTD는 10-30 개의 아미노산을 포함하며 양친매성 나선을 형성할 수 있다. 많은 PTD들은 염기성 특성을 가지며, 최소 4, 5, 6, 또는 8개의 염기성 잔기 (알기닌 또는 라이신)를 갖는다. PTD는 세포벽이 없는 세포 혹은 진핵세포, 척추동물 세포, 인간, 유인원, 쥐, 소, 말, 고양이, 양과 같은 포유동물 세포 안으로 폴리펩타이드의 전위 (translocation)를 촉진할 수 있다.

전형적으로 PTD는 징크 핑거 단백질의 DNA 결합도메인과 PTD를 하나의 폴리펩타이드 사슬로 만드는 것으로 징크 핑거 단백질과 연결되나, PTD를 결합시키는 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, PTD는 바이오틴-아비딘, 코일드 코일 (coiled-coil) 같은 비공유결합 반응에 의하여 결합될 수 있다. 더욱 구체적 예에서, PTD는 유연성 링커 (flexible linker)를 사용하여 징크 핑거 단백질과 연결될 수 있다. 유연성 링커는 자유 회전을 부여하기 위하여 하나 또는 그 이상의 글라이신 (glycine) 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어 PTD는 전사인자의 DNA 결합 도메인으로부터 10, 20, 또는 50 아미노산 이상 간격을 둘 수 있다. PTD는 DNA 결합 도메인을 기준으로 N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다.

징크 핑거 단백질은 복수의 PTD (예를 들어 상이한 복수의 PTD 또는 2 카피 이상의 동일한 PTD) 를 포함할 수 있다.

예시적인 PTD는 안테나페디아(antennapedia) 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP22 단백질과 HIV TAT 단백질에서 유래한 절편들을 포함할 수 있다.

Tat. 인간 면역결핍 바이러스 타입 I (HIV-I)에서 유래한 Tat 단백질은 외부에서 가해질 때 세포안으로 들어가는 놀라운 능력을 가지고 있다 (Frankel A.D. and Pabo C.O. (1988) Cell 55:11891193, Mann D.A and Frankel A.D. (1991) EMBO J. 10:17331739, Fawell et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:664668). Tat PTD의 최소요소는 인간 면역결핍 바이러스 Tat 단백질의 47-57번 잔기를 포함한다. 이 펩타이드 서열은 본 명세서에서 "TAT"으로 언급한다.

안테나페디아 (Antennapedia). 안테나페디아 호메오도메인도 PTD 펩타이드를 포함한다 (Derossi et al. (1994) J. Bio. Chem. 269:10444-10450). 이 펩타이드는 "페네트라틴 (penetratin)"으로도 불린다.

VP22. HSV VP22 단백질도 PTD를 포함한다. 이 PTD는 VP22 C-말단 34 아미노산 잔기에 위치한다. 엘리옷 및 오헤어(Elliott and O'Hare, 1997, Cell88:223-234) 및 미국 특허 제6,184,038호를 참조할 수 있다.

다른 예시적 PTD는 폴리-알기닌 (poly-arginine) 서열, 예를 들어 4, 5, 6, 또는 8 개 이상의 알기닌 잔기, 예를 들어 5 내지 10 알기닌 잔기를 포함하는 서열이다.

세포-특이적 PTD. 몇몇 PTD들은 특정 타입의 세포 혹은 상태에 특이성을 갖는다. 세포-특이적 PTD의 하나의 예시로 미국 출원 공개 제2002-01022호에 명시된 Hn1 합성 펩타이드가 있다. Hn1은 인간 두경부 편평세포암(head and neck squamous carcinoma) 세포에 의하여 내부로 받아들여지고, 인공전사인자가 두경부 종양 같은 종양 혹은 밀접히 연관된 서열을 표적으로 하는데 사용될 수 있다. 미국 출원 공개 제2002-0102265호는 파아지 디스플레이를 사용하여 세포-특이적 PTD를 확인하는 일반적 방법을 상술하고 있다. PTD에 대한 추가적 정보를 위하여 미국 출원 공개 제2003-0082561호, 제2002-0102265호 및 제2003-0040038호, Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572 Derossi et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:18188; Hancock et al. (1991) EMBO J. 10:4033-4039; Buss et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8:3960-3963; Derossi et al. (1998) Trends in Cell Biology 8:84-87; Lindgren et al. (2000) Trends in Pharmacological Sciences 21:99-103; Kilic et al. (2003) Stroke 34:1304-10; Asoh et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(26):17107-12; Tanaka et al. (2003) J Immunol. 170(3):1291-8를 또한 참조할 수 있다.

새로운 DNA 결합 단백질의 디자인

하나의 실시예에 있어서, 징크 핑거 단백질은 각 도메인이 표적 부위의 절편을 인식하도록, 특성화된 징크 핑거 도메인들의 혼합-적합 (mixing and matching) 방법에 의하여 추론적으로 디자인되었다. 징크 핑거 도메인들은 미국 출원 공개 제2002-0061512호 및 제2003-165997호에 명시된 방법들을 이용하여 단리되고 특성화되었다. 징크 핑거 도메인의 조립구조들은 새로운 DNA 결합 단백질을 제조하기 위한 이들의 재배열을 용이하게 한다. 자연형 Zif268 단백질내의 징크 핑거 도메인들은 DNA 이중나선을 따라 직렬로 위치되어 있다. 각 도메인은 독립적으로 3-4 염기쌍의 DNA 부분을 인식한다.

징크 핑거 도메인의 데이터베이스. 상기에서 기술된 원-하이브리드 선별 시스템은 가능한 3 또는 4-염기쌍 결합 부위 각각에 대하여 또는 대표적인 수의 상기 결합 부위에 대하여 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 동정하는 데 사용될 수 있다. 이 과정의 결과는 징크 핑거 도메인과 그의 선호되는 3 또는 4-염기쌍 결합부위(들) 사이의 일련의 연관성으로서 축적될 수 있다. 그러한 연관성의 예는 미국 출원 공개 제2002-0061512호 및 제2003-165997호에 나타나 있다.

그 결과는 예를 들어 상관적인 데이터베이스, 스프레드시트, 또는 텍스트 파일 등의 데이터베이스로 기계에 저장될 수 있다. 그러한 데이터베이스의 각 기록은 징크 핑거 도메인의 표시를 그 도메인의 하나 이상의 선호되는 결합부위의 서열을 표시하는 스트링과 연관시킨다. 데이터베이스의 기록은 각 부위에 결합하는 징크 핑거 도메인의 상대적인 친화성의 표시를 포함할 수 있다. 어떤 실시태양에서, 데이터베이스의 기록은 특정 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산의 실제 위치를 가리키는 정보를 포함할 수 있다. 그러한 실제 위치는, 예를 들어 냉동고에 저장된 마이크로플레이트의 특정 웰(well)일 수 있다.

데이터베이스는 SQL 작동 환경(PERL 또는 MICROSOFT EXCEL® macro와 같은) 스크립팅 언어, 또는 프로그래밍 언어를 이용하여 질문하거나 필터할 수 있도록 배열될 수 있다. 그러한 데이터베이스는 사용자가 특정 3 또는 4-염기쌍 결합 부위를 인식하는 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 동정할 수 있게 한다. 데이터베이스, 및 데이터베이스 서버에 저장될 수 있는 것과 같은 다른 정보는 어떤 장치에 의해 번역될 수 있는 명령 또는 다른 시그날을 이용하여 각 장치와 의사소통이 되도록 역시 배열 될 수 있다. 이 시스템의 컴퓨터에 기초한 태양은 디지털 전자회로로 또는, 컴퓨터 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어로, 또는 이들의 조합으로 이행될 수 있다. 본 발명의 데이터베이스 서버 등의 기구는 프로그램 가능한 프로세서에 의해 실행하기 위해 기계로 판독 가능한 저장장치에 명백하게 구체화된 컴퓨터 프로그램 산물에 의해 실행될 수 있으며; 방법 동작들은 입력 데이타에 작동하여 출력을 생성함으로써 본 발명의 기능을 수행하기 위한 지시들의 프로그램을 실행하는 프로그램 가능한 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 실행환경의 비제한적 예의 하나는 윈도우 XP® 또는 윈도우 NT4.0®(Microsoft, Redmond WA), LINUX^TM, 또는 다른 오퍼레이팅 시스템에 의해 작동되는 컴퓨터를 포함한다.

또한 상기 징크 핑거 도메인들의 특이성을 입증하기 위하여 이들을 다수의 상이한 융합 단백질 내에 융합된 상황에서 시험할 수 있다. 더욱이, 소량의 도메인이 이용 가능한 특정 결합 부위는 추가적인 선별 스크리닝의 표적이 될 수 있다. 그러한 선별을 위한 라이브러리는, 유사하지만 뚜렷이 구별되는 부위에 결합하는 징크 핑거 도메인을 돌연변이 시킴으로써 제조할 수 있다. 이용 가능한 도메인을 최대한 활용하기 위해 표적 결합 부위에 대해서 도메인을 엇갈리게 할 수 있으므로, 각각의 가능한 결합 부위에 대한 징크 핑거 도메인의 완전한 매트릭스가 필수적인 것은 아니다. 이러한 엇갈림은 가장 유용한 3 또는 4 염기쌍 결합 부위들에서 결합 부위를 분해하고, 또한 징크 핑거 도메인들 사이의 링커의 길이를 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 디자인된 폴리펩타이드가 선택성 및 높은 친화도를 모두 갖게 하기 위하여는, 원하는 부위에 대해 높은 특이성을 가진 징크 핑거 도메인의 양 옆에 더 높은 친화도를 가지면서 특이성이 떨어지는 다른 도메인을 연결시킬 수 있다. 미국 출원 공개 제2002-0061512호 및 제2003-165997호에서 기술된 생체 내 스크리닝 방법은 인위적으로 조립된 징크 핑거 단백질 및 이들의 유도체의 생체 내 기능, 친화도, 및 특이성을 시험하는 데 이용될 수 있다. 유사하게, 본 방법은 예를 들어 다양화된 링커 조성, 징크 핑거 도메인 모듈, 징크 핑거 도메인 조성 등의 라이브러리를 제조함으로써 그러한 조립된 단백질을 최적화하는 데 사용될 수 있다.

표적 부위의 분해. 표적 9-bp 또는 보다 긴 DNA 서열은 3- 또는 4-bp 단편으로 분해된다. 각각의 분해된 3- 또는 4-bp 단편을 인식하는 징크 핑거 도메인을 (예를 들어 상기에서 언급한 데이터베이스로부터) 동정한다. 더 긴 표적 서열, 예를 들어 20 bp 내지 500 bp 서열은 그 안에서 9 bp, 12 bp, 및 15 bp 하위서열을 동정할 수 있으므로, 표적 서열로서 역시 적합하다. 특히, 데이터베이스에 잘 나타나 있는 부위로 분해될 수 있는 하위서열은 최초 디자인 표적으로서 기능할 수 있다.

고안된 특정 키메라 징크 핑거 단백질이 세포 내에서 표적 부위를 인식할 가능성을 추정할 수 있도록 점수제를 사용할 수 있다. 이 점수는 상기 고안된 단백질에서 각 구성 핑거의 선호되는 하위 부위에 대한 친화성, 그 특이성 및 그 성공도의 함수일 수 있다.

컴퓨터 프로그램. 전술한 기계로 판독 가능한 데이터베이스를 사용하기 위해, 표적 부위를 분해하기 위해, 그리고 하나 이상의 키메라 징크 핑거 단백질의 고안을 출력하기 위하여 컴퓨터 시스템과 소프트웨어가 사용될 수 있다.

상기 기술들은 이동 또는 고정 컴퓨터와 같은 프로그램 가능한 기계와, 프로세서, 그 프로세서에 의해 판독 가능한 저장 매체 및 하나 이상의 출력 기구를 포함하는 유사한 기구 상에서 실행되는 프로그램으로 이행될 수 있다. 각 프로그램은 기계 시스템과 의사소통하기 위해 고도의 과정 또는 목적지향적 프로그래밍 언어에 의해 이행될 수 있다. 컴퓨터 언어의 몇 가지 비제한적 예는 C, C++, JAVA®, 포트란, 및 VISUAL BASIC^TM이다.

이러한 각 프로그램은 CD-ROM(compact disc read only memory), 하드 디스크, 자기 디스켓, 또는 그와 유사한 매체 또는 기구 등의 저장매체 또는 기구에 의해 저장될 수 있는데, 이들은 본 명세서에 기술된 과정을 수행하기 위하여 컴퓨터가 저장매체 또는 기구를 판독할 때 기계를 배치하고 작동시키기 위하여 일반적이거나 특정한 목적의 프로그램 가능한 기계에 의해 판독될 수 있다. 이 시스템은 프로그램과 함께 배치된 기계로 판독 가능한저장매체로 이행될 수 있는데, 이렇게 배치된 저장매체가 기계를 특정적이고 예정된 방식으로 작동하도록 한다.

컴퓨터 시스템은 내부 또는 외부 네트워크에 연결될 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 시스템은 HTTP, HTTPS, 또는 XML 프로토콜을 이용하여 멀리 떨어진 고객 시스템으로부터 요구를 받을 수 있다. 이러한 요구는 알려진 표적 유전자, 또는 표적 핵산의 서열을 대표하는 스트링에 대한 식별자(identifier)일 수 있다. 전자의 경우에는 컴퓨터 시스템이 GENBANK®와 같은 서열 데이터베이스에 들어가서 표적 유전자의 조절 영역의 핵산 서열을 검색할 수 있다. 이어서, 조절 영역의 서열 또는 직접 받은 표적 핵산 서열은 하위 부위로 분해되고, 전술한대로 키메라 징크 핑거 단백질을 고안한다.

시스템은 멀리 떨어진 고객에게 결과를 통보할 수 있다. 한편, 시스템은 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 실제로 검색하도록 로봇을 조정할 수도 있다. 이 실시태양에서, 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리가 제조되어 냉동 정제 DNA, 또는 핵산을 포함하는 냉동 세균균주로 저장된다. 로봇은 라이브러리의 특정 어드레스를 찾아냄으로써 컴퓨터 시스템의 시그날에 반응한다. 이어서, 검색된 핵산은 프로세스되고 포장되어 고객에게 배달될 수 있다. 한편, 검색된 핵산을 세포에 삽입하여 분석할 수 있다, 컴퓨터 시스템은 네트워크를 통해 고객에게 분석 결과를 통보할 수 있다.

선택된 모듈로부터 단백질의 제조. 다수의 징크 핑거 도메인들을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 서열을 일단 디자인하면, 디자인된 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산 서열을 합성할 수 있다. 합성 유전자를 제조하는 방법은 이 기술분야에서는 일상적인 것이다. 상기 방법은 주문 합성된 올리고뉴클레오티드, PCR 매개된 클로닝, 및 메가-프라이머 PCR로부터의 유전자 제조를 포함한다. 한 예로, 선택된 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 핵산들은 연속적으로 연결되어 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 형성한다. 추가 서열이 고안된 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산에 덧붙여질 수 있다. 추가 서열은 자체로서 조절기능을 제공할 수 있고, 원하는 기능의 아미노산 서열을 코드할 수 있다.

키메라 징크 핑거 단백질의 조절 프로필

키메라 징크 핑거 단백질의 특성을 확인하여 이 단백질이 포유동물 세포와 같은 세포에서 하나 이상의 내생 유전자를 조절할 수 있는지를 결정할 수 있다. 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 우선 억제 또는 활성화 도메인에 연결한 후, 대상 세포 내로 도입할 수 있다. 적당한 배양 및 코딩 핵산의 발현 유도 후, 세포로부터 mRNA를 추출하고 핵산 마이크로어레이를 통해 분석한다.

핵산 마이크로어레이는 예를 들어 포토리토그래픽 방법(예: 미국 특허 제5,510,270호 참조), 기계적 방법(예: 미국 특허 제5,384,261호에 기재된 직접 흐름 [directed flow] 방법) 또는 핀 기반(pin based) 방법(미국 특허 제5,288,514호에 기재됨) 등의 다양한 방법에 의해 제작될 수 있다. 이 어레이는 발현된 특정 유전자에 대한 핵산을 검출하기에 적합한 특별한 캡쳐 프로브(capture probe)를 각 주소에 갖도록 제작된다.

mRNA는 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons, N.Y]에 기술된대로 DNase를 처리하며 게놈 DNA를 제거하고, 올리고-dT를 붙인 고체 기질에 혼성화하는 것을 포함하는 일반적인 방법으로 분리할 수 있다. 기질을 세척한 다음, mRNA를 용출시킨다. 분리된 mRNA를 미국 특허 제4,683,202호에 기재된대로 rtPCR 등에 의해 역전사시키고 임으로 증식시킨다. 증식 또는 역전사과정 동안 표지된 뉴클레오타이드의 삽입에 의해 핵산을 표지시킬 수 있다. 바람직한 표지의 예는 적색 형광염료 Cy5(Amersham) 또는 녹색 형광염료 Cy3(Amersham)과 같은 형광 표지를 포함한다. 한편, 핵산을 바이오틴으로 표지하고, 스트렙타비딘-파이코에리트린(Molecular Probes) 등의 표지된 스트렙타비딘과의 혼성화로 거출할 수 있다.

이어서 표지된 핵산을 어레이에 접촉시킬 수 있다. 추가로, 대조 핵산 또는 참고 핵산을 동일한 어레이에 접촉시킬 수 있다. 대조 핵산 또는 참고 핵산을 표본 핵산의 표지와는 다른 표지, 예를 들어 상이한 최대 방출(emission) 파장을 가진 표지로 표지할 수 있다. 표지된 핵산을 혼성화 조건에서 어레이와 접촉시킨다. 어레이를 세척한 후, 어레이의 각 주소에서 형광을 검출하기 위해 영상화한다.

프로필을 만들고 평가하는 일반적 방법은 어레이의 각 주소에서 혼성화를 검출하는 것을 포함한다. 각 주소의 혼성화 정도는 숫자로 표시하여 벡터, 일차원 매트릭스, 또는 일차원 어레이에 저장한다. 벡터 x는 어레이의 각 주소에 대한 값을 갖는다. 예를 들면, 특정 주소에서 혼성화 정도에 대한 수치는 x_a라는 변수로 저장된다. 이 수치는 각 지역의 배경 수준, 표본량 및 다른 변이조건에 맞춰 조정될 수 있다. 대조 표본으로부터 핵산을 역시 준비하고, 동일하거나 상이한 어레이에 혼성화시킬 수 있다. 벡터 y는 벡터 x와 동일하도록 만든다. 예를 들어, 두 벡터의 함수인 수학식을 사용하여 표본 발현 프로필을 대조 프로필과 비교할 수 있다. 이 비교는 두 프로필의 유사성을 나타내는 점수등의 스칼라(scalar) 값으로 평가할 수 있다. 어레이에 의해 검출되는 상이한 유전자들에 가중치를 부가하기 위하여 상기 벡터들 중 어느 하나 또는 모두는 매트릭스에 의해 변환될 수 있다.

발현 데이터는 데이터베이스, 예를 들어 SQL 데이터베이스(예: 모라클(Oracle) 또는 사이베이스(Sybase) 데이터베이스 환경)와 같은 연관 데이터베이스에 저장될 수 있다. 데이터베이스는 여러 개의 표를 가질 수 있다. 예를 들어, 처리되지 않은(raw) 발현 데이터를, 각 세로줄은 분석되는 유전자(예: 주소 또는 어레이)에 해당하고, 각 가로줄은 표본에 해당하는 하나의 표에 저장할 수 있다. 별도의 표는 식별자, 및 사용한 어레이의 뱃치(batch) 숫자, 날짜 및 다른 품질 관리 정보 등의 표본 정보를 저장할 수 있다.

유사하게 조절되는 유전자들은 함께 조절되는 유전자들을 동정하기 위해 발현 데이터를 클러스터화(clustering) 함으로써 동정할 수 있다. 이러한 클러스터는 키메라 징크 핑거 단백질에 의해 동등으로 조절되는 유전자 세트를 표시한다. 유전자는 위계적 클러스터화(hierarchical clustering) [예: Sokal and Michener (1958) Univ. Kans. Sci. Bull. 38:1409 참조], 베이시언 클러스터화(Bayesian clustering), 카파 평균 클러스터화(k-means clustering), 및 자체조직 지도(self-organizing maps) [Tamayo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2907 참조]를 사용하여 클러스터화될 수 있다.

표본 발현 프로필의 대조 발현 프로필(예: 대조 세포)과의 유사성은 예를 들어 표본 발현 수준의 로그를 프리딕터(predictor) 또는 대조 발현 값의 로그와 비교하고, 이 비교 결과를 프로필 내의 예시값의 모든 유전자에 대한 중요도에 의해 조정함으로써 결정될 수 있다.

고안된 전사 인자의 추가적인 특징

펩타이드 링커. DNA 결합 도메인들은 다양한 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커의 유용성과 디자인은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다. 특히 유용한 링커는 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 링커이다. 따라서, 제1 DNA 결합 도메인, 펩타이드 링커, 및 제2 DNA 결합 도메인을 코딩하는 합성 유전자를 제조할 수 있다. 이러한 디자인은 대규모의 합성 다수-도메인 DNA 결합 단백질을 제조하기 위해 반복될 수 있다. 국제특허출원 제WO 99/45132호 및 김 및 파보 (Kim and Pabo, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7)는 징크 핑거 도메인들을 연결하는 데 적합한 펩타이드 링커의 디자인을 기술하고 있다.

무작위 코일, α-나선 또는 β-주름의 3차 구조를 형성하는 추가적인 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 적합한 유연성 있는 링커를 형성하는 폴리펩타이드는 이 기술분야에서 잘 알려져 있다 (Robinson and Sauer (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34 참조). 유연성 있는 링커는 전형적으로 글리신을 포함하는데, 이는 글리신이 측쇄가 결여되어 있어서 회전 자유도가 있는 유일한 아미노산이기 때문이다. 친수성을 증가시키기 위하여 세린 또는 트레오닌을 링커에 삽입할 수 있다. 아울러, 결합 친화도를 증가시키기 위해 DNA의 인산 골격과 상호작용할 수 있는 아미노산이 사용될 수 있다. 이러한 아미노산들의 현명한 사용으로 친화도의 증가와 서열 특이성의 감소 사이의 균형을 잡을 수 있다. 만약, 링커가 엄격한 신장성을 요구한다면 문헌 [Pantoliano et al. (1991) Biochem. 30:10117-10125]에 기술된 나선형 링커와 같은 α-나선 링커를 사용할 수 있다. 또한 링커는 컴퓨터 모델링에 의해 디자인될 수 있다 (미국 특허 제4,946,778호 참조). 분자 모델링을 위한 소프트웨어는 상업적으로 입수할 수 있다 (예를 들어 Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA). 이러한 링커는, 단백질 공학 분야에서 실시되는 표준적인 돌연변이 유도 기술 및 적절한 생물리학적 테스트, 및 본 명세서에 기술된 기능적 분석법을 사용하여, 예를 들어, 항원성을 감소시키고/시키거나 안정성을 증가 등을 위해 최적화된다.

징크 핑거 도메인을 활용한 실시를 위해, 징크 핑거 사이에서 자연적으로 발견되는 펩타이드를 핑거들을 함께 연결하기 위한 링커로서 사용할 수 있다. 그러한 자연적으로 발견되는 링커로서 전형적인 것은 Thr-Gly-(Glu-Gln)-(Lys-Arg)-Pro-(Tyr-Phe) (서열번호: 125)이다.

이량체화 도메인. DNA 결합 도메인들을 연결하는 또 다른 방법은 이량체화 도메인, 특히 이종이량체화 도메인 (Pomerantz et al. (1998) Biochemistry 37:965-970 참조)을 사용하는 것이다. 이러한 예에서는 DNA 결합 도메인이 별개의 폴리펩타이드 사슬로 존재한다. 예를 들어, 첫 번째 폴리펩타이드는 DNA 결합 도메인 A, 링커 및 도메인 B를 코딩하는 반면, 두 번째 폴리펩타이드는 도메인 C, 링커 및 도메인 D를 코딩한다. 당업자는 특성이 밝혀진 많은 이량체화 도메인들로부터 하나의 이량체화 도메인을 선별할 수 있다. 동종이량체가 바람직하지 않다면 이종이량체화를 선호하는 도메인이 사용될 수 있다. 특히 적용가능한 이량체화 도메인은 코일화된 코일 모티프, 예를 들어 이량체 평행 또는 역평행 코일화된 코일이다. 우선적으로 이종이량체를 형성하는 코일화된 코일 서열을 또한 이용할 수 있다 (Lumb and Kim, (1995) Biochemistry 34:8642-8648). 이량체화 도메인의 또 다른 종류로 이량체화가 소분자에 의해 또는 신호전달 경로를 통해 유발되는 것이 있다. 예를 들어, FK506의 이량체 형태는 두 개의 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인들을 이량체화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 이량체화 도메인은 추가적인 조절 단계를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

기능성 분석(Functional Assays) 및 용도

징크 핑거 단백질들은 세포를 사용하지 않는 시험이나 세포 시험을 이용하여 평가될 수 있다. 세포를 사용하지 않는 시험의 예로는 최소한 부분적으로 정제된 단백질의 생화학적 특성을 시험하는 것, 예를 들어 시험관 내 DNA 결합 시험이 포함된다. 유용한 시험관 내 시험의 예로는 전기영동 이동 검정법 (EMSA), DNA 풋프린팅 (DNA footprinting), DNA 메틸화 보호법, 표면 플라스몬 공명분석, 형광 편광분석, 그리고 형광 공명에너지 전이 (FRET)가 있다. 결합과 다른 기능적 특성들은 세포 내 시험에서 또는 생체 내에서(예를 들어, 생물체에서) 시험될 수 있다.

예를 들면, 표적 부위, 예를 들어 세포 증식을 조절하는 유전자의 프로모터 부위에 결합하는 도메인이 선택될 수 있다. 단위체 조립에 의해, (1) 표적 프로모터 부위에 걸친 하위 부위에 각각 결합하도록 선택된 도메인들 및 (2) 활성화 도메인 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인 포함하는 단백질을 디자인할 수 있다. 세포 증식을 조절하는 유전자를 조절하는 단백질과 세포 증식과 길항하는 단백질의 예에서, 적합한 전사 조절 도메인은 상기 유전자가 세포 증식을 촉진했는지 (예를 들어 억제 도메인이 사용됨), 또는 억제했는지 (예를 들어 활성화 도메인이 사용됨)에 따라 선택될 수 있다. 다른 예에서, 징크 핑거 도메인의 무작위 조합을 코딩하는 라이브러리는 표현형질을 변화시키는 키메라 징크 핑거 단백질을 확인하기 위하여 스크린 된다.

키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 강 및 김 (Kang and Kim, (2000) J Biol Chem, 275:8742)에 기재된 유도성 발현 벡터 등의 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 유도성 발현 벡터는 유도가능한 프로모터 또는 조절 서열을 포함할 수 있다. 유도가능한 프로모터의 비제한적 예는 스테로이드-호르몬 반응성 프로모터 (예, 엑다이존-반응성, 에스트로겐-반응성, 및 글루타코티코이드-반응성 프로모터), 테트라사이클린 "테트-온 (Tet-on)"과 테트-오프 (Tet-Off)" 체계, 및 금속-반응성 프로모터를 포함한다. 이러한 구조물을 조직 배양 세포 또는 배아 줄기 세포에 형질감염시킴으로써 대상 모델로서의 유전자 이식 생물체를 생성할 수 있다. 유전자 이식 동물 모델에서 단백질의 발현을 유도하고, 조직 배양 세포의 세포 증식을 조사하거나 발생학적 변화 및/또는 종양 성장을 분석함으로써 키메라 징크 핑거 단백질의 효율을 결정할 수 있다. 아울러, 표적으로 삼은 유전자의 발현 정도는 예를 들어 RT-PCT 또는 노던 블롯과 같은 mRNA를 검출하는 일반적인 방법에 의해 분석할 수 있다. 더욱 완벽한 측정을 위해서는 키메라 징크 핑거 단백질을 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포에서 mRNA를 정제한다. 이러한 mRNA의 두 개의 풀을 이용하여 대규모의 유전자 집합물, 예를 들어 관심있는 질환 (예를 들어, 암)에 관계된 유전자들의 집합물 또는 생물체의 게놈에서 동정된 유전자들의 집합물에 대한 프로브를 함유하는 마이크로어레이를 탐지한다. 이러한 분석은 키메라 징크 핑거 단백질의 특이성을 결정하는데 특히 유용하다. 만일 단백질이 높은 친화도를 가지나 낮은 특이성을 가지고 결합한다면, 예상되는 표적 유전자 이외에 유전자의 발현에도 영향을 주어 다면적이고 바람직하지 않은 효과를 가져올 수 있다. 이러한 효과는 전사물의 전체적인 분석에 의해 밝혀진다.

추가로, 고안된 단백질은 내재 유전자를 조절하기 위해 대상 세포 또는 대상 생물체에서 생산될 수 있다. 고안된 단백질은 전술한 대로 내재 유전자의 한 영역에 결합하여 전사 활성화 또는 억제를 초래하도록 배열된다. 강 및 김의 상기 문헌에 기술된 대로, 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산의 발현은 조절가능한 프로모터 (예, 유도성 또는 억제성 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터를 조절할 수 있는 물질, 예를 들어 프로모터에 대한 유도체의 농도를 변화시킴으로써 내재 유전자의 발현을 농도 의존적 방식으로 조절할 수 있다.

징크 핑거 단백질의 결합 부위 선호도는 EMSA, DNase 풋프린팅 (footprinting), 표면 플라스몬 공명법, 셀렉스 (SELEX), 또는 컬럼 결합과 같은 생화학적 분석법에 의해 확인할 수 있다. 결합을 위한 기질로는 표적 부위 또는 제한 절편을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 분석은 비특정 DNA를 경쟁체로서 또는 특정 DNA 서열을 경쟁체로서 포함할 수 있다. 특정 경쟁체 DNA는 하나, 둘, 또는 세 개의 뉴클레오티드 돌연변이를 가진 DNA 결합을 위한 인식 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 생화학적 분석으로 소정 부위에 대한 도메인의 친화도 뿐만 아니라 다른 부위에 대한 소정 부위의 상대적 친화도도 측정할 수 있다. 레바 및 파보 (Rebar and Pabo, 1994, Science 263:671-673)는 EMSA로부터 징크 핑거 도메인에 대한 Kd 상수를 얻는 방법을 기술하고 있다. 예시적인 징크 핑거 단백질들은 특정 인식 부위에 대하여 하나, 둘, 또는 세 개의 뉴클레오티드에 돌연변이를 가지는 관련 부위에 비하여 최소 2, 5, 10, 50, 100, 또는 500배의 선호도를 가진다.

본 발명의 명세서에 기재된 단백질 또는 핵산은 내피세포 또는 혈관생성을 조절하는 능력과 같은 생물학적 활성을 시험하기 위하여 시험관 내 또는 생체 내에서 평가될 수도 있다.

내피세포 증식. 소 모세내피세포 증식시험, 병아리 캠 (CAM) 시험, 마우스 각막시험, 그리고 이식된 종양에 대한 단백질 또는 핵산의 효능 판정 등과 같은 생물 활성 시험을 이용하여 단백질 또는 핵산의 내피세포 증식 억제력을 시험할 수 있다. 병아리 캠 (CAM) 시험은 예를 들어, 오레일리 등 ("Angiogenic Regulation of Metastatic Growth" Cell, vol. 79 (2), Oct. 21, 1994, pp. 315-328)에 기재되어 있다. 간략히, 완전한 노른자위를 가지는 3일된 병아리 배아를 알로부터 분리하여 페트리디쉬에 옮긴다. 3일간 배양 후 시험될 단백질을 함유하는 메틸셀룰로즈 디스크가 각 배아의 CAM에 처리된다. 48시간 배양 후, 배아와 CAM들은 내피세포 성장이 저해되었는지 판정하기 위해 관찰된다. 마우스 각막시험은 성장인자를 함유하는 펠릿을 또 다른 내피세포 증식을 저해할 것으로 추정되는 물질을 함유하는 펠릿과 함께 마우스의 각막에 이식하고 모세혈관의 패턴을 관찰하는 것을 수반한다.

혈관생성. 혈관생성은 제대 정맥, 관상동맥, 또는 피부세포 등과 같은 다양한 인간 내피세포 체계를 사용하여 시험될 수 있다. 적합한 시험들로는 증식을 측정하기 위한 알라마블루 -기반 시험 (Alamar blue based assay) (Biosource International로부터 구입가능함); 형광분자를 이용하는 전이시험, 예를 들어 혈관생성 증강제 또는 억제제의 존재 혹은 부재시 세포가 막을 지나 이동하는 것을 측정하기 위해 벡턴 디킨슨 팔콘 (Becton Dickinson Falcon)사의 HTS 플루오로블록 세포 배양 삽입기 (HTS FluoroBlock cell cultrue inserts)를 사용하는 것; 마트리젤 (Matrigel, Becton Dickinson) 위에서 내피세포에 의한 관형성에 기초한 세관 형성 시험법 등이 포함된다.

세포 부착. 세포 부착 시험은 시험하고자 하는 단백질 또는 핵산이 존재 또는 부재 시 정제된 부착 단백질에 세포가 부착되는 것 또는 세포간에 서로 부착되는 것을 측정한다. 세포-단백질 부착시험은 정제된 단백질에 세포가 부착되는 것을 조절하는 시료의 능력을 측정한다. 예를 들어, 생성된 재조합 단백질을 2.5g/ml 로 PBS에 희석하여, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅한다. 대조군에 사용된 웰은 코팅하지 않는다. 코팅된 웰을 씻고, 1% BSA로 블로킹한 후, 다시 씻는다. 시료는 최종 시험 농도의 2배로 희석하여, 블로킹 및 코팅된 웰에 가한다. 그 후 세포들을 웰에 가하고, 붙지 않은 세포들은 씻어 버린다. 플레이트 위에 남아있는 세포들에 칼세인-AM과 같은 막투과성 형광염색을 가하여 직접 표지하고, 신호를 형광 마이크로플레이트 판독기로 정량화한다.

세포-세포간 부착시험은 시험 대상인 단백질 또는 핵산이 세포 서로간의 결합을 조절하는 능력을 측정하기 위하여 이용될 수 있다. 이들 시험들은 자연적 또는 재조합적으로 선별된 부착 단백질 (adhesion protein)을 발현하는 세포들을 사용할 수 있다. 예시적 시험에서, 세포 부착 단백질을 발현하는 세포들은 다른 세포들 (동일한 세포 타입, 또는 세포들이 부착하는 다른 타입의 세포들)과 함께 다중 웰 플레이트의 웰 상에 도포된다. 부착할 수 있는 세포들은 BCECF와 같은 막투과성 형광염색으로 표지되고, 시험 대상 단백질 또는 핵산이 존재하는 단일층 위에 부착되도록 한다. 붙지 않은 세포들을 씻어 버리고, 붙어있는 세포들을 형광 플레이트 판독기를 사용하여 검출한다. 또한, 고효율 세포 부착시험들도 문헌 [Falsey J R et al., Bioconjug Chem. May-June 200112(3):346-53] 등에 기재되어 왔다.

세관 형성. 세관 형성 시험은 배양된 세포, 일반적으로 내피세포들이 세포기질 (matrix) 위에서 세관구조를 형성하는 능력을 관찰하기 위하여 사용될 수 있으며, 그것은 일반적으로 세포외기질의 환경과 유사하다. 기질의 예로는 라미닌, 콜라겐 IV 및 헤파린 설페이트 프로테오글라이칸을 포함하는 기저막 단백질의 추출물인 마트리젤 (Matrigel^TM,Becton Dickinson)이 있으며, 이것은 4 ℃에서는 액체이고, 37 ℃에서는 고형 젤을 형성한다. 다른 적합한 기질로는 콜라겐, 피브로넥틴, 및/또는 피브린과 같은 세포 외 성분이 포함된다. 세포들은 친혈관생성 자극제로 자극되고, 그들이 세관을 형성하는 능력이 상으로 검출된다. 소관들은 일반적으로 자극제와 하룻밤 배양된 후 검출되나, 더 길거나 짧은 시간도 가능하다. 세관 형성 시험은 공지되어 있다 (예, 문헌 [Jones M K et al., 1999, Nature Medicine 5:1418-142] 참조). 이들 시험들은 전통적으로 혈장 또는 성장인자 FGF 또는 VEGF에 의한 자극과 관련되어 왔다. 한 실시예에서, 상기 시험은 혈장을 함유하지 않는 배지에서 배양된 세포들을 이용하여 실시된다. 한 실시예에서, 상기 시험은 하나 이상의 친혈관생성 인자, 예를 들어, TNF-α와 같은 염증성 혈관생성 인자, 또는 FGF, VEGF, 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA), TNF-알파, 에프린 (ephrin) 등의 존재 하에 실시된다.

세포 이동. 내피세포의 이동에 대한 예시적 시험에는 인간 미세혈관 내피세포 (HMVEC) 이동 시험이 있다 (문헌 [Tolsma et al. (1993) J. Cell Biol 122, 497-511] 참조). 세포 이동 시험은 공지되어 있다 (예, 문헌 [Paik J H et al., 2001, J Biol Chem 276:11830-11837] 참조). 한 예로, 배양된 내피세포를 기질로 코팅된, 전형적 세포 크기보다 작은 구멍 크기를 갖는 다공질 층위에 가한다. 층은 전형적으로, 트랜스웰 폴리카보네이트 막 (Corning Costar Corporation, Cambridge, Mass.)과 같은 막이며, 일반적으로 친혈관생성 자극제를 함유하는 하층 쳄버의 액체와 접촉하는 상층 쳄버의 부분이다. 세포 이동은 일반적으로 자극제와 함께 하룻밤 배양을 한 후 시험되나, 더 길거나 짧은 시간도 가능하다. 세포 이동은 층을 통과한 세포의 숫자로서 측정되며, 세포들을 헤모톡실린 용액 (VWR Scientific.)으로 염색하거나 세포의 수를 산정할 수 있는 다른 방법으로 측정될 수 있다. 다른 예로, 세포들은 형광 표지되고 세포 이동은 예를 들어, 팔콘 HTS 플루오로블록 (Becton Dickinson)을 이용한 형광 판독으로 검출된다. 자극의 부재하에도 약간의 세포 이동이 관찰되지만, 세포 이동은 친혈관생성 인자에 반응하여 크게 증가한다. 상기 시험은 내피세포의 이동에 대하여 시험 중인 단백질 또는 핵산의 효과를 시험하기 위하여 사용될 수 있다.

발아 시험 (sprouting assay). 예시적 발아 시험은 콜라겐 젤을 기초로 하는 기질(matrix)에 묻힌 세포 수가 정해진 내피세포 스페로이드 (spheroid)의 집합체를 사용하는 3차원 시험관 내 혈관생성 시험이다. 상기 스페로이드는 세포외기질 내 침입에 의한 모세관 유사 구조의 발아 (세포 발아 (cell sprouting)로 칭함)의 시작점이 되며, 이에 뒤따르는 복잡한 혈관접합망 (anastomosing network)을 형성하는 역할을 한다 (Korff and Augustin, 1999, J Cell Sci 112:3249-58). 하나의 실험설계의 예에서, 스페로이드는 400개의 인간 제대 정맥 내피세포를 비접착성 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 하룻밤 배양하여 스페로이드체를 형성함으로써 제조된다 (Korff and Augustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998). 스페로이드는 회수되어 메토셀-콜라겐 용액 900 ㎕ 에 도포되고 콜라겐 젤 폴리머화가 일어나도록 24 웰 플레이트의 각 웰로 분주된다. 30분 후에 시험 시료의 사용 농도의 10배 농축물 100 ㎕을 젤 상부에 분주하여 가한다. 플레이트는 24시간 동안 37℃에서 배양된다. 실험 배양 시간의 마지막에 파라포름알데히드를 첨가함으로써 배양판은 고정된다. 내피세포들의 발아 정도는 스페로이드 당 누적된 발아 길이를 측정하기 위한 자동 영상 분석 시스템에 의하여 정량화될 수 있다.

다른 예시적 시험들로는 [Ferrara and Henzel (1989) Nature 380:439-443]; [Gospodarowicz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7311-7315]; [Claffey et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1246:1-9]; [Leung et al. (1989) Science 246:1306-1309]; [Rastinejad et al. (1989) Cell 56:345-355]; 및 [미국 특허 제5,840,693호]가 있다. 허혈증 (ischemia)을 조절하는 조성물의 효능은, 예를 들어, 랫트 뒷다리 허혈증 모델 (rat hindlimb ischemia model)을 이용하여 평가할 수 있다 (Takeshita, S. et al., Circulation (1998) 98: 1261-63).

유전자 조절의 표적

표적 유전자는 임의의 유전자, 예를 들어 염색체의 유전자 또는 이종 유전자 (예, 형질전환 유전자)일 수 있다. 표적 유전자는, 예를 들어 표적 유전자의 활성을 조절 (예, 증가 또는 감소)하는 것의 유용성 여부로 선택될 수 있다. 예를 들어, 병원체에게 필요한 유전자는 억제될 수 있고, 종양의 증식에 필요한 유전자는 억제될 수 있고, 발현이 잘 안되거나 불안정한 단백질을 코딩하는 유전자는 활성화되거나 과발현될 수 있으며, 스트레스에 대한 저항성을 주는 유전자는 활성화될 수 있다.

특정 표적 유전자의 예는 다음의 단백질들을 코딩하는 유전자들을 포함한다: 세포표면 단백질 (예: 당화된 표면 단백질), 종양-관련 단백질, 사이토카인 (cytokines), 케모카인 (chemokines), 펩타이드 호르몬 (peptide hormones), 신경전달물질 (neurotransmitters), 세포표면 수용체 (cell surface receptors) (예: 세포표면 수용체 키나제 (cell surface receptor kinases), 7 막관통 수용체 (seven transmembrane receptors), 바이러스 수용체와 보조수용체 (virus receptors and co-receptors)), 세포외 결합 단백질 (extracellular matrix binding proteins), 세포 결합 단백질 (cell-binding proteins), 병원체의 항원 (예를 들어, 박테리아 항원, 말라리아 항원 등). 그 외의 표적 단백질들은 에놀라제 (enolases), 사이토크롬 P450s, 아실트랜스퍼라제 (acyltransferase), 메틸라제 (methylase), TIM 배럴(barrel) 효소, 아이소머라제 (isomerase) 등이 있다.

더 구체적인 예는 다음을 포함한다: 인테그린 (integrins), 세포 부착 분자 (cell attachment molecules) 또는 "CAMs" (예: 캐드헤린 (cadherins), 셀렉션 ( selections), N-CAM, E-CAM, U-CAM, I-CAM 등); 프로테아제 (예: 서브틸리신, 트립신, 카이모트립신; 플라스미노겐 활성제 (plasminogen activator)(예: 유로키나제 (urokinase), 인간 조직형 플라스미노겐 활성제 등); 봄베신 (bombesin); 인자 IX, 트롬빈; CD-4; 혈소판-유래 성장인자; 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II; 신경 성장인자; 섬유아세포 성장인자 (예: aFGF and bFGF); 표피세포 성장인자 (EGF); VEGFa; 전환 성장인자 (TGF, 예: TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질; 에리스로포이에틴; 트롬보포이에틴; 뮤신 (mucins); 인간 혈청 알부민; 성장 호르몬 (예: 인간 성장 호르몬); 프로인슐린, 인슐린 A-사슬 및 인슐린 B-사슬; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 티록신 (thyroxine); 여포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone); 칼시토닌; ANP (atrial natriuretic peptides) A, B 또는 C; 황체 호르몬 (leutinizing hormone); 글루카곤; 인자 VIII; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자 (예: TNF-α 및 TNF-β); 엔케팔리나제 (enkephalinase); MIS (Mullerian-inhibiting substance); 고나도트로핀-관련 펩타이드; 조직 인자 단백질; 인히빈 (inhibin); 액티빈 (activin); 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자 수용체; 류마티스 인자 (rheumatoid factor); 골유도 인자 (osteoinductive factors); 인터페론 (예: 인터페론-α,β,γ); 콜로니 자극 인자 (CSFs)(예: M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF); 인터류킨 (ILs)(예: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, 등); DAF (decay accelerating factor); 및 면역글로불린. 몇몇 예에 있어서, 표적 유전자는 예를 들어 암, 감염성 질환, 염증, 또는 심혈관계 질환과 같은 질병에 연관된 단백질이나 다른 인자 (예, RNA)를 코드한다.

하나의 실시예에 있어서, 상기 유전자는 인간 질병 유전자이다. 예를 들어, 유전자는 결함이나 장애가 있는 효소를 코딩하는 돌연변이를 포함하거나 조절 서열 (예, 전사, 번역 또는 접합 조절 서열) 내에 결함을 가질 수 있다. 이러한 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 징크 핑거 단백질이 얻어질 수 있다.

예를 들어, FGF 유전자와 반응할 수 있는, 예를 들어 도 2a-f에 기재된 서열내 결합 부위에 결합하는 징크 핑거 단백질을 고안하거나, 간세포 성장인자 (HGF) 유전자와 반응할 수 있는, 예를 들어 도 3a-e에 기재된 서열내 결합 부위에 결합하는 징크 핑거 단백질을 고안할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질들은 이들 유전자의 프로모터 영역과 작용할 수 있다.

임의의 유전자를 조절하기 위한 키메라 징크 핑거 단백질은 하나 또는 그 이상의 표적 부위에 작용할 수 있도록 고안될 수 있다. 예를 들어, 표적 부위는 유전자의 코딩 영역 또는 비코딩 영역에 위치할 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 표적 부위는 조절 영역, 예를 들어 프로모터와 같은 전사조절 영역에 있다. 하나의 실시예에 있어서, 표적 부위는 전사 개시 부위, DNase 민감 부위, 또는 전사인자 결합 부위의 700, 500, 300, 200, 50, 20, 10, 5, 또는 3 염기쌍 내에 위치한다. 표적 유전자가 VEGF-A인 실시예에 있어서, 결합 부위는 국제특허공개 제WO 02/46412호의 표 2 또는 3의 부위와 다를 수 있다 (예를 들어, 중복되지 않을 수 있다). 다른 실시예에 있어서, 결합 부위는 이러한 부위와 중복되지 않는다.

유전자 및 세포 치료

키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 유전자 치료를 목적으로 다양한 DNA 구조체 및 벡터 내에 삽입될 수 있다. 본 발명의 명세서에 사용된 바와 같이, "벡터"는 그것이 공유적으로 연결된 상이한 핵산 분자를 운반할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터들은 플라스미드, 코스미드, 인공염색체 (artificial chromosome), 바이러스성 요소, 및 RNA 벡터 (예를 들어, RNA 바이러스 유전체에 기초한)를 포함한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 복제되거나, 숙주의 DNA 내로 편입될 수 있다. 바이러스성 벡터는 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등을 포함한다.

유전자 치료용 벡터는 예를 들어 포유동물과 같은 대상에게 투여하는 것을 목적으로, 대상의 세포가 벡터에 포함된 치료용 유전자를 발현할 수 있도록 고안된 벡터이다. 유전자 치료용 벡터는 예를 들어, 5' 조절 요소, 인핸서, 프로모터, 5' 비번역 영역 (5' untranslated region), 신호서열 (signal sequence), 3' 비번역 영역, 폴리아데닐화 부위 (polyadenylation site), 및 3' 조절 영역 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 5' 조절 요소, 인핸서, 또는 프로모터는 치료용 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA의 전사를 조절할 수 있다. 상기 조절은 조직 특이적일 수 있다. 예를 들어, 상기 조절은 뇌세포에 바람직한 유전자의 전사, 예를 들어 뇌피질 뉴런 또는 신경교세포; 조혈모세포 (hematopoietic cells); 또는 내피세포 등으로 제한할 수 있다. 이와 달리, 조절 요소들은 외래 약물, 예를 들어 스테로이드, 테트라사이클린 또는 유사한 것에 반응하는 것에 포함될 수 있다. 따라서, 치료용 징크 핑거 단백질 (예를 들어, VEGF를 조절하는 폴리펩타이드)의 발현의 수준 및 시기는 통제될 수 있다.

유전자 치료용 벡터들은 노출형 핵산으로서 전달하기 위하여, 바이러스 또는 비활성 바이러스성 요소, 또는 리포좀 혹은 다른 운반체의 구성요소로써 제조될 수 있다 (미국 출원 공개 제2003-0143266호 및 제2002-0150626호 참조). 하나의 실시예에 있어서, 핵산은 미세입자, 예를 들어, 50 내지 10 마이크로미터의 직경을 갖는 입자들을 형성하기 위하여 리피드-단백질-당 기질 (matrix)에서 제형화될 수 있다. 상기 입자들은 공지된 임의의 리피드 (예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린; DPPC), 단백질 (예를 들어, 알부민), 또는 당 (예를 들어, 락토스)을 이용하여 제제화 될 수 있다.

유전자 치료용 벡터들은 바이러스성 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 예시적 바이러스성 벡터들은 몰로니 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 렌티바이러스, 예를 들어 단순 포진 바이러스 (Herpes simplex viruses; HSV) 등 레트로바이러스에서 유래한 벡터들을 포함한다. 예를 들어, HSV는 신경계 세포들을 감염시키는데 잠재적으로 유용하다 (미국 출원 공개 제2003-0147854호, 제2002-0090716호, 제2003-0039636호, 제2002-0068362호 및 제2003-0104626호 참조). 유전자 전달 물질, 예를 들어 바이러스성 벡터는 유전자 전달 시스템을 생산하는 재조합 세포로부터 생산될 수 있다.

유전자 치료용 벡터는 대상에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 정맥내 주사, 국부 투여 (미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 정위 주사 (stereotactic injection; 문헌 [Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057] 참조)로 투여될 수 있다. 유전자 치료 물질은 예를 들어, 서방형 기질 (slow release matrix)을 이용하여 방출을 지연하거나 연장하기 위하여 제형화될 수 있다. 재조합 징크 핑거 단백질을 제공하는 하나의 방법에는 대상으로부터 회수된 골수 세포에 유전자 치료용 벡터를 삽입하는 것이 있다. 세포들은 예를 들어 레트로바이러스 유전자 치료 벡터로 감염되고, 배양된다.

그러는 동안, 대상은 골수 세포를 제거하기 위하여 방사능에 조사된다. 대상의 골수는 감염된 배양세포로 재충전된다. 대상은 회복 및 치료용 폴리펩타이드의 생산을 알아보기 위하여 모니터된다.

세포기반-치료방법들은 배양조건에서의 세포에 작동가능한 프로모터에 연결된 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 키메라 징크 핑거 단백질은 배양된 세포내의 내생 유전자를 조절하거나 배양된 세포에서 바람직한 표현형질을 만들도록 선택될 수 있다. 나아가, 형질전환 유전자, 예를 들어 내생 유전자를 조절하는 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 형질전환 유전자를 삽입하기 위하여 핵산 재조합을 통하여 세포들, 예를 들어 줄기세포를 개조하는 것도 가능하다. 개조된 줄기세포는 대상에게 투여될 수 있다. 줄기세포를 시험관 내에서 배양하는 방법은 예를 들어, 미국 출원 공개 제2002-0081724호에 기재되어 있다. 몇 개의 예에 있어서, 줄기세포들은 대상 내에서 분화하고, 형질전환 유전자를 발현하도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포들은 간, 지방세포, 또는 골격근 세포로 분화될 수 있다. 줄기세포들은 바람직한 조직 타입, 예를 들어 간, 지방세포, 골격근 세포를 생산하는 세포종으로부터 유도될 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 키메라 징크 핑거 단백질을 발현하거나 발현할 수 있는 재조합 세포들은, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대상 내에서 대체 치료법 (replacement therapy)을 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 작동가능하도록 프로모터 (예를 들어 유도성 프로모터, 스테로이드 호르몬 수용체에 의하여 조절되는 프로모터)에 연결된 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산은 인간 또는 비인간, 예를 들어 돼지 재조합 세포와 같은 포유동물에 도입될 수 있다. 세포는 배양되고 폴리-라이신 알긴산염 (poly-lysine alginate)과 같은 생체적합성 물질 내에 캡슐화되고, 이어서 대상에 이식된다 (문헌 [Lanza (1996) Nat. Biotechnol. 14:1107]; [Joki et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:35]; 및 미국 특허 제5,876,742호 참조). 세포를 캡슐화하기 위한 생체적합성 폴리머의 다른 예로는 소듐 알기네이트 (sodium alginate), 바륨 알기네이트 (barium alginate) 또는 소듐 셀룰로즈 설페이트 (sodium cellulose sulfate)가 포함된다. 유용한 폴리머들은 단백질들 (예를 들어, 70, 20, 10 kDa 이하의 단백질들)이 이들을 통과하여 확산될 수 있도록 한다. 초순수 물질은 캡슐화된 세포들의 생존력을 개선하고, 면역반응을 감소시킬 수 있다. 캡슐화된 세포들, 예를 들어 인공전사인자를 포함하며, 확산성 인자를 생산하는 세포들은 대상 내에서 확산성 인자를 대상에게 제공하는 치료법으로서 사용될 수 있다.

세포와 조직을 캡슐화하는 하나의 예시적 방법은 비섬유유도성 알긴산염 (non-fibrogenic alginate), 특정 종류의 갈조류로부터 얻어질 수 있는 젤라틴성 물질로 형성된 코팅을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포들은 점액질의 액체 알긴산염에 현탁되고, 세포를 캡슐화하기에 적합한 크기의 방울 안에 임의의 다양한 배열로 분무된다. 방울이 염화칼슘 (calcium chloride) 또는 염화바륨(barium chloride)과 같은 젤화 용액 (gelling solution)과 접촉하면, 세포를 둘러싸는 단일층 알긴산염 코팅이 만들어진다.

정전기적 코팅 과정을 이용한 단일층 알긴산염 코팅의 생성을 위한 접근법의 예는 미국 특허 제4,789,550호, 제4,956,128호, 제5,639,467호, 제5,656,468호, 및 제5,693,514호에 소개되었다. 공기날 (air knife) 공법을 이용하여 단일층 알긴산염 코팅을 생성하는 예는 미국 특허 제5,521,079호에 소개되었다. 방울을 코팅하기 위한 가압 공법 (pressurized process)은 미국 특허 제5,260,002호 및 제5,462,866호에 기재되었다. 회전판 장치를 사용하여 단일층 알긴산염 코팅을 만들기 위한 다른 예들은 미국 특허 제5,643,594호 및 제6,001,387호에 나타나 있다. 압전 노즐을 이용하여 단일층 알긴산염 코팅을 만들기 위한 예들은 미국 특허 제5,286,496호, 제5,648,099호 및 제6,033,888호에 나타나 있다.

미국 특허 제5,470,731호 및 제5,531,997호는 젤화가 가능한 유기폴리머 및 양이온성 폴리머의 일차 층 및 일차 층과 화학적으로 결합된 수용성 및 반투과성 이차층을 기재하고 있다. 미국 특허 제6,020,200호는 교차 결합 기질 (cross-linked matrix)로 이루어진 안정화된 외피층을 가지는 이중층을 기재하고 있다. 미국 특허 제5,227,298호 (Weber 등)는 이중층 알긴산염 코팅을 기재하고 있다.

캡슐화된 세포들은 수술 (예, 복강경 또는 종래의 외과술) 또는 주사를 통해 이식될 수 있다. 세포들은 간, 비장, 흉선, 고환, 뇌, 췌장, 폐, 신장, 복강, 피하조직, 지방층 및 다른 위치를 포함하는 임의의 적절한 신체 부위에 도입될 수 있다 (문헌 [J. Rozga et al., Intraabdominal Organ Transplantation 2000); 및 [Landes Co., USA, 1994: 129] 참조).

키메라 징크 핑거 단백질이 분비성 단백질을 코딩하는 내생 유전자를 조절함에 있어서, 분비되는 폴리펩타이드의 생산은 대상에 약물 (예를 들어 스테로이드 호르몬)을 투여함으로써 대상 내에서 조절될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 징크 핑거 단백질의 생산은 내생 신호, 예를 들어 분비된 단백질의 감소를 지시하는 신호에 의하여 통제될 수 있다. 따라서, 인공적 피드백 루프가 사용될 수 있다. 예를 들어, 신호는 분비된 단백질 자체의 수준에 의하여 조절되는 전사인자에 의하여 매개될 수 있다.

세포를 캡슐화하는 추가적 방법은, 문헌 [미국 특허 제4,391,909호; 미국 출원 공개 제2002-0022016호; Lohr et al., (2002) Cancer Chemother Pharmacol, 49: S21-S24; Hobbs et al., (2001) Journal of Investigative Medicine, vol.49, no.6, 49(6):572-5; Zimmermann et al. (2001) Ann N Y Acad Sci. 2001; Moashebi et al; Tissue Engineering, 2001, vol.7, 5, 525-534; Orive et al., (2002) Trends in Biotechnology, vol.20, 382-7; Lim and Sun (1980) Science 210: 908-910; Reed et al. 2001. Nature Biotech. 19:29-34; Dornish et al., (2001) "Standards and guidelines for Biopolymers in Tissue-Engineered Medical Products: 및 ASTM Alginate and Chitosan Standard Guides." Ann N Y Acad Sci. 2001; 944:388-97]에 나타나 있다.

또 다른 실시예에 있어서, 키메라 징크 핑거 단백질을 발현하거나 발현할 수 있는 재조합 세포들은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 재조합 세포들에 의하여 생산된 단백질은 세포들 또는 세포 주위의 배양액으로부터 회수 (예를 들어, 정제) 될 수 있다. 다른 예에 있어서, 재조합 세포들은 바탕영양세포 (feeder cells)로서 사용될 수 있다.

약학적 조성물

다른 실시예에 있어서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형된 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 임의 또는 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 생리적으로 호환될 수 있는 유사한 것을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추, 상피의 투약 (예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합한 것이다. 투약의 경로에 따라, 활성 물질은 그 물질을 불활성화 할 수 있는 산 혹은 다른 자연적 환경의 작용으로부터 그 물질을 보호하기 위한 재료 내에 코팅될 수 있다.

"약학적으로 허용되는 염"은 원 물질의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 어떠한 바람직하지 않은 독성 효과 (Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조)를 주지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예에는 산부가염 (acid addition salt)과 염기부가염 (base addition salt)을 포함한다. 산부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 3가 인산 등으로부터 유도된 무독성 무기산 뿐 아니라 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐로 치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족 산들, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 무독성 유기산으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기부가염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토금속에서 유도된 것 뿐 아니라 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등의 무독성 유기 아민으로부터 유도된 것을 포함한다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체 용액 (예를 들어 주사 또는 주입 가능한 용액), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 리포좀 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 제형을 포함한다. 상기 제형은 목적하는 투여의 방법과 치료적 적용에 따라 달라진다. 조성물의 예로서 주사 또는 주입 가능한 용액 형태가 있다. 하나의 투여 방법으로 비경구 (예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여가 있다. 하나의 실시예에 있어서, 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의하여 투여된다. 다른 실시예에 있어서, 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 근육 내 또는 피하에 주사된다.

본 명세서서 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되다" 라는 문장은 장내 (enteral) 및 국부의 투여를 제외한, 일반적으로 주사에 의한 방법 및 정맥내, 근육내, 동맥내, 간층 (뇌, 척추)내, 포피내, 안와내 (intraorbital), 심장내 (intracardiac), 피부내, 복강내, 호흡관내, 피하내, 상피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

약학적 조성물은 전형적으로 생산과 보관의 조건 하에 무균 및 안정하여야 한다. 시료 준비 과정에서의 엔도톡신의 수준은 USP 24/NF 19 방법에 따라 리뮬러스 아메보사이트 라이세이트 시험 (예, Bio Whittaker lot # 7L3790의 킷트를 사용하여 검출한계 0.125 EU/ml)으로 테스트될 수 있다. 약학적 조성물의 무균성은 USP 24/NF 19 방법에 따라 티오글리콜레이트 배양액을 이용하여 특정될 수 있다. 예를 들어, 준비된 시료는 티오글리콜레이트 배양액에 접종하는데 사용하며, 35 ℃에서 14일 또는 그 이상 배양한다. 상기 배양액은 미생물의 증식을 검출하기 위하여 주기적으로 검사된다.

상기 조성물은 용액, 미세현탁액, 분산, 리포좀, 또는 다른 고농도의 약에 적합한 정돈된 구조를 갖도록 제형화될 수 있다. 무균의 주사 가능한 용액은 활성 합성물 (즉, 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산)을 필요한 양으로 하나의 성분 또는 위에 열거된 성분들의 조합으로 적절한 용매 내에 혼합하여 제조될 수 있으며 필요에 따라, 필터를 이용하여 살균할 수 있다. 일반적으로, 분산액 (dispersion)은 활성 합성물을 기본적 분산 매질을 포함하는 무균의 운반체 및 위에 열거한 다른 필요한 성분에 혼합하여 준비된다. 무균 주사가능한 용액을 준비하기 위하여 무균 분말을 사용하는 경우, 활성 성분과 미리 무균 필터된 용액으로부터 부가적으로 바람직한 성분의 분말을 얻을 수 있는 진공건조 및 동결건조 방법이 바람직하다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산의 경우 바람직한 입자의 크기를 유지하고, 계면활성제를 이용함으로 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는, 예를 들어 모노스테아린산염 및 젤라틴 같은 흡수를 지연시키는 약품을 성분에 포함시켜 가능하게 할 수 있다.

징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 공지의 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 여러 적용을 위하여, 투여의 경로/방법은 정맥 주사 또는 주입이다. 예를 들어, 치료용 적용을 위하여, 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 30, 20, 10, 5 또는 1 mg/분 이하 속도의 정맥 주입으로 투여되어 1 내지 100 mg/m² 또는 7 내지 25 mg/m² 의 양을 투여할 수 있다. 투여의 경로/방법은 기대하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 어떤 실시예에 있어서는 활성 성분은 신속한 방출로부터 성분을 보호할 수 있는, 예를 들어 조절성 방출 제형, 즉, 이식, 미세캡슐 전달 시스템과 같은 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머들이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 준비를 위한 많은 방법들이 특허화되거나 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, 지속 및 조절 방출 약물 전달 시스템 (J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)이 있다.

특정 실시예에 있어서, 상기 조성물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 상기 화합물 (및 바람직한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 외피 내에 넣거나, 정제형으로 압축하거나, 또는 대상자의 음식 내에 직접 혼합할 수 있다. 치료용 경구 투여를 위하여, 화합물은 부형제와 함께 혼합되어 소화가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물을 비경구 투여 이외의 방법으로 투여하기 위하여, 화합물을 불활성화를 방지하는 물질과 함께 코팅하거나 또는 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다.

약학적 조성물들은 공지의 의료 기구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기의 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호, 또는 제4,596,556호에서 공개된 기구와 같은 바늘없는 피하주사 기구로 투여될 수 있다. 본 발명에서 잘 알려진 유용한 이식장치와 모듈은 서방성 속도로 약물을 분산시키기 위한, 이식가능한 미세-주입 펌프 (미국 특허 제4,487,603호); 피부를 통과하여 약을 투여하는 치료기구 (미국 특허 제4,486,194호); 정확한 주입 속도로 약을 전달하기 위한 약물 주입 펌프 (제4,447,233호); 계속적인 약 전달을 위한 가변 유속 이식가능한 주입 장치 (제4,447,224호); 다중 쳄버 분획을 가지는 삼투성 약물 전달 시스템 (제4,439,196호); 및 삼투성 약물 전달 시스템 (제4,475,196호)을 포함하며, 다른 공지의 이식, 전달 시스템, 그리고 모듈도 포함된다.

어떤 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 화합물은 생체 내에서의 적절한 분포를 위하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 많은 강친수성 화합물을 배제시킨다. 화합물의 BBB 통과를 보장하기 위하여(바람직한 경우), 예를 들어, 화합물은 리포좀 내에 제형화될 수 있다. 리포좀 생산 방법은 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호 및 제5,399,331호에 기재되어 있다. 리포좀은 특정 세포 혹은 기관으로 선별적으로 운반되는 하나 또는 그 이상의 부분을 포함할 수 있으며, 표적화된 약물 전달을 증진시킬 수 있다 (예를 들어, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 참조).

투여 처방계획은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 예를 들어 한번의 정제가 투여될 수 있고, 여러 번으로 나누어 오랫동안 투여되거나, 투여량은 치료 상황에서의 필요성에 따라 일정 비율로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 비경구용 조성물을 투여 단위 형태로 조제하는 것은 투여의 용이성과 투여량의 일관성을 위하여 특히 이점이 있다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료 대상자에게 단일 투여량으로써 적합한 물리적으로 분리된 단위로; 각 단위는 바람직한 치료효과를 만들기 위하여 계산된, 정량의 활성 혼합물과 필요한 약학적 담체를 포함한다. 투여 단위 형태 설계는 (a)활성 성분의 고유한 특성과 성취하고자 하는 특수한 치료효과 및 (b)이러한 활성 성분을 개인별 민감성의 처치를 목적으로 하는 성분화 상의 고유한 제한점에 달려 있다.

본 명세서에 기재된 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 조성물의 양은 0.1-20 mg/kg이며, 더 바람직한 양은 1-10 mg/kg 이다.

조성물은 정맥내 주입법에 의하여 30, 20, 10, 5, 또는 1 mg/분의 속도로 1 내지 100 mg/m² 또는 약 5 내지 30 mg/m²의 투여량에 이르도록 투여될 수 있다. 투여량의 값은 완화되어야 하는 질환의 종류와 심각성에 따라 변화될 수 있다는 것을 유념할 필요가 있다. 임의의 특정 대상에 대하여 특이적 투여계획은 개인의 필요와 투여하는 사람 또는 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 충분한 시간을 두고 조정되어야 하며, 본 명세서에서 설명하는 투여량의 범위는 단지 예이며 이에 제한되지는 않는다.

약학적 조성물은 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질 또는 핵산의 "치료적으로 효과적인 양" 또는 "예방적으로 효과적인 양"을 포함할 수 있다. "치료적으로 효과적인 양"은 투여량 및 필요한 시간 주기에서 바람직한 치료 결과를 얻을 수 있는 유효한 양을 지칭한다. 조성물의 치료적으로 효과적인 양은 개인의 질병의 단계, 연령, 성별, 및 체중에 따라, 그리고 상기 단백질이 개인에서 바람직한 반응을 도출하는 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 또한 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과도 치료적으로 유익한 효과보다 초과되지 않는 양이다. "치료적으로 효과적인 투여량"은 측정 가능한 변수, 예를 들어 염증 또는 종양 증식속도를 치료되지 않은 대상에 비교하여 최소 약 20%, 더 바람직하게는 최소 약 40%, 더욱 바람직하게는 최소 약 60%, 훨씬 더 바람직하게는 최소 약 80%를 억제한다. 측정 가능한 변수, 예를 들어 종양을 억제하는 성분의 능력은, 인간 종양에서의 약효를 예측 가능한 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 조성물의 이 특성은 당업계의 숙련자에게 알려져 있는 시험법으로 억제하는 성분의 능력을 시험관 내에서 시험함으로 평가될 수 있다.

"예방적으로 효과적인 양"은 투여량 및 필요한 시간 주기 동안 바람직한 예방적 결과를 달성하기 위하여 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 투여는 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계에서 사용되기 때문에, 예방적으로 효과적인 양은 치료적으로 효과적인 양보다 적을 것이다.

본 발명의 범위에는 징크 핑거 단백질 또는 그것을 코딩하는 핵산을 포함하는 킷트와 사용법, 예를 들어 처리, 예방 또는 진단 용도의 사용법도 있다. 징크 핑거 단백질이 VEGF-A 유전자를 조절하는 하나의 실시예에 있어서, 치료적 적용의 사용법은 종양 또는 종양성 질환, 또는 혈관생성과 관련된 질환 (예를 들어, 특정 염증 질환)을 가지는 환자에 제안되는 투여량 및/또는 투여방법을 포함한다. 상기 킷트는 진단용 또는 치료용 시약과 같은 하나 이상의 추가적 시약을 포함할 수 있는데, 예를 들면 본 명세서에 기재된 진단용 또는 치료용 시약 및/또는 하나 또는 그 이상의 구별된 제약학적 조제에서 적절히 제형화된 하나 이상의 추가적 징크 핑거 단백질 또는 핵산이다.

치료(Treatments)

내생 유전자를 조절할 수 있는 징크 핑거 단백질, 특히 VEGF-A 유전자를 조절할 수 있는 단백질은 치료 및 예방 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면, 이 단백질들과 이 단백질들을 코딩하는 핵산은 시험관 내나 생체 외 배양세포에 투여하거나 생체 내에서와 같이 대상에 투여함으로써 암, 특히 전이성 암, 염증성 질환과 혈관생성과 관련된 질병을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 것과 같이, "치료하다" 또는 "치료"는 질병, 질병의 증상 또는 예후들을 치료하거나 상처를 치료, 약화, 감소, 변화, 치유, 제거, 개선 또는 영향을 주기 위하여 징크 핑거 단백질이 세포 내로 들어가서 유전자 발현을 조절할 수 있도록 하는 약물을 환자와 같은 대상에 가하거나 투여하는 것, 또는 환자와 같은 대상으로부터 분리한 조직이나 세포주와 같은 세포에 약물을 가하거나 투여하는 것으로 정의되는데, 이때 환자는 질병(예: 본문에 사용된 질병)을 가지고 있거나 질병의 증상이나 예후를 보이고 있는 대상을 말한다.

하나의 실시예에 있어서, "세포를 치료하는 것" 또는 "조직을 처치하는 것"은 VEGF-A 생산, 혈관생성 촉진, 세포 증식과 같이 세포의 활성이 적어도 하나 이상 감소되는 것, 또는 과다증식하는 세포 또는 종양과 같은 조직 내나 주변 세포와 같은 세포의 활성을 감소시키는 것을 말한다. 이와 같은 감소에는 세포나 조직 (예: 전이 조직)의 활성이나 세포의 개수나 조직의 크기, 및 조직으로 공급되는 피의 양의 감소, 예를 들어 통계적으로 의미있는 감소를 포함할 수 있다. 활성 감소의 예로는 세포의 이동 (예: 세포외 기질을 통한 이동), 혈관형성의 감소, 또는 세포 분화의 감소가 있다. 다른 예로는 직접 또는 간접적으로 염증이나 염증의 표지를 감소시키는 것이 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 징크 핑거 단백질이나 그를 코딩하는 핵산의 치료에 효과적인 양 또는 "치료효과량"은 세포 치료에서 대상에 단일 투여나 반복 투여를 통해 효과를 나타내는 단백질이나 핵산의 양을 말한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 질병을 예방하는데 효과적인 징크 핑거 단백질이나 이를 코딩하는 핵산의 양 또는 단백질이나 핵산의 "예방효과량"은 단일 투여나 반복 투여를 통해 질병 (예: 암, 혈관생성 관련 질병, 또는 염증 질환)의 발병의 시작을 막거나 연기시키는 효과를 보이는 단백질이나 이를 코딩하는 핵산의 양을 말한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상"은 인간이나 인간 이외의 동물을 포함한다. 예시적 대상은 비정상적인 세포 증식이나 분화로 특징 지워지는 질병을 가지고 있는 인간 환자를 포함한다. "인간 이외의 동물"은 인간 이외의 모든 척추동물, 예를 들면, 비포유동물 (예: 닭, 양서류, 파충류) 및 양, 개, 소, 돼지 등과 같은 인간 이외의 영장류와 같은 포유동물을 포함한다.

하나의 실시예에 있어서, 대상은 인간이다. 하나의 실시예에 있어서, 징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산의 조성물은 수의학적인 목적이나 인간 질병에 대한 동물 모델로 사용하기 위해 인간 이외의 동물 (예: 영장류, 돼지 또는 생쥐)에 투여될 수 있다. 동물 모델과 같은 후자의 경우는 조성물의 치료효과 (예: 투여량이나 투여시간 추이)를 평가하는데 유용할 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 본 발명은 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들면 신생물성 질환을 치료하거나 예방할 만큼 충분한 양으로, VEGF-A 또는 이를 코딩하는 유전자를 조절하는 징크 핑거 단백질과 같은 징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산으로 대상의 세포와 접촉하는 단계들을 포함한다. 예를 들면, 이 질병은 발암성 세포, 종양 세포 또는 전이성 세포에 의해서 유발될 수 있다. 이 방법은 시험관 내나 생체 외 배양세포에 사용될 수 있다. 예를 들면, 발암성 세포나 전이성 세포 (예: 신장, 방광, 대장, 직장, 폐, 유방, 자궁 내막, 난소, 전립선, 또는 간의 암 또는 전이성 세포)는 세포 배양액 내에서 시험관 내로 배양될 수 있으며, 접촉단계는 징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 배양액에 넣어 주는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 이 방법은 생체 내 (예: 치료용 또는 예방용) 프로토콜의 일부로서, 대상 (예: 인간)에 존재하는 세포들 (예: 발암성 또는 전이성 세포들)에 적용될 수 있다. 생체 내 실시예의 경우, 접촉단계는 대상 내에서 영향을 주며, 대상의 세포들에 있는 VEGF-A 유전자를 조절하는 효과를 보이는 조건 하에 징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 대상에 투여하는 것을 포함한다.

상기 방법은 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되고 있는 바와 같이, "암", "과다증식", "악성" 및 "신생물성"은 서로 같은 뜻으로 사용되며, 빠른 증식 또는 신생물에 의해 특징 지워지는 비정상적인 상태나 조건을 말한다. 이 용어는 조직병리학적인 형태와 진행정도와 무관하게, 모든 형태의 발암성 성장, 발암 과정, 전이조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관들을 포함한다. "병리학적인 과다증식"세포는 악성 종양 성장으로 특징 지워지는 질병상태에서 나타난다.

"조직신생"이라는 용어의 일반 의학적 의미는 신생물성 세포와 같은 세포에 대한 정상적인 성장조절에 대한 반응이 결손되는 결과를 나타내는 "새로운 세포의 성장"이다. "증생"은 비정상적으로 성장속도가 빨라진 세포를 말한다. 그러나, 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 신생물과 증생은 서로 혼용될 수 있는데, 내용이 나타내는 바와 같이, 일반적으로 비정상적인 세포의 증식속도를 가진 세포를 말한다. 신생물과 증생은 종양을 포함하며, 이는 양성이거나, 악성 전이거나 또는 악성일 수 있다.

암의 예로는 고형암, 연조직암 (soft tissue tumors), 전이성 손상 (lesion) 등을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 고형암의 예로는 폐, 유방, 임파계, 위장 (예; 대장) 및 비뇨기관 (예: 신장, 요도세포), 인두, 전립선, 난소 등의 여러 기관들에 발생하는 육종 (sarcoma), 선암 (adenocarcinomas)과 암종 (carcinomas) 등의 악성종양 (malignancy) 뿐 아니라, 대부분의 대장암, 직장암, 신장세포암, 간암, 비세포성폐암, 소장암 등을 포함하는 선암 (adenocarcinoma)이 포함된다. 앞에서 기술한 암들의 전이성 손상은 본 명세서에 기술된 바 있는 방법 또는 조성물에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.

상기 방법은 폐, 유방, 임파계, 위장 (예: 대장), 그리고 비뇨생식기관 (예: 신장, 요도), 전립선, 난소, 인두 등의 여러 기관들에 발생하는 악성종양 및, 대부분의 대장암, 신장세포암, 전립선암, 고환암, 비세포성폐암, 소장암 및 식도암 등의 악성종양을 포함하는 선암 (adenocarcinoma)을 치료하는데 유용할 수 있다. "암 또는 암종"은 당업계의 숙련자에 의해서 발견될 수 있으며, 호흡계 종양, 위장계 종양, 비뇨기계 종양, 고환 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 내분비계 종양과 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비계 조직의 악성종양을 말한다. 암종의 예로는 장막암과 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 자궁 내막, 머리 및 목, 대장 및 난소 등의 조직으로부터 생성되는 암을 포함한다. 이 용어는 또한 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양 등의 암육종을 포함한다. "선암"은 선조직으로부터 유래한 암이거나 특징적인 선구조를 가지고 있는 암을 말한다. "육종"은 당업계의 숙련자에 의해 발견될 수 있으며, 간엽세포 유래 조직들의 악성종양을 말한다.

상기 방법은 VEGF-A를 발현하는 조혈줄기세포 유래 세포들의 과다증식/신생 세포의 증식을 억제하기 위해서도 사용될 수 있다.

징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 투여하는 방법은 "약학 조성물" 부분에서 기술되었다. 사용되는 물질들의 적정 투여량은 대상의 나이와 체중과 사용되는 특정 약물에 따라 달라진다.

징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 대상에 도입된 후에 대상 내 이미징을 위해 표지물질과 연결될 수 있다. 적당한 표지 물질들로는 MRI에서 검출 가능한 것이나 방사선 표지들을 포함한다.

본 명세서에 기술되어 있는 징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 단독으로 투여되거나 기존에 존재하는 치료법들과 병행하여 투여될 수 있으며, 기존 방법들은 수술을 비롯하여 방사선요법, 화학요법 등을 포함한다.

징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 특히 VEGF-A 유전자를 조절 (예: 발현 억제)하는 것은 염증성 질환이나 질병을 치료하기 위해 단독으로 투여하거나 하나 이상의 기존의 치료방법과 병행하여 투여할 수 있다. 대표적인 염증성 질환이나 질병들은 류마티스성 관절염, 청소년 만성 관절염, 건선, 이식편대숙주병 (GVHD), 피부경화증, 당뇨병, 알러지와 같은 급성 및 만성 면역 질환 및 자가면역성 질환들; 천식, 동종이계 이식 (예, 신장이식, 심장이식, 척수이식, 간이식, 췌장이식, 소장이식, 폐이식과 피부이식 등)과 관련된 급성 또는 만성 면역질환; 유육종증, 만성 염증성 장 질병, 궤양성 대장염, 크론 병변이나 질병과 같은 만성 염증성 병변; 파종성 혈관내 응고, 동맥경화, 카와사키 병변 및 맥관염 증후군 (예, 결절성 다발 동맥염, 베게너 육아종, 헤노흐-쇤라인 자반병, 거대세포 관절염및 신장 미세 맥관염 등)의 맥관 염증성 병변; 만성 활성 간염; 쉐그렌 증상; 건선성 관절염; 장질환성 관절염; 반응성 관절염과 염증성 장 질병과 관련된 관절염; 포도막염 등을 포함한다.

염증성 장 질병 (IBD)은 일반적인 만성, 재발성 위장염을 포함한다. IBD는 크론 질병과 궤양성 대장염의 두 특징적인 질병을 말한다. IBD의 임상적인 증상은 간헐적인 직장 출혈, 경련성 복통, 체중감소 및 설사를 포함한다. 궤양성 대장염의 임상 활성 지수 (Clinical Activity Index) 와 같은 임상적 지표가 IBD를 모니터하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Walmsley et al. Gut. 1998 Jul;43(1):29-32] 및 [Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2):164-71] 참조).

징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 앞에서 서술한 질병들 중 하나를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이 단백질은 각각의 질병의 최소한 한 증상을 완화시키는데 효과적인 양이 (국부적 또는 전신적으로) 투여될 수 있다. 이 단백질은 또한 국부 체온, 부종 (예: 측정되는 것), 붉어지는 것, 국부 또는 전신의 백혈구 수, 호중구의 존재 유무, 사이토카인 수준 등과 같은 염증의 표지들과 같은 염증을 완화할 수 있다. 단백질 투여 전, 투여 중, 투여 후에 위에서 말한 대상의 염증 표지들 중 하나 또는 그 이상을 평가할 수 있다.

징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 특히 VEGF-A 유전자를 조절(예: VEGF-A 유전자 발현 활성화)하는 것은 상처 치유를 향상시키는 것과 같이 상처를 치료하기 위하여 단독으로 투여하거나 기존 치료방법들 중 하나 또는 그 이상과 병행 투여할 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 VEGF-A 활성화는 새로운 혈관이나 모세혈관 형성을 증가시킨다. 그 단백질이나 핵산은 수술, 화상, 외상, 궤양, 골절 및 혈관생성을 증가시키는 것이 필요한 다른 질병들을 완화시키는데 사용될 수 있다.

징크 핑거 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 특히 VEGF-A 유전자를 조절(예를 들면, VEGF-A 유전자의 발현 증가)할 수 있는 단백질 또는 핵산은 허혈성 심장질환, 사지동맥질환 또는 심장동맥질환과 같은 심혈관질환의 치료를 위해 단독으로 투여되거나 기존의 치료방법들 중 하나 또는 그 이상과 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명은 하기 실제적인 실시예를 통해 더욱 구체적으로 기술될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도로 제공된 것이 아님에 유의하여야 한다.

실시예 1: 겔 이동 분석

본 실시예는 생체 내(in vivo)에서 징크 핑거 단백질들의 DNA 결합 특성을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 징크 핑거 단백질들을 대장균에서 발현시키고, 정제한 후 겔 이동 분석 실험에 사용하였다. 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 DNA 단편들을 pGEX-4T2(Pharmacia Biotech)에 삽입하였다. GST(glutathione-S-transferase)에 융합된 징크 핑거 단백질들을 포함하는 융합 단백질들을 생산하기 위하여 상기 구조물들을 대장균 BL21에서 발현시켰다. 상기 융합 단백질들을 글루타치온 친화 크로마토그래피(glutathione affinity chromatography, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 사용하여 정제한 후 트롬빈으로 절단하였다. 트롬빈은 GST 잔기와 징크 핑거 단백질들 사이의 링커(linker) 서열을 절단한다.

다양한 양의 징크 핑거 단백질을 20 mM Tris(pH 7.7), 120 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 10% 글리세롤, 0.1% 노니뎃 P-40(Nonidet P-40), 5 mM DTT 및 0.10 ㎎/㎖ BSA(bovine serum albumin) 함유 완충용액 내에서 방사성 동위원소로 표지된 DNA 탐침과 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하였다. 겔 상의 탐침의 분포를 PHOSPHORIMAGER^TM 분석(Molecular Dynamics)에 의해 정량하였다. 해리상수(dissociation constant, K_d)는 문헌에 기술된 바에 따라 결정하였다(Rebar 및 Pabo (1994) Science 263:671-673).

본 발명자들은 생체 내 효모 분석에서 기능을 하는 징크 핑거 단백질들이 생화학적 활성 또한 가지고 있음을 이미 발견한 바 있다. 일반적으로, 예를 들면 3개의 징크 핑거 도메인들을 갖는 징크 핑거 단백질이 1 nM 이하의 해리상수로 DNA 서열에 결합한다면, 상기 징크 핑거 단백질은 미국 출원 공개 제 2002-0061512호에 기술된 단일-혼성화 효모 분석법(one-hybrid yeast assay)에서 세포 성장을 가능케하는 반면, 징크 핑거 단백질이 1 nM 이상의 해리상수로 DNA 서열에 결합한다면, 상기 분석에서 세포 성장은 가능하지 않다. 1 nM 이상 50 nM 미만의 해리상수로 결합하는 징크 핑거 단백질들 역시 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 보다 단단하거나 특이적인 결합제(binder)를 생산하기 위하여 부가적인 핑거들이 상기 징크 핑거들에 첨가될 수 있다.

생체 내 분석은 특정한 3-bp 또는 4-bp 부위에 대한 개별 징크 핑거 도메인의 결합을 평가하기 위하여 적용될 수도 있다. 하나의 실시 태양에 있어서, 개별 징크 핑거 도메인은 Zif268의 핑거 1 및 2와 ⅰ) 핑거 1 및 2에 의해 인식되는 염기쌍과 ⅱ) 특정한 3-bp 또는 4-bp 부위를 포함하는 표적부위의 관계에 있어서 평가된다.

실시예 2: 개별 3-핑거 단백질의 제조

본 실시예는 키메라 3-핑거 단백질을 코딩하는 핵산의 제조방법을 제공한다. 포유류 세포들에서 키메라 징크 핑거 단백질을 발현시키기 위하여 벡터 P3(Toolgen, Inc.)을 사용하였다. P3은 벡터 pcDNA3(Invitrogen, San Diego CA)의 변형을 통해서 제작되었다. 연결이 가능한 돌출말단(overhangs)을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 이중가닥을 HindⅢ 및 XhoI으로 절단된 pcDNA3 벡터에 연결하였다. 상기 이중가닥은 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 태그(tag)와 핵 위치 신호(nuclear localization signal, NLS)를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 이중가닥은 또한 BamHI, EcoRI, NotI 및 BglⅡ 절단부위들 및 정지 코돈을 포함한다. 나아가, 상기에서 생성된 벡터를 XmaI으로 절단하고, 절단부위의 돌출말단을 메운 후, 양 말단을 재연결함으로써, 이 벡터의 SV40 복제기원 내 XmaI 절단부위를 제거하였다.

하기는 다중 징크 핑거 도메인들을 갖는 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드를 제작하는 하나의 예시적인 방법이다. 먼저, 단일 징크 핑거 도메인을 코딩하는 삽입체(insert)를 하나의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 서열을 갖는 벡터(P3 벡터)에 삽입하였다. 상기 클로닝의 결과로 두 개의 징크 핑거 도메인들을 갖는 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드가 얻어진다. 두 개의 징크 핑거 도메인으로 구성된 징크 핑거 도메인 삽입체를 상기 방법에 의해 제조한 후 한 개 또는 두 개의 징크 핑거 도메인들을 갖는 AgeI/NotI 절단에 의해 선형화된 벡터 P3에 클로닝하여 3개 또는 4개의 징크 핑거 도메인들로 구성된 징크 핑거 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드를 얻었다.

키메라 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 유전자들을 p65 전사활성 도메인, Kid 전사 억제 도메인 또는 Kox 전사 억제 도메인과 같은 기능성 도메인을 코딩하는 미리 준비된 플라스미드에 클로닝하였다. 키메라 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 유전자들을 포함하는 상기 플라스미드들을 EcoRI/NotI으로 절단한 후 동일한 제한효소에 의해 선형화된 플라스미드 내로 삽입하였다. 수용체 플라스미드들(pLFD-p65, pLFD-KRAB, pLFD-KOX)의 클로닝 부위는 기능성 도메인에 대해 DNA 결합부위가 N-말단이 될 수 있는 위치로 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 서열을 위치시켰다. 이로부터 얻은 구조물들은 N-말단에서 C-말단으로 HA-태그, 핵 위치 신호, 징크 핑거 단백질 및 기능성 도메인을 포함하는 단백질을 암호화한다.

실시예 3: 인간 징크 핑거 도메인들을 갖는 3-핑거 단백질의 생체 내 분석

생체 내 억제 분석법이 새로운 3-핑거 단백질들이 생체 내에서 기능적인지를 결정하기 위하여 사용되었다. 예를 들면, 문헌 김 및 파보(Kim 및 Pabo, (1997) J. Biol. Chem. 272:29795-29800)를 참조하라. 상기 분석법은 김 및 파보의 구조물(상기 문헌 참조)에서 Zif268 부위의 위치에 상응하는 위치에 표적부위가 존재하는 루시퍼라제 리포터 구조물을 사용하였다.

상기 루시퍼라제 리포터 플라스미드들은 pGL3-TATA/Inr(Kim 및 Pabo, 상기 문헌 참조)의 변형체인 p△S-modi로부터 제작되었다. 상기 리포터들은 리포터 단백질로서 개똥벌레 루시퍼라제를 사용한다. TATA 박스의 상류 SacI 절단부위를 p△S-modi로부터 제거하였다. 새로운 SacI 절단부위를 전사개시부위 다음에 삽입하였다. 서로 다른 리포터 플라스미드들이 서로 다른 징크 핑거 단백질들 각각에 대해서 제작되었다. 각각의 플라스미드를 제작하기 위하여, 특정 징크 핑거 단백질과 상호작용할 것으로 예상되는 특이적 9-bp 결합부위를 포함하는 올리고머를 상기 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드 p△S-modi를 SacI 및 HindⅢ로 절단한 후 상기 올리고머를 삽입하였다. 이 조작은 전사개시부위로부터 12-bp 하류에 위치한 14-bp를 대체하였다. 이로부터 얻은 리포터 플라스미드들을 p1G-ZFP ID로 명명하였는데, 본 명세서에서 ID는 상응하는 징크 핑거 단백질의 이름이다.

특정 3-핑거 단백질의 생체 내 활성을 하기와 같이 분석하였다. HEK 293 세포들을 4개의 플라스미드들로 형질감염(transfection)시켰다: 특정 3-핑거 단백질을 발현하는 플라스미드 14 ng; 상기에서 기술된 리포터 플라스미드 14 ng; GAL4-VP16을 발현하는 플라스미드 70 ng; 및 레닐라(Renillar) 루시퍼라제를 발현하는 플라스미드 1.4 ng. GAL4-VP16은 특정 3-핑거 단백질에 의한 리포터 억제 부재시 최소 합성 프로모터의 전사를 활성화시킨다. 다른 징크 핑거 단백질들의 능력을 또 다른 3-핑거 단백질들과 비교하였다. 레닐라 루시퍼라제를 발현하는 플라스미드는 형질감염 효율의 대조군을 제공하였다.

리포펙타민(LIPOFECTAMINE^TM, Gibco-BRL)이 형질감염을 위해서 사용되었다. 세포들은 96-웰 플레이트의 웰에서 30 내지 50% 현탁도(confluency)로 형질감염되었다. 상기 세포들을 2일 동안 배양한 후 루시퍼라제 분석을 위해 수확하였다. 그런 다음, 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(DUAL-LUCIFERASE^TM Reporter Assay System, Promega)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 상기에서 관찰된 개똥벌레 루시퍼라제의 활성을 관찰된 레닐라 루시퍼라제의 활성을 이용하여 보정하였다. 억제 또는 "억제-배수(fold-repression)"의 정도를 징크 핑거 단백질 부재시의 보정된 리포터 발현값을 징크 핑거 단백질 존재시의 보정된 리포터 발현값으로 나누어 계산하였다.

징크 핑거 단백질들은 형질감염 분석에서 적어도 2배 이상의 전사 억제를 나타내는 경우에는 높은 엄격성(stringency)의 컷-오프(cut-off) 값을 만족하는 것으로, 또는 형질감염 분석에서 1.5 내지 2배의 전사 억제를 나타내는 경우에는 낮은 엄격성의 컷-오프 값을 만족하는 것으로 분류되었다.

실시예 4: ZFPs와 이들의 특이적 리포터의 결합 분석 결과

생체 내 분석에서 관찰된 활성을 결합 친화도와 연관시키기 위해서 겔 이동 분석(gel shift assay)을 사용하였다. 서로 다른 표적서열들에 대한 Zif268의 결합을 겔 이동 분석 및 상기 실시예 3에 기재된 형질감염 분석을 이용하여 평가하였다. 겔 이동 분석에 의해 측정된 해리상수와 상술한 형질감염 분석에서의 전사 억제 수준 사이에 양호한 상호연관성이 확인되었다. 일반적으로, 형질감염 분석에서 2배 이상의 억제(즉, 50%의 억제)를 나타내는 징크 핑거 단백질들은 겔 이동 분석에 의해 측정된 바와 같이 1 nM 이하의 해리상수를 나타내었다.

실시예 5: 3-핑거 단백질들의 특성 분석

두 가지 형태의 "3-핑거" 키메라 징크 핑거 단백질들이 제조되었다. 하나는 천연형 인간 징크 핑거 도메인들로만 구성된 키메라 단백질들을 포함하는데, 상기 도메인들은 자연형(naturally-occurring) 인간 징크 핑거 도메인들과 동일하다. 다른 하나는 자연형 징크 핑거 도메인과 동일하지 않은 징크 핑거 도메인들을 포함하는 키메라 단백질들을 포함한다. 후자의 징크 핑거 도메인들은 전형적으로 자연형 징크 핑거 도메인의 생체 내 돌연변이와 파아지 디스플레이 선택(phage display selection)에 의해 동정되었다. 이러한 돌연변이 도메인들은 자연적 진화의 엄격성을 피한 것이다.

총 36개의 징크 핑거 도메인들, 즉 18개의 인간 징크 핑거 도메인들 및 18개의 돌연변이 징크 핑거 도메인들이 검정 3-핑거 단백질들의 한 셋트를 조립하는데 사용되었다. 돌연변이된 징크 핑거 도메인들은 문헌(Choo 및 Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11168-11172; Desjarlais 및 Berg (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:11099-11103; Dreier 등 (2001) J. Biol. Chem. 276:29466-29478; Dreier 등 (2000) J. Mol. Biol. 303:489-502; Fairall 등 (1993) Nature 366:483-487; Greisman 및 Pabo (1997) Science 275:657-661; Kim 및 Pabo (1997) J. Biol. Chem. 272:29795-29800; Segal 등 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-2763) 등에 기술되어 있다. 미국 출원 공개 제2003-165997호의 표 9 역시 참조하라. 36개의 도메인들을 코딩하는 핵산들을 EcoRI 및 NotI으로 절단된 P3 벡터에 개별적으로 서브클로닝한 후, 생성된 플라스미드들을 키메라 징크 핑거 단백질의 제작을 위한 출발물질로 사용하였다.

키메라 3-핑거 단백질들을 코딩하는 핵산들을 두 가지 다른 방법에 의해 제조하였다. 첫 번째 방법에서는, 모든 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 핵산들을 무작위로 혼합하였고, 3-핑거 구조물들을 이후의 분석을 위해 무작위로 선별하였다. 각 구조물의 염기서열을 분석하여 그것이 코딩하는 폴리펩티드 내 구성 징크 핑거 도메인들을 결정하였다. 이어서, 무작위로 분류된 각각의 3-핑거 단백질들에 대해 표적 DNA 서열들을 합성하였다. 상기 표적 DNA 서열들은 예상되는 선호 표적부위를 기초로 하였다. 상기 표적들을 위에서 기술한 루시퍼라제 리포터 벡터에 클로닝하였다. 이러한 접근방식을 "징크 핑거 단백질-우선" 접근방식이라고 한다.

두 번째 방법에서는, 키메라 3-핑거 단백질들을 코딩하는 핵산을 특정 표적 DNA 서열들에 기초하여 조립하였다. 징크 핑거 도메인들의 인식부위들과 표적 DNA 서열들을 연결해주기 위해 컴퓨터 알고리즘이 사용되었다. 공지된 유전자들의 프로모터 서열들이 입력 표적 DNA 서열들로서 사용되었다. 상기 프로모터 서열들을 스캐닝하여 9개 뉴클레오티드의 길이로 징크 핑거 도메인들의 이용가능한 집합이 제공된 키메라 3-핑거 단백질들에 의해 인식될 허용가능한 표적부위들인 단편들을 동정하였다. 일단 동정되면, 키메라 3-핑거 단백질들을 코딩하는 핵산을 제작하였다. 이 접근방식을 "표적부위-우선" 접근방식이라고 한다.

염기 접촉 잔기들의 2번 위치에 아스파르트산 잔기를 포함하는 징크 핑거 도메인들을 특별히 고려하여 분석하였다. 상기 징크 핑거 도메인들은 RDER1, RDHT, RDNR, RDKR, RDTN, TDKR 및 NDTR을 포함한다. DNA에 결합된 Zif268의 X-선 공동-결정 구조(X-ray co-crystal structure)는 2번 위치의 아스파르트산이 징크 핑거들에 의해 인식되는 3-bp 하위부위 밖의 한 염기와 수소결합을 형성할 수 있음을 보여준다. 그 결과, 2번 위치에 아스파르트산 잔기를 포함하는 RDER 핑거는 4-bp 부위를 선호한다: 5'-GCG(G/T)-3'. 상기 컴퓨터 알고리즘은 이러한 부가적인 특이성을 고려하였다. 2번 위치에 아스파르트산 잔기를 갖는 핑거를 포함하고 4-bp 부위에 대한 상기 규칙을 따르지 않는 무작위로 조립된 3-핑거 단백질들은 본 명세서에 기술된 다른 분석에서 제외하였다.

총 153개의 3-핑거 단백질들이 "징크 핑거 단백질-우선" 및 "표적부위-우선" 접근방식들에 의해 제조되었다. 이들 단백질들을 실시예 3에 기재된 일시적 공동-형질감염 분석법으로 검증하였다.

153개 키메라 징크 핑거 단백질들 중 31개가 높은 엄격성 기준인 2배 억제(RF 2; RF=억제 배수) 이상을 나타내었다. 전적으로 자연형 인간 징크 핑거 도메인들로만 제작된 단백질들의 경우, 28.1%(96개중 27개)가 높은 엄격성 기준을 통과하였고, 59.4%는 낮은 엄격성 기준(RF 1.5)을 통과하였다. 두개의 자연형 인간 징크 핑거 도메인들과 한 개의 돌연변이 도메인으로 제작된 단백질들 중에서는, 33.3%가 높은 엄격성 기준을 통과하였고, 20%만이 낮은 엄격성 기준을 통과하였다.

대조적으로, 한 개의 인간 도메인과 두 개의 돌연변이 도메인으로 제작된 17개의 단백질들의 경우에는 한 개의 단백질(5.9%)만이 높은 엄격성 기준을 통과하였고, 두 개의 단백질(11.8%)만이 낮은 엄격성 기준을 통과하였다. 놀랍게도, 전적으로 돌연변이 도메인들만으로 구성된 징크 핑거 단백질들 중 어느 것도 억제 분석법에서 높은 엄격성 기준을 만족시키지 못했다. 그러한 단백질들 중 한 개(4%)만이 낮은 엄격성 기준을 만족시켰다. 이 결과들은 자연형 인간 징크 핑거 도메인들이 돌연변이 도메인들보다 새로운 DNA-결합 단백질들의 제조에 훨씬 우수한 빌딩 블록임을 나타내는 것이다.

실시예 6: VEGF-A 유전자에 결합하는 키메라 징크 핑거 단백질들의 고안

본 실시예에서, 본 발명자들은 인간 혈관 내피 성장인자 A(VEGF-A) 유전자 내 DNA 구성요소에 결합하는 키메라 징크 핑거 단백질들을 고안하였다. VEGF-A 프로모터의 -950부터 +450 지역을 스캐닝하여 3-핑거 형태로 징크 핑거 도메인들의 이용가능한 조합에 의해 인식될 수 있는 9개 뉴클레오티드 부위들을 동정하였다.

본 발명자들은 이러한 9개 뉴클레오티드 부위들을 인식하도록 고안된 도메인들을 포함하는 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 수 개의 DNA 구조물들을 제작하였다. 상기 단백질들을 대장균에서 발현시킨 후 정제하였다. 본 발명자들은 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 실험을 통해 이들의 DNA 결합 특이성을 조사하였다. VEGF-A 프로모터를 표적으로 고안된 많은 징크 핑거 단백질들은 예상되는 DNA 결합 특이성을 나타내었다. SELEX 분석에 의해 얻어진 거의 모든 보존적인 서열들은 VEGF-A 유전자 내 의도된 표적서열들과 동일하였다. 한 개의 예시적인 징크 핑거 단백질로 F121은 이에 상응하는 징크 핑거가 염기 인식에 있어 축중(degeneracy)을 나타내는 위치에서의 염기 한 개가 의도된 표적서열과 다른 보존적인 서열을 나타내었다.

이러한 인공적인 징크 핑거들로 구성된 DNA 결합 도메인을 포함하는 전사인자들은 세 개의 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 핵산을 p65 또는 VP16 활성 도메인을 코딩하는 핵산에 융합시켜 제조하였다. 그 결과로 생성된 핵산을 발현 플라스미드에 삽입하였다.

도 4는 이러한 키메라 징크 핑거 단백질들에 의해 인식되는 VEGF-A 프로모터 내 DNA 결합 부위들의 위치들을 나타낸 것이다. 인간 VEGF-A 프로모터는 적어도 두 개의 DNase I-과민성 지역들(hypersensitive regions)을 포함한다. 이들 부위들에 대한 조작된 징크 핑거 단백질 전사인자들의 결합은 VEGF-A 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. F480은 약 -633R("R"은 역방향 가닥을 의미함)에서 결합부위를 인식하도록 고안되었다. F475는 약 -455에서 결합부위를 인식하도록 고안되었다. F435는 약 -391R과 -90R에서 결합부위를 인식하도록 고안되었다. F83은 약 +359에서 결합부위를 인식하도록 고안되었다. F121은 약 +434에서 결합부위를 인식하도록 고안되었다.

본 발명자들은 결합부위의 위치에 상관없이, 조사된 4개의 징크 핑거 단백질들(F480, F475, F121 및 F435)이 VEGF 프로모터의 조절하에서 루시퍼라제 리포터 유전자뿐만 아니라 내생적 VEGF-A 유전자 자체도 활성화시킴을 발견하였다. 일시적으로 형질감염된 세포들의 배지를 이용한 ELISA는 이들 키메라 징크 핑거 단백질들이 또한 VEGF-A 단백질의 생산을 상향-조절(up-regulation)하여 13 내지 21배 증가시킴을 나타내었다.

두 개의 키메라 징크 핑거 단백질들, F435와 F121을 각각 KRAB 억제 도메인에 융합시키면, 이들은 각각 HEK 293 세포에서 VEGF-A 발현을 활발하게 억제하였다. 어떠한 징크 핑거 단백질 암호화 서열도 포함하지 않는 모발현벡터로 형질감염된 대조군 세포들은 VEGF-A mRNA 또는 단백질 수준에서 어떠한 증감도 나타나지 않았다.

단백질 F83은 상기 분석에서 VEGF-A mRNA 또는 단백질의 수준에 아무런 효과도 나타내지 않았다. 이는 표적부위 또는 국소적 염색질 구조에 어떤 다른 단백질의 결합에 기인한 것으로 보이고, 이러한 결합은 표적 DNA가 징크 핑거 단백질에 접근하지 못하게 만든다. 이들 징크 핑거 단백질들에 의한 VEGF-A의 발현수준과 이들의 DNA-결합 친화력 또는 이들의 세포내 발현수준 사이에는 어떠한 절대적인 상관관계도 없었다.

게놈 전체(genome-whole scale)에 대한 징크 핑거 단백질들의 특이성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 하기 세 종류의 징크 핑거 전사인자들 중 어느 하나를 코딩하는 DNA 구조물들로 안정적으로 형질감염된 293 세포들을 대상으로 DNA 마이크로어레이(microarray) 실험을 수행하였다: F121-p65, F435-p65 및 F475-VP1. 7458개 유전자들 중 51개가 3종의 징크 핑거 전사활성 단백질들 모두에 의해 조절되었다. 49개가 2배 이상 상향-조절되었고, 2개는 2배 이상 하향-조절되었다. 이러한 동시-조절된 유전자들 대부분이 VEGF-A 기능과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보인다. 이들 중 다수가 VEGF-A에 의해서 조절되고, 혈관생성(angiogenesis) 또는 저산소증(hypoxia)에 관여하거나, 혈관 내피세포들에서 발현된다. 따라서, 이들 유전자들은 VEGF-A 발현의 하류 표적들인 것으로 보인다. 또한, 수많은 다른 유전자들이 검증된 세 개의 단백질들 모두에 의해서가 아니라 한 개 또는 두 개의 징크 핑거 단백질 활성제들(activators)에 의해 조절되었다. 이들 징크 핑거 단백질들은 9-bp 부위를 인식하므로, 이들 징크 핑거 단백질들이 예를 들면, 다른 유전자들 내 동일하거나 관련된 표적부위들에 결합함으로써 VEGF-A 이외의 다른 유전자들을 직접적으로 조절하는 것이 가능하다. 4, 5 또는 6-핑거 단백질들의 제작은 특이성을 향상시킬 것이다. 종합하면, 상기 결과들은 자연형 징크 핑거 도메인들의 셔플링(shuffling)에 의해 조립된 상기에 기재된 징크 핑거 단백질들이 세포 내에서 특이적인 내생 유전자들의 전사 조절자로 작용함을 나타내는 것이다.

예를 들면, 본 명세서에 기재된 단백질은 하기의 유전자들 중 하나 이상을 조절할 것이다: jun B 원발암유전자(proto-oncogene)(N94468), EphA2(H84481), EphB4(AI261660), 섬유아세포 성장인자 수용체 3(fibroblast growth factor receptor 3)(연골무형성[achondroplasia], 싸나토포릭 골격이형성증[thanatophoric dwarfism])(AA419620), FK506-결합 단백질 8(38 kD)(N95418), 단백질 키나제 C, 제타(zeta)(AA458993), v-erb-b2 조류 적혈구성 빈혈 바이러스 발암유전자 동족체 3(avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3)(AA664212), 렉틴(lectin), 갈락토사이드-결합(galactoside-binding), 수용성, 1(갈렉틴[galectin] 1)(AI927284), 단백질 포스파타제 2(protein phosphatase 2), 조절성 서브유닛 B(regulatory subunit B)(B56), 알파 아이소형(alpha isoform)(R59165), 인슐린-유사 성장인자 2(insulin-like growth factor 2)(소마토네딘 A[somatomedin A])(N54596), 플렉틴 1(plectin 1), 중간 미세섬유 결합 단백질(intermediate filament binding protein), 500 kD(AA448400), 페리플라킨(Periplakin)(AI703487), 콜린 키나제(choline kinase)(H09959), 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 1(H99676), 어댑터-관련 단백질 복합체 1(adaptor-related protein complex 1), 시그마 1 서브유닛(sigma 1 subunit)(W44558), 어레스틴(arrestin), 베타 2(AW009594), GATA-결합 단백질 2(H00625), 사이클린-의존성 키나제 억제제 1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)(p21, Cip1)(AI952615), 미토겐-활성 단백질 키나제 키나제 키나제 11(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11)(R80779), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase)(YT 혈액군)(AI360141), 뇌-특이적 Na-의존성 무기 인산염 동시전달자(brain-specific Na-dependent inorganic phosphate cotransporter)(AA702627), 세포성 레티노산-결합 단백질 1(cellular retinoic acid-binding protein 1)(AA454702), 세포성 레티노산-결합 단백질 2(AA598508), 캐드헤린 13(cadherin 13), H-캐드헤린(심장)(R41787), 칼슘 채널, 전압-의존성, 베타 3 서브유닛(calcium channel, voltage-dependent, beta 3 subunit)(R36947), 탄산탈수효소 XI(carbonic anhydrase XI)(N52089), 트로포닌 T1(troponin T1), 골격, 저속(slow)(AA868929), 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid, GABA) B 수용체, 1(N70841), 아데닐레이트 사이클라제 활성 폴리펩티드 1(adenylate cyclase activating polypeptide 1)(뇌하수체) 수용체 타입 I(H09078), 용질 수송체 패밀리 4(solute carrier family 4),음이온 교환체(anion exchanger), 멤버 2(적혈구 막 단백질 밴드-3 유사 1[erythrocyte membrane protein band 3-like 1])(W45518), 글라이피칸 1(glypican 1)(AA455896), 단백질 C 억제제(플라스미노겐 활성제 억제제 Ⅲ[plasminogen activator inhibitor Ⅲ])(W86431), 사이클린-의존성 키나제 억제제 1C(p57, Kip2)(AI828088), 징크 핑거 단백질 43(HTF6)(AA773894), 마우스에서 Zfp-36의 징크 핑거 단백질 동족체(R38383), 메이스(Meis)(마우스) 동족체 3(AA703449), SWI/SNF 관련, 기질 연합(matrix associated), 크로마틴(chromatin)의 액틴 의존성 조절자, 서브패밀리 d, 멤버 3(AA053810), 미상(R11526), 미상(AA045731), 미상(T51849), 미상(T50498), 잠정적 유전자 산물(putative gene product)(H09111), B/K 단백질(H23265), 손상-특이적 DNA 결합 단백질 2(48 kD)(AA410404), 디하이드로피리미디나제-유사 4(dihydropyrimidinase-like 4)(AA757754), N-메틸퓨린-DNA-글라이코실라제(N-methylpurine-DNA glycosylase)(N26769), 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, N(R45941), 다발형성 및 연장 단백질 제타 1(fasciculation and elongation protein zeta 1)(zygin I)(H20759), 라노스테롤 합성제(lanosterol synthase)(2,3-옥시도스쿠알렌-라노스테롤 사이클라제[2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase])(AA437389), 스퍼미딘/스퍼민 N1-아세틸전이효소(spermidine/spermine N1-acetyltransferase)(AA011215), 및 트롬보스폰딘 타입 1 모티프(thrombospondin type 1 motif)를 갖는 디스인테그린-유사 및 금속단백분해효소(disintegrin-like and metalloprotease)(레프로라이신 타입[reprolysin type]), 1(T41173). 상기 단백질들 또는 이들을 코딩하는 유전자들의 발현은 적어도 0.5, 1.0, 2, 5, 10 또는 50배, 예를 들면 2 내지 80배 정도 조절될 수 있다.

VEGF-A 프로모터 내 예시적 부위들 및 이들을 인식할 수 있는 단백질들은 하기를 포함한다:

징크 핑거 라이브러리를 위한 효모 발현 플라스미드의 제작

본 발명자들은 pPC86(Chevray and Nathans (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793)의 변형에 의해 징크 핑거 전사인자를 코딩하는 발현 플라스미드를 제작하였다. Zif268 징크 핑거 단백질을 코딩하는 유전자를 pPC86의 SalI 및 EcoRI 절단부위 사이에 삽입하여 Gal4 활성 도메인이 Zif268 도메인에 융합되어 있는 pPCFM-Zif를 제조하였다. pPCFM-Zif를 징크 핑거 라이브러리를 제조하기 위한 벡터로 사용하였다. 인간 징크 핑거 라이브러리를 제조하기 위해, 징크 핑거들을 코딩하는 DNA 단편들을 중합효소연쇄반응(PCR)(Promega, Madison, WI)과 자연형 징크 핑거 단백질들 내 징크 핑거들 사이의 연접부(junction)에서 빈번하게 발견되는 서열 His-Thr-Gly-Glu/Gln-Lys/Arg-Pro-Tyr/Phe를 갖는 변성(degenerate) PCR 프라이머들의 혼합물을 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 징크 핑거들을 코딩하는 100-bp PCR 산물들을 SacⅡ 및 AvaI으로 절단한 후 pPCFM-Zif에 삽입하였는데, 상기 PCR 산물들은 Zif268의 핑거 1 및 2와 인간 게놈으로부터 유래된 징크 핑거 도메인(함께 3-핑거 단백질을 구성함)으로 구성된 혼성화(hybrid) 전사인자들을 암호화한다. 상기 플라스미드 라이브러리는 총 1.2×10⁶ 대장균 형질전환체들로부터 제조되었다.

리포터 플라스미드들은 세 카피(copy)의 9-bp 표적서열을 포함하는 64쌍의 상보적인 올리고뉴클레오티드들 중 어느 하나를 pRS315(His) 및 pLacZi(Clontech, Palo Alto, CA)에 삽입하여 제조되었다.

인간 게놈으로부터 선택된 인간 징크 핑거 도메인들의 틈새 복구 클로닝

개별적 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 DNA 서열들의 틈새 복구 클로닝(gap repair cloning)은 문헌에 기술된 바에 따라 수행하였다(Hudson 등 (1997) Genome Res. 7:1169-1173). 징크 핑거 도메인을 코딩하는 하나의 DNA 단편을 클로닝하기 위해, 두 개의 중첩(overlapping) 올리고뉴클레오티드들을 합성하였다. 각 올리고뉴클레오티드는 개별적 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 어닐링할 수 있는 특정 서열뿐만 아니라 PCR의 두 번째 반응을 위해 그의 3'-말단에 21-bp 공통 꼬리(common tail)를 포함한다. 징크 핑거들을 코딩하는 DNA 서열들은 동일한 몰농도로 혼합된 두 개의 상응하는 올리고뉴클레오티드들의 혼합물을 이용하여 인간 게놈 DNA로부터 증폭되었다.

PCR 초기반응으로부터 증폭된 산물들을 두 번째 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 두 번째 PCR 반응을 위한 프라이머들은 두 개의 지역을 갖는데, 하나는 pPCFM-Zif의 단편과 동일하고, 다른 하나는 21-bp 공통 꼬리와 동일하다. 두 번째 PCR 반응 산물들의 혼합물과 MscI 및 EcoRI으로 절단되어 선형화된 pPCFM-Zif를 yW1(MATα △gal4 △gal80 lys2801 his3-△200 trp1-△63 leu2 ade2-101CYH2) 효모 균주에 형질전환시켰다. 이 방법에 의해 총 823개의 인간 징크 핑거들이 클로닝되었다. 많은 클론들이 본 명세서에 기재된 생체 내 선별 방법에 사용되었다.

징크 핑거 도메인들의 생체 내 선별

효모 교잡법(yeast mating)은 3-bp 표적부위 각각에 결합하는 징크 핑거들의 동정을 용이하게 하기 위하여 사용되었다. 징크 핑거 라이브러리를 yW1(MATα) 균주에 도입하였고, 이로부터 ∼1.47×10⁶개의 개별적 형질전환 효모 클론들을 얻었다. 이들 형질전환 세포들의 분액(aliquot)들을 반수체 효모 균주 yW1(MATα)와 30℃에서 5시간 동안 교잡시켰는데, 상기 형질전환 세포들은 두 셋트 각각에 64개의 리포터 플라스미드들을 포함하고 있다(리포터 유전자들 각각에 대해 하나씩). 상기 리포터 플라스미드들은 LacZ 또는 HIS3 유전자의 코딩지역들에 인접한 세 카피수의 표적 DNA 서열들을 포함하고 있다. 이로부터 얻은 반수체들을 X-gal(40 ㎍/㎖) 및 3-아미노 트리아졸(3-amino triazole, 3-AT)(1 mM)을 포함하지만 히스티딘(histidin)이 결핍된 선택 배지에 도말하였다. 파란색(양성) 콜로니들로부터 분리된 플라스미드들을 상기 결과를 확인하기 위하여 다시 형질전환시키고 염기서열을 분석하여 이들의 코딩 징크 핑거 도메인들을 동정하였다. Zif268의 핑거 1 및 2에 융합된 징크 핑거 각각의 결합 친화력 및 특이성을 효모 내에서 EMSA를 이용하여 결정하였다. 이들 방법들은 하기에 설명된다.

모듈 빌딩블록(modular building block)으로서 선별된 징크 핑거들을 이용한 3-핑거 단백질들의 제조

pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA) 벡터의 변형체 벡터(P3)를 포유류 세포에서 징크 핑거 단백질들을 발현시키기 위한 모벡터로 사용하였다. P3은 HA 태그 및 핵 위치 신호를 포함하는데, 이들 모두 개시코돈의 3'-말단에 삽입되었다. 개별 징크 핑거 도메인들을 코딩하는 DNA 단편들을 P3 벡터의 EcoRI 및 NotI 절단부위 사이에 서브클로닝하였고, 이로부터 얻은 플라스미드들을 키메라 징크 핑거 단백질의 제조를 위한 출발물질로 사용하였다. 새로운 3-핑거 단백질들은 두 개의 다른 방법들에 의해 제조되었다. 첫 번째 방법에서는, 모든 징크 핑거들을 혼합하고, 조립된 3-핑거 구조물들을 이후의 분석을 위해 무작위로 선발하였다. 두 번째 방법에서는, 새로운 3-핑거 단백질들을 특이적인 DNA 서열들을 표적으로 하여 고안하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 징크 핑거들의 인식부위들과 표적 DNA 서열들간의 조합(match)을 찾아내는 간단한 컴퓨터 알고리즘을 이용하였다. 본 발명자들은 입력 DNA 서열들로서 공지된 유전자들의 프로모터 서열들을 사용하였고, 상기 입력 서열들 내에서 9-bp DNA 단편들에 결합하는 3-핑거 단백질들을 동정하였다.

VEGF-A 유전자를 표적으로 하는 징크 핑거 단백질들이 이 방법에 의해 제조되었다. 이와 같이 제조된 징크 핑거 단백질들을 이전에 기술된 방법에 따라 포유류 세포에서 이들의 DNA 결합력 및 친화력을 조사하였다(Kim 및 Pabo (1997) J. Biol. Chem. 272: 29795-29800; Kim 및 Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2812-2817; 및 Kang 및 Kim (2000) J. Biol. Chem. 275: 8742-8748). 상기 분석을 위한 리포터 플라스미드는 리포터로서 개똥벌레 루시퍼라제 유전자를 갖는 pGL3-TATA/Inr을 사용하여 제작되었다.

징크 핑거 단백질들에 기능적 도메인들을 연결하기 위하여, p65(아미노산 288-548) 및 VP16(아미노산 413-490)의 전사 활성 도메인을 특정 올리고머 쌍을 이용한 PCR을 통해 증폭하였고, p65 및 VP16의 PCR 산물들을 각각 P3에 클로닝하여 pLFD-p65 및 pLFD-VP16를 제조하였다. VEGF-A 프로모터를 표적으로 하는 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 핵산들을 pLFD-p65 또는 VP16에 삽입하여 징크 핑거 단백질-활성 도메인(AD) 융합 단백질(ZFD-AD)을 발현시켰다. 실시간 PCR, ELISA 및 마이크로 어레이 분석법들을 수행하여 이들 ZFP-ADs가 VEGF-A 유전자를 활성화시키는지 여부를 결정하였다. 또한, 상기 단백질들이 적절한 표적 DNA 서열들을 인식하는지 여부를 조사하기 위하여 SELEX를 수행하였다. 하기를 참조하라.

인간 징크 핑거 도메인들의 결합 친화력 및 특이성

파란색 효모 콜로니들로부터 분리된 플라스미드들("징크 핑거 도메인들의 생체 내 선별" 항목 참고)을 개별적으로 yW1 세포내로 재-형질전환시켰다. 각각의 분리된 플라스미드에 대하여, 재-형질전환된 yW1 세포들을 64개의 LacZ 리포터 플라스미드 각각을 포함하는 yW1a 세포와 교잡시켰다. 이로부터 얻은 세포들을 X-gal과 히스티딘은 포함하지만 트립토판과 우라실은 결핍된 최소배지 위에 도말하였다. GEL-DOC^TM 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여, 콜로니들 각각에 대한 파란색의 강도를 측정하여 Zif268의 핑거 1 및 2에 융합된 징크 핑거 도메인들 각각의 DNA 결합 친화력 및 특이성을 결정하였다. Zif268 단백질을 이용한 대조군 실험들은 징크 핑거 도메인과 LacZ 리포터의 프로모터 내 표적 결합부위 사이의 양성 상호작용들이 짙은 파란색부터 흐린 파란색의 콜로니들을 생산하고, 이들간의 음성 상호작용들이 흰색의 콜로니들을 생산함을 나타내었다.

전기영동 이동 검정법(electrophoretic mobility shift assay; EMSA)

징크 핑거 단백질들을 코딩하는 DNA 단편들을 SalI 및 NotI 처리에 의해 분리한 후 pGEX-4T2(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 삽입하였다. 징크 핑거 단백질들을 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST)가 연결된 융합 단백질 형태로 대장균 BL21(DE3) 균주에서 발현시켰다. 상기 융합 단백질들을 글루타치온 친화 크로마토그래피(glutathione affinity chromatography, Amersham Pharmacia)을 이용하여 정제한 후, 트롬빈으로 절단하였다. 이러한 절단과정이 GST 잔기와 징크 핑거 단백질들간의 연결을 제공한다. 이 경우에, 정제된 징크 핑거 단백질들은 C-말단의 위치 3에서 선별된 징크 핑거들에 융합된 Zif268의 핑거 1 및 2를 포함한다. DNA 탐침들을 합성하고, 어닐링하고, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(T4 polynucleotide kinase)를 이용하여 ³²P로 표지한 후 문헌에 기재된 대로 EMSA를 수행하였다(Kim 및 Pabo (1997) J. Biol. Chem. 272:29795-29800, 및 Kim 및 Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-2817). 상기와 동일한 과정이 다른 징크 핑거 단백질들을 검증하기 위해 사용될 수 있다.

내생 VEGF의 전사적 조절

인간 배아 신장 293 세포들을 100 단위/㎖ 페니실린, 100 g/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에서 유지하였다. 루시퍼라제 분석을 위해, 상기 세포들을 10⁴ 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에서 미리 배양하였다. 리포펙타민 형질감염 킷트(LIPOFECTAMINE^TM transfection kit, Life Technologies, Rockville, MD)를 사용하여, 293 세포들을 천연형의 VEGF 프로모터가 pGL3-basic(Promega) 내 루시퍼라제 유전자에 융합된 리포터 플라스미드 25 ng과 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드 25 ng으로 형질감염시켰다. 48시간 동안 배양한 후, 루시퍼라제 활성을 TD-20/20 조도계(luminometer, Turner Designs Inc., Sunnyvale, CA)를 이용하여 이중 루시퍼라제 분석 킷트(DUAL LUCIFERASE^TM assay kit, Promega)로 측정하였다.

역전사효소-PCR(RT-PCR) 및 ELISA 분석을 위하여, 상기 세포들을 10⁵ 세포/웰의 농도로 12-웰 배양 플레이트에서 1 ㎖의 배양 배지(항생제가 없는 10% FBS 함유 배지)에 접종한 후 37℃, 5% CO₂를 포함하는 습성 공기하에서 24시간 동안 미리 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 리포펙타민 형질감염 킷트(Life Technologies)를 이용하여 DNA로 형질감염시켰다. 간단히 설명하면, 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드 1 ㎍을 5 ㎕ 플러스 시약(plus reagent)을 함유하는 50 ㎕의 DMEM에 첨가한 후, 상기 용액을 2 ㎕의 리포펙타민 시약을 포함하는 50 ㎕의 DMEM과 혼합하였다. 15분간 배양한 후, 총 100 ㎕ 혼합물들을 배양 플레이트 내 세포들에 첨가하였고, 상기 세포들을 48시간 동안 더 배양하여 성장시켰다. 세포들과 배양 상등액들을 RT-PCR 및 ELISA 분석을 위해 수확하였다.

정량적 RT-PCR

총 세포성 RNA를 제조사의 지침에 따라 트리졸-용해질(TRIZOL^TM-lysates, Life Technologies)을 이용하여 추출하였다. mRNA에 대한 제1 가닥 합성 프라이머로서 올리고-dT와 슈퍼스크립트 제1-가닥 합성 시스템(SUPERSCRIPT^TM first-strand synthesis system, Life Technologies)에서 제공되는 MMLV 역전사효소를 사용하여 4 ㎍의 총 RNA에 대해 역전사 반응을 수행하였다. mRNA 정량분석을 위하여, RT 반응으로부터 형성된 1 ㎕의 제1-가닥 cDNAs를 VEGF-A 특이적 프라이머들을 사용하여 증폭시켰다. RNA의 초기량을 GAPDH 특이적 프라이머를 이용한 특이적 증폭에 의해 계산된 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA 농도로 보정하였다. VEGF-A 및 GAPDH-특이적인 cDNAs의 증폭을 QUANTITECT SYBR^TM 킷트(QIAGEN, Valencia, CA) 및 ROTORGENE^TM 2000 실시간 증폭기(Corbett, Sydney, Australia)를 이용하여 실시간으로 분석하였고, 상기 반응에 포함된 표준시료들의 연속 희석법(serial dilution)을 이용하여 정량하였다.

ELISA

신장 293 세포 배양 상등액들을 5분간 간단히 원심분리하여 세포와 세포 찌꺼기를 제거하였다. 배양 배지에 축적된 VEGF 단백질(각각 100 ㎕)과 재조합 VEGF-A 단백질 표준시료들의 희석액들을 샌드위치 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용하여 분석하였는데, 상기 ELISA에서 배양 상등액을 항-인간 VEGF 항체(R&D systems; AF-293-NA), 바이오틴화(biotinylated) 항-인간 VEGF 항체(R&D systems; BAF293) 및 스트렙타비딘 알칼라인 포스파타제(streptavidin alkaline phosphatase)와 반응시켰다. 항원-항체 복합체를 pNPP 완충용액(Chemicon; ES011)에 용해된 pNPP(p-Nitrophenyl phosphate)와 반응시켰다. 시료내 VEGF-A 농도를 POWERWAVE^TM X340(Bio-TEK Instrument Inc., Winooski VT)을 이용하여 405 ㎚에서 측정하였다.

안정적으로 징크 핑거 단백질들을 발현하는 FlpTRex-293 세포주의 DNA 마이크로어레이 분석

VEGF-A 프로모터를 표적으로 하여 고안된 ZPFs를 코딩하는 플라스미드들을 제조사의 지침에 따라 FlpTRex-293 세포주(Invitrogen)에 안정적으로 도입하였다. 간략히 설명하면, 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 DNA 단편들을 포함하는 pLFD-p65 또는 pLFD-VP16 벡터로부터 얻은 HindⅢ-XhoI 단편을 pCDNA5/FRT/TO(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 이로부터 생성된 플라스미드들을 pOG44(Invitrogen)와 함께 FlpTRex-293 세포내로 동시-형질감염시킨 후 안정적 삽입체(integrant)를 스크리닝하였다. 이로부터 생성된 세포주들은 독시사이클린(doxycycline) 유도에 의해 ZFP-p65 또는 ZFP-VP16을 발현한다.

7458개의 인간 발현된 서열 태그(expressed sequence tag, EST) 클론들을 포함하는 DNA 마이크로어레이는 Genomic Tree, Inc.(Taejon, Korea)로부터 제공받았다. ZFP-p65 또는 ZFP-VP16을 안정적으로 발현하는 FlpTRex-293 세포들을 48시간 동안 1 ㎍/㎖의 독시사이클린 처리(+Dox) 혹은 비처리(-Dox) 상태에서 배양하였다. 총 RNA를 각각의 시료로부터 분리하였다. -Dox 시료로부터 분리한 RNA를 대조군(Cy3)으로 사용하였다. 마이크로어레이 실험은 제조 회사의 지침에 따라 수행하였다.

조합된 징크 핑거 단백질들의 SELEX

주형 올리고뉴클레오티드는 그의 양 말단에서 불변 서열들(invariant sequences)에 인접하는 무작위 20-뉴클레오티드 지역을 포함하도록 고안되었다. 또한, 상기 주형 올리고뉴클레오티드의 불변 지역들에 상보적인 두 개의 프라이머들을 PCR 증폭을 위해 고안하였다. 상기 주형 올리고뉴클레오티드는 프라이머들 중 하나로부터의 클레노우 단편 확장(Klenow fragment extension)에 의해 이중-가닥 DNA로 전환되었다. 징크 핑거 단백질에 의해 결합된 표적서열들의 증폭을 위하여, 100 ㎍의 GST-융합 단백질들을 100 ㎕ 결합 완충용액(25 mM Hepes pH 7.9, 40 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 상에서 10 pmol의 이중-가닥 DNA와 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. GST-수지(10 ㎕)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후, 상기 수지를 2.5% 탈지유를 포함하는 결합 완충용액으로 3회 세척하였다.

상기 수지를 실온에서 10분간 1 M KCl 100 ㎕와 반응시켜 결합된 이중-가닥 주형 올리고머들을 수지로부터 분리하였다. 회수된 이중-가닥 주형 올리고머들의 PCR 증폭 후, SELEX의 새로운 반응을 반복하였다. 이 과정을 8번 반복하였다. 최종 PCR 산물을 XbaI 및 BamHI으로 절단한 후 동일한 제한효소로 처리된 pBLUESCRIPT^TM KS에 삽입하였다. 징크 핑거 단백질당 적어도 8개의 개별적 삽입체(insert)들의 DNA 서열들을 결정하였다.

실시예 7: 대표적인 단백질들의 서열

하기는 VEGF-A를 조절할 수 있는 대표적인 단백질들의 DNA 결합지역들의 아미노산 서열들이다.

폴리펩티드, 예를 들면 상기에 기재된 서열을 포함하는 폴리펩티드는 또한 태그(예를 들면, HA 태그), NLS, 링커 및 조절 도메인(예를 들면, 활성 또는 억제 도메인)을 포함한다. 이들 구성요소들은 N-말단부터 C-말단으로 어떠한 순서에 의해서도 배열될 수 있다. 한 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 하기와 같이 배열된다: HA 태그-NLS-PGEKP-DNA 결합 도메인(예를 들면, 상기에서 기재된 서열)-AAA-p65. 또는 보다 구체적으로는 다음과 같다:

MVYPYDVPDYAELPPKKKRKVGIRIPGEKP-DNA_BINDING_DOMAIN-AAA-p65; (DNA 결합 도메인에 대한 선도 N-말단(leader N-terminal)은 서열번호: 126이다)

● YPYDVPDYA(서열번호: 126의 3 내지 12)는 예시적인 태그이다(여기서는 HA-태그)

● PPKKKRKV(서열번호: 126의 15 내지 21)는 예시적인 NLS이다(핵 위치 신호)

● "ZFP"는 징크 핑거 도메인들의 정렬이다.

다른 실시예에서는, 상기 폴리펩티드가 DNA 결합 도메인 및 억제 도메인, 예를 들면 KRAB 또는 KOX 도메인을 포함한다.

본 실시예에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은, 예를 들면 원핵생물에서의 발현에 유용한(예를 들면, 최적화된) 코돈들, 진핵생물에서의 발현에 유용한(예를 들면, 최적화된) 코돈들, 또는 상응하는 자연형 도메인들을 코딩하는 코돈들과 같은 코돈들의 어떠한 선택에 의해서도 생산될 수 있다.

하기 결과들은 다수의 징크 핑거가 VEGF-A 생산을 활성화시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 8: 봉입된 세포에 의한 VEGF-A 생산

독시사이클린-유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 F435-p65 징크 핑거 단백질을 코딩하는 코딩 지역을 포함하는 핵산 구조물을 Flp-T-Rex 세포내로 안정적으로 형질감염시켰다.

ZFP-TFs를 안정적으로 발현하는 인간 배아 신장(HEK) 세포주들을 하기에 따라 제조하였다: ZFP-TFs를 코딩하는 플라스미드들을 제조사의 지침에 따라 FlpTRex-293 세포주에 안정적으로 도입하였다. 간단히 설명하면, ZFP-TFs를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 pLFD-p65 벡터들로부터 얻은 HindⅢ/XhoI 절편을 pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 이로부터 생성된 플라스미드들을 pOG44(Invitrogen)와 함께 Flp-In^TM TRex^TM-293 세포내로 동시-형질감염시켜 부위-특이적인 통합(site-specific integration)을 유도하였다. 그 후에 안정적 삽입체 or 통합체(integrant)를 스크리닝하였다. 이로부터 생성된 세포주들은 배양 배지에 독시사이클린 (1 ㎍/㎖)을 첨가한 상태에서 조건부로 징크 핑거 단백질을 발현하였다. F435-p65를 안정적으로 발현하는 세포들을 고정하기 위해, 소듐 알지네이트(Sigma)를 최종 농도가 1%(wt/v)가 되도록 PBS에 용해시키고, 10⁶ 세포/㎖의 최종 밀도로 세포들과 조심스럽게 혼합하였다. 상기 세포 현탁액을 CaCl₂(100 mM) 용액에 적가하여 15분간 세포 피막들(capsules)을 응고시킨 후 PBS로 세척하였다. 봉입된 세포들을 배양용 배지에 첨가하였다. 1 ㎍/㎖의 독시사이클린을 첨가하여 발현을 유도하였고 봉입된 세포로부터 생산된 VEGF-A의 양을 측정하였다. F435-p65를 이용한 일 실시예에서, 독시사이클린의 존재하에 성장한 세포들(세포주 #151)은 2일 경과 후에는 적어도 600 pg/㎖, 3일 경과 후에는 적어도 4000 pg/㎖, 4일 경과 후에는 적어도 5000 pg/㎖, 5일 경과 후에는 적어도 5300 pg/㎖의 VEGF-A를 생산하였다. VEGF-A 생산은 F435-p65 징크 핑거 단백질을 포함하지 않은 대조군 또는 독시사이클린을 첨가하지 않은 상태에서 성장한 세포들에 비하여 적어도 5, 10, 50 또는 100배 이상 높게 나타났다.

실시예 9: 인간 VEGF-A 발현을 위한 세포-기반 분석

3×10⁴ HEK 293T 세포들을 폴리라이신(Biocoat)으로 코팅된 96-배양 플레이트에서 100 ㎍의 pLFD-4F-p65 플라스미드 각각으로 형질감염시켰다. 형질감염시키고 48시간 경과 후에 배양 상등액을 수확하여 사용하기 전까지 즉시 -80℃에 보관하였다. 형질감염 효율은 X-gal 염색에 의해 100 ng의 LacZ로 형질감염된 각 플레이트의 웰에서 측정하였다. 각 실험에서 계산된 형질감염 효율은 70 내지 80% 범위에서 다양하였다.

VEGF-A의 생산은 샌드위치 ELISA에 의해 분비된 VEGF-A 단백질을 측정하여 분석하였다. 포획 항체(capture antibody, AF-293-NA)와 바이오틴화 검출 항체(detection antibody, BAF293)는 R&D 시스템스(Systems)사로부터, 스트렙타비딘-AP(SA110)와 기질 완충용액(ES011)은 케미콘(Chemicon)사로부터, 기질 pNPP(N9389)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)사로부터 구입하였다. ELISA 분석과정은 자동화된 워크스테이션(workstation)(GENESIS RSP 150, TECA)으로 수행되었다. 405 ㎚에서 광학 밀도(OD)를 측정하였고(POWERWAVE^TM X340, BioTek Instrument Inc.), VEGF-A의 양은 연속적으로 희석된 재조합 인간 VEGF-A 단백질(R&D Systems)의 OD 값들로부터 얻어진 표준곡선으로부터 계산하였다. 상대적인 VEGF-A 생산은 pLFD-4F-p65의 개별적인 형질감염 배양액으로부터 얻은 VEGF-A 농도를 모벡터 p3으로 형질감염된 배양액으로부터 얻은 VEGF-A 농도로 보정하여 계산하였다.

실시예 10: 인간 VEGF-A 발현을 위한 세포-기반 분석

징크 핑거 단백질 F121은 인간 VEGF-A 유전자의 전사개시부위로부터 약 +434 뉴클레오티드 위치에 인간 VEGF 프로부터의 9-bp 서열들이 결합하도록 고안된 3개의 인간 징크 핑거 도메인들로 구성되어 있다; F109는 인간 VEGF-A 유전자의 전사개시부위로부터 약 -536 뉴클레오티드 위치에 인간 VEGF 프로부터의 12-bp 서열들이 결합하도록 고안된 4개의 인간 징크 핑거 도메인들로 구성되어 있다; 그리고, F435는 인간 VEGF-A 유전자의 전사개시부위로부터 약 -90R 및 -391R 뉴클레오티드 위치(여기서, R은 역방향 가닥을 의미한다)에 인간 VEGF 프로부터의 9-bp 서열들이 결합하도록 고안된 3개의 인간 징크 핑거 도메인들로 구성되어 있다.

인간 VEGF 프로모터를 포함하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드들의 제조

천연형 인간 VEGF 프로모터 DNA(-950부터 +450 위치에서, 도 1a, 1b 및 1c에 나타난 전사개시서열에 비례하여 번호가 매겨짐)를 서열 특이적인 프라이머들을 이용하여 인간 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭한 후 플라스미드 pGL3(Promega, E1751)의 KpnI/XhoI 절단부위에 클로닝하고, 이로부터 생성된 플라스미드를 pGL3-VEGFprom(도 5b)으로 명명하였다.

징크 핑거 단백질에 의한 천연형 인간 VEGF 프로모터를 포함하는 루시퍼라제 리포터의 억제

293 세포들을 천연형 인간 VEGF 프로모터(전사개시부위로부터 -950 내지 +450)를 포함하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드 pGL3-VEGFprom과 30 ng의 pLFD-F121-KRAB 또는 pLFD-F109-KRAB로 형질감염시켰다. 루시퍼라제 활성은 전술한 바와 같이 측정하였다. 억제 배수 값들은 레닐라 루시퍼라제 활성에 대해서 개똥벌레 루시퍼라제 활성을 보정하여 계산하였고, 상기 결과를 대조군 벡터 pLFD 및 리포터 플라스미드로 293 세포들을 형질감염시켜 얻은 대조군의 값과 비교하였다.

F121-KRAB(30 ng) 및 F109-KRAB(30 ng)를 코딩하는 상기 플라스미드들은 각각 8.7배 및 6.1배 감소된 리포터 활성을 나타내었다.

ZFP-KRAB에 의한 내생 VEGF-A mRNA의 억제

ZFP 발현 플라스미드들을 인간 배아 신장 293F 세포들(Gibco Life Technologies)에 형질감염시켰다. 293F 세포들은 높은 형질감염율을 나타낸다.

293F 세포들을 24-웰 배양 플레이트에서 10% FBS를 함유하는 1 ㎖의 DMEM에 10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO₂를 포함하는 습성 공기하에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 LIPOFECTAMINE PLUS^TM(Life Technologies)를 사용하여 0, 200 또는 400 ng의 목적하는 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 만약 400 ng 이하의 징크 핑거 단백질 발현벡터가 사용되었다면, 모벡터를 첨가하여 총 DNA 양을 400 ng으로 조절하였다. 상기 세포들을 48시간 동안 더 배양하였다. 총 RNA를 TRIZOL® 시약(Gibco Life Technologies)을 이용하여 상기 세포들로부터 추출하였다.

VEGF mRNA의 정량은 하기의 실시간 RT-PCR에 의해 수행되었다.

제1-가닥 cDNA를 얻기 위하여, 4 ㎍의 총 RNA와 슈퍼스크립트 제1-가닥 합성 시스템(Gibco Life Technologies)으로부터 제공되는 mRNA에 대한 제1-가닥 합성 프라이머인 올리고-dT, dNTP 및 MMLV 역전사 효소를 이용하여 역전사 반응을 수행하였다. mRNA 양을 분석하기 위하여, 이로부터 얻은 제1-가닥 cDNA 1 ㎕를 VEGF-A cDNA 특이적인 프라이머들(정방향 프라이머 5'-CGGGGTACCCCCTCCCAGTCACTGACTAAC-3', 서열번호: 127 및 역방향 프라이머 5'-CCGCTCGAGTCCGGCGGTCACCCCCAAAAG-3', 서열번호: 128)을 사용하여 실시간 PCR로 증폭하였다. 이 방법은 초기 RNA 양에 민감하기 때문에, 초기 RNA 양을 GAPDH-특이적인 프라이머들을 이용한 특이적 증폭에 의해 계산된 GAPDH mRNA로 보정하였다. VEGF- 및 GAPDH-특이적인 cDNAs의 증폭은 QUANTITECT^TM SYBR 키트(QIAGEN, Valencia, CA)와 ROTORGENE^TM 2000 실시간 증폭기(Corbett, Sydney, Australia)를 이용하여 실시간으로 추적하고 분석하였으며, 증폭된 cDNAs는 상기 반응에 포함된 표준시료들의 연속 희석법에 의해 정량하였다.

징크 핑거 단백질들에 의한 VEGF-A mRNA 합성의 억제

내생적 VEGF-A mRNA의 발현은 비처리 대조군 세포에 비해 2.2배(54.5% 억제, 200 ng pLFD-F435-KRAB) 및 4.1배(75.6% 억제, 400 ng pLFD-F435-KRAB) 감소되었다. 이러한 결과들은 용량 의존적 효과를 나타내었다.

ZFP(F435-KRAB)에 의한 VEGF-A 단백질 생산의 억제

VEGF-A mRNA 발현의 억제가 VEGF-A 단백질 분비의 감소로 인한 것인지를 검증하기 위해, 293F 세포들(10⁴/96 웰 플레이트)을 0 내지 200 ng의 ZFP 발현 플라스미드들(pLFD-F435-KRAB)로 형질감염시킨 후 72시간 동안 배양하였다. 배양 배지(각 100 ㎕) 내에 축적된 VEGF 단백질과 재조합 인간 VEGF-A 단백질 표준시료의 희석액들을 샌드위치 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)로 분석하였는데, 상기 ELISA에서 배양 상등액을 항-인간 VEGF 항체(R&D systems; AF-293-NA), 바이오틴화 항-인간 VEGF 항체(R&D systems; BAF293) 및 스트렙타비딘-알칼라인 포스파타제와 반응시켰다. 항원-항체 복합체를 pNPP 완충용액(Chemicon, ES011)에 용해시킨 pNPP(p-Nitrophenyl phosphate)와 반응시켰다. 시료내 VEGF-A 농도는 POWERWAVE^TM X340(Bio-TEK Instrument Inc., Winooski VT)을 이용하여 405 ㎚에서 측정된 흡광도로부터 결정하였다.

F435-KRAB는 용량 의존적 방식으로 VEGF-A 생산을 감소시켰다. 200 ng의 플라스미드가 사용된 경우, VEGF-A 단백질 농도는 대조군 플라스미드로 형질감염된 대조군 세포들에 비해 3.9배(138 pg/㎖) 억제되었다. 표 14를 참고하라.

저산소 조건에 의한 VEGF-A 유전자 유도의 억제

VEGF-A 유전자는 혈관생성을 유도하는데 중요한 인자로 알려져 있다. VEGF-A활성은 많은 종양의 발생과 성장을 위해 필수적이다. VEGF-A 활성은 암 조직에서 저산소 조건에 의해 자극되는 것으로 발견되었다. VEGF-A의 고발현은 종양세포들에서 빈번하게 관찰된다.

293F 세포들을 배양하기 위한 배지를 100 내지 800 μM의 CoCl₂로 약 7시간 동안 처리하면, 저산소 조건이 유도되어 세포에 의한 VEGF 생산이 급격하게 증가된다. 징크 핑거 단백질이 저산소 조건에서 VEGF 발현을 억제할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

293F 세포들(10⁴ 세포/웰, 96-웰 플레이트)을 50 ng의 pLFD-F435-KRAB로 형질감염시킨 후 48시간 동안 배양하였다. 저산소 조건을 유도하기 위해, 800 μM의 CoCl₂를 배양단계에서 적어도 7시간 동안 배지에 처리하였다. 배양 배지 내로 분비되는 VEGF-A의 양을 ELISA로 측정하였다.

모의(mock)-형질감염된 세포들의 저산소 CoCl₂ 처리 배양으로부터 생산된 VEGF 양은 약 1,039 pg/㎖로 증가한 반면, 비처리 대조군 세포들에서는 약 273 pg/㎖이었다. 상기 결과는 저산소 조건이 VEGF-A의 생산을 강하게 유도함을 입증하는 것이다. 그러나, pLFD-F435-KRAB로 형질감염된 세포들은 저산소 조건에서 VEGF-A의 생산을 유도하지 않았다. 상기 세포들은 비-저산소 조건에서와 유사한 농도인 약 272 pg/㎖의 VEGF-A만을 생산하였다. 이 결과는 F435-KRAB의 발현이 저산소 조건하에서 VEGF-A의 생산을 억제함을 증명하는 것이다. 형질감염율이 약 85 내지 90%에 불과하기 때문에, 이러한 VEGF-A 생산의 잔여 수준은 배양시 비형질감염 세포들로부터 기인한 것으로 볼 수 있다. 본 발명자들은 F435-KRAB 및 이의 기능적으로 유사한 키메라 징크 핑거 단백질들이 VEGF-A 발현의 강력한 억제제인 것으로 결론지었다.

선택된 징크 핑거 단백질들 또는 동일한 잔기들을 포함하는 관련된 단백질들은 예를 들면 치료제로서 사용될 수 있을 것이다. 이러한 제제들은 예를 들면 VEGF-A의 발현을 억제하여 종양세포의 성장을 지연시킬 수 있을 것이다.

본 발명에 관한 많은 실시 태양을 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않는 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시 태양들도 후술하는 청구항의 범위에 포함된다.

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Claims (29)

1. 혈관생성인자(VEGF) 유전자에 결합하고 N-말단에서 C-말단 방향으로 아래의 아미노산 서열을 갖는 Cys₂-His₂ 류 징크 핑거 도메인 3개 또는 4개로 이루어진 폴리펩타이드로서,

   

   여기에서, X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 아미노산의 개수를 나타내며, 하이픈으로 연결된 두 개의 아래 첨자는 개입하는 아미노산의 전형적인 범위를 나타내고, X_a는 방향족 아미노산이며, Ψ는 소수성 아미노산 잔기이고,

   위의 징크 핑거 도메인에서,

   (1) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (2) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (3) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (4) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSNV이거나;

   (5) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHV, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (6) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (7) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHR이거나;

   (8) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (9) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHR이거나;

   (10) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (11) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (12) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (13) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (14) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (15) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (16) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (17) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (18) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (19) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSSR이거나;

   (20) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (21) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (22) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (23) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (24) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (25) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (26) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSNV이거나;

   (27) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (28) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 DSCR이거나;

   (29) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR이거나;

   (30) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (31) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (32) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (33) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (34) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSSR이거나;

   (35) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHR이거나;

   (36) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (37) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 CSNR이거나;

   (38) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (39) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (40) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (41) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (42) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR이거나;

   (43) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSTR이거나;

   (44) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (45) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNV이거나;

   (46) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (47) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR이거나;

   (48) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR이거나;

   (49) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (50) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 DSAR이거나;

   (51) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (52) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (53) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (54) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSSR이거나;

   (55) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (56) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 DSAR이거나;

   (57) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 DSCR이거나;

   (58) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (59) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (60) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (61) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (62) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 CSNR이거나;

   (63) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (64) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNV이거나;

   (65) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (66) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (67) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (68) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (69) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (70) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (71) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (72) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (73) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (74) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSSR이거나;

   (75) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (76) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (77) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (78) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (79) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (80) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 CSNR이거나;

   (81) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (82) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (83) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR이거나;

   (84) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSNV이거나;

   (85) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (86) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (87) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNV, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNV이거나;

   (88) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSSR이거나;

   (89) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (90) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (91) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (92) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (93) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (94) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNV이거나;

   (95) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (96) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 VSSR이거나;

   (97) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (98) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 DSAR이거나;

   (99) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 DSCR이거나;

   (100) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (101) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (102) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (103) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (104) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 CSNR이거나;

   (105) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (106) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSNV이거나;

   (107) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (108) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (109) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (110) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSNV, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (111) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (112) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (113) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (114) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (115) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (116) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 VSSR이거나;

   (117) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (118) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (119) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (120) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 WSNR이거나;

   (121) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (122) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 CSNR이거나;

   (123) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (124) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (125) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSNR이거나;

   (126) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 VSNV이거나;

   (127) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSTR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (128) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSCR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (129) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNV, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSNV이거나;

   (130) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 VSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSSR이거나;

   (131) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (132) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (133) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 CSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (134) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 DSAR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (135) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제4 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (136) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제4 징크 핑거 도메인에서는 QSNV인 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서,

   서열번호 20 내지 71의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 징크 핑거 도메인에서,

   (1) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSX₁R이며, 여기에서 X₁은 H 또는 N이거나;

   (2) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHX₂, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RX₃HR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이며, 여기에서 X₂는 T 또는 V이고 X₃은 S 또는 D이거나;

   (3) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSNV이거나;

   (4) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

   (5) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (6) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

   (7) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

   (8) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (9) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

   (10) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSSR이거나;

   (11) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (12) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

   (13) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,

   VEGF 유전자가 인간 VEGF-A 유전자인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
7. 제1항에 있어서,

   VEGF 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
8. 제1항의 폴리펩타이드와, 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인 및 단백질 전달 도메인(protein transduction domain; PTD)으로 이루어진 군에서 선택된 조절 도메인으로 구성된 폴리펩타이드.
9. 제8항에 있어서,

   전사 활성화 도메인이 p65 또는 VP16 활성화 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
10. 제8항에 있어서,

    전사 억제 도메인이 Kid 또는 KOX 억제 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
11. 제8항에 있어서,

    단백질 전달 도메인이 TAT 단백질, VP22 단백질, 또는 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain)의 PTD 펩타이드인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
12. 제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
13. 삭제
14. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 포유동물 세포.
15. 제14항에 있어서,

    폴리펩타이드가 세포 내에서 제12항의 핵산으로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 세포.
16. 제1항 또는 제8항의 폴리펩타이드, 제12항의 핵산 또는 제14항의 변형된 포유동물 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 신생물 질환, 염증성 질환 또는 혈관생성-기반 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
17. 제16항에 있어서,

    신생물 질환이 암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
18. 제16항에 있어서,

    폴리펩타이드가 서열번호 20 내지 71의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
19. 제16항에 있어서,

    폴리펩타이드에 포함된 징크 핑거 도메인에서,

    (1) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSX₁R이며, 여기에서 X₁은 H 또는 N이거나;

    (2) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHX₂, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RX₃HR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이며, 여기에서 X₂는 T 또는 V이고 X₃은 S 또는 D이거나;

    (3) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 VSNV이거나;

    (4) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RDER, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSHT이거나;

    (5) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

    (6) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDHT이거나;

    (7) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RDHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSNR이거나;

    (8) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

    (9) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RDER이거나;

    (10) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 QSSR이거나;

    (11) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 QSSR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

    (12) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 QSHT, 제2 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 RSHR이거나;

    (13) -1, 2, 3 및 6 위치의 DNA 접촉 잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 WSNR, 제2 징크 핑거 도메인에서는 RSHR, 제3 징크 핑거 도메인에서는 WSNR인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
20. 50 kDa 미만의 분자량을 갖는 단백질에 대해 투과성이고 폴리-라이신 알긴산염 (poly-lysine alginate), 소듐 알기네이트 (sodium alginate), 바륨 알기네이트 (barium alginate) 및 소듐 셀룰로즈 설페이트 (sodium cellulose sulfate)로 이루어진 군에서 선택되는 생체적합성 물질로 구성된 캡슐화 층(encapsulation layer), 및 분비 인자의 생산을 조절하는 제1항 또는 제8항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 포유동물 세포를 포함하는, 캡슐화된 조성물.
21. 제20항에 있어서,

    분비 인자가 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, VEGF, HGF, 인터페론, 인터류킨, 또는 섬유아세포 성장 인자인 것을 특징으로 하는 캡슐화된 조성물.
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