JPWO2004001038A1 - 細胞または組織の神経化に関与する新規遺伝子およびタンパク質、並びにその利用 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞または組織の神経化に関与する新規遺伝子およびタンパク質、並びにその利用に関するものであり、特に、再生医療、遺伝子治療への応用が可能な神経化誘導方法や、ミトコンドリアのこの神経化誘導方法に利用できる新規遺伝子、並びにそのタンパク質に関するものである。本発明によれば、ＣＲＡＭタンパク質に結合するタンパク質または当該タンパク質をコードする遺伝子を用いて、細胞または組織の神経化を誘導することができる。

Description

本発明は、細胞または組織の神経化に関与する新規遺伝子およびタンパク質、並びにその利用に関するものであり、特に、再生医療、遺伝子治療への応用が可能な神経化誘導方法や、ミトコンドリアのこの神経化誘導方法に利用できる新規遺伝子、並びにそのタンパク質に関するものである。

神経発生過程において分化した神経細胞は、軸索を進展し、最終的にそれぞれ特異的な標的を探し当て、神経伝達の場であるシナプスを形成する。この膨大な数にのぼる個々の神経細胞の正確な神経連絡網の確立が、神経系機能の基礎を形成している。この神経回路網の形成過程において、神経細胞が局所の標識分子を認識することの連続により、最終的な標的に至るものと考えられている。したがって、多数の分子および分子間認識が重要な役割を担っており、近年、これらの分子としてセマフォリンやＮＩ３５などの反発因子、さらにネトリン，カドヘリンなどの誘因因子が同定されるに至った。
現在、多数のセマフォリンファミリーおよびその受容体が同定され、セマフォリンを介する反発性のシグナル伝達機構が注目されている。セマフォリン（例えば、後述のＳｅｍａ３Ａ）は、標的細胞の表面分子ニューロピリン（例えば、後述のＮＰ−１）と相互作用することで誘引され、膜貫通分子プレキシン（例えば、後述のＰｌｅｘｉｎＡ１）と特異的に結合する。プレキシンは、単独またはニューロピリンと共に、セマフォリン受容体として機能する。最近の研究では、プレキシンの細胞質側がチロシンリン酸化されることが報告され、プレキシンが未知のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）によりリン酸化され、シグナル伝達される可能性が示唆されている。
また、１９９５年には、セマフォリンによる神経成長円錐崩壊の細胞内シグナル伝達に関与する分子としてＣＲＭＰ（Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が同定された（Ｎａｔｕｒｅ １９９５；３７６：５０９−５１４参照）。
一方、本発明者は、上記ＣＲＭＰに結合する新規のシグナル分子を同定し、「ＣＲＡＭ（ＣＲＭＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」と命名した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：２７２９１−２７３０２参照）。さらに、ＣＲＭＰおよびＣＲＡＭは、線虫の神経走行異常を引き起こす原因遺伝子として知られている「ＵＮＣ−３３」の哺乳類ホモログであることが判明し、神経ガイダンスに関与するシグナル分子として注目されている。
ところで、最近は基礎研究から生まれた新技術を、新たな治療法、検査・診断方法、手術方法として臨床現場に利用する動きが活発であり、画期的治療法として注目されている再生医療、遺伝子治療の実現にも、こうした遺伝子レベル細胞レベルでの基礎研究が不可欠になっている。言い換えれば、上記のような神経ガイダンスの仕組みを調べる基礎研究を通じて、神経再生医療、遺伝子治療等さまざまな医療・医薬用途に直接役立つ知見が得られる可能性があり、これを利用し、各種神経疾患（例えば、痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病などのような神経変性疾患、あるいは脊髄損傷や顔面神経麻痺などの神経麻痺）に対して、新たな神経再生技術の開発、新たな遺伝子治療法の開発、各種神経疾患の病態機序の研究、その治療薬の開発、さらには、新たな神経細胞・神経組織の人為的生産技術の開発、といった種々の応用面・臨床面での利用が期待できる。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、神経系の研究を通じて、再生医療、遺伝子治療等さまざまな医療・医薬用途への応用が可能な神経化誘導方法を開発すると共に、これら神経化誘導方法等に利用できる新規遺伝子、並びにそのタンパク質を提供することにある。

本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、上記ＣＲＡＭに結合するタンパク質およびその遺伝子を利用することにより、非神経細胞の神経化を誘導することができること、さらには、上記タンパク質およびその遺伝子は、例えば、ミトコンドリアの異常に由来する疾患の治療や診断に利用することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
Ａ．本発明に係る神経化誘導方法
本発明に係る神経化誘導方法は、ＣＲＡＭタンパク質に結合するタンパク質または当該タンパク質をコードする遺伝子を用いて、細胞または組織の神経化を誘導する方法であり、具体的には、下記▲１▼〜▲５▼の方法を挙げることができる。
▲１▼ 以下の（ａ）または（ｂ）に示される第１のタンパク質または当該第１のタンパク質をコードする遺伝子を用いて、神経化を誘導する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質。
▲２▼ 上記第１のタンパク質と、プレキシンタンパク質とを対象とする細胞内で共発現させることにより、神経化を誘導する方法。
▲３▼ 以下の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示される第２のタンパク質または当該第２のタンパク質をコードする遺伝子を用いて、神経化を誘導する方法。
（ｃ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＲＡＭタンパク質との結合能を有するタンパク質。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち、５５番目のグリシン残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
Ｂ．本発明に係る遺伝子、タンパク質、神経化誘導剤
本発明に係る神経化誘導剤としては、下記▲１▼および▲２▼の誘導剤を挙げることができる。
▲１▼ 以下の（ａ）または（ｂ）に示される第１のタンパク質または当該第１のタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる神経化誘導剤。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質。
▲２▼ 上記▲１▼の神経化誘導剤に、さらに、プレキシンタンパク質または当該タンパク質をコードする遺伝子を含有する神経化誘導剤。
本発明に係るタンパク質としては、下記のタンパク質を挙げることができる。
以下の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示される第３のタンパク質。
（ｃ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＲＡＭタンパク質との結合能を有するタンパク質。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち、５５番目のグリシン残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明に係る遺伝子としては、下記▲１▼および▲２▼の遺伝子を挙げることができる。
▲１▼ 上記本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子。
▲２▼ 配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子。
また、本発明に係る神経化誘導剤には、下記▲１▼および▲２▼の神経化誘導剤も含まれる。
▲１▼ 上記本発明に係るタンパク質、または、上記本発明に係る遺伝子（上記▲１▼または▲２▼の遺伝子）を含んでなる神経化誘導剤。
▲２▼ 上記▲１▼の神経化誘導剤に、さらに、プレキシンタンパク質または当該タンパク質をコードする遺伝子を含有する神経化誘導剤。
以上、本発明に係る神経化誘導方法、神経化誘導剤、遺伝子およびタンパク質によれば、神経ガイダンスに関与する遺伝子群の神経突起誘導活性を利用し、人為的に神経軸索誘導および伸展を操作することによる新たな神経再生技術の確立と遺伝子治療が可能である。特に、神経再生能力のない神経を再生することにより、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患および脊髄損傷や顔面神経麻痺などの神経麻痺に対する新しい治療法への開発が期待できる。
Ｃ．本発明に係るミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療・診断方法等
本発明に係るミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療・診断方法等としては、下記▲１▼・▲２▼の方法、並びに、これら方法に用いられる素材等を挙げることができる。
▲１▼ 前記（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示される第２のタンパク質、あるいは、当該タンパク質をコードする遺伝子または配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子を含む発現ベクター等を含んでなる、ミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療用薬剤。
▲２▼ 前記第２のタンパク質のタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子または配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子、および／または、当該タンパク質に対する抗体を用いる、ミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の診断方法。
変異ミトコンドリアを特異的に認識し、封入体を形成することによりミトコンドリアタンパク質のユビキチン化と酸化誘導および細胞外への封入体の放出を行うことにより、変異ミトコンドリアの消去機構に密接に関与している。そのため、本発明は、ミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療・診断方法等に利用することができ、当該疾患についての新しい治療法や診断法への開発が期待できる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明に係るタンパク質Ｍセプチンのアミノ酸配列を、セプチンＨ５およびＡＲＴＳと比較して示す図である。
図２（ａ）は、発現ベクターを用いて種々の遺伝子を細胞に導入した場合の各細胞の形態を示す顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は、各場合において細胞が収縮した割合を示すグラフである。
図３は、Ｆｅｓタンパク質およびプレキシンタンパク質をＣＯＳ−７細胞に共発現させた場合の細胞の形態を示す顕微鏡写真である。
図４は、Ｆｅｓ遺伝子を導入したラットＰＣ１２細胞に対してＮＧＦ処理した後の細胞の形態を示す顕微鏡写真である。
図５は、本発明に係るＭセプチンをコードする遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し、同一の細胞におけるＭセプチンと微小管との局在を調べた結果を示す顕微鏡写真である。
図６は、Ｐ−ｌｏｏｐモチーフ欠損型Ｍセプチン変異体をコードする遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し、同一の細胞におけるＭセプチンと微小管との局在を調べた結果を示す顕微鏡写真である。
図７は、コイルドコイル領域欠損型Ｍセプチン変異体をコードする遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し、同一の細胞におけるＭセプチンと微小管との局在を調べた結果を示す顕微鏡写真である。
図８上図は、Ｍセプチンの凝集塊とミトコンドリアの局在を調べた図である。図８下図は、紫外線刺激後３時間でのＭセプチンの凝集塊とミトコンドリアの局在を調べた図である。
図９は、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体とミトコンドリアタンパク質であるミトコンドリアＨＳＰ７０の抗体で２重染色した結果を示す図である。
図１０は、Ｍセプチン遺伝子とＦｌａｇタグ付きのユビキチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体と抗Ｆｌａｇ抗体で２重染色した結果である。
図１１は、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現した細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒで染色した結果を示す図である。
図１２は、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現した細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒで染色し、ＦＡＣＳ解析でＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒのシグナル増強を定量した結果を示す図である。
図１３は、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体と抗８オキソグアニン抗体で２重染色した結果を示す図である。
図１４は、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体とＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒで２重染色し、時間経過による封入体の動きを観察した結果を示す図である。

以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
（１）本発明に係る第１の神経化誘導方法
本発明に係る第１の神経化誘導方法は、前記の（ａ）または（ｂ）に示される第１のタンパク質または当該第１のタンパク質をコードする遺伝子を用いて、神経化を誘導する方法である。
上記第１のタンパク質の具体的な一例として、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）であるＦｅｓタンパク質が挙げられる。具体的には、上記Ｆｅｓタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列、即ち８２０個のアミノ酸からなり、分子量約９５ｋＤａのタンパク質である。
上記Ｆｅｓタンパク質が、ＣＲＡＭタンパク質に結合し、かつ、神経化を誘導する活性を持つことは、後述の実施例に示すとおりである。なお、ここで、「ＣＲＡＭタンパク質に結合」するとは、単独のＣＲＡＭタンパク質に結合するか、または、ＣＲＭＰタンパク質と結合し複合体を形成したＣＲＡＭタンパク質（以下、この複合体を略して「ＣＲＭＰ／ＣＲＡＭ複合体」という）に結合することをいう。また、「神経化を誘導」するとは、主として未分化細胞や非神経細胞に対してその神経化を誘導することを意味するが、既に神経分化した細胞に対してその軸索や神経突起を伸展・成長させるなどして、神経細胞を活性化することをも含む意味である。神経化の誘導は、軸索や神経突起の伸長の有無を形態観察により確認してもよいし、神経系細胞に特異的に発現するマーカー（例えば、Ｔａｕ，ＭＡＰ−２など）によって確認してもよい。
神経化を誘導する方法は、具体的には、上記Ｆｅｓタンパク質やその遺伝子を目的の細胞に導入することによって行うことができる。例えば、これまで知られている細胞への遺伝子導入方法としては、遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエンドサイトーシスによって目的細胞に導入する方法（リン酸カルシウム法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクトロポレーション法、遺伝子銃法）、超音波法、単純拡散法、電荷を有する脂質を用いる方法、リポソーム法、あるいは、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う方法、などがあり、このうち適当な方法によって遺伝子を導入し細胞内発現させればよい。
上記の方法以外に、ウィルスベクター（アデノウィルス、シンドビスウィルス）などを用いた遺伝子導入方法でもよい。特に生体内への導入はこの方法が有効であると考えられる。
以上の方法を用いて、目的の細胞に上記Ｆｅｓタンパク質のヒトホモログやその遺伝子を導入することを、各種神経疾患の治療法、またはその１ステップとして行うことも可能である。
また、後述の実施例に示すように、上記Ｆｅｓ遺伝子（ｃＤＮＡ：その塩基配列は、配列番号１およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ１２６１６に示される）とプレキシン（ＰｌｅｘｉｎＡ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｄ８６９４８に示されるｃＤＮＡ）とを哺乳類細胞用発現ベクター（ｐＣＭＶ５）に組込み、非神経細胞であるＣＯＳ−７細胞に対してリポソーム法にて遺伝子導入を行ったところ、神経様突起が誘導及び伸展しているのが観察された。さらに、神経細胞としてラット海馬初代培養系においても、同様の方法により神経突起の伸展の増強が観察された。したがって、Ｆｅｓタンパク質およびプレキシンタンパク質のヒトホモログを対象とする細胞内で共発現させることにより神経化を誘導する方法も、神経再生治療へ利用可能な有効な方法といえる。なお、ヒトホモログのＦｅｓタンパク質のｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ５２１９２に、ヒトホモログのプレキシンのｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ８７８３２−１に示されている。
本発明に係る「遺伝子」は、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味であり、アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡや、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの転写元のゲノムＤＮＡが含まれる。また、ＤＮＡは２本鎖のみならず、それを構成するセンス鎖、アンチセンス鎖といった１本鎖でもよい。さらに、上記「遺伝子」は、前記（ａ）、（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
また、本発明において、前記「１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のフラグタグ（Ｆｌａｇ ｔａｇ）等の付加配列を末端に含ませてもよい。
上記のように変異を導入すれば、神経化誘導因子として高い活性を持つ変異型Ｆｅｓタンパク質や精製の容易な組換えタンパク質等を人為的に得られる可能性がある。
上記Ｆｅｓタンパク質やその遺伝子、またはそのヒトホモログを神経化誘導剤として用いる場合には、遺伝子やタンパク質以外に、これらを効率よく細胞内に導入するための運搬体（外被タンパク質等）などを含むものであってもよく、また、神経化誘導剤は、各種の試薬や反応液、酵素などと組み合わせて使用することができる。
（２）本発明に係る第２の神経化誘導方法
本発明に係る第２の神経化誘導方法は、前記の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示される第２のタンパク質または当該第２のタンパク質をコードする遺伝子を用いて、神経化を誘導する方法である。
上記第２のタンパク質の具体的な一例として、今回、本発明者がマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）から単離・同定した新規タンパク質が挙げられる。本発明者は、このタンパク質を「Ｍセプチン（Ｍ−ｓｅｐｔｉｎ）」と命名した。具体的には、このＭセプチンは、配列番号４に示すアミノ酸配列、即ち３７９個のアミノ酸からなり、分子量約４２ｋＤａのタンパク質である。
また、上記タンパク質Ｍセプチンをコードする遺伝子として、１，１４０ｂｐの全長ｃＤＮＡを取得した。このＭセプチン遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。
相同性検索の結果、上記Ｍセプチンは、マウス由来のセプチンＨ５と高い相同性を示し、セプチンＨ５（４７８アミノ酸）のアミノ末端近くの９９アミノ酸残基を欠失したタンパク質であることが分かった。また、ヒトセプチンＨ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＦ０３５８１１）に示されるｃＤＮＡ遺伝子のゲノム配列分析により、この９９アミノ酸部位がセプチンＨ５遺伝子の２番目のエクソンと一致していることが分かった。つまり、Ｍセプチンは、セプチンＨ５ゲノムＤＮＡから選択的スプライシングにより生じた、２番目のエクソンに対応するアミノ酸配列を欠く選択的スプライシング産物である。
図１は、Ｍセプチンの構造を、セプチンＨ５およびＡＲＴＳと比較して示す図である。ＡＲＴＳも、セプチンＨ５ゲノムＤＮＡから作られる選択的スプライシング産物の一つであり、ＴＧＦ−β誘導アポトーシスを仲介する。同図に示すように、これらＭセプチン、セプチンＨ５、ＡＲＴＳは、ＧＴＰに結合し、ＧＴＰ ａｓｅ活性に機能する「Ｐ−ループ（Ｐ−ｌｏｏｐ）」モチーフという共通の配列構造を有している。また、ＡＲＴＳ以外の２つのタンパク質Ｍセプチン、セプチンＨ５は、Ｃ末端部分にタンパク質間の相互作用に関係する「コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）」ドメインを有している。Ｍセプチンでは、この「Ｐ−ループ」モチーフと「コイルドコイル」ドメインとが、機能に必須の領域であると考えられる。
また、上記第２のタンパク質の他の例として、Ｍセプチンのヒトホモログがある。このヒトホモログＭセプチンは、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなり、その遺伝子は配列番号１３に示す塩基配列からなる。
さらに、上記Ｍセプチンについて機能解析を進めることにより、以下の知見が得られた。
▲１▼ Ｍセプチンは、神経発生段階初期に一時的に強く発現しており、ラット脳においてＣＲＡＭタンパク質と複合体を形成している。
▲２▼ 線維芽細胞であるＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入すると、ミトコンドリアにおける特異的な局在を示し、ミトコンドリア周辺に微小管の束化を誘導する。
▲３▼ マウス胚性癌細胞であるＰ１９細胞の神経分化過程において発現が誘導され、ミトコンドリアをはじめさまざまな局在を示す。
▲４▼ Ｍセプチンの変異体（Ｐ−ループモチーフの機能を欠損させたもの）では、微小管凝集活性の増強が観察され、異常な微小管構築を誘導する。この変異体は、Ｍセプチンの活性型であると推測される。また、この変異体は、ＮＧＦによるラットＰＣ１２細胞の神経分化を増強した。
▲５▼ Ｍセプチンの変異体（コイルドコイル領域の機能を欠損させたもの）では、微小管凝集活性が消失し、微小管がバラバラになり崩壊することが観察される。この変異体は、Ｍセプチンの不活性型であると推測される。この変異体をＰＣ１２細胞に遺伝子導入すると、細胞死を誘導する。
▲６▼ ＣＯＳ−７細胞における遺伝子導入実験において、Ｍセプチンは、ＣＲＡＭタンパク質をミトコンドリアに移行させる活性を有する。
このように、Ｍセプチンは、多様な機能を有するが、神経発生段階に強く発現し、その活性型では神経分化を増強する作用も観察されたことから、このＭセプチンまたはそのヒトホモログを用いた神経化誘導方法も、神経再生を中心とした医療への有効な利用方法と考えられる。
Ｍセプチンは、また、ＣＲＡＭをミトコンドリアに輸送し、ミトコンドリア周辺の微小管の束化を誘導する。細胞に軸索や樹状突起が発生するときにミトコンドリアは高い運動性を有するので、ミトコンドリアの移動やミトコンドリアＤＮＡが軸索形成などの神経システムの構築に寄与している可能性がある。ミトコンドリアの移動が神経極性と神経分化に決定的な現象であるとすれば、Ｍセプチンがミトコンドリアの動きをコントロールして、神経分化における細胞の形態変化の誘導に関わっている可能性がある。
また、Ｍセプチンは、ミトコンドリアの機能を制御し、神経細胞の生死を制御している可能性が推測される。したがって、例えば、Ｍセプチンまたはその変異体（Ｐ−ループモチーフの機能を欠損させたもの）を神経細胞に遺伝子導入することにより、神経細胞死を抑制できる可能性がある。Ｐ−ループモチーフの機能を欠損させる方法としては、具体的には配列番号４に示すアミノ酸配列の５５番目のグリシン（Ｇ）を他のアミノ酸（例えばバリン（Ｖ））に置換するなどの方法が挙げられる。この方法は、痴呆、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患に対して、神経細胞のアポトーシスを防ぐ有効な治療方法になり得るものである。
（３）本発明に係るミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療方法、治療用薬剤等。
ミトコンドリアは細胞内最大の活性酸素発生源であるためミトコンドリアＤＮＡは核ＤＮＡより酸化障害を受けやすい。さらに、ミトコンドリアの修復酵素は核に比べて不十分であり、事実、紫外線による代表的なＤＮＡ障害で生じるピリミジン２量体はミトコンドリアでは修復されない。したがって、ミトコンドリアＤＮＡの変異率は核に比べてきわめて高いことが報告されている。このようにミトコンドリアでは修復されないＤＮＡ障害が明らかに存在するにもかかわらず、どのようにこれらの障害ＤＮＡが処理され、ミトコンドリアゲノムの遺伝情報が守られているのか全く不明である。
ここで、上記Ｍセプチンは、ＣＲＡＭと結合するタンパク質であること、ミトコンドリア特異的に局在するセプチンタンパク質であること等については明らかとなっているが、その具体的な機能はこれまで不明であった。
本発明者が上記Ｍセプチンについてその機能を解析した結果、次の各知見が新たに見出された（実施例３参照）。
▲１▼ Ｍセプチンは変異ミトコンドリアを特異的に認識し、封入体形成を誘導した。
▲２▼ Ｍセプチンにより形成された封入体内においてユビキチン化が誘導され、ミトコンドリアタンパク質（チトクロームＣやミトコンドリアＨＳＰ７０）の消去が観察された。このユビキチン化はＭセプチンのコイルドコイルドメインが関与していることが示された。
▲３▼ Ｍセプチンにより形成された封入体内において強いＯｘｉｄａｔｉｏｎ（酸化）がおこり、８オキソグアニンの生成が観察された。
▲４▼ Ｍセプチンにより形成された封入体が細胞の外に放出された。
上記の各知見から、Ｍセプチンは、変異ミトコンドリアを特異的に認識し、封入体を形成することによりミトコンドリアタンパク質のユビキチン化と酸化誘導および細胞外への封入体の放出を行うことにより、変異ミトコンドリアの消去機構に密接に関与していることが明らかとなった。
従って、本発明に係る第２のタンパク質は、ヒトのミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患（以下、便宜上、ミトコンドリアＤＮＡ異常疾患と称する）の治療方法及び治療用薬剤に用いることができる。
本発明が適用可能なミトコンドリアＤＮＡ異常疾患としては、特に限定されるものではないが、例えば、次に示す表１に挙げられる各種疾患を挙げることができる。

本発明に係るミトコンドリアＤＮＡ異常疾患の治療方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、前記（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示されるタンパク質を含む薬剤（便宜上、タンパク質薬剤と称する。）を用いる方法と、前記（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示されるタンパク質をコードする遺伝子（便宜上、遺伝子薬剤と称する）を用いる方法とを挙げることができる。
前者の方法に用いられる薬剤すなわちタンパク質薬剤の具体的な構成は特に限定されるものではなく、前記（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示されるタンパク質を含んでおり、使用時に当該タンパク質が十分な機能を発揮できるようになっていればよい。具体的には、例えば、
本発明に係るタンパク質薬剤の使用形態すなわちヒトへの投与方法も特に限定されるものではなく、自体公知の方法を用いて行なえばよい。例えば、静脈注射等により局部的に投与する方法を挙げることができる。さらに、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。
後者の方法に用いられる薬剤すなわち遺伝子薬剤の具体的な構成は特に限定されるものではないが、例えば、前記（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示されるタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを挙げることができる。
より具体的には、本発明に係る組換え発現ベクターとしては、前記（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のタンパク質（Ｍセプチン）をコードする本発明の遺伝子を含むものであればよいが、例えば、配列番号４または１４に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターを挙げることができる。
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。具体的には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
上記発現ベクターを投与する方法、すなわち遺伝子治療方法は特に限定されるものではないが、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を用いることができる。
また、上記発現ベクターを投与してＭセプチンをコードする遺伝子を発現させる場合、必要に応じて、当該遺伝子がホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
また、本発明に係る第２のタンパク質やこれをコードする遺伝子は、ミトコンドリアＤＮＡ異常疾患の診断方法等にも応用することができる。例えば、本発明の上記遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具は、ミトコンドリアＤＮＡ異常疾患に用いることが可能である。
上記遺伝子検出器具は、種々の条件下での本発明の遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用できる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものである。例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができ、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）などを挙げることができる。
尚、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
あるいは、本発明に係る第２のタンパク質もミトコンドリアＤＮＡ異常疾患の診断方法等に応用することが可能である。本発明の抗体は、前記（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の検出・測定などに利用でき、その他、診断用・治療用などに利用できる可能性がある。
抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
以上、本発明の神経化誘導方法に利用可能な各タンパク質、各遺伝子の配列、構造および機能などの諸特徴について説明したが、以下では、本発明に係る各タンパク質、各遺伝子の取得方法について説明する。
前記各タンパク質をコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、各タンパク質をコードするＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニング・ベクターを使用して対象となる動物からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、前記各遺伝子の少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出するステップとを含む方法を用いることができる。このように本発明の各遺伝子のうち、少なくとも一部の領域はプローブとして有用であり、ＤＮＡチップ上やマイクロアレイ上で使用するプローブとしても有用である。
プローブに用いる領域は、例えば、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを設計して用いてもよい。また、上記ライブラリーからのスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
また、上記プローブの配列を、上記各タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、Ｍセプチンの場合、前記「Ｐ−ループ」ドメインや「コイルドコイル」ドメイン）の中から選択し、ヒトやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係る各タンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記各タンパク質又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ）を、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れ、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、適切な条件下で目的のタンパク質を精製することが可能である。
また、上記各タンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質を作製する方法としては、例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊 新細胞工学実験プロトコール 秀潤社 ２４１−２４８（１９９３）」に記載の方法、さらには、市販のキット（例えば、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ ストラタジーン社製）を利用する方法も可能である。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られているが、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。本発明に含まれる変異タンパク質は、野性型と比べてより優れた神経化誘導活性を有するものであってもよいし、野性型と同様の神経化誘導活性を有するものであってもよい。また、サイレント変異（アミノ酸配列は変わらず、塩基配列のみが変化する変異）であってもよい。つまり、本発明に含まれる変異タンパク質は、神経化誘導因子としての活性が野生型タンパク質と略同等であってもよいし、より優れていてもよい。
以下では、実施例によって本発明についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、前述した様々な態様が可能であることはいうまでもない。
以下の実施例では、▲１▼Ｆｅｓ、▲２▼Ｍセプチンについて行った、神経化誘導に関する実験の各実験結果、およびＭセプチンによる変異ミトコンドリアの消去機能についての実験結果について説明する。
〔実施例１：Ｆｅｓタンパク質による神経分化誘導〕
Ａ．ＣＲＡＭ結合ＰＴＫとしてのＦｅｓタンパク質の同定
ＣＲＡＭに結合するＰＴＫが存在するか調べるため、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：２７２９１−２７３０２に記載の方法に従って、新生児ラット脳を材料に抗ＣＲＡＭ抗体を用いた免疫沈降法とｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイとを行った。その結果、分子量６６ｋＤａおよび９５ｋＤａの２つのリン酸化タンパク質が検出された。
ＣＲＡＭはＣＲＭＰと大きな複合体を形成するため、同様のアッセイを抗ＣＲＭＰ２抗体を用いて行ったところ、上記と同様に、新生児ラット脳から６６ｋＤａおよび９５ｋＤａのタンパク質が検出された。そこで、このうち９５ｋＤａのタンパク質に注目し、さらに詳細に検討した。
まず、アミノ酸分析に十分な量の精製９５ｋＤａタンパク質を得るため、生後２０日齢ラット脳（約１００ｇ）を小片に切断し、氷点下で５倍量の抽出液Ａ（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１０μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１０ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４）を用いてブレンダーで１分ホモジェナイズし破砕した。以降すべての手順は４℃下で行われた。得られた細胞破砕液を８，０００×ｇで１０分間遠心分離して脂質や壊れ残りの細胞を除去した後、さらに１００，０００×ｇで６０分間遠心して上清の可溶性画分を分離した。得られた可溶性画分は、抗ＣＲＡＭ抗体アフィニティーカラムに吸着させ、抽出液Ａで洗浄した後、１ｍＭの抗ＣＲＡＭ抗体抗原ペプチド（ＣＲＡＭの４６８〜４８５番目のアミノ酸配列）を用いて溶出した。
上記溶出した画分を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＡＴＰ，１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムを含む反応液において、３０℃で３０分間、リン酸化反応させた。その後、反応液を抗リン酸化チロシン抗体である４Ｇ１０アガロースビーズのカラムに通し、抽出液Ａで洗浄した後、２０ｍＭのリン酸フェニルで溶出した。溶出した３０ｍｌの溶出画分は、ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ３０（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いた遠心式限外濾過法により１ｍｌまで約３０倍濃縮した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびＣＣＢ（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）染色法により分析した結果、最終的に得られた９５ｋＤａタンパク質は、１０ｐ ｍｏｌであると算出された。
ポリアクリルアミドゲルにおける９５ｋＤａタンパク質を含む部分を切り取り、組成２０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３，１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル，０．１％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００の反応液１００μｌにて、３μｇの溶解エンドペプチダーゼにより３７℃で一晩消化した。得られたペプチドは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のモデル１７３Ａ、液体クロマトグラフィシステム（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）により分離され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のモデル４９２、自動アミノ酸シークエンサーによりアミノ酸配列を決定した。
これにより、２つのペプチド断片が得られた。ＥＭＢＬデータバンクの公開タンパク質シークエンスを用いたＢＬＡＳＴ相同検索を行うと、２つのペプチド断片は、マウスおよびヒト由来のチロシンキナーゼＦｅｓのペプチド配列とそれぞれ８３．３％および９０％の相同性を示した。
次に、Ｆｅｓの異なった部位をエピトープとして認識する２種類の抗Ｆｅｓ抗体を用いて免疫分析を行った。この結果、上記９５ｋＤａタンパク質は、ＦｅｓのＮ末端を認識する抗体とＣ末端を認識する抗体との両方に認識されたので、今回得られたＣＲＡＭ結合ＰＴＫは、Ｆｅｓであることが示された。
Ｂ．細胞内におけるＦｅｓとＣＲＡＭとの結合およびその共局在
上記ＦｅｓとＣＲＡＭとが、実際に神経細胞のような細胞においても結合しているのか調べた。
初めに、神経分化させたＰ１９細胞におけるＦｅｓの発現を調べた。レチノイン酸（ＲＡ）処理して神経分化させたＰ１９細胞からｏｌｉｇｏ−ｄＴセルロースを用いて全ｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。これを鋳型として、ＦｅｓｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーとして配列番号５および６に示されるプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドを含む１．０％アガロースゲルにより電気泳動し、ＰＣＲ産物の塩基配列は、ＡＢＩ−３７７シークエンサーを用いて決定した。この結果、神経分化したＰ１９細胞において、Ｆｅｓの発現が確認された。ＲＴ−ＰＣＲノーザン分析においても、同様に、ＦｅｓがＰ１９細胞で発現されていることが確認された。
次に、上記Ｐ１９細胞でのＦｅｓとＣＲＡＭとの間の結合を調べた。Ｐ１９細胞溶解液を、抗ＣＲＡＭ抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物は、抗Ｆｅｓ抗体に認識されたので、ＦｅｓとＣＲＡＭとの結合が確認された。
ＦｅｓとＣＲＡＭとの結合をさらに調べるため、Ｐ１９細胞およびマウス胚ＤＲＧ細胞において、抗ＣＲＡＭ抗体および抗Ｆｅｓ抗体を用いた２重免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡により観察した。
２重染色のために、細胞をまず抗ＣＲＡＭ抗体および抗Ｆｅｓ抗体と共に室温で２時間反応させ、その後、０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄した。次に、適切な２次抗体（ＦＩＴＣラベルしたヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｃｙ３ラベルしたヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＦＩＴＣラベルしたロバ抗ヤギＩｇＧ）を用いて１時間反応させ、標識した。
その後、細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分固定し、２回ＰＢＳで洗浄し、０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳで１０分透過し、３回ＰＢＳで洗浄し、３％牛血清アルブミンを含むＰＢＳでブロックした。すべての処理は室温で行われた。
そして、ＳｌｏｗＦａｄｅ−Ｌｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）でスライドに固定し、ＯＰＴＩＰＨＯＴ−２（ＮＩＫＯＮ社）とＭＲＣ−１０２４共焦点画像処理システム（ＢＩＯＲＡＤ社）により分析した。この結果、ＦｅｓとＣＲＡＭとは完全に共局在し、２つのタンパク質が結合していることが示された。
Ｃ．細胞内でのＦｅｓによるＣＲＡＭとＣＲＭＰとのチロシンリン酸化
（Ｃ−１）Ｐ１９細胞におけるＦｅｓのＣＲＡＭリン酸化
次に、細胞内でのＦｅｓによるＣＲＡＭのチロシンリン酸化について調べた。神経分化したＰ１９細胞を過バナジウム酸塩により１０分間刺激してから（または刺激せずに）溶解し、その細胞溶解液を抗ＣＲＡＭ抗体を用いて免疫沈降した後、抗リン酸チロシン抗体（４Ｇ１０）で免疫ブロットした。この結果、過バナジウム酸塩処理によって、ＣＲＡＭのチロシンリン酸化が増強されることが分かった。
また、上記免疫沈澱物は、抗Ｆｅｓ抗体による免疫ブロットで、９５ｋＤａ前後のバンドが認識されたので、リン酸化されたＣＲＡＭにＦｅｓが結合していることが示された。この結果は、Ｐ１９細胞内でも、ＦｅｓがＣＲＡＭをチロシンリン酸化するＰＴＫであることを示すものである。
（Ｃ−２）ＣＯＳ−７細胞におけるＦｅｓのＣＲＡＭリン酸化
次に、ＣＯＳ−７細胞（１×１０^５）を培養皿にて培養し、大体５０％コンフルエントになったとき、ＣＲＡＭおよびＦｅｓの発現ベクター（１〜２μｇ）と無血清メディウムで混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて遺伝子導入した。４８時間後、メディウムを無血清メディウムに変え、４時間後セマフォリン（Ｓｅｍａ３Ａ）にて刺激した後、免疫沈降−免疫ブロットを行って、ＦｅｓによりＣＲＡＭがリン酸化されるか調べた。なお、上記の発現ベクターに組み込んだ遺伝子は、３週齢のマウス脳抽出液より増幅して得た。
この結果、ＣＯＳ−７細胞のＣＲＡＭがチロシンリン酸化されたことが分かった。さらに、Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ ＣＲＡＭを用いて同様の実験を行っても、ＣＲＡＭがチロシンリン酸化された。一方、ＣＲＡＭとＦｅｓ欠損変異体とを共発現させたＣＯＳ−７細胞では、ＣＲＡＭのチロシンリン酸化は観察されなかった。これらの結果は、ＣＯＳ−７細胞発現システムにおいて、ＦｅｓによりＣＲＡＭがリン酸化されることを示すものである。
（Ｃ−３）ＦｅｓのＣＲＡＭリン酸化を確かめるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
次に、ＦｅｓがＣＲＡＭを直接リン酸化しているか調べるため、次のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成実験を行った。まず、発現ベクターによりＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ ＣＲＡＭを導入したＣＯＳ−７細胞を、抗ＣＲＡＭ抗体を用いて免疫沈降し、洗浄後、Ｆｌａｇエピトープペプチドで溶出した。溶出された精製Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ ＣＲＡＭは、１０ｎｇの精製Ｆｅｓおよび３０μＭのＡＴＰと共に、３０μｌの反応液（５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，５ｍＭ ＭｎＣｌ_２，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で１０分間インキュベートし、リン酸化反応させた。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて反応を終了させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗リン酸チロシン抗体（４Ｇ１０）を用いて免疫ブロットした。この結果、Ｆｅｓが直接ＣＲＡＭをリン酸化することが示された。
（Ｃ−４）ＦｅｓによるＣＲＭＰのリン酸化
次に、ＦｅｓがＣＲＭＰをリン酸化するか調べた。ＣＯＳ−７細胞に４種類のＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄＣＲＭＰとＦｅｓとを遺伝子導入すると、すべてのＣＲＭＰについてチロシンリン酸化が観察された。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成実験を上記と同様に行うと、ＦｅｓがＣＲＭＰ２を直接リン酸化していることが示された。これらの結果は、神経分化のときに、ＣＲＡＭおよび４つのＣＲＭＰがＦｅｓの基質になっていることを示すものである。
Ｄ．Ｆｅｓとプレキシンとの結合とその制御
プレキシン（ＰｌｅｘｉｎＡ１）は、セマフォリン（Ｓｅｍａ３Ａ）受容体の１つであり、前述のように、その細胞質部位のチロシンリン酸化が報告されている。そこで、Ｆｅｓがリン酸化されたプレキシンと結合するか調べた。この目的のため、プレキシンの細胞質部位に対する抗プレキシンポリクローナル抗体を作製した。この抗体は、マウス脳溶解液からの免疫ブロット分析で２２０ｋＤａのバンドを認識した。
次に、新生児マウス脳の溶解液から抗プレキシン抗体を用いて免疫沈降を行った。この免疫沈降物からＦｅｓが検出された。この結果は、神経分化において、Ｆｅｓがプレキシンに結合していることを示すものである。
Ｆｅｓとプレキシンとの結合をさらに調べるため、ＤＲＧニューロンにおいて、抗プレキシン抗体および抗Ｆｅｓ抗体を用いた２重免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡で観察した。この結果、合成蛍光画像は、ＤＲＧニューロンの神経突起でのプレキシンおよびＦｅｓのほとんど完全な共局在を示した。
次に、Ｆｅｓとプレキシンとの結合を、ＣＯＳ−７細胞発現システムを用いて調べた。プレキシンのｃＤＮＡは、３週齢マウス脳からｍＲＮＡを逆転写することで得た。ｃＤＮＡの前半部分（１〜２９３４）は、配列番号９および１０に示すプライマーを用いて増幅し、一方、後半部分（２９１１〜５６８５）は、配列番号１１および１２を用いて増幅し、得られた２つの断片を連結させ、ベクターに組み込んだ。
プレキシンおよびＦｅｓを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞から抗プレキシン抗体を用いて免疫沈降し、得られた免疫沈降物からは、抗Ｆｅｓ抗体によりＦｅｓが認識され、Ｆｅｓがプレキシンに結合することが示された。しかし、プレキシン／Ｆｅｓ／ニューロピリン（ＮＰ−１）を遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞では、抗プレキシン抗体による免疫沈降物からはＦｅｓが検出されなかった。この結果は、Ｆｅｓとプレキシンとの結合が、ＮＰ−１発現によりネガティブに制御されることを示すものである。なお、上記の「／」は「および」の意味で使用しており、以下も同様である。
次に、プレキシン／Ｆｅｓ／ＮＰ−１を発現するＣＯＳ−７細胞において、セマフォリン（Ｓｅｍａ３Ａ）刺激による、Ｆｅｓとプレキシンとの結合への影響を調べた。Ｓｅｍａ３Ａ刺激は、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含むＭＥＭメディウム（無血清）で４時間処理した後に、Ｓｅｍａ３Ａを加えることで行った。Ｓｅｍａ３Ａ刺激された上記ＣＯＳ−７細胞では、抗プレキシン抗体による免疫沈降物からＦｅｓが抗Ｆｅｓ抗体により強く認識されたので、Ｓｅｍａ３Ａは、Ｆｅｓのプレキシンへの結合を増強することが分かった。この場合、結合は１０分で最大レベルに達し、３０分以内に減少した。この結果は、Ｓｅｍａ３Ａ刺激がＮＰ−１によるネガティブ制御を取り消し、Ｆｅｓとプレキシンとの相互作用を可能にすることを示すものである。
Ｅ．プレキシンのリン酸化とＮＰ−１共発現による阻害
ＣＯＳ−７細胞において、Ｆｅｓがプレキシンをリン酸化するか調べた。細胞はＨＡタグを付加したＨＡ−プレキシン、Ｆｅｓ、ＨＡ−プレキシン／Ｆｅｓ、ＨＡ−プレキシン／Ｆｅｓ／ＮＰ−１発現ベクターによりそれぞれ形質転換され、形質転換された細胞溶解液を抗プレキシン抗体、抗ＮＰ−１抗体、または抗Ｆｅｓ抗体により免疫ブロットし、その発現を確認した。
次に、各細胞溶解液を抗リン酸化チロシン抗体で免疫ブロットすると、ＨＡ−プレキシンおよびＦｅｓを共発現させたＣＯＳ−７細胞において、顕著なバンドが観察された。このリン酸化チロシンのバンドは、ＮＰ−１を共発現させると著しく減少した。この結果は、ＮＰ−１のプレキシンとＦｅｓとの結合への阻害効果によるものと推測される。つまり、ＮＰ−１はプレキシンとＦｅｓとの結合を阻害することで、プレキシンのリン酸化を阻害しているものと考えられる。
Ｓｅｍａ３Ａ刺激が、Ｆｅｓによるプレキシンのリン酸化にも影響を与えているのか同様の実験で調べたところ、Ｓｅｍａ３Ａ刺激を受けたプレキシン／Ｆｅｓ／ＮＰ−１を発現するＣＯＳ−７細胞においては、プレキシンのリン酸化が認められた。
さらに、Ｓｅｍａ３ＡがＦｅｓを活性化するか調べるため、前記と同様のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。この結果、Ｆｅｓ／プレキシン／ＮＰ−１を発現するＣＯＳ−７細胞において、Ｓｅｍａ３ＡがＦｅｓを活性化していることが分かった。すなわち、ＦｅｓはＳｅｍａ３Ａにより活性化され、１０分で最大レベルに達し、２０分以内に減少した。同様に、細胞のチロシンリン酸化は、１０分で最大レベルに達し、２０分以内に減少した。
また、Ｆｅｓの活性化は、Ｆｅｓ／ＮＰ−１／ｍプレキシン（細胞質部位を欠く変異型プレキシン（アミノ酸１〜１６７４））を発現するＣＯＳ−７細胞では抑制された。この結果は、Ｓｅｍａ３Ａがプレキシンの細胞質部位に依存したかたちでＦｅｓを活性化していることを示すものである。一方、Ｓｅｍａ３Ａ刺激は、Ｆｅｓを介してＣＲＡＭおよびＣＲＭＰ２のリン酸化を増強した。この結果は、Ｓｅｍａ３ＡシグナルとＣＲＭＰ／ＣＲＡＭ複合体との間の分子機構をはじめて明らかにしたものである。
Ｆ．Ｆｅｓとプレキシンとの共発現による細胞収縮
ＮＰ−１／プレキシンを発現するＣＯＳ−７細胞をＳｅｍａ３Ａと共に培養すると、細胞の面積が劇的に減少した。この結果は、プレキシンが通常は不活性であるが、Ｓｅｍａ３Ａ刺激で活性化されて細胞収縮を起こすことを示しており、この細胞収縮は、成長円錐崩壊等のＳｅｍａ３Ａシグナルによるアクチン再編成に連動している可能性がある。
上記の細胞収縮をアッセイシステムとして用い、プレキシン活性化へのＦｅｓの影響を調べた。ＣＯＳ−７細胞を、ＧＦＰ−Ｆｅｓ、ＧＦＰ／プレキシン、ＧＦＰ−Ｆｅｓ／プレキシン、ＧＦＰ−Ｆｅｓ／プレキシン／ＮＰ−１、ＧＦＰ−Ｆｅｓキナーゼ部位欠損変異体（Ｆｅｓ（ｋ−））／プレキシンをコードする発現ベクターでそれぞれ形質転換し、形質転換から４８時間後にＧＦＰ発現によりＦｅｓを可視化した（図２（ａ）参照）。同図に示されるように、プレキシン発現細胞およびＧＦＰ−Ｆｅｓ発現細胞は広がって見えるが、ＧＦＰ−Ｆｅｓ／プレキシン共発現細胞は劇的に収縮した。一方、Ｆｅｓ／プレキシン／ＮＰ−１共発現細胞およびＦｅｓ（ｋ−）／プレキシン共発現細胞では、細胞の形態は変わらなかった。収縮した細胞の割合を、図２（ｂ）のグラフに示す。この結果から、Ｆｅｓはプレキシン活性を誘導していることが示された。
Ｇ．Ｆｅｓによる神経分化の誘導
上記と同様に、ＦｅｓおよびプレキシンのｃＤＮＡを哺乳類細胞用発現ベクター（ｐＣＭＶ５）に組込み、ＣＯＳ−７細胞にリポソーム法にて遺伝子導入を行った。２４〜４８時間後にＦｅｓとプレキシンとを共発現させた細胞の形態を蛍光顕微鏡で観察したところ、図３に示されるように、神経様突起が誘導及び伸展しているのが観察された。なお、同図左の写真は、細胞内のＦｅｓの局在を蛍光で示したもの、中央の写真は、細胞内のα−ｔｕｂｕｌｉｎの局在を蛍光で示したもの、右の写真は、これら２つの写真を重ね合わせたものである。
また、Ｆｅｓ遺伝子をラットＰＣ１２細胞に導入することで、図４に示されるように、ＮＧＦによる神経分化を増強することが確認された。なお、同図左の写真は、ＧＦＰを発現させた細胞のＮＧＦ投与後４日目の形態を示したもの、中央の写真は、ＧＦＰ融合Ｆｅｓタンパク質を発現させた細胞のＮＧＦ投与後４日目の形態を示したもの、右の写真は、ＧＦＰ融合キナーゼ部位欠損型Ｆｅｓタンパク質を発現させた細胞のＮＧＦ投与後４日目の形態を示したものである。
〔実施例２：ＣＲＡＭ結合タンパク質Ｍセプチンの神経分化誘導における役割〕
Ａ．ＣＲＡＭに結合する新規タンパク質の同定
生後２０日齢ラット脳（約１００ｇ）を小片に切断し、氷点下で５倍量の前記抽出液Ａを用いてブレンダーで１分ホモジェナイズし破砕した。以降すべての手順は４℃下で行われた。得られた細胞破砕液を８，０００×ｇで１０分間遠心分離して脂質や壊れ残りの細胞を除去した後、さらに１００，０００×ｇで６０分間遠心して上清の可溶性画分を分離した。得られた可溶性画分は、抗ＣＲＡＭ抗体アフィニティーカラムに吸着させ、抽出液Ａで洗浄した後、１ｍＭの抗ＣＲＡＭ抗体抗原ペプチド（ＣＲＡＭの４６８〜４８５番目のアミノ酸配列）を用いて溶出した。溶出した３０ｍｌの溶出画分は、ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ３０（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いた遠心式限外濾過法により１ｍｌまで約３０倍濃縮した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびＣＣＢ（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）染色法により分析した結果、分子量４６ｋＤａ，５６〜６０ｋＤａ，７０ｋＤａ，９０ｋＤａの位置にタンパク質のバンドが検出されたので、これらのうち４６ｋＤａタンパク質に注目し、さらに詳細に分析した。
４６ｋＤａタンパク質の量をＣＣＢゲル染色により分析すると、約１０ｐ ｍｏｌであると算出された。ポリアクリルアミドゲルにおける４６ｋＤａタンパク質を含む部分を切り取り、組成２０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３，１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル，０．１％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００の反応液１００μｌにて、３μｇの溶解エンドペプチダーゼにより３７℃で一晩消化した。得られたペプチドは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のモデル １７３Ａ、液体クロマトグラフィシステム（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）により分離され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のモデル４９２、自動アミノ酸シークエンサーによりアミノ酸配列を決定した。
これにより、２つのペプチド断片が得られた。ＥＭＢＬデータバンクの公開タンパク質シークエンスを用いたＢＬＡＳＴ相同検索を行うと、２つのペプチド断片はマウス由来のタンパク質「セプチンＨ５」のアミノ酸配列とそれぞれ９２％および１００％一致することが明らかになった。
Ｂ．上記タンパク質をコードする遺伝子配列の決定
上記タンパク質をコードするＤＮＡを取得するため、次のようなＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、生後３週齢マウス脳および生後３月齢のマウス脳からｏｌｉｇｏ−ｄＴセルロースを用いて全ｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。これを鋳型として、上記タンパク質の決定したアミノ酸配列をもとに配列番号７および８に示されるプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
増幅されたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル上で分離された。ＤＮＡ断片は、ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１社）を用いて回収され、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローン化された。クローン化されたすべてのＰＣＲ断片は、ＡＢＩ−３７７自動ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列が確認された。
さらに解析を進めた結果、上記タンパク質をコードする全長遺伝子（ｃＤＮＡ）を発生過程のマウス脳から検出した。その全塩基配列（１，１４０ｂｐ）を決定し構造解析したところ、上記タンパク質「セプチンＨ５」をコードするＨ５ゲノムＤＮＡから選択的スプライシングにより生じたタンパク質であることが分かった。さらに、このタンパク質の機能解析を行ったところ、後述のように、ミトコンドリアと共局在することが観察されたことから、このタンパク質を「Ｍセプチン」と命名した。
一方、生後３月齢マウス脳からは、上記セプチンＨ５をコードするｃＤＮＡ（１，４３７ｂｐ）が検出された。
Ｃ．神経分化の前後におけるＭセプチン発現量の変化
（Ｃ−１）マウス脳におけるＭセプチン発現量
発生過程のマウス脳でのＭセプチンの発現を確かめるため、セプチンＨ５およびＭセプチン両方を認識する特異的抗体を用いて、次のように、胎生１４日（Ｅ１４）マウス脳の溶解物の免疫ブロット解析を行った。
まず、Ｅ１４マウス脳を前記抽出液Ａを用いて４℃にて溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離した後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移して、セプチンＨ５およびＭセプチン両方を認識する特異的抗体でタンパク質の有無を調べた。この抗体は、Ｍセプチンの配列中１９２〜２０８番目のアミノ酸配列と一致する合成ペプチドで免疫したウサギにより得られた。
上記実験の結果、Ｅ１４マウス脳では、Ｈ５ゲノムＤＮＡは、Ｍセプチンに優性的にスプライシングされていた。さらに、同様の実験をマウス脳の各発達段階に従って行うと、Ｍセプチンは、Ｅ１４マウス脳と生後１日（Ｐ１）マウス脳とで優性発現していたのに対して、Ｅ７マウスでは胚全体にセプチンＨ５が発現しており、成体マウス脳ではセプチンＨ５およびＭセプチンのどちらも発現していた。このことから、発生中のマウス脳においては、Ｈ５ゲノムＤＮＡは、主にＭセプチンに転写される様に制御されていることが分かった。
（Ｃ−２）Ｐ１９細胞におけるＭセプチン発現量
上記と同様の実験を、レチノイン酸（ＲＡ）にさらされることにより神経分化誘導される胚芽腫細胞株Ｐ１９細胞についても行った。
この結果、神経分化前（ＲＡにさらして０日目）ではＭセプチン発現量はごく低いが、Ｐ１９細胞がＲＡにさらされるに従って発現量が増加した。Ｍセプチン発現の最大レベルは、ＲＡを培養液に加えてから４日目の神経分化初期であり、細胞が完全に神経分化した（７日目）後は減少する。逆に、セプチンＨ５の発現は４日目までに著しく減少し、その後、細胞が培養皿に接着し、神経突起を伸ばし始めるときに発現量が増加した。
以上のように、ＭセプチンおよびセプチンＨ５の発現はＰ１９細胞の神経分化に従い制御されており、Ｍセプチンが神経分化の誘導に重要な役割を果たしていることが示された。
Ｄ．各細胞内におけるＭセプチンの局在
（Ｄ−１）神経分化したＰ１９細胞内でのＭセプチンおよびセプチンＨ５の分布
神経様細胞でのＭセプチンおよびセプチンＨ５の細胞内局在を調べるため、ＭセプチンおよびセプチンＨ５をそれぞれ認識する抗体を用いて、免疫組織化学的分析を行った。
Ｐ１９細胞は、はじめバクテリア用培養皿にて、１０％ＦＢＳと１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）とを含んだαミニマルエッセンシャルメディウム（α−ＭＥＭ）で凝集させた。２日後浮遊した凝集体を回収し、α−ＭＥＭで洗浄し、再びバクテリア用培養皿に戻し、ＲＡ下で２日間培養した。凝集体は、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡで処理することで細胞単位に分散させ、この細胞懸濁液をカバースリップにまいて培養した。
２重染色のために、細胞をまず抗Ｍセプチン抗体および抗セプチンＨ５抗体と共に室温で一時間反応させ、その後、０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄した。次に、適切な２次抗体（ＦＩＴＣ−ラベルしたヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｃｙ３ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ）を用いて１時間反応させ、標識した。
Ｐ１９細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分固定し、２回ＰＢＳで洗浄し、０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳで１０分透過し、３回ＰＢＳで洗浄し、３％牛血清アルブミンを含むＰＢＳでブロックした。すべての処理は室温で行われた。
そして、ＳｌｏｗＦａｄｅ−Ｌｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）でスライドに固定し、ＯＰＴＩＰＨＯＴ−２（ＮＩＫＯＮ社）とＭＲＣ−１０２４共焦点画像処理システム（ＢＩＯＲＡＤ社）により分析した。
この結果、Ｐ１９細胞の神経分化誘導前では、セプチンＨ５が発現し、びまん的に細胞質、核、細胞膜へ分布していたが、４日目、神経分化が始まる頃になると、Ｐ１９細胞ではＭセプチンが発現し、核の周辺部分に小胞状に分布する。そして、神経分化し終わった７日目頃になると、ＭセプチンとセプチンＨ５との両方が核の周辺部と神経突起とに分布する。
同様の実験をマウス胎児（Ｅ１４）の後根神経節初代培養細胞について行うと、Ｍセプチンが核周辺部位、軸索および成長円錐にて広範囲に発現していた。
また、いずれの細胞においても、Ｍセプチンは、神経発達過程では神経突起と軸索の根底に集中して存在していた。これらの結果は、Ｍセプチンが神経突起誘導と神経細胞の形態変化に重要な役割を果たしていることを示すものである。
（Ｄ−２）ＣＯＳ−７細胞におけるＭセプチンのミトコンドリア分布
次に、ＣＯＳ−７細胞にＭセプチンとセプチンＨ５とを遺伝子導入し、ＭセプチンおよびセプチンＨ５の細胞内局在を、（Ｄ−１）と同様の方法を用いて免疫組織化学的に調べた。遺伝子導入は、ＣＯＳ−７細胞を培養皿にて培養し、大体５０％コンフルエントになったときに無血清メディウムに移して発現ベクターと混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いることで行われた。分析の結果、Ｍセプチンは、ほとんどが大きな小胞構造をとって核周辺部に局在するのに対し、セプチンＨ５は、拡散的に核周辺部から細胞膜へ分布していた。
さらに、Ｍセプチンの小胞状構造は、ミトコンドリアマーカーＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで選択的に染色されたミトコンドリアと完全に一致し、Ｍセプチンが、ミトコンドリア特異的に局在することが示された。
そこで、Ｍセプチンでは欠失している、Ｈ５ゲノムＤＮＡの２番目のエクソンを含むセプチンＨ５のＮ末端部位（１〜１１９アミノ酸部分）のペプチドを、Ｍセプチンと共にＣＯＳ−７細胞に発現させて同様の顕微鏡観察を行った。この結果、Ｍセプチンは、細胞質、核、細胞膜に分布することが観察され、Ｈ５ゲノムＤＮＡの２番目のエクソンの存在が、Ｍセプチンのミトコンドリア局在を阻害することが分かった。
Ｅ．ＣＲＡＭタンパク質の細胞内分布に対するＭセプチンの影響
上記（Ｄ−１）と同様の免疫組織化学的分析を行い、ＣＯＳ−７細胞にＣＲＡＭまたはＣＲＭＰ２を発現させたときに、その細胞内分布がＭセプチンによってどのような影響を受けるのか調べた。
この結果、ＣＯＳ−７細胞にＣＲＡＭ単独を発現させると、ＣＲＡＭは細胞質に分布したが、ＣＲＡＭをＭセプチンと共発現させると、ＣＲＡＭはＭセプチンと共局在しながらミトコンドリアに蓄積されていた。このことから、Ｍセプチンは、ＣＲＡＭを細胞質からミトコンドリアへ移動させるはたらきを持つことが示された。一方、Ｍセプチンは、ＣＲＭＰ２の細胞質分布には影響を与えなかった。
Ｆ．Ｐ１９細胞の神経突起誘導の前のＭセプチンのミトコンドリア分布
上記（Ｄ−１）と同様の免疫組織化学的分析を行い、Ｐ１９細胞の神経分化の間に、内在するＭセプチンがミトコンドリアに局在するかどうか調べた。この結果、Ｍセプチンの発現が最大レベルに達した神経突起誘導４日目に、Ｍセプチンは一時的にミトコンドリアへ移動した。しかし、細胞が神経突起を伸ばし始めた６日目になると、Ｍセプチンはミトコンドリアから離れているのが観察された。このことから、Ｍセプチンは、神経突起誘導前に一時的にミトコンドリアに局在するよう制御されることが示された。
Ｇ．Ｍセプチン変異体の細胞導入
ＣＯＳ−７細胞に、Ｍセプチンをコードする遺伝子をリポソーム法により導入した後、Ｍセプチンまたは微小管（Ｔｕｂｕｌｉｎ）を認識する抗体を用いて、上記（Ｄ−１）と同様の免疫組織化学的分析を行った。この結果、図５に示すように、Ｍセプチンの小胞、すなわちミトコンドリアの周辺には微小管が束化しているのが観察された。なお、同図左の写真は、細胞内のＭセプチンの局在を蛍光で示したもの、中央の写真は、細胞内のＴｕｂｕｌｉｎの局在を蛍光で示したもの、右の写真は、これら２つの写真を重ね合わせたものである。
同様の方法で、「Ｐ−ｌｏｏｐ」モチーフの機能が欠損したＭセプチン変異体（Ｍ−Ｓｅｐｔｉｎ（ＰＬ−））をコードする遺伝子を導入し、分析した結果、微小管の異常な凝集が観察された（図６参照）。このことから、「Ｐ−ｌｏｏｐ」モチーフ欠損型のＭセプチン変異体は、Ｍセプチンの活性型であると考えられた。さらに、この変異遺伝子をラットＰＣ１２細胞に導入することで、ＮＧＦによる神経分化を増強することが確認された。なお、ここで用いた「Ｐ−ｌｏｏｐ」モチーフの機能が欠損したＭセプチンは、配列番号４に示されるアミノ酸配列の５５番目のグリシン（Ｇ）を、バリン（Ｖ）に置換したものである。
一方、「ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ」部位の機能が欠損したＭセプチン変異体（Ｍ−Ｓｅｐｔｉｎ（ＣＣ−））をコードする遺伝子を導入し、同様の方法で分析すると、微小管がバラバラに崩壊し、凝集の消失が観察された（図７参照）。このことから、「ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ」部位欠損型のＭセプチン変異体は、Ｍセプチンの不活性型であると考えられた。さらに、この変異遺伝子をラットＰ１２細胞に導入すると、細胞死が誘導された。
〔実施例３：Ｍセプチンによる変異ミトコンドリアの消去機能について〕
Ａ．Ｍセプチンによる変異ミトコンドリアの封入体形成
Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体とミトコンドリアマーカーであるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒで２重染色し、細胞内局在を比較検討した。
図８右上の図では、Ｍセプチンの凝集塊とミトコンドリアの局在の一致を示している。さらに紫外線ＵＶ（３０ｍＪ）刺激後３時間で同様に観察したところ、図８下図に示す通り、Ｍセプチンがミトコンドリアマーカーで染色される巨大封入体を取り囲んでいることが観察された。この巨大封入体に存在するミトコンドリアＤＮＡは抗ピリミジン２量体抗体で特異的に標識されたので、紫外線照射による変異を受けたミトコンドリアであることが判明した（データ省略）。これらの結果より、Ｍセプチンは変異ミトコンドリアを特異的に認識し、封入体形成（Ｍセプチン封入体）を誘導する役割があることが示された。
Ｂ．Ｍセプチン封入体によるミトコンドリアの消去
（Ｂ−１）Ｍセプチン封入体におけるミトコンドリアＨＳＰ７０の消去
上記Ａと同様に、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体とミトコンドリアタンパク質であるミトコンドリアＨＳＰ７０の抗体で２重染色した。その結果、図９に示す通り、Ｍセプチンにより形成された封入体内においてミトコンドリアタンパク質ミトコンドリアＨＳＰ７０の消去が観察された。同様にチトクロームＣも封入体内に存在が認められなかった（データ省略）。したがって、Ｍセプチンにより形成された封入体内においてミトコンドリア構造はもはや存在せず、封入体内のミトコンドリアタンパク質はなんらかの機構で消去されていることが示唆された。
（Ｂ−２）Ｍセプチン封入体におけるミトコンドリアタンパク質消去機構の解明
上記（Ｂ−１）で封入体内におけるミトコンドリアタンパク質の分解が示唆されたので、その機構を探るために、蛋白質分解誘導に密接に関与することが知られているユビキチン化との関連性に注目し、解析を行った。Ｍセプチン遺伝子とＦｌａｇタグ付きのユビキチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体と抗Ｆｌａｇ抗体で２重染色した。その結果、図１０に示す通り、Ｍセプチンにより形成された封入体とユビキチン化タンパク質の局在の一致が認められた。さらにＭセプチンが自らコイルドコイル領域を介してユビキチン化を受けることが認められた（データ省略）。したがって、Ｍセプチンはユビキチン化を介して、ミトコンドリアタンパク質の分解に関与していることが示唆された。
Ｃ．Ｍセプチン封入体におけるミトコンドリアの酸化
（Ｃ−１）Ｍセプチン封入体におけるミトコンドリアの酸化
図１１に示す通り、Ｍセプチンにより形成された封入体内において、ミトコンドリアマーカーであるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒのシグナル増強傾向が観察された。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒは酸化されることにより蛍光を発するので、封入体内において強い酸化が亢進していることが示唆された。
（Ｃ−２）Ｍセプチンにおける酸化機能を有する領域の検討
Ｍセプチンによる酸化を定量するために、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現した細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒで染色し、ＦＡＣＳ解析でＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒのシグナル増強を定量した結果を図１２に示す。これによって、ＭセプチンにＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒのシグナル増強傾向が定量的に証明された。また、コイルドコイル領域の決失したＭセプチン変異体では酸化亢進が検出されなかった。したがって、Ｍセプチンはコイルドコイル領域を介して、酸化を誘導していることが示唆された。
（Ｃ−３）ＭセプチンによるミトコンドリアＤＮＡの酸化
Ｍセプチンによる酸化現象を確認するために、Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体と抗８オキソグアニン抗体で２重染色した。その結果、図１３に示す通り、Ｍセプチンにより形成された封入体内において８オキソグアニンの生成が観察された。したがって、Ｍセプチンによる酸化誘導がおこり、ミトコンドリアＤＮＡが酸化されていることが確かめられた。
Ｄ．Ｍセプチン封入体の細胞外放出
Ｍセプチン遺伝子をＣＯＳ−７細胞に導入し発現させ、細胞を固定後、抗Ｍセプチン抗体とＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒで２重染色し、時間経過による封入体の動きを観察した。その結果、図１４で示す通り、Ｍセプチン封入体が細胞の外に放出されるという驚くべき現象が観察された。Ｍセプチン封入体の細胞外放出がイムノブロット法による生化学的解析でも示された（データ省略）。
以上の結果より、Ｍセプチンは変異ミトコンドリアを特異的に認識し、封入体を形成することによりミトコンドリアタンパク質のユビキチン化と酸化誘導および細胞外への封入体の放出を行うことにより、変異ミトコンドリアの消去機構に密接に関与していることが示された。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。

産業上の利用の可能性

以上のように、本発明に係る神経化誘導方法、神経化誘導剤、遺伝子およびタンパク質は、神経発生過程や神経分化の制御機構の解明といった神経系の研究を含め、形態形成全般にわたる基礎研究の研究材料・研究手法として幅広く利用できることは勿論であるが、このような基礎研究への利用に止まらず、各種神経疾患に対する治療法としての新たな神経再生技術の開発、新たな遺伝子治療法の開発、各種神経疾患の病態機序の研究、その治療薬の開発、さらには、新たな神経細胞・神経組織の人為的生産技術の開発、またミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療・診断方法等といった応用面・臨床面での幅広い利用が期待できるものである。

Claims (15)

1. ＣＲＡＭタンパク質に結合するタンパク質または当該タンパク質をコードする遺伝子を用いて、細胞または組織の神経化を誘導する方法。
2. 以下の（ａ）または（ｂ）に示される第１のタンパク質または当該第１のタンパク質をコードする遺伝子を用いて、神経化を誘導する請求の範囲１に記載の神経化誘導方法。
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質。
3. 上記第１のタンパク質とプレキシンタンパク質とを、対象とする細胞内で共発現させることにより、神経化を誘導する請求の範囲２に記載の神経化誘導方法。
4. 以下の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示される第２のタンパク質または当該第２のタンパク質をコードする遺伝子を用いて、神経化を誘導する請求の範囲１に記載の神経化誘導方法。
   （ｃ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｄ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＲＡＭタンパク質との結合能を有するタンパク質。
   （ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち、５５番目のグリシン残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
5. 以下の（ａ）または（ｂ）に示される第１のタンパク質または当該第１のタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる神経化誘導剤。
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質。
6. さらに、プレキシンタンパク質または当該タンパク質をコードする遺伝子を含有する請求の範囲５に記載の神経化誘導剤。
7. 以下の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に示されるタンパク質。
   （ｃ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｄ）配列番号４または配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＲＡＭタンパク質との結合能を有するタンパク質。
   （ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち、５５番目のグリシン残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
8. 請求の範囲７に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
9. 配列番号３に示される塩基配列からなる請求の範囲８に記載の遺伝子。
10. 請求の範囲７に記載のタンパク質、または、請求の範囲８もしくは９に記載の遺伝子を含んでなる神経化誘導剤。
11. 請求の範囲７に記載のタンパク質を含んでなる、ミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療用薬剤。
12. 請求の範囲８または９に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
13. 請求の範囲１２に記載の発現ベクターを含んでなる、ミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の治療用薬剤。
14. 請求の範囲７に記載のタンパク質に対する抗体。
15. 請求の範囲７に記載のタンパク質、請求の範囲８または９に記載の遺伝子、および／または、請求の範囲１４に記載の抗体を用いる、ミトコンドリアＤＮＡの異常に由来する疾患の診断方法。

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