JP2002508666A

JP2002508666A - 神経幹細胞遺伝子

Info

Publication number: JP2002508666A
Application number: JP50537999A
Authority: JP
Inventors: ラベル−バッジ，ロビン; ペヴニー，ラリッサ，エイチ．; スミス，オースティン
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2002-03-19
Also published as: AU737409B2; WO1999000516A2; EP0990046A2; GB9713469D0; AU8223898A; CA2295305A1; WO1999000516A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、（a）細胞内でのSox1遺伝子の発現を検出する工程；および（b）細胞を選別してSox1遺伝子を発現する細胞を単離する工程、を含んでなる、細胞集団から神経芽細胞を単離する方法、ならびに細胞にSox1を投与することを特徴とする、細胞を神経経路に運命付ける方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】神経幹細胞遺伝子本発明は、組織から神経幹細をマーキング、選択および作製する方法に関する。特に本発明は、神経芽細胞の作製のためのSox1遺伝子の使用に関する。 SOXタンパク質は、HMGボックスDNA結合ドメイン内の相同性により哺乳動物精巣決定因子SRYに関する転写因子の１ファミリーを構成する。DNA結合研究においてSOXタンパク質は、配列特異的結合を示す。しかし多くの転写因子とは異なり、結合は小溝中で起き、DNAらせん内におおきな湾曲（bend）が引き起こされる。SOXタンパク質はin vitroでリポーター構築物の転写を誘導することができ、クロマチンの古典的転写因子と構造成分の両方の性質を示す（PevenyとLovell-B adge（1997）Cur．Opin．Genetics and Development，7:338-344に総説がある）。 Sox遺伝子ファミリーのメンバーは、種々の胚および成体組織中で発現され、これが特定の細胞系統の発生と合成に関与すると思われる。SryはXY生殖隆起の前駆体セルトリ細胞中で一過性に発現され、雄の表現型の発生の誘発に関与する（Lovell-BadgeとHacker，(1995)Phil．Trans．R．Soc．Lond．B 350:205-214）。このように、Sryの欠如によりXYの雌とXXの雄が生じる。Sox9は、未成熟軟骨細胞および雄の生殖腺中で発現され、ヒトSox9遺伝子内での突然変異は、Campom elic形成異常、ヒト骨格奇形症候群、およびXY女性性転換に関係している。Sox4 は多くの組織で発現され、マウスにおけるこの遺伝子のヌル変異は、成熟Ｂ細胞の欠如と心臓の奇形を引き起こす。Xsox17遺伝子は、アフリカツメガエル（Xeno pus）胚の内胚葉形成に関与している。これらの機能的分析は、Sox遺伝子が多様な発生経路において細胞の運命の決定において機能していることを示唆する。 Sox遺伝子のサブファミリー（Sox1、Sox2、およびSox3を含む）は、脊椎動物の胚形成中に、これらの遺伝子が発生初期の神経系内の細胞の運命決定の制御において機能し得ることを示唆する発現プロフィールを示す。Sox2とSox3は、それぞれ着床前と原外胚葉期に発現され始め、次に感覚上皮に限定される。Sox1は、神経誘導時期の近くでのみ現れる。神経誘導と決定を制御する分子機序が解明され始めている。神経誘導に関与する分泌された分子の細胞的および生化学的方法による同定から、細胞の正体を特定する上で環境が重要な役割を果たすことが示されている。さらに、神経細胞系統(neuronal cell linkage)の特殊化と分化に重要な役割を果たす多くの転写因子が単離されている。例えばハエの神経の特殊化を制御するキイロショウジョウバエ（Drosophila）の神経前および神経原性遺伝子の脊椎動物の同族体の性状解析により、脊椎動物神経細胞の運命決定と分化における類似の分子機序が明らかになった。キイロショウジョウバエ（Drosophila）では、AS-C複合体の基本的ならせん−ループ−らせん転写因子の発現により、外胚葉細胞群の神経としての可能性が確認される。神経細胞の運命決定に関与する転写因子の誤発現が、神経発生の異常を引き起こすことが観察されている。 Sox1発現は、胚の神経誘導期の近辺でのみ現れることが知られている。しかし、胚形成におけるSox1の役割は不明である。発明の概要本明細書において、Sox1発現は神経板の形成と関係することが示される。さらに胎生性癌細胞でのSox1発現の開始は、神経誘導に依存することが示される。So x1発現のアップレギュレーション自体が、多能性細胞に神経の運命を付与するのに充分である。本発明の第１の態様において、（a）細胞内でのSox1遺伝子の発現を検出する工程：および（b）細胞を選別してSox1遺伝子を発現する細胞を単離する工程、を含んでなる、細胞集団から神経芽細胞を単離する方法を提供される。以下の記載で述べるように、SOX1をコードするSox1遺伝子は、神経芽細胞または神経幹細胞の特殊化に関与し、同時にこのような細胞のマーカーとして作用する。Sox1の発現は神経芽細胞タイプの生成に関与し、これはin vivoでCNSの多くの異なる細胞および神経節へ分化することができる。さらにSox1は神経芽細胞のユニークなマーカーである。例えば抗SOX1抗体への結合、SOX1依存性リガンド−受容体系の活性化、または Sox1 mRNAに特異的なアンチセンス核酸を用いる検出により、この遺伝子を発現するとして同定される細胞は、多能性神経芽細胞である。このような細胞は、初期の胚組織または成体CNS物質中で確認することができる。細胞は、アフィニティ技術またはセルソーティング（例えば、蛍光活性化セルソーティング）により選別でき、この場合、細胞は、例えばアンチセンス核酸分子または免疫グロブリンまたはそれらの一部に結合している蛍光物質のような適当な標識物により標識される。本発明の第２の態様によれば、神経芽細胞は、リポーター系を使用してin viv oでSOX1の発現を検出することによって他の細胞型から積極的に選別することができる。したがって、例えば本発明は、（a）Sox1調節領域に機能しうる形で連結された検出可能なマーカーをコードするコード配列を含む遺伝子構築物で、細胞集団をトランスフェクトする工程；（b）該選択マーカーを発現する細胞を検出する工程、および（c）該選択マーカーを発現する細胞を該細胞集団から選別する工程、を含んでなる、細胞集団から神経芽細胞を単離する方法を提供する。従来と同様に、選択マーカーは任意の選択可能な物質であるが、好ましくは、自動セルソーティング法により検出され選別される蛍光または発光マーカーである。例えばマーカーはGFPまたはルシフェラーゼでもよい。他の有用なマーカーとしては、細胞膜で発現され、従ってアフィニティ手段によるセルソーティングを促進するものが含まれる。本発明の遺伝子構築物は、全体的調節がSOX1に感受性である（すなわち、SOX1 の非存在下ではマーカーコード配列の発現が起きない）限り、必要に応じて任意のプロモーターおよびエンハンサーエレメントを含んでよい。Sox1遺伝子の調節配列は当技術分野で公知であり、本明細書で引用し参照することにより本明細書の一部とされる文献に記載されている。しかし少なくとも、本発明の構築物はSO X1結合部位を含む。好ましくはSOX1調節エレメントはその全体が使用される。しかしSOX1の影響下にある限り、他のプロモーターおよびエンハンサーエレメントを使用してもよい。神経芽細胞のみがSOX1を発現するため、選択マーカーはこれらの細胞中でのみ発現され、これはSox1調節配列からの転写を必要とする。従って好ましくは、選択マーカーを発現させるのに使用される発現系は、漏出性(leaky)ではなく、SOX 1の非存在下では最小量のマーカーを発現する。従って、本発明のコード遺伝子構築物により細胞を形質転換し、マーカーを検出し、かつ細胞を選別する技術は当技術分野で公知である。第３の態様において本発明は、前駆細胞を形質転換し、それによってそこから神経芽細胞を分化させるための、Sox1コード配列の使用を提供する。従って（a）適当な調節配列に機能しうる形で連結されたSox1コード配列を含む遺伝子構築物で、多能性前駆細胞を形質転換する工程；および（b）該細胞を培養してSox1コード配列を発現させ、こうして細胞が神経芽細胞に分化するように誘導する工程、を含んでなる、１つまたはそれ以上の多能性前駆細胞から１つまたはそれ以上の神経芽細胞を分化させる方法を提供する。本発明の第３の態様で使用される適当な調節配列は当技術分野で公知であり、誘導性または構成性調節配列を含有してもよい。誘導性調節配列は、所望すれば、例えば細胞が他の神経細胞に分化してしまえば、Sox1発現のスイッチが切られるという利点を有する。さらに外因性Sox1の発現のスイッチが切られると、うまく分化した神経芽細胞は、内因性Sox1遺伝子の継続的発現により同定される。前駆細胞は、例えばヒトES細胞のようなES細胞および生殖細胞から得られる同様の多能性を有する細胞（EG細胞）でもよい。より具体的な神経多能性前駆体または直接神経芽細胞前駆体を使用してもよい。本発明により得られる神経芽細胞は、多くの方法で使用される。もちろんSox1 の発現は、神経分化の研究において重要な意味を有する。神経芽細胞の作製と選択は、基礎研究の材料を提供する。さらに本発明は、医学的および診断的用途を有する。Sox1発現細胞の検出は、臨床神経学および神経系の癌の診断と治療に重要である。従って本発明は、診断目的での上記の神経芽細胞の存在の検出方法を提供する。神経幹細胞はまた、神経疾患、特にCNSの事故による外傷の修復またはCNSの先天的または病的疾患の修正に有用である。さらに神経組織の遺伝的欠陥を修正するように設計された体細胞遺伝子治療を含む用途において、活発に分裂している多能性神経芽細胞の除去、処置および置換は明らかに有利であり、標的とする欠陥を永久に治療するための修飾神経細胞の恒常的供給源となる。Sox1調節配列は、必要な場合には神経芽細胞内でのトランスジーン発現を指令するように具体的に使用することができる。さらに遺伝子発現は、in vivoで成熟ニューロン中でのNF-1の発現を指令するNF-1調節配列のような他の調節配列の使用により、神経芽細胞から分化する神経細胞型を対象とすることができる。本明細書に記載の方法の大きな利点は、神経疾患の治療の必要な患者が自己ドナーになるということである。すなわち患者から細胞を単離し、選別して神経芽細胞を分泌させるか、または特定のまたは一般的な前駆体から上記の神経芽細胞を分化させるために処理する。発明の詳細な説明本発明は、神経になるように運命付けられた(committed to the neutral fate )細胞の単離または生産方法に関する。従って本明細書において神経芽細胞という用語は、神経経路に沿って分化を始めた任意の細胞または細胞系を意味する。神経経路に運命付けられているがまだ最終分化していない細胞を得るために、細胞集団からの神経芽細胞の単離が好ましい。このような細胞は、神経分化の研究、および神経変性疾患のような疾患、および例えば外傷により引き起こされた神経障害の治療に、有用である。したがって、神経芽細胞を分化させる典型的な細胞集団としては、哺乳動物（例えばヒト）のCNS（成体および胎児のCNSを含む）から得られる細胞集団がある。さらに組織培養により得られる細胞集団を、神経芽細胞の単離に使用してもよい。 SOX1発現は、in vitroとin vivoの両方で外胚葉による神経の運命の獲得に密接に関連している。多能性EC細胞凝集物にレチノイン酸を添加すると、神経上皮マーカー（例えば、NESTIN、Mash1およびWnt1）の誘導に一致して、24時間後に in vitroのSox1発現が始まる。マウスやラットの胚では、発現は前／遠位外胚葉の細胞に限定される。従来の発生運命地図研究では、原外胚葉のこの領域が神経系の原基を構成することを示している。 SOX1の発現は、神経板の細胞および初期神経管でその全後方向の軸全体に沿って検出される。予定CNS全体でSox1が早期かつ均一に発現されることは、Sox1が神経誘導性シグナルにより活性化され、神経系の作製（神経化そして次に部域分化）の形成体シグナルに対する外胚葉の２段階応答の仮説を支持している。 Sox遺伝子サブファミリーの発現は、進化的に保存されている。キイロショウジョウバエ（Drosophila）（NambuとNambu 1996；Russelら、1996）、ゼブラフィッシュ（Vrizら、1996）、および鳥類（Unwanoghoら、1995；Streitら、1997 ；Rexら、1997）のSox1、Sox2、およびSox3の予定オルソログ体（orthologue）は、神経原基中で発現を示す。すなわちSox遺伝子のこのサブフアミリーは、一般的な初期神経上皮マーカーとして作用することができる転写因子の新規な群である。神経芽細胞を単離するために、本発明はその中のSox1の検出を提供する。本明細書においてSox1は、哺乳動物、鳥類および脊椎動物を含む任意の供給源から誘導される。Sox1はまた、非脊椎動物源からも誘導される。 Sox1は、ヒト、ニワトリおよびマウスからクローン化されている。ニワトリ、マウスおよびヒトのSox1の配列は、本明細書の配列番号１〜３に記載されている。 Sox1をコードする好適な配列は、ヒトSox1をコードしかつ配列番号３の配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号３と同じ配列を有する核酸が最も好ましい。本明細書において実質的に同じ配列とは、少なくとも約90％の同一性を有する。しかし、例えば追加のエキソン配列を有するスプライス変種の場合は、相同性は低くてもよい。プローブまたは他の用途に使用される場合も、本発明の核酸は好ましくは、配列番号３に示すヒトSox1の配列と実質的に相同的である。本明細書において「相同性」とは、２つの物質が、その起源と機能においてこれらが同様であると当業者が決定するのに充分な特徴を共有することを意味する。好ましくは相同性は、配列の同一性を示すのに使用される。すなわち本発明のSox1配列は、ヒトSox1と実質的に同一の配列を保持する。「実質的な相同性」ここで相同性は配列の同一性を示す）とは、直接の配列アライメントおよび比較により判定すると、40％を超える配列同一性、好ましくは 45％を超える配列同一性、および最も好ましくは50％またはそれ以上の配列同一性を意味する。配列相同性（または同一性）は、例えばデフォールトのパラメータを使用して、任意の適当な相同性アルゴリズムを使用して決定してもよい。BLASTアルゴリズムを使用して、パラメータをデフォールト値に設定することが有利である。BL AST アルゴリズムは、詳細にはhttp://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htm l（これは参照することにより本明細書の一部とする）に記載されている。探索パラメータは以下のように規定され、規定のデフォールトパラメータに設定することが有利である。 BLASTにより評価される「実質的な相同性」は、少なくとも７、好ましくは少なくとも９、および最も好ましくは10またはそれ以上のEXPECT値に一致する配列と等しいことが有利である。BLAST探索のEXPECTのデフォールト閾値は通常10である。 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、blastn 、blastx、tblastn、およびtblastxにより使用される実践的探索アルゴリズムである。これらのプログラムは、その重要性を、KarlinとAltschul（http://www.n cbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html）の統計的方法に幾つか改良を加えたものを使用するこれらの知見にあるとしている。BLASTプログラムは、例えば質問の配列の相同体を同定するための配列の類似性の探索に合わせて作られた。このプログラムは一般的に、モチーフスタイルの探索には有用ではない。配列データベースの類似性探索の基礎的事項の説明については、Altschulら（1994）Nature G enetics 6:119-129を参照されたい。 http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用できる５つのBLASTプログラムは、以下のタスクを行う。 blastpは、質問のアミノ酸配列をタンパク質配列データベースと比較する。 blastnは、質問のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。 blastxは、質問のヌクレオチド配列（両方の鎖）の６フレーム概念(6-frame c oncetual)翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較する。 tblastnは、質問のタンパク質配列を、６つのすべて読みとり枠（両方の鎖）で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する。 tblastxは、質問のヌクレオチド配列の６フレーム(6-frame)翻訳物を、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物と比較する。 BLASTは、以下の探索パラメータを使用する。 HISTOGRAMは、各探索のスコアのヒストグラムを表示する。デフォールトはyes である（BLASTマニュアル中のパラメータＨを参照されたい）。 DESCRIPTIONSは、報告された一致する配列の短い記載の数を特定された数に限定する。デフォールトの限界は100の記載である（マニュアルのページ中のパラメータＶを参照されたい）。EXPECTとCUTOFFも参照されたい。 ALIGNMENTSは、データベースの配列を、高スコアセグメント対（HSPs）が報告されている特定された数に限定する。デフォールト限界は50である。これより多くのデータベース配列が、たまたま報告の統計的有意の閾値（下記のEXPECTとCU TOFFを参照されたい）を満足するなら、最大の統計的有意性がある一致のみが報告される（BLASTマニュアルのパラメータＢを参照されたい）。 EXPECTは、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意閾値。 KarlinとAltschul(1990)の確率モデルに従って、偶然によって10の一致がのみ見つかることが予測されるように、デフォールト値は10である。一致に帰される統計的有意性がEXPECT閾値より大きいなら、一致は報告されない。低いEXPECT閾値はよりきびしく、偶然の一致がより小さいものが報告される。端数値は許容される（BLASTマニュアルのパラメータＥを参照されたい）。 CUTOFFは、高スコアセグメント対を報告するためのカットオフスコア。デフォールト値は、EXPECT値（上記）から計算される。HSPは、これに帰因する統計的有意性が、少なくともCUTOFF値と等しいスコアを有する孤立HSPに帰されるものと同程度に高い場合のみ、データベース配列について報告される。高いCUTOFF値はよりきびしく、偶然の一致がより小さいものが報告される（BLASTマニュアルのパラメータＳを参照されたい）。典型的には、有意性閾値は、EXPECTを使用して、より直感的に管理される。 MATRIXは、BLASTP、BLASTX、TLBASTN、およびTBLASTXの交互のスコアマトリックスを特定する。デフォールトマトリックスはBLOSUM62である（Henikoff & Hen ikoff，1992）。有効な交互の選択としては、PAM40、PAM120、PAM250およびIDEN TITYがある。BLASTNについては交互のスコアマトリックスは利用できない。BLAS TNのMATRIX指令を選ぶと、エラー応答が返ってくる。 STRANDは、TBLASTN探索を、データベース配列のすぐ上または下の鎖に限定する。あるいはBLASTN、BLASTXまたはTBLASTX探索を、質問の配列の上または下の鎖上の読みとり枠に限定する。 FILTERは、Wootton & Federhen（1993）ComputersとChemistry 17:149-163のS EGプログラムにより決定した場合に低い組成複合性（compositional complexity ）を有する質問の配列のセグメント、またはClaverie & States（1993）Compute rsとChemistry 17:191-201のXNUプログラムにより、またはBLASTNについてTatus ovとLipmanのDUSTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）により決定した場合に短い周期性内部繰り返しからなるセグメントをマスクする。フィルタリングにより、blastアウトプットから統計的には有意であるが生物学的に興味のない報告（例えば、通常の(common)酸性、塩基性またはプロリンの豊富な領域に対するヒット）は排除され、データベース配列に対して特定の一致について利用可能な質問の配列の生物学的により興味深い領域が残る。フィルタープログラムにより見つかる低複雑性配列は、ヌクレオチド配列中で文字「Ｎ」を使用して（例えば、「NNNNNNNNNNNNN」）、およびタンパク質配列中で文字「Ｘ」を使用して（例えば、「XXXXXXXXX」）代用される。ユーザーは、「Advanced options for the BLAST server」ページの「フィルター」オプションを使用してフィルタリングを切ってもよい。フィルタリングは、質問の配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォールトフィルタリングは、BLASTNについてはDUST、他のプログラムについてはSEGである。 SWISS-PROT中で配列に適用される時、SEG、XNU、またはこの両方により何もマスクされないことは珍しくなく、従ってフィルタリングがいつも有効であると期待すべきではない。さらに、ある場合には配列が完全にマスクされることもあり、フィルタリングされていない質問の配列に対して報告される一致の統計的有意性を疑うべきであることを示している。 NCBI-glは、受け入れ名および／または位置名以外に、アウトプット中にNCBIg i識別名が示されるようにする。最も好ましくは、配列比較は、http://www.ncbi.nim.nlh.gov/BLASTで与えられる単純なBLAST探索アルゴリズムを使用して行われる。好ましくは本発明は、Sox1コード配列の断片を使用する。数ヌクレオチド（好ましくは５〜150ヌクレオチドの長さ）の長さの核酸配列の断片が、プローブとして特に有用である。あるいは核酸の例は、Sox1タンパク質をコードし、配列番号３に記載のDNA配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または該DNA配列の選択された断片として、解析することができる。好適なものは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号３の配列にハイブリダイズするSox1をコードする配列である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、その条件下でポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。そのような条件は、当業者には明らかである。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Tm ）に反映されており、これは配列相同性が１％上昇する毎に約１〜1.5℃低下する。一般にハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的にはハイブリダイゼーション反応は、高ストリンジェンシー条件下で行われ、次に種々のストリンジェンシー条件下で洗浄される。本明細書において高ストリンジェンシーとは、65〜68℃で1MのNa+で安定なハイブリッドを生成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。高ストリンジェンシー条件は、例えば6xSSC、5xデンハルツ溶液、１％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1 Na+ピロリン酸および非特異的競合物質としての0.1mg/ml変性サケ精子DNAを含有する水溶液中のハイブリダイゼーションにより与えられる。ハイブリダイゼーション後、数工程の高ストリンジェンシー洗浄が行われ、0.2〜0.1xSSC、0.1％ SDS中でハイブリダイゼーション温度で最後の洗浄（約30分）が行われる。中程度のストリンジェンシーとは、上記溶液中であるが約60〜62℃でのハイブリダイゼーションに等しい条件を意味する。この場合、最後の洗浄は、1xSSC、0 .1％ SDS中でハイブリダイゼーション温度で行われる。低ストリンジェンシーとは、上記溶液中であるが約50〜52℃でのハイブリダイゼーションに等しい条件を意味する。この場合、最後の洗浄は、2xSSC、0.1％ S DS中でハイブリダイゼーション温度で行われる。これらの条件は、種々のバッファー（例えばホルムアミドベースのバッファー）と温度を使用して適合させ繰り返されると理解される。デンハルツ溶液とSSC は、他の適切なハイブリダイゼーションバッファーのように当業者に公知である（例えば、Sambrookら編、（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，C old Spring Harbor Laboratory Press，New YorkまたはAusubelら編、（1990）C urrent Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.を参照されたい）。ハイブリダイズする対の長さとGC含量も影響を与えるため、最適なハイブリダイゼーション条件は、実験的に決定すべきである。本発明はさらに、配列番号３の断片にストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を有利に提供する。好ましくは断片は15〜50塩基長である。これは約25塩基長であることが有利である。当業者には理解できるように、遺伝子コードの冗長のために、ヒトSox1をコードする多くの配列の設計が可能になる。これらの配列の任意のものが、以下に記載するSOX1を発現するのに有用である。ヒトSox1配列でないヒトSOX1をコードする配列を使用することの利点は、産生されるmRNAが、内因性Sox1 mRNAとは異なる配列を有し、従ってこれと区別し得ることである。内因性または外因性Sox1遺伝子のいずれかの発現を選択的に阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが設計され得る。ヒトSOX1をコードする縮重配列を、配列番号５に記載する。本明細書に記載の指針により、当技術分野で公知の方法に従って、Sox1をコードする核酸を得ることができる。例えばSox1をコードする核酸は、化学合成により、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、またはSox1を含有しこれを検出可能なレベルで発現すると考えられる供給源からゲノムライブラリーもしくは適切なcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、得ることができる。目的の核酸の合成のための化学的方法は当技術分野で公知であり、トリエステル法、亜リン酸法、ホスホラミダイト法およびH-ホスホン酸法、PCRおよび他のオートプライマー法、ならびに固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成がある。核酸の完全な核酸配列がわかっている場合、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が利用できる場合、これらの方法を使用することができる。あるいは、標的アミノ酸配列がわかっている場合、各アミノ酸残基について既知のかつ好適なコード残基を使用して可能な核酸配列を推定してもよい。 Sox1をコードする遺伝子を単離する別の手段は、例えばSambrookら（1989）の第14節に記載のPCR技術を使用することである。この方法は、Sox1核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択のための方策を以下に説明する。目的の遺伝子またはこれがコードするタンパク質を同定するように設計されたプローブまたは分析手段により、ライブラリーをスクリーニングする。cDNA発現ライブラリーの場合、適当な手段には、Sox1を認識しこれに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；同じまたは異なる種由来の既知のまたは疑われるSox1 cDNAをコードする約20〜80塩基長のオリゴヌクレオチド；および／または、同じかもしくはハイブリダイズする遺伝子をコードする相補的なまたは相同的なcDNAもしくはその断片がある。ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするのに適したプローブとしては、特に限定しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド、同じDNAまたはハイブリダイズするDNAをコードする cDNAもしくはその断片；および／または相同的なゲノムDNAもしくはその断片がある。 Sox1をコードする核酸は、適当なハイブリダイゼーション条件下で適当なcDNA またはゲノムライブラリーを、プローブすなわち配列番号３に記載の配列から得られるオリゴヌクレオチドを含む本明細書に開示の核酸を用いて、スクリーニングすることにより単離される。適切なライブラリーは市販されているかまたは例えば細胞系、組織サンプルなどから調製することができる。本明細書において、プローブは、配列番号３に記載の連続する塩基と同じ数またはそれより多い数の塩基と同じである（またはその相補体）10〜50、好ましくは15〜30、および最も好ましくは少なくとも約20の連続する塩基を含むヌクレオチドの配列を有する、１本鎖DNAまたはRNAである。プローブとして選択される核酸配列は、擬陽性の結果が最小になるように充分な長さを有し明白であるべきである。このヌクレオチド配列は通常、Sox1の保存されたかまたは高度に相同的なヌクレオチド配列もしくは領域に基づく。プローブとして使用される核酸は、１つまたはそれ以上の位置で縮重してもよい。その種での優先的なコドン使用が不明である種からライブラリーをスクリーニングする場合は、縮重オリゴヌクレオチドの使用が特に重要である。プローブを構築するのに好適な領域には、5'および／または3'コード配列、リガンド結合部位をコードすると予測される配列などがある。例えば本明細書に開示の完全長cDNAクローンまたはその断片はプローブとして使用することができる。好ましくは本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーションにより容易に検出できるように、適当な標識手段により標識される。例えば適当な標識手段は放射能標識物である。DNA断片を標識するのに好適な方法は、当技術分野で公知のように、ランダムプライミング反応においてDNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてα³²P dATPを取り込むことである。オリゴヌクレオチドは通常、γ³²P標識ATPとポリヌクレオチドキナーゼで末端標識される。しかし他の方法（例えば、非放射性）を使用して断片またはオリゴヌクレオチドを標識することができ、例えば酵素標識、適当な蛍光物質とビオチン化を用いる蛍光標識がある。例えば実質的にSox1をコードする配列全体を含むDNAの一部または該DNAの一部に基づく適当なオリゴヌクレオチドでライブラリーをスクリーニングした後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出して陽性クローンを同定する。同定されたクローンは、制限酵素マッピングおよび／またはDNA配列解析により性状解析され、次に例えば本明細書に示した配列と比較して、これらが完全なSox1をコードするDNAを含有するかどうか（すなわち、これらが、翻訳開始コドンおよび停止コドンを含有するかどうか）を確認する。選択されたクローンが不完全なら、これらを使用して再度スクリーニングするかまたは異なるライブラリーをスクリーニングして重複するクローンを得る。ライブラリーがゲノミックであるなら、重複クローンはエキソンやイントロンを含有することもある。ライブラリーがcDNA ライブラリーなら、重複クローンはオープンリーディングフレームを含む。いずれの場合も、完全なクローンは本明細書に記載のDNAおよび推定アミノ酸配列と比較することにより確認される。 Sox1をコードする配列は、ヌクレオチドストレッチ（stretch）のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入または反転、およびこれらの任意の組合せにより容易に修飾することができると考えられる。そのような突然変異体を使用して、例えば天然に存在するSOX1配列とは異なるアミノ酸配列を有する SOX1変異体を産生することができる。突然変異誘発は、あらかじめ決められた（部位特異的）ものでもランダムでもよい。サイレント変異ではない変異は、読みとり枠の外に配列を置いてはならず、好ましくはハイブリダイズして２次mRNA構造（例えば、ループまたはヘアピン構造）を産生できる相補的領域を作製しない。 Sox1遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、前述の当技術分野で公知の方法により行われる。例えば細胞はフローサイトメトリーすなわちFACSにより選別してもよい。一般的な文献としては、Flow Cytometry and Cell Sorting:A Labo ratory Manual（1992）A．Radbruch（編）、Springer Laboratory，New Yorkを参照されたい）。フローサイトメトリーは、細胞を研究し精製するのに強力な方法である。これは応用範囲が広く、特に免疫学および細胞生物学において使用されている。しかしFACSの能力は、生物学の他の多くの分野に応用することができる。頭字語F.A. C.S.は、蛍光活性化細胞ソーテイング（Fluorescence Activated Cell Sortlng ）を意味し、「フローサイトメトリー」と互換的に使用される。FACSの原理は、薄い流体の流れの中に置かれた各細胞を１つまたはそれ以上のレーザー光に通すと、光が分散され、蛍光色素が種々の振動数の光を放出するというものである。光電子増倍管（PMT）は光を電気シグナルに変換し、これはソフトウェアにより解釈されて細胞についてのデータを生成する。所定の特徴を有する細胞の亜集団が同定され、非常に高純度（〜100%）の懸濁液から自動的にソーティングすることができる。 FACS装置は、異なるレーザー光励起と蛍光放出波長に対応する１〜数個のチャネルで蛍光シグナルを集める。蛍光標識は、細胞の構造と機能の多様な面の研究を可能にする。最も広く使用されている応用は免疫蛍光（フルオレセインやフィコエリトリンのような蛍光色素に結合した抗体による細胞の染色）である。この方法はしばしば細胞表面上の分子を標識するのに使用されるが、抗体は細胞内の標的にも向けることもできる。直接免疫蛍光法では、特定の分子（SOX1ポリペプチド）に対する抗体を直接蛍光色素に結合させる。次に細胞を１工程で染色する。間接免疫蛍光法では、１次抗体は標識されないが、１次抗体に特異的な蛍光結合した２次抗体が加えられる。例えば、抗SOX1抗体がマウスIgGである場合、２次抗体はマウスIgGに対するラットまたはウサギの抗体でもよい。 FACSは、SOX1をコードする組換えDNAでトランスフェクトされた細胞中の遺伝子発現を測定するのに使用することができる。これは、タンパク質生成物を直接標識するか、または構築物中のリポーター遺伝子を使用して間接的に行うことができる。リポーター遺伝子の例には、β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質（GFP）がある。β−ガラクトシダーゼ活性は、フルオレセインジガラクトシド（FDG）のような蛍光性基質を使用してFACSにより検出することができる。FDGは低張ショックにより細胞中に導入され、酵素により切断されて蛍光生成物を生成し、これは細胞内に捕捉される。従って１つの酵素が多量の蛍光生成物を生成することができる。GFP構築物を発現する細胞は、基質の添加無しに蛍光を発するであろう。異なる励起周波数を有するが同じチャネルで蛍光を発するGFPの変異体が入手できる。２レーザーFACS装置では、異なるレーザーで励起される細胞を区別することができ、従って同時に２つのトランスフェクション体を測定することができる。細胞ソーティングのための別の方法を使用してもよい。例えば本発明は、Sox1 mRNAに相補的な核酸プローブの使用を含む。このようなプローブを使用して、S ox1を発現する細胞を個別に同定し、次にこれを手動でまたはFACSソーティングにより選別してもよい。Sox1 mRNAに相補的な核酸プローブは、前述の教示に従ってSambrookら(1989)に記載の一般的方法を使用して調製してもよい。好適な実施形態において本発明は、FACS細胞ソーティングで使用される蛍光物質に結合した、Sox1 mRNAに相補的なアンチセンス核酸分子の使用を含む。 FACSで使用される適当な画像化（イメージング）剤は、任意の適当な方法により細胞にデリバリーされ、こういった方法には細胞培養物中での直接細胞への暴露、ウイルスまたは非ウイルスベクター手段により一過性に発現する核酸のデリバリー、核酸または画像化剤のリポソーム介在輸送などがある。ある実施形態において本発明は、SOX1を特異的に認識して結合する抗体を含む。例えばこのような抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するSOX1に対して作製される。あるいはSOX1またはSOX1断片（これもin vitro法により合成できる）を、免疫原性ポリペプチドに融合（組換え発現またはin vitroペプチド結合により）して、この融合ポリペプチドを使用してSOX1エピトープに対する抗体を作製する。抗SOX1抗体は、免疫した動物の血清から回収してもよい。モノクローナル抗体は、免疫した動物から常法に従って調製してもよい。本発明の抗体は、本発明に従ってSox1を発現する神経細胞中のSOX1を同定するのに有用である。本発明の抗体は、天然のクラスの抗体（例えば、IgEおよびIgM抗体）全てでもよいが好ましくはIgG抗体である。さらに本発明は、抗体断片、例えばFab、F(ab ')2、FvおよびScFvを含む。小さい断片（例えばFvおよびScFv）は、その小ささとそれに伴う優れた組織分布性のため、診断および治療での応用に有利な性質を有する。抗体は、標識物を含有してもよい。特に好適な標識物は、in vivoで神経細胞中の抗体の画像化（イメージング）を可能にするものである。このような標識物は組織内で容易に視覚化可能な放射能標識物または放射線不透過性標識物（例えば、金属粒子）でもよい。さらにこれらは、組織中で視覚化され細胞ソーティングに使用される蛍光標識物または他の標識物でもよい。組換えDNA技術を使用して、本発明の抗体を改良してもよい。すなわち、診断または治療的応用においてその免疫原性を低減させるために、キメラ抗体が構築される。さらに、CDR移植［ヨーロッパ特許出願第0239400号（Winter）を参照されたい］および任意でフレームワーク修飾により、抗体をヒト化することにより、免疫原性を最小にしてもよい。本発明の抗体は、動物の血清から得てもよく、またはモノクローナル抗体もしくはその断片の場合は、細胞培養により産生することができる。組換えDNA技術を使用して、細菌または好ましくは哺乳動物細胞培養で確立された方法に従って抗体を産生してもよい。選択された細胞培養系は、好ましくは抗体産物を分泌する。従って本発明は、上記タンパク質をコードする第２のDNA配列に正しい読み取り枠で結合したシグナルペプチドをコードする第１のDNA断片に機能しうる形で連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換した宿主（例えば、大腸菌（E．coli）または哺乳動物細胞）を培養し、該タンパク質を単離することを特徴とする、本発明の抗体の産生方法を含む。 in vitroでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、通常の標準的な培地である適切な培地、例えば哺乳動物血清（例えば牛胎児血清）、または微量元素および増殖維持補助剤（例えば、正常なマウス腹腔内滲出細胞のようなフィーダー細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、2-アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）を任意で補足したダルベッコー改変イーグル培地（DMEM）またはRPMI1640培地中で行われる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当技術分野で公知の適当な培地、例えば細菌については培地LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SO B、SOC、2xYT、またはM9最小培地、および酵母については培地YPD、YEPD、最小培地または完全最小ドロップアウト培地（Complete Minimal Dropout Medium）中で行われる。 in vitroでの生産は、比較的純粋な抗体調製物をもたらし、スケールアップして所望の抗体を大量に得ることを可能にする。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞の培養の技術は当技術分野で公知であり、均一懸濁培養（例えば、空気反応層槽または連続攪拌反応槽）、または固定化培養または捕捉細胞培養（例えば、中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上）がある。大量の所望の抗体はまた、in vivoで哺乳動物細胞を増殖させることによっても得られる。このために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、組織適合性哺乳動物に注射して抗体産生腫瘍の増殖を引き起こす。場合により、注射前に動物を炭化水素（特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）のような鉱物油）でプライミングしてもよい。１〜３週間後、これらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば好適なミエローマ細胞と、Balb/cマウスの抗体産生脾臓細胞または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Sp2/0から得られるトランスフェクション細胞とを、融合して得られるハイブリドーマ細胞を、プリスタンで任意で前処理したBalb/cマウスの腹腔内に注射し、１〜２週間後、マウスから腹水を採取する。 SOX1を発現する細胞の免疫蛍光染色、免疫ブロッティング、酵素免疫定量法（例えば、サンドイッチ測定法またはドット測定法）、またはラジオイムノアッセイにより選択的に、所望の抗体について細胞培養物上清をスクリーニングする。抗体の単離のために、培養上清または腹水中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウム沈殿、吸湿性物質（例えばポリエチレングリコール）に対する透析、選択膜によるろ過などにより、濃縮してもよい。必要および／または所望であれば、通常のクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAEセルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィー（例えば、SOX1タンパク質またはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィー）により、抗体を精製する。本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞に関する。本発明の好適なハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望の特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を分泌し、急速冷凍した培養物から解凍と再クローニングにより活性化することができる。本発明はまた、SOX1に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の調製法であって、適当な哺乳動物（例えばBalb/cマウス）を精製SOX1タンパク質、精製SOX1を含有する抗原性担体、またはSOX1を有する細胞で免疫し、免疫した哺乳動物の抗体産生細胞を、適当なミエローマ細胞系の細胞と融合させ、融合で得られたハイブリッド細胞をクローン化し、そして所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする方法に関する。例えばSOX1を有する細胞で免疫したBalb/cマウスの牌臓細胞を、ミエローマ細胞系PAIまたはミエローマ細胞系Sp2/0-Ag14の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、そして陽性ハイブリドーマ細胞をクローン化する。好適な方法は、数ヶ月間（例えば２〜４ヶ月）Balb/cマウスを、適当なアジュバントを含有するSOX1を発現するヒト腫瘍起源の10〜10⁷-10⁸細胞を皮下および／または腹腔内に数回（例えば４〜６回）数ヶ月間（例えば２〜４ヵ月間）にわたって注射して免疫し、最後の注射の２〜４日後に免疫マウスから脾臓細胞を採取し、融合促進物質（好ましくはポリエチレングリコール）の存在下でミエローマ細胞系PAIの細胞と融合することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞系の調製法である。好ましくはミエローマ細胞は、分子量約4000のポリエチレングリコール約30％〜約50％を含有する溶液中の３〜20倍過剰の免疫マウスの脾臓細胞と融合させる。融合後、普通のミエローマ細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰に増殖させることを防ぐために一定の間隔で、選択培地（例えばHAT培地）を補足した前述の適当な培地中で細胞を増殖させる。本発明はまた、前述のSOX1の細胞外ドメインに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えDNAに関する。定義により、このようなDNAは、コード１本鎖DNA、該コードDNAとこれに相補的なDNAとからなる２本鎖DNA、またはこれらの相補的な（１本鎖）DNA自体を含む。さらにSOX1に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするDNAは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、またはこれらの変異体をコードする真正のDNA配列を有する、酵素的または化学的に合成したDNAでもよい。真正DNAの変異体は、１以上のアミノ酸が欠失しているかまたは１以上のアミノ酸と交換された、上記抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするDNAである。好ましくは該修飾は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのCDRの外にある。このような変異DNAはまた、１以上のヌクレオチドが同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドで置換された、サイレント変異体であることを意図する。このような変異配列はまた、縮重配列である。縮重配列は、本来コードされるアミノ酸配列を変化させることなく無数のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されるという、遺伝コードの意味の範囲内で縮重している。このような縮重配列は、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適な発現を得るために、特定の宿主（特に大腸菌（E．coli））が好適とする制限部位および／または特定のコドンの頻度が異なるため、有用である。変異体という用語は、当技術分野で公知の方法に従って真正DNAのin vitro突然変異誘発により得られるDNA変異体を含むことを意図する。完全な４量体免疫グロブリン分子のアセンブリおよびキメラ抗体の発現のために、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えDNAインサートを、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するDNAと融合させ、次に（例えば、ハイブリッドベクターに取り込んだ後）適当な宿主細胞に移す。従って本発明はまた、ヒトの定常ドメインであるｇ（例えば、γ1、γ2、γ3 、またはγ4、好ましくはγ1またはγ4）に融合したSOX1に対する抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えDNAに関する。同様に本発明は、ヒトの定常ドメインであるκまたはλ（好ましくはκ）に融合したSOX1 に対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えDN Aに関する。別の実施形態において本発明は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが、スペーサー基をコードするDNAインサート（任意で、宿主細胞中の抗体のプロセシングを促進するシグナル配列、および／または抗体の精製を促進するペプチドをコードするDNA、および／または切断部位をコードするDNA、および／またはペプチドスペーサーをコードするDNA、および／または標識物のようなエフェクター分子をコードするDNAを含む）により結合されている、組換え核酸に関する。さらなる態様においておよび前述のように、リポーター系を使用してin vivo でSox1発現を検出することにより、神経芽細胞は他のタイプの細胞から積極的に選別され得る。例えばこのようなリポーター系は、Sox1活性化発現系の調節下で、容易に同定可能なマーカーを含んでよい。FACSにより検出され選別される蛍光マーカーが好適である。特にGFPとルシフェラーゼが好適である。あるいは、リポーターを発現するin vivo構築物を、Sox1調節配列自体の調節下に置いてもよい。これらの配列は、Sox1発現が活性化される時に同時に活性化され、従ってSox1と同じ正確度で神経経路中への移動をマークする。使用される Sox1調節配列はヒトSox1調節配列であることが有利である。好ましくはこれらは、配列番号３に記載のヌクレオチド１〜60を含む。一般にリポーター遺伝子の発現により神経細胞を検出するのに有用なリポーター構築物は、Sambrookら(1989)の一般的教示に従って構築することができる。典型的には本発明の構築物はSox1によるプロモーター、および所望の（例えばGFP またはルシフェラーゼの）リポーター構築物をコードするコード配列を含む。GF Pやルシフェラーゼをコードするベクターは、当技術分野で公知であり、市販されている。 SOXタンパク質は、高親和性を有する配列モチーフ（A/T A/T CAA A/TG）（配列番号６）に結合する。従って本発明の構築物は、選択マーカーをコードする遺伝子に機能しうる形で連結された上記モチーフまたはその機能的同等物を含むことが有利である。 Sox1を発現する可能性のある細胞中にトランスフェクトすれば、本発明の構築物は特にSox1発現により活性化されるであろう。従って選択マーカーは、細胞がいったん神経分化経路に入りSox1発現が誘導されると発現されるであろう。このため、神経分化経路に入る細胞をFACSによりソーティングすることが可能になる。さらに別の態様において本発明は、Sox1を発現するベクターを用いた神経細胞に分化することができる多能性前駆細胞のトランスフェクションに関する。このような手段により多能性前駆細胞は、神経経路に沿って分化するように誘導されることができ、種々の神経組織に分化できる前駆体ニューロンになる。本明細書において「トランスフェクション」、「形質転換」などの用語は、核酸が細胞または生物中に機能的な形で移入されることを意味する以外は、重要ではない。このような用語は、核酸を細胞に移す種々の手段（CaPO₄、電気穿孔法、ウイルス形質導入、リポフェクチン、リポソームおよび他の運搬ビヒクルを使用する運搬、バイオリスティクス（biolistics）などを含む）を含む。適当な多能性前駆細胞は、多くの供給源から得られる。例えばES細胞（例えばヒトES細胞）および生殖細胞から得られる細胞（EG細胞）は、胚組織から得られてよい。あるいは多能性細胞は、逆分化、増殖因子などの投与（WO96/23870を参照されたい）、またはクローニング（例えば、成体細胞から卵子のような多能性細胞への核移入）により調製される。神経系統のヒト幹細胞は、ヒト組織から直接単離される。あるいはヒト以外の動物（例えばげっ歯類）の幹細胞も使用される。神経幹細胞はまた、例えばSnyderら(1996)Clinical Neuroscience 3:310-316 およびMartinez-Serranoら、（1996）Clinical Neuroscience 3:301-309に記載のように、in vitroで増殖してもよい。さらに、レチノイン酸のような物質による刺激により神経細胞に分化することができる多能性細胞系（例えば、N-Tera I I細胞系）も、Sox1刺激に対して応答性である。未変性または変異体SOX1をコードするcDNAもしくはゲノムDNA、またはSox1配列もしくはSOX1によりトランス活性化される配列の調節下にある標識物も、当技術分野で公知の技術に従ってベクター中に取り込むことができる。本明細書においてベクター（またはプラスミド）とは、発現のために細胞中に異種DNAを導入する独立したエレメントを意味する。このようなビヒクルの選択と使用は当業者の技術の範囲内にある。ベクター成分は一般に、特に限定されないが、以下の１つまたはそれ以上を含む：複製開始点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写停止配列およびシグナル配列。多くの発現ベクターはシャトルベクター（すなわちこれらは少なくとも１つのクラスの生物中で複製することができる）であるが、発現のために別のクラスの生物にトランスフェクトすることができる。例えばベクターは宿主細胞染色体とは無関係に複製することができないとしても、これを大腸菌（E．coli）中でクローン化し、次に同じベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする。発現ベクターおよびクローニングベクターは、Sox1発現細胞をマーキングする以外の目的に、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ぶ）を含有していると有利である。この遺伝子は、選択培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の生存や増殖に必要なタンパク質をコードしてもよい。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換していない宿主細胞は、該培地中で生存できないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質や他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠陥を補足タンパク質、または複合培地から入手できない非常に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。ベクターの複製は大腸菌(E．coli)中で行うことが便利であるため、大腸菌(E ．coli)遺伝マーカーおよび大腸菌(E．coli)複製開始点を含めることが有利である。これらは大腸菌(E．coli)複製開始点と抗生物質(例えばアンピシリン)に対する耐性を付与する大腸菌(E．coli)遺伝マーカーの両方とを含有する、例えば、 pUC19)のような大腸菌(E．coli)プラスミドから得ることができる。発現ベクターは通常、宿主生物に認識されSOX1または標識物をコードする核酸に機能しうる形で連結しているプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、Sox1を誘導する因子またはSox1自体により誘導可能である。このプロモーターは、供給源DNAからプロモーターを取り出し、単離したプロモーター配列をベクター中に挿入することにより、SOX1をコードするDNAに機能的しうる形で連結される。生(native)SOX1プロモーター配列と多くの異種プロモーターの両方とも、SOX1 DNAの増幅および／または発現を指令するために使用される。用語「機能しうる形で連結」とは、記載の成分が目的の様式で機能することを可能にする関係で並んで存在することを意味する。コード配列に「機能しうる形で連結」した調節配列は、コード配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるように結合される。プロモーターと任意のエンハンサーを含む調節配列は、ヒトまたは他のSox1遺伝子から得られる。あるいはSOX1誘導性エレメントの調節下に置かれる時、任意の適当なプロモーターが使用される。そのような構築物において、選択されるプロモーターは、Sox1発現のないところでは標識物の発現が最小になるように、活性の残存レベルが低い。ベクターはまた、転写の停止およびmRNAの安定化に必要な配列を含有してもよい。そのような配列は、真核生物またはウイルスDNAまたはcDNAの5'および3'非翻訳領域から一般的に入手できる。これらの領域は、SOX1または標識物をコードするmRNAの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。発現ベクターは、DNAの発現が可能な調節配列(例えばプロモーター領域)に機能しうる形で連結された、標識物をコードする核酸またはSOX1を発現することができる任意のベクターを含む。すなわち発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入されると、クローン化DNAが発現される、組換えDNAまたはRNA構築物(例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター)を意味する。適当な発現ベクターは当業者に公知であり、真核生物および／または原核生物細胞中で複製可能なもの、およびエピソームのままでいるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものを含む。例えばSOX1をコードするDNAは、哺乳動物細胞中でのcDNAの発現に適したベクター(例えば、pEVRFのようなCMVエンハンサーに基づくベクター(Matthias,ら、（1989）NAR 17，6418))中に挿入される。本発明の実施に特に有用なものは、哺乳動物細胞中でSOX1または標識物をコードするDNAの一過性の発現を提供する発現ベクターである。一過性の発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、これが高レベルのSOX1または標識物を合成するように、宿主細胞中で効率的に複製することができる発現ベクターを使用する。本発明の目的において、一過性の発現系は、例えばSOX1発現細胞の同定または多能性細胞の分化を誘導するのに有用である。本発明のベクターの構築は、例えばSambrookら、1989に記載のような常法を使用する。単離されたプラスミドまたはDNA断片は、必要なプラスミドを作製するのに好ましい形で、切断され、作製され、かつ再結合される。所望であれば構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析が既知の方法で行われる。発現ベクターの構築、in vitroの転写産物の調製、宿主細胞へのDNAの導入、および遺伝子発現と機能の評価のための分析の実施に適した方法は、当業者に公知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、例えば常法のサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング(DNAまたはRNA解析)、またはin situハイブリダイゼーションにより、本明細書に記載の配列に基づく適切に標識したプローブを使用して、サンプル中で直接測定される。当業者は、これらの方法が所望であれば改変できることを容易に理解するであろう。あくまで例示の目的で以下の実施例により本発明を説明する。材料と方法 SOX1ポリクローナル抗体の製造：SOX1(207アミノ酸)のHMGボックスのＣ末端配列をコードする622塩基対のHincII断片を、構築物pGEX3X中の細菌GST遺伝子にインフレームで融合させる。融合タンパク質を誘導し、SmithとJohnson（1988）Gene 67:31-40に記載のように精製する。ウサギを、SmithとJohnson（1988）が薦めるように注射のコース(各回の注射は250μgの融合タンパク質を含有する)により処理する。ウサギから２つの最終血液(FB43とFB44)を得てから、ポリクローナル血清を調製する。免疫細胞化学：胚、P19細胞および神経板外植片を標準的方法で調べる(Placzek ら、（1993）Development 117:205-218)。抗体は以下の希釈率で使用する：抗SO X1 PAb(1:500)；K2抗HNF3β MAb(1:40)；6G3抗FP3 MAb(1:10)；抗3A10MAb(1:10 )；抗2H3(神経繊維-160)MAb(1:10)；4D5抗Islet-1 MAb(1:1000)；抗SSEA1 MAb(1 :80)(Hybridoma Bank)；抗NESTINE MAb(1:10)(Hybridoma Bank)；抗BrDU MAb(1: 500)(Sigma)；適当な２次抗体(TAGOとSigma)は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy2またはCy3に結合させる。 BrDU解析：妊娠マウスに、0.9％NaCl中の50μg/g体重の5-ブロモ-2デオキシウリジン(BrDU)(Sigma)を腹腔内注射し、注射の２時間後に屠殺する。胚を固定し、前述のように切片にする。スライドをPBSで２回洗浄し、0.2％ HCl中で37℃で30 分インキュベートし、次にPBSで完全にリンスし、PBS/0.1％Trinton/1％熱不活性化ヤギ血清(P-T-G)で３回リンスする。モノクローナル抗BrDU(P-T-G中で1:500 希釈)を切片に適用し、４℃で一晩インキュベートする。SOX1抗体(P-T-G中1:500 希釈)中で連続切片を４℃で一晩インキュベートする。スライドをP-T-Gで2回洗浄し、次に適当な２次抗体で室温で30分インキュベートし、P-T-Gで洗浄し、マウントする。培養したP19細胞とレチノイン酸処理：P19細胞を既に記載されているように培養する(RudnichyとMcBurney，1987)。分化を誘導するために、細菌グレードのシャーレ中でのみ、１μMレチノイン酸の存在下または１μMレチノイン酸の存在下でまたは５mM IPTGの存在下で、細胞を凝集させる。誘導物質の存在下で４日間の凝集後、細胞を組織培養チャンバースライド上に置く。細胞を接着させ４〜５日間増殖させ、24時間毎に培地の交換を行う。免疫蛍光法のために細胞を、0.1％ゼラチンで被覆した組織培養チャンバースライド中で増殖させ、PBSで１回洗浄し、室温で1xMEMFA中で１時間固定し、P-T-Gで２回洗浄する；次に適当な抗体で染色する。細胞計測分析：細胞計測実験のために、P19トランスフェクション体細胞系を誘導して分化させ、ゼラチン被覆スライド上に塗布し、６〜８日目にニューロンについて室温で1xMEMFA中で１時間固定する。細胞を神経繊維(2H3)抗体で染色し、 Olympus蛍光顕微鏡を使用して写真を撮る。細胞数を、領域中の総細胞のパーセントとして表す。各P19クローンについて、２つの異なる実験からの８つの領域を計測する。プラスミドとトランスフェクション体：SOX1発現ベクターpRSVopSox1を構築するために、POP113CATオペレーターベクター(Stratagene)をNot1で消化し、Sox1cDN AのKpn/Stu(431〜1694位)断片の末端を埋める。真核生物Lacリプレッサー発現ベクターP3'SS(Stratagene)を、リポフェクチンによりP19細胞中にトランスフェクトする。安定な形質転換体を250μg/mlのヒグロマイシンで選択する。拡張したクローン(250)を単離し、抗lac PAb(Stratagene)を用いて間接免疫蛍光法により Lacリプレッサーの発現について調べる。Lacリプレッサーの遍在性の構成的発現を示す４つの細胞系を単離する(P3'SS-10、13、22および47)。以後の実験のためにP3'SS-10を選択する。次にリポフェクチンによりP3'SS-10をpRSVopSox1でトランスフェクトする。500μg/mlのG481を使用して安定なクローンを選択する。250クローンを拡張し、RNase保護法とSOX1抗体を用いる免疫細胞化学法により誘導性Sox1発現について分析する。 RNase保護測定法：P19細胞から全RNAを調製し、Capelら、（1993）Cell 73:1019 -1030に記載のように、５μgのP19細胞RANを使用してRNase保護測定法を行う。S ox1 cDNAの396塩基対のSma1-BspH1断片(1467〜1863位)、Wnt1 cDNAの215塩基対のBsa1エキソン４特異断片、Mash1 cDNAのPvuII消化物(Johnsonら、（1992）Dev elopment 114:75-87)からアンチセンス標識プローブが得られ、SAP D cDNAのNot 1消化物を添加対照として使用する(Dresserら、（1995）Hum．Mol．Genet．4:16 13-1618)。 RT-PCR：Capelら、(1993)に記載のようにP19細胞から全RNAを調製する。逆転写、PCR反応、およびプライミングを、Okabeら、(1996)に記載のように行う。ラット外側神経板外植片：既に記載されている(Placzekら、1993)ように8.5〜9. 0日令のラット胚の予定後脳と脊髄領域から外側神経板(LNP)を単離する。既に記載されている(Placzekら、1993)ように、HHステージ608のヒヨコ胚から脊索外植片を切開する。外植片をコラーゲン中に包埋し、24、48、および96時間培養する (Placzekら、1993)。精製したラットSHH-N(Ericsonら、（1996）Cell 87:661-67 3)を、他の測定法で使用される有効な範囲内の濃度で培養物に加える(Ericsonら、1996)。実施例１ SOX1は初期神経発生中に発現されるマウスとラットの神経胚形成中のSOX1発現を、SOX1Ｃ末端領域に対するウサギポリクローナル抗体を使用して分析する。マウスでは、まず7.5交尾後日数(dpc) に後期線条卵筒の前半分中にSOX1の発現が検出される。この段階の胚の断面は、円柱外胚葉細胞中で発現を示し、これは神経板を決定するようであり、一方より外側に位置する細胞は陰性である。すなわちこの段階のSOX1発現は神経板に特異的である。SOX1は、神経板ベンドとして前後軸全体に沿って神経上皮細胞中で維持され(8.0〜8.5dpc、Sox1発現が神経ひだに限定される２体節マウス胚の断面に示されるように)、融合して神経管を形成する(9.0〜9.5dpc、Sox1標識は、10〜1 2体節マウス胚の断面中の神経管に限定されていることがわかる)。ラット中のSO X1の発現パターンは、マウス中の発現パターンと同じである。神経板と初期神経管にわたってSOX1の発現は、これらの細胞の間の類似性を示す。神経管の閉鎖後、神経上皮細胞は、脊髄内で特異的な背腹方向(D/V)の位置で規定されたクラスのニューロンに分化し始める(AltmanとBayer（1984）Adv．Ana t．Embryol．Cell Biol．85:32-46；TanabeとJessell，（1996）Science 274:11 15-1123)。発生の進行に伴い、Sox1は神経管のD/V軸に沿って細胞中で型にはまった方法でダウンレギュレートされる。脊髄では、発現はまず腹側中線を占める細胞中でダウンレギュレートされ(20体節マウス胚の胸部領域の断面は、この領域のSOX1染色の欠如を示す)、次に腹側運動角(30〜35体節胚の断面に、対応する染色の欠如がみられる)、そして次に背側領域を占める細胞中でダウンレギュレートされる。これらの領域は、それぞれ底板、運動ニューロン、および感覚リレー介在ニューロンと関連するようである。これを確認するために、一連の抗体２重標識実験をラット胚において行なう。底板と成熟ニューロンの細胞(神経繊維(NF-1)：色を目立たせるマーカーで標識し、E11ラット胚内で視覚化する)を同定する抗原性マーカーのパネルと一緒に、 SOX1抗体を使用する。SOX1の発現とこれらのマーカーの発現はほとんど完全に互いに排他的である。30〜35体節胚で分化した底板と腹側運動角の間に位置する２すじの細胞の免疫標識により明らかなように、腹側脊髄または10.0〜12.0dpcのマウス胚において、SOX1発現は「領域Ｘ」(Yamadaら、（1991）Cell 64:635-647 )でのみ維持される。最終的に13.5dpcまでに、SOX1発現はCNS中の薄い心室ゾーンに限定される。SOX1発現は末梢神経系(PNS)で検出される。これらの発現プロフィールは、SOX1はCNS中の初期神経細胞で発現され、神経分化に一致して発生中の神経管でダウンレギュレートされていることを示唆している。実施例２ SOX1は胚神経管内で増殖細胞をマークする神経板と初期神経管中のSOX1の均一な発現とその後のD/V軸に沿ったダウンレギュレーションと心室ゾーンへの限定は、発生中の中枢神経系の細胞増殖のパターンを思わせる(Sauer，(1935)J．Comp．Neurol．62:377-405；Fujita，(1963)J ．Comp．Neurol．120:37-42；AltmanとBayer，1984)。神経板と初期神経管では、増殖する前駆細胞は多列上皮中で組織化され、ここでこれらの細胞の突起は内部管腔から外部被膜表面に伸びる。後期段階で神経管は徐々に厚くなり、異なるゾーンに分割される。増殖するCNS前駆細胞は主に、管腔の周りの心室ゾーン(VZ )に限定される。これらは管腔から移動し始め、Ｓ期および最後の分裂後は、外層の辺縁帯(MZ)に移動する。10.5dpcのマウス胚では後神経管の多列上皮中に、抗SOX1抗体を使用してSOX1発現が検出され、神経管のより成熟した前領域では心室ゾーンに限定される。SOX1発現と増殖するCNS細胞の間の関係を評価するために、抗BrDU抗体を用いてブロモデオキシウリジン(BrDU)の取り込みをモニタリングして細胞の増殖を直接測定する。10.5dpcの妊娠した雌マウスにBrDUを注射し、２時間後切開して増殖細胞を検出する。次に胚を固定し、切片にし、BrDU取り込みとSOX1発現のために２重標識する。SOX1発現細胞と同様に、10.5dpcのマウス胚中の後神経管中にBrDUを取り込む細胞が見られ、前神経管の心室ゾーン中にある。BrDUを取り込むすべての細胞はまたSOX1を発現する。BrDUを取り込まない SOX1陽性細胞は、心室ゾーンの管腔表面に限定されている。これに対して、外層の辺縁帯ではSOX1もBrDU陽性細胞も検出されない。これらの結果は、胚CNS内の分裂している神経上皮細胞中でSOX1が発現されることを示している。実施例３ SOX1は決定付けられた細胞中でダウンレギュレートされる SOX1とIslet1のような決定付けられた分化細胞のマーカー(Pfaffら、（1996） Cell 84:1-20)の互いの排他性は、SOX1のダウンレギュレーションが、in vitro の神経板外植片の分化のための必要条件である可能性を示す。単離された神経板外植片を、既知の腹部神経細胞のインデューサー(すなわち、脊索とプールされたソニックヘッジホッグタンパク質)とともに培養する。次にSOX1の発現とBrDU の取り込みを、腹部細胞の３つのマーカー(Isletl、FP3およびHNF3β)の発現と比較する。in vivoでの観察結果に一致して、SOX1とIslet1の発現ならびにSOX1 とFP3の発現の両方とも、脊索の近くで培養した神経板外植片中(n=8)で、またはソニックヘッジホッグタンパク質とともに48時間培養し、抗SOX1抗体と抗Islet1 抗体で染色したE9ラット神経板組織で見られるよう精製したソニックヘッジホッグタンパク質の存在下で、互いに排他的である。同様に、BrDUとIslet1ならびに BrDUとFP3(抗FP3抗体を使用して検出される)の両方の取り込みは互いに排他的である。これに対して、HNF3βの発現のドメインはFP3のドメインを超えて延長し、BrDU陽性細胞の領域に伸びている。細胞の同様の集団がin vivoで検出されるかどうかを決定するために、FP3とHN F3βの同時発現およびBrDUとHNF3βの同時発現について胚を分析する。内底板細胞はHNF3βとFP3を同時発現するがBrDUを取り込まず、一方外底板細胞はHNF3β のみを発現しBrDUを取り込むことを見出している。HNF3βは、分裂は活発であるが分化し始めた細胞のマーカーを提供する。底板の内部領域を占めるこれらの細胞はHNF3βを発現するがSOX1は発現しない。これに対して、底板の外領域を占める細胞はHNF3βとSOX1を同時発現する。これらの観察結果は、腹部神経細胞中のIslet1を有するSOX1とFP3の相互排除発現とともに、細胞が分化を開始する時ではなく有糸分裂を終了する(exit)時、SOX1 がダウンレギュレートされることの証拠を提供する。実施例４ SOX1発現が神経分化に関連する神経誘導は新しい遺伝子発現の開始を伴い、これは次に表皮組織ではなく神経組織の形成を可能にする。神経細胞中のSOX1の早期かつ明らかに均一な発現は、 Sox遺伝子が細胞系統決定に影響を与え得るという観察結果とともに、SOX1発現は神経誘導シグナルに対する初期応答であり、その発現は神経の運命に対して細胞を指令することに関与するかも知れないという可能性を示す。SOX1が応答した神経の運命の確立において役割を果たすかどうかを調べるために、SOX1発現とその誤発現の影響を解析するためにin vivoのモデル系としてP19細胞培養系を使用する。 P19細胞は、すべての３つの胚葉に分化する能力を有する胚癌細胞系である(Mc Burney，(1993)Int．J．dev．B1ol．37:135-140)。未分化状態ではP19細胞は、まだ決定付けられていない原始外胚葉細胞に形態が似ており、かつ細胞表面抗原 SSEA-1を発現する。これらの細胞は、化学インデューサーの非存在下で単層で増殖させると、自発的分化の率が非常に低い。しかし凝集物として増殖したP19細胞は、部分的に内胚葉細胞に分化する。さらにレチノイン酸の添加により、凝集 P19細胞は神経上皮様細胞に分化する(Jone-Villeneuveら、（1982）J．Cell．Bi ol．94:253-262)。これらは、NCAM、中間繊維NESRIN、MASHI(Johnsonら、1992) およびWNTI(St．Arnaudら、（1989）Oncogene 4:1077-1080)のような神経上皮マーカーを発現する。基質上に置くと、これらの細胞の約15％は、神経繊維を発現する成熟ニューロンに分化する。すなわちこのin vitroモデル系では、レチノイン酸は「神経インデューサー」として作用する。まず、P19細胞中のSox1の発現を、RNase保護法と免疫細胞化学法により調べる。P19細胞中のSox1発現の特徴は、in vivoで神経になるべき組織中で観察されるものと同様である。Sox1mRNAとタンパク質は、抗SOX1抗体と抗SSEA抗体、および RNase保護法を使用して分析した場合、細胞表面抗原SSEA1を発現する未分化P19 細胞中では検出されない。同様にP19細胞が化学インデューサーの添加無しで凝集物として分化している時、RNase保護法で測定する時SOX1は発現されない。これに対して、レチノイン酸の存在下で凝集P19細胞が分化している時、SOX1は神経分化中に急速に誘導される。従ってSox1は、Mash1やWnt1のような他の神経上皮マーカーと同様に挙動し、その転写産物は、RNase保護法によりレチノイン酸処理したP19細胞中で検出される。レチノイン酸処理したP19細胞凝集物を組織培養基質上に塗布すると、約15％の細胞は、成熟した突起を有する神経繊維発現ニューロンに分化する。完全分化したニューロンの形態を示すP19細胞中のSOX1の発現を調べるために、２重標識免疫蛍光法を使用してSOX1と神経繊維を同時に検出する。突起を有する神経繊維陽性ニューロン中では、SOX1免疫反応性は検出されない。すなわちin vivoと同様に、SOX1は、最初に神経の運命を取るとSOX1はP19細胞により発現されるが、次にその分化とともにダウンレギュレートされる。実施例５細胞を神経に決定付けるためのSOX1の使用従来のデータは、in vivoでP19細胞では、神経上皮細胞が分化し始める時SOX1 発現が誘導されることを示唆している。細胞を神経に決定付ける役割をSOX1が果たすなら、P19細胞でのSOX1の発現は、神経分化を開始させるレチノイン酸の代わりになり得るかも知れない。従って内因性SOX1は、誘導性真核生物lacリプレッサー−オペレーター発現系を使用して、P19細胞中で活性化される。この系を確立するために、lacリプレッサーを構成的かつ遍在性に発現するP19細胞のクローン株を作製する。この親株(P3'SS-10)を、誘導性RSVプロモーターの調節下でS ox1 cDNAを含有するベクターであるpRSVopSox1でトランスフェクトすると、安定な株が樹立される。非誘導状態では、イソプロピル−β−ｄ−チオガラクターゼ (IPTG)の添加無しで、これらの株は、RSVプロモーターの上流でオペレーター部位に結合し従ってSox1の転写を阻止する高レベルのlacリプレッサーを発現する。IPTGを添加するとコンフォメーションの変化が起き、リプレッサーの親和性が低下し、pRSVopSox1が活性化される。抑制状態で約250クローンの形質転換体が単離される。RNase保護法と免疫細胞化学測定法を使用して、IPTGに応答して高レベルのRSVopSox1を発現する３つのクローンが選択される(708-13、708-16および708-21)。これらのクローンの多能性はトランスフェクションや選択により弱められることはない。すべての３つの株は、非誘導状態でSSEAIを発現する。さらにレチノイン酸中で凝集すると、非誘導クローンは内因性Sox1の発現を開始し、野生型P1 9細胞非感染細胞と同様に、塗布後に成熟した神経繊維発現ニューロンに分化する。 SOX1の発現が神経分化を開始させることができるかそしてこれによりレチノイン酸の必要性に代わることができるかどうかを調べるために、レチノイン酸への P19凝集物の一過性の暴露を、IPTGの添加を介してRSVopSox1の一過性誘導により置換することができるかどうかを調べる。野生型P19細胞およびトランスフェクトしたP19クローン(708-13、708-16および708-21)を、IPTG添加有りまたは無しで96時間凝集物として培養する。96時間後、RNase保護測定法および／またはRT- PCR測定法のために、凝集物の半分からRNAを単離する。残りの凝集物を組織培養基質上に塗布し、IPTGをさらに添加することなく３日間分化させ、次に免疫細胞化学法による神経上皮のパネルと神経マーカーの発現についてスコアを付ける。これらの条件は、野生型P19細胞のレチノイン酸誘導性分化について使用したものと同じである。96時間後、IPTGでRSVopSox1を発現するように誘導したクローンは内因性Sox1とMash1を発現する。これらの２つの神経上皮マーカーの発現は、レチノイン酸で誘導した野生型で見られたものと同じである。さらにIPTG誘導したクローンはNESTINとHoxa7を発現した(Mahonら、（1988）Development（増刊）187-195)。基質上の一過性に誘導したクローンのさらなる分化は、神経繊維陽性、3A10-陽性、およびIslet1陽性細胞により証明されるように、成熟ニューロンの存在を示した。すべての３つのクローン(708-13、708-16および708-21)はこうして分化するが、産生される成熟ニューロンの数は変動する。IPTG誘導クローンで形成された分化ニューロンの数は、一定の領域の細胞中の神経繊維陽性細胞の数を測定することにより推定される。ニューロンの数は、クローン708-13については６〜８％、クローン708-16については15〜20％、そしてクローン708-21については20〜25％の範囲である。後者の２つのクローンは、SOX1発現の均一で遍在性の誘導を示すが、クローン708-13での発現はすべての細胞には存在しない。さらに一過性に誘導されるクローンはGFAP陽性細胞を生成し、グリア細胞分化を示している。これらのマーカーのいずれも、IPTGの存在下で培養した野生型P19 細胞、IPTGの非存在下で培養したクローン708-13、708-16および708-21で検出されない。in vivoおよびin vitroでのSOX1の発現は、神経繊維およびIslet1のような成熟神経マーカーと互いに排他的である。一過性に誘導したクローン中で生成した成熟ニューロン中のSOX1発現を調べるために、２重標識免疫蛍光法を使用してSOX1と神経繊維を同時に検出する。これらの培養物中で神経繊維が陽性の細胞では、SOX1発現は検出できなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ペヴニー，ラリッサ，エイチ. イギリス国エヌダブル７１エーエーロンドン，ミルヒル，ザリッジウェイ，ナショナルインスティチュートフォーメディカルリサーチ (72)発明者スミス，オースティンイギリス国イーエイチ９３ダブルキューエジンバラ，イーストメインズロード，ユニバーシティーオブエジンバラ，センターフォーゲノムリサーチ

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）細胞内でのSox1遺伝子の発現を検出する工程；および（b）該細胞を選別してSox1遺伝子を発現する細胞を単離する工程、を含んでなる、細胞集団から１つまたはそれ以上の神経芽細胞を単離する方法。２．前記細胞集団がCNS組織から誘導される、請求項１記載の方法。３．前記細胞集団が細胞培養物から誘導される、請求項１に記載の方法。４．前記Sox1遺伝子の発現が核酸ハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．前記Sox1遺伝子の発現が、SOX1と検出可能なリガンドとの結合により検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。６．前記検出可能なリガンドが標識免疫グロブリンである、請求項５記載の方法。７．前記検出可能なリガンドがSox1 mRNAに相補的な標識オリゴヌクレオチドである、請求項５記載の方法。８．前記Sox1遺伝子の発現がFACS解析により検出される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．細胞集団から神経芽細胞を単離する方法であって、（a）Sox1調節領域に機能しうる形で連結された検出可能なマーカーをコードするコード配列を含む遺伝子構築物で、細胞集団をトランスフェクトする工程；（b）その選択マーカーを発現する細胞を検出する工程、および（c）該選択マーカーを発現する細胞を該細胞集団から選別する工程、を含んでなる前記方法。 10．細胞集団から神経芽細胞を単離する方法であって、（a）SOX1によりトランス活性化され得る調節領域に機能しうる形で連結された検出可能なマーカーをコードするコード配列を含む遺伝子構築物で、細胞集団をトランスフェクトする工程；（b）その選択マーカーを発現する細胞を検出する工程、および（c）該選択マーカーを発現する細胞を該細胞集団から選別する工程、を含んでなる前記方法。 11．前記選択マーカーが蛍光または発光ポリペプチドである、請求項９または10 記載の方法。 12．前記選択マーカーが細胞の表面で検出可能なポリペプチドである、請求項９または10記載の方法。 13．前記Sox1調節配列が配列番号３のヌクレオチド１〜60を含む、請求項９記載の方法。 14．SOX1によりトランス活性化され得るエレメントが配列モチーフA/T A/T CAA A/TGを含む、請求項10記載の方法。 15．神経系統に運命付けられた細胞の生産方法であって、（a）Sox1を発現するコード配列を含む遺伝子構築物で、多能性幹細胞をトランスフェクトする工程；（b）神経細胞に分化させるために該幹細胞を培養する工程；および（c）こうして生産された神経細胞を単離する工程、を含んでなる前記方法。 16．Sox1配列が誘導性プロモーターに機能しうる形で連結している、請求項15記載の方法。 17．前記細胞を、Sox1配列の発現をモジュレートするレギュレーターをコードする配列を含むベクターでさらにトランスフェクトする、請求項15または16記載の方法。