JP2007006701A

JP2007006701A - Ｂｍｐ−４中和因子タンパク質

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Publication number: JP2007006701A
Application number: JP2000254594A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Noda; 昌晴野田; Hiroshi Sakuta; 拓作田
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2007-01-18

Abstract

【課題】骨形成因子に属するＢＭＰ−４に結合し、ＢＭＰ−４の作用を抑制する新規ＢＭＰ−４中和因子タンパク質Ventroptin（ＶＯＰＴ）及びＶＯＰＴをコードする遺伝子ＤＮＡ、並びにＶＯＰＴを用いたＢＭＰ−４中和活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供すること。
【解決手段】Ｅ８ニワトリ網膜の背腹軸特異的に発現している分子をＲＬＣＳ法によりスクリーニングし、腹側特異的に発現しているＤＮＡ断片をプローブとしてノーザンブロットによりｍＲＮＡを検出し、ニワトリ網膜ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、シグナル配列とシステインに富んだ３つの繰返し配列をコードする完全長のＶＯＰＴｃＤＮＡを得る。このニワトリのＶＯＰＴ配列に基づいてプライマーをデザインし、マウス眼ｃＤＮＡライブラリーから常法に従い、完全長のマウスＶＯＰＴをコードするｃＤＮＡを単離する。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨形成因子（ＢＭＰ；bone morphogenetic protein）に属するＢＭＰ−４に結合し、ＢＭＰ−４の作用を抑制する新規ＢＭＰ−４中和因子タンパク質及びそれをコードする遺伝子ＤＮＡ、並びにＢＭＰ−４中和因子タンパク質を用いたＢＭＰ−４中和活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨基質中に存在する異所性骨誘導活性を指標として精製又はクローニングされた分子群は骨形成因子（ＢＭＰ）と呼ばれ、現在のところ、ＢＭＰ−２からＢＭＰ−８までのＴＧＦ−β（transforming growth factor type β）ファミリーに属するものと、これとは異なる構造のＢＭＰ−１が知られている。これらの分子群は種を超えて保存され、また広くさまざまな臓器の細胞に発現しており、単に骨形成にとどまらず体軸決定などを含む形態形成に関与するサイトカインであることが明らかになりつつある。
【０００３】
近年、ＢＭＰの中和因子としてノギン（Noggin）、コーディン（Chordin）、ホリスタチン（Follistatin）、セルベラス（Cerberus）、グレムリン（Gremlin）など、数多くの分泌タンパク質が報告されている（Dev. Biol. 38, 30-40, 1974, Brain Res. 63, 285-90, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2439-44, 1999 )。これらＢＭＰ中和因子は分泌タンパク質であり、ＢＭＰに特異的に結合し、ＢＭＰが特異的受容体に結合することやＢＭＰのシグナリングを阻害する。
【０００４】
ＢＭＰ−４中和因子として知られているコーディンは、アフリカツメガエル、ヒト、ラットよりｃＤＮＡがクローニングされており、ツメガエルのコーディンは１２０ｋＤの分泌タンパク質であり、そのアミノ酸配列中のよく保存された場所にシステイン残基に富んだ５８〜７４アミノ酸の４回の繰返し配列（ＶＷＦＣドメイン）を含んでいる（Cell 79, 779-790, 1994, Cell 86, 589-598, 1996）。このシステイン残基に富んだ配列は、ノギン等の他のＢＭＰ中和因子には見られず、ＢＭＰ中和因子ではコーディンだけに見られるものであるが、ＢＭＰ中和因子以外ではフォンビルブラント（von Willebrand）因子などの細胞外に存在するタンパク質にも見い出されており、オリゴマー形成やタンパク質同士の相互作用に関与しているものと考えられている。
【０００５】
ＢＭＰ−４を含むＴＧＦ−βファミリー分子は、中胚葉や腹側外胚葉誘導に必須で、初期発生時の背腹軸形成に関与している。また、神経系においては神経管背側（蓋板）に発現しており、神経管の背腹軸形成に関与し、その濃度勾配で分化してくる神経細胞の種類が決まるとされている。同様に網膜においてもＢＭＰ−４は背側に発現しており、背腹軸決定への関与が示唆されている。また、ＢＭＰ−４を含むＴＧＦ−βファミリー分子は、神経系において増殖の抑制やアポトーシスの誘導などの作用が知られており、コーディン同様にＢＭＰ中和因子であるノギンのノックアウトマウスの神経管では多数のアポトーシスが観察されている。また、コーディンとノギンのダブルノックアウトマウスでは、前脳の形成不全が観察されている。かかるＢＭＰ−４を含むＴＧＦ−βファミリー分子は、肢芽に発現し、ＢＭＰ活性を調節することも知られている（Science 280, 1455-7, 1998, Dev. Biol. 197, 205-17, 1998, Cell Tissue Res. 296, 111-9, 1999, Development 126, 2161-70, 1999, Development 126, 5515-22, 1999)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、骨形成因子に属するＢＭＰ−４に結合し、ＢＭＰ−４の作用を抑制する新規ＢＭＰ−４中和因子タンパク質Ventroptin（ＶＯＰＴ）及びVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする遺伝子ＤＮＡ、並びにVentroptin（ＶＯＰＴ）を用いたＢＭＰ−４中和活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、神経系における領域特異性形成の分子機構解明に向けて、網膜における領域特異性の形成をモデルとして研究しており、網膜の前後軸あるいは背腹軸方向においてトポグラフィックな発現を示す分子群を、網羅的に単離・同定することを目指して、ＲＬＣＳ（Restriction Landmark cDNA Scanning）法を用いてスクリーニングを行った。この解析から両軸方向に対して各数十個のクローンを同定し、その構造解析を行い、網膜においてトポグラフィックな発現を示す分子群は、転写因子、分泌因子、接着分子、細胞内シグナル伝達分子など多様な分子で構成されており、また、網膜内での発現部位に関しては、神経節細胞層にのみ発現する分子、神経節細胞層と内顆粒層に発現する分子、内顆粒層のみに発現する分子などさまざまなタイプに分類することができるという知見を得た。かかる知見を得る過程において、前記同定したクローンから、ＢＭＰ−４と結合してその活性を阻害する、ニワトリ網膜の腹側特異的に発現している新規分子Ventroptin（ＶＯＰＴ）を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質（請求項４）や、配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ（請求項５）や、請求項５記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項６）に関する。
【０００９】
また本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項７）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質（請求項８）や、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項９）や、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質（請求項１０）や、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の一部からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するペプチド（請求項１１）に関する。
【００１０】
また本発明は、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質又は請求項１１記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド（請求項１２）や、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質又は請求項１１記載のペプチドに特異的に結合する抗体（請求項１３）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３記載の抗体（請求項１４）や、請求項１３又は１４記載の抗体が特異的に結合し、かつＢＭＰ−４中和活性を有することを特徴とする組換えタンパク質又はペプチド（請求項１５）に関する。
【００１１】
また本発明は、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１６）や、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物（請求項１７）や、非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１７記載の非ヒト動物（請求項１８）や、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物（請求項１９）や、非ヒト動物が、マウス又はラットであることを特徴とする請求項１９記載の非ヒト動物（請求項２０）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質又は請求項１１記載のペプチドと、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２１）や、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２２）や、請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞が、請求項１６記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２２記載のＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２３）や、請求項１７又は１８記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２４）や、請求項１９又は２０記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項２５）や、請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるＢＭＰ−４中和活性促進物質（請求項２６）や、請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるＢＭＰ−４中和活性抑制物質（請求項２７）や、請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現促進物質（請求項２８）や、請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現抑制物質（請求項２９）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡとしてはVentroptin（ＶＯＰＴ）ｃＤＮＡ等を挙げることができ、例えばニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）のｃＤＮＡは、ＲＬＣＳ（Restriction Landmark cDNA Scanning）法等によりＥ８ニワトリ網膜ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができ、シグナル配列と、フォンビルブラント因子やコーディンを含む数種のタンパク質に保存されているシステインに富んだ繰返し配列（ＶＷＦＣドメイン）が３回出現する４５６アミノ酸配列の新規のタンパク質をコードしている（図２参照）。また、本発明のタンパク質としてはＢＭＰ−４中和活性を有する分泌タンパク質Ventroptin（ＶＯＰＴ）等を挙げることができ、本発明のペプチドとしては、本発明のタンパク質の一部からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するペプチドを挙げることができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチド、並びにこれらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドはそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
【００１４】
上記本発明の対象となるＤＮＡとして、具体的には、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質又はマウスVentroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、例えばヒトVentroptin（ＶＯＰＴ）遺伝子（GenBankアクセッションＮＯ．ＡＬ０４９１７６）や、配列番号１又は３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡを挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばニワトリ、マウス、ヒト等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法、例えば全ＲＮＡを用いる５′ＲＡＣＥ法により調製することができる。
【００１５】
また、配列番号１又は３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、Ventroptin（ＶＯＰＴ）ｃＤＮＡと同効な目的とするＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１６】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したVentroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質等の精製や、Ventroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質と相互作用するタンパク質の検出や、Ventroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質等に対する抗体の定量などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１７】
本発明の前記タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記Ventroptin（ＶＯＰＴ）等のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、眼や脳の神経系における領域特異性形成の分子レベルでの機構を解明する上で有用である。
【００１８】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパク質・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１９】
本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件タンパク質・ペプチドやその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、前記のように神経系における領域特異性形成の分子レベルでの機構を解明する上で有用である。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。
【００２０】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２１】
本発明はまた、上記本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２２】
また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２３】
上記発現系を含んでなる宿主細胞や、かかる細胞を培養して得られる本件タンパク質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。本件タンパク質・ペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペプチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００２４】
本発明において、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件タンパク質・ペプチドを発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件タンパク質・ペプチドを大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件タンパク質・ペプチド欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば以下に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、Ventroptin（ＶＯＰＴ）ノックアウトマウスやVentroptin（ＶＯＰＴ）トランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２６】
例えば、Ventroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちVentroptin（ＶＯＰＴ）ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、マウスVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたマウスVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのマウスVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００２７】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のVentroptin（ＶＯＰＴ）ノックアウトマウスを作製することができる。また、Ventroptin（ＶＯＰＴ）ノックアウトマウスにVentroptin（ＶＯＰＴ）発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
【００２８】
Ventroptin（ＶＯＰＴ）のトランスジェニックマウスは、ニワトリ、マウス、ヒト、ラット、ウサギ等に由来するVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００２９】
また、上記本件タンパク質・ペプチドをコードするＤＮＡの全部又は一部、本件タンパク質・ペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部、本件タンパク質・ペプチド、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体、本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、視神経や脳神経の再生剤やアポトーシスの抑制剤、また骨の再生、傷の修復、細胞分化、血球分化、免疫・炎症反応、細胞移動の調節剤として、あるいはインビトロ培養やブタ等を用いたインビボでの臓器の作製における使用等において有用であり、ＢＭＰ−４中和活性の促進又は抑制物質のスクリーニングや本件タンパク質・ペプチドの発現の促進又は抑制物質のスクリーニングに用いることができるばかりでなく、神経系における領域特異性形成の分子レベルでの機構解明にも使用することができる。
【００３０】
本発明のＢＭＰ−４中和活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、前記本発明の本件タンパク質・ペプチドと被検物質とを用いる方法や、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。また、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等は本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法に用いることができる。
【００３１】
上記本件タンパク質・ペプチドと被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドと被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４中和活性を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。また、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４中和活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。
【００３２】
前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、これら非ヒト動物から得られる細胞又は組織と、被検物質とをインビトロで接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４中和活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞又は組織における該本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４中和活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物における該本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４中和活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００３３】
上記被検物質と本件タンパク質・ペプチドとを用いたスクリーニング方法について、以下に具体的に例を挙げて説明するが、本発明のスクリーニング方法はこれらに限定されるものではない。上記被検物質と本件タンパク質・ペプチドとを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４中和活性を測定・評価する方法としては、例えば、本件タンパク質・ペプチドとＢＭＰ−４とのタンパク質−タンパク質相互作用分析を行い、本件タンパク質・ペプチドのＢＭＰ−４との結合力の強弱を測定し、被検物質が非存在下の対照の場合と比較・評価する方法を具体的に例示することができる。また、上記被検物質と本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法としては、本件タンパク質・ペプチド発現細胞を被検物質の存在下で培養し、一定時間培養後細胞外に分泌された本件タンパク質・ペプチドが減少又は増加したことを、本発明の本件タンパク質・ペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ等による免疫化学的に検出して、あるいはｍＲＮＡの発現が抑制又は促進したことを指標として評価する方法を具体的に例示することができる。上記ｍＲＮＡの検出法は、ＤＮＡチップ、ノーザンハイブリダイゼーション等の方法で行なうことができる他、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をつないだ遺伝子を導入した細胞を用いると、被検物質による本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の発現抑制又は促進は、前記レポーター遺伝子の活性を指標に検出することが可能となる。
【００３４】
また上記スクリーニング方法により得られる本発明のＢＭＰ−４中和活性促進物質や発現促進物質は、ＢＭＰ−４中和活性の促進や本件タンパク質・ペプチドの発現の促進を必要としている患者の治療等に用いることができる。また、上記スクリーニング方法により得られる本発明のＢＭＰ−４中和活性抑制物質や発現抑制物質は、ＢＭＰ−４中和活性の抑制や本件タンパク質・ペプチドの発現の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。さらに、これらＢＭＰ−４中和活性促進物質や発現促進物質あるいはＢＭＰ−４中和活性抑制物質や発現抑制物質は、視神経や脳神経の再生・調節剤、骨の再生、傷の修復、細胞分化、血球分化、免疫・炎症反応、細胞移動の調節剤、アポトーシスの抑制・促進剤として使用できる可能性や、あるいはインビトロ培養やブタ等を用いたインビボでの臓器の作製において使用できる可能性がある。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例Ａ［方法］
Ａ−１（動物）
白色レグホンの受精卵を３７．５℃でインキュベートした。胚のステージは文献（J Morphol, 88, 49-92, 1951)記載の方法に基づき調整した。
【００３６】
Ａ−２（ＲＬＣＳ法）
胎生８日目のニワトリ網膜の背側又は腹側の３分の１から、ＡＧＰＣ（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法（Anal.Biochem. 162, 156-159, 1987）により全ＲＮＡを調製した。ダイナビーズ−オリゴ（ｄＴ）₂₅（Dynal,Inc.）を用い、全ＲＮＡからポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを精製した。鈴木らの報告(Nucleic Acids Res. 24, 289-94, 1996)に準じてＲＬＣＳ（Restriction Landmark cDNA Scanning）分析を行った。すなわち、ｄＴストレッチの５′側にあるＮｏｔＩサイトを含む５′−ビオチン化オリゴ（ｄＴ）₁₅アンカープライマーを用いて、ｃＤＮＡ合成キット（SuperScriptTM Lambda System;Gibco BRL）により２本鎖ｃＤＮＡを合成した。上記ｃＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、その後ｃＤＮＡ断片をシークェナーゼ及び[α−³²Ｐ]ｄＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とのフィルアップ反応により標識化した。ビオチン化ｃＤＮＡ断片は、ダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（Dynal,Inc.）により回収し、ＮｏｔＩ消化により磁気ビーズから遊離させた。これらのｃＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、ＨｉｎｆＩを用いてゲル中のｃＤＮＡ断片をin situで消化し、ゲルのストリップを再度６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この電気泳動後のゲルを乾燥してオートラジオグラフにかけた。ｃＤＮＡスポットをＭｅｌａｎｉｅ II ２−ＤＰＡＧＥソフトウエア（BioRad）を用いて濃度分析した。ｃＤＮＡスポットのサブクローニングをＰＣＲ-mediated法によって行った。
【００３７】
Ａ−３（発現ベクターの構築）
完全長のVentroptin（ＶＯＰＴ）ｃＤＮＡを鋳型にして、Ｃ末端にフラッグ・タッグ配列を有する／有さないニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）のコード領域（ヌクレオチド残基４１６−１７８３、GenBankアクセッションＮＯ．ＡＬ２５７３５２）を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。このＰＣＲ産物をシャトルベクターＳＬＡＸ−ＮＳのクローニングサイトであるＮｃｏｌ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。ＳＬＡＸ−ＮＳ／ＶＯＰＴ及びＳＬＡＸ−ＮＳ／ＶＯＰＴフラッグをＮｏｔＩとＳｐｅＩで切断し、ＲＣＡＳ−ＮＳレトロウイルスベクターのＮｏｔＩ／ＳｐｅＩサイトに挿入し、それぞれＲＣＡＳ／ＶＯＰＴ及びＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグを調製した。また、ＳＬＡＸ−ＮＳ／ＶＯＰＴをＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで消化して得られたVentroptin（ＶＯＰＴ）のＤＮＡ断片を、インビトロＲＮＡ調製用ｐＣＳ２＋のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＣＳ２＋／ＶＯＰＴを得た。このＳＬＡＸ−ＮＳ／ＶＯＰＴのＣｌａＩ断片を、ｐＭｉｗＣｌａＩ発現ベクター（Dev. Growth Differ. 41, 575-87, 1999)のＣｌａＩサイトの中にエレクトロポレーションにかけるためにクローニングし、Ｍｉｗ／ＶＯＰＴを得た。上記シャトルベクターＳＬＡＸ−ＮＳは、pBluscript KS(-)（STRATAGENE）のＮｏｔＩ／ＳｐｅＩサイトにｓｒｃ遺伝子の５′側非翻訳領域（Methods in Cell Biology, Academic Press, Inc.,Vol, 51, 185-218, 1996)とポリリンカーを含むＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ断片を挿入して作製し、またレトロウイルスベクターＲＣＡＳ−ＮＳは、ＲＣＡＳ−ＢＰ（Ｂ）(Methods in Cell Biology, Academic Press, Inc., Vol. 51, 185-218, 1996)のＣｌａＩサイトにＮｏｔＩ、ＳｐｅＩサイトを付加して作製した。
【００３８】
Ａ−４（ＣＥＦにおけるVentroptin（ＶＯＰＴ）発現）
ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を、抗生物質と１０％仔牛血清を添加したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）培地を用いて生育させた。ＲＣＡＳ／ＶＯＰＴ、ＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグ、及びヒト胎盤アルカリホスファターゼを含むＲＣＡＳ／ＡＰのトランスフェクションを、それぞれリポフェクタミン（Life Technologies,Inc.）を用いて行った。培地上に万遍なくウイルスが広がるように、細胞を植え付け、細胞がコンフルエントになった後、抗生物質を添加したＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）の新しい培地で置換し、さらに４８時間インキュベーションを続けた。次に培養上清を採取し、Centricon−３０（ミリポア）を用いて当初濃度の１／１０まで希釈した。
【００３９】
Ａ−５（Surface Plasmon Resonance Biosensorを用いたタンパク質−タンパク質相互作用分析）
文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9337-42, 1998）記載の方法に準じてＢＩＡＣＯＲＥ２０００（Biacore）を用いて、Ventroptin（ＶＯＰＴ）とＢＭＰとの結合実験を行った。すなわち、ＲＣＡＳ／ＡＰ又はＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグに感染させたＣＥＦでコンディショニングした上清を、室温下流速１０μｌ／分で３００秒間表面に流した。ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮソフトウエア（Biacore）を用いて、ＲＣＡＳ／ＡＰで感染させたＣＥＦによりコンディショニングした上清におけるカーブを差し引くことによって、全反応カーブのバックグラウンドを補正した。アフリカツメガエルの組換えＢＭＰ−４は、蚕の発現システム（J. Biol. Chem. 272, 11535-40, 1997）を用いて得た。アフリカツメガエルの組換えＢＭＰ−４／７ヘテロ２量体及びＢＭＰ−７（Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 670-7, 1995）は、藤沢氏（武田薬品工業株式会社）より供与されたものを用いた。アフリカツメガエル組換えアクチビンＡは、江藤氏（味の素株式会社）より供与されたものを用いた。ヒト組換えＴＧＦ−β１はキング醸造（日本）から購入したものを用いた。
【００４０】
Ａ−６（in situハイブリダイゼーション）
文献（「免疫染色 in situ ハイブリダイゼーション」羊土社発行、５８〜１０４頁、１９９７）に記載されているプロトコールに従って、セクション及びホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った。プローブとしては、Ventroptin（ＶＯＰＴ）の５０８ｂｐ断片（ヌクレオチド残基３４７５−３９８２）、ニワトリＢＭＰ−４のコード領域、ニワトリＶａｘ（ｃＶａｘ）のコード領域を使用した。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈｏｔｏ２マイクロスコープシステム又はＣＣＤカメラ（ＲＤ−１７５、ミノルタ、日本）を使用し、ＩＢＭＰＣ／ＡＴコンパティブルコンピューターのＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ５．５により現像した。
【００４１】
Ａ−７（アフリカツメガエル胚へのインビトロでのマイクロインジェクション及びトランスクリプション）
ｍＭｅｓｓａｇｅｍＭａｃｈｉｎｅＫｉｔ（Ambion）を用いて、線状化したｐＣＳ２＋／ＶＯＰＴ及びｐＳＰ６４Ｔ／ＢＭＰ−４（Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 1487-95, 1992）から、キャップ化した合成ＲＮＡを合成した。人工授精によりアフリカツメガエルの胚を得て、文献（Biochem. Biophys. Res. Commun. 232, 153-6, 1997）記載の方法で調製した合成ＲＮＡを４細胞期胚にマイクロインジェクションした。
【００４２】
Ａ−８（エレクトロポレーション）
ＨＨ８−１０期胚の嘴末端の左右側にそれぞれ陰極と陽極を取り付けた。２μｇ／μｌのＭｉｗ／ＶＯＰＴ及び０．５μｇ／μｌのｐＥＧＦＰ−ＮＩ（Clontech）を、ガラス製ピペットを用いて眼小胞に注入した。次いで、ＣＵＹ−２１エレクトロポレーター（BEX Co.Ltd）を用いて、５０ｍｓ間２０Ｖパルスを、４００ｍｓの間隔で３回印可した。ＤＮＡが導入されていない左側眼小胞を対照とした。Ｍｉｗ／ＡＰをエレクトロポレーションにかけても、Ｔｂｘ５やｃＶａｘの発現ドメインは変化しなかった。
【００４３】
実施例Ｂ［結果］
Ｂ−１（ＲＬＣＳ法によるニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）のスクリーニング）網膜の背腹軸に沿った局在特異性を決定する分子メカニズムを理解するために、Ｅ８（胎生８日目）ニワトリ網膜の背腹軸特異的に発現している分子を、上記実施例Ａ−２に記載したＲＬＣＳ法によりスクリーニングした。結果を図１に示す。図１ａは、最初の酵素としてＢａｍＨＩを用いたときの、網膜背側（図１ａ左）及び腹側（図１ａ右）それぞれ３分の１のＲＬＣＳプロフィールに相当する部分を示している。コンピューターによる画像解析により、通常、一対のオートラジオグラムにおいて非対称的な強さを有する幾つかのスポットが同定される。腹側特異的な点(図１ａ右の腹側画像中の矢印で示す)に相当するｃＤＮＡ断片をゲルから採り、次の実験のためにサブクローンした。該クローンを仮にＶ／ＢａｍＨＩ＃１と名付けた。Ｖ／ＢａｍＨＩ＃１の断片をプローブとしてノーザンブロット分析を行い、Ｅ８の網膜腹側から４．９ｋｂのｍＲＮＡを検出した(図１ｂ)。
【００４４】
次に、Ｅ８ニワトリ網膜ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長のＶ／ＢａｍＨＩ＃クローンを得た。単離クローンは、推定されるシグナル配列と、フォンビルブラント因子やコーディンを含む数種のタンパク質に保存されているシステインに富んだ繰返し配列（ＶＷＦＣドメイン）が３回出現する４５６アミノ酸配列の新規のタンパク質をコードしていた(図２ａ、ｂ)。この分子をVentroptin（ＶＯＰＴ）と命名した。これまでにクローニングされたＶＷＦＣドメインをもつタンパク質は、膜透過タンパク質を含む細胞外タンパク質として知られているので、Ventroptin（ＶＯＰＴ）についても調べてみた。Ventroptin（ＶＯＰＴ）発現ウイルスベクター（ＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグ）に感染させたＣＥＦよりコンディショニングした培養上清液を、ウエスタンブロット法により分析したところ、図１ｄに示されるように、シグナル配列を処理したときの予想分子量である約５０ｋＤａに相当するシングルバンドが認められたことから、Ventroptin（ＶＯＰＴ）もまた分泌タンパク質であると考えられる。
【００４５】
Ｂ−２（マウスVentroptin（ＶＯＰＴ）のスクリーニング）
ニワトリのVentroptin（ＶＯＰＴ）配列に基づいて、ＰＣＲによってマウス相同体を増幅するためにプライマーを数組デザインし、Ｐ０マウス眼ｃＤＮＡライブラリーから常法に従い、完全長のマウスVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする２つのｃＤＮＡクローンを最終的に単離した（図２ａ）。また、Ventroptin（ＶＯＰＴ）配列を用いたオンラインデータベースによるスクリーニングによって、Ventroptin（ＶＯＰＴ）と高い相同性を有するヒト遺伝子（ＡＬ０４９１７６）を同定した。以上のことから、Ventroptin（ＶＯＰＴ）、特にＶＷＦＣドメインが脊椎動物に進化論的に保存されてきたことがわかる(図２ａ)。しかし、マウスVentroptin（ＶＯＰＴ）はヒト及びニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）より短く、第３ＶＷＦＣドメインに続く領域が消失している。そのため、Ｃ末端領域をもつ他のスプライシング産物が、マウスに存在している可能性がある。
【００４６】
Ｂ−３（Ventroptin（ＶＯＰＴ）とＢＭＰ−４との結合）
Ventroptin（ＶＯＰＴ）のＶＷＦＣドメインは、ＢＭＰ−４と特異的に結合するコーディンのＶＷＦＣドメインと高い相同性を示すことから（図２ｃ）、Ventroptin（ＶＯＰＴ）がＢＭＰ−４に結合することが予想された。そこで、実施例Ａ−５に記載されているように、ＳＰＲバイオセンサー（Biacore）を用いて、Ventroptin（ＶＯＰＴ）といくつかのＴＧＦ−βファミリー分子との結合性を調べてみた。ＢＭＰ−４ホモ二量体、ＢＭＰ−７ホモ二量体、アクチビンホモ二量体ＴＧＦ−βホモ二量体、及びＢＭＰ−４／ＢＭＰ−７のヘテロ二量体を、それぞれＳＰＲバイオセンサーチップ上に固相化し、実施例Ａ−３で調製したＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグでインフェクションしたＣＥＦでコンディショニングした上清液をアナライトとしてセンサーチップに加えた。Ventroptin（ＶＯＰＴ）はＢＭＰ−４に対して強い結合力をみせ、またＢＭＰ−４／７ヘテロ二量体に対しても、より低い親和力ではあるが結合力をみせた。しかし、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β及びアクチビンに対しては結合しなかった（図３ａ）。さらに、免疫沈降分析によりＢＭＰ−４はVentroptin（ＶＯＰＴ）と共免疫沈降することも明らかになった（図３ｂレーン２）。Ventroptin（ＶＯＰＴ）のＢＭＰ−４に対する結合性により、Ventroptin（ＶＯＰＴ）がコーディン同様、ＢＭＰ−４の作用を阻害することがわかった。
【００４７】
次にVentroptin（ＶＯＰＴ）の生体内活性をテストするため、実施例Ａ−７で調製したVentroptin（ＶＯＰＴ）をコードする合成ＲＮＡをアフリカツメガエルの初期胚に注入した（図３ｃ）。Ventroptin（ＶＯＰＴ）の異所的発現は注入後の胚に２次体軸の発生を誘導した（ｎ＝６６／１０４）。この２次軸には頭部構造がなく、当然、眼やセメント腺を有しなかった。Ventroptin（ＶＯＰＴ）とＢＭＰ−４ｍＲＮＡを同時に注入した場合、Ventroptin（ＶＯＰＴ）ｍＲＮＡに誘導された２次軸形成は、完全に阻害された（ｎ＝５７／５７）。これらの結果は、Ventroptin（ＶＯＰＴ）はＢＭＰ−４と結合し、ＢＭＰ−４の生体内活性を阻害することを示している。コーディンの生物活性はＶＷＦＣドメインに拠るものとされ、特に１番目と３番目のＶＷＦＣドメインに存在している(Development 127, 821-830, 2000)。Ventroptin（ＶＯＰＴ）の３つのＶＷＦＣドメインの内、１番目と３番目のＶＷＦＣドメインがコーディンのＶＷＦＣドメインと高い相同性を有しているので（図２ｃ）、Ventroptin（ＶＯＰＴ）のＢＭＰ−４中和活性は主として、１番目と３番目のＶＷＦＣドメインに拠るものと考えられる。
【００４８】
Ｂ−４（網膜におけるVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現）
ニワトリの眼においては、網膜神経細胞形成がちょうど始まる胎生３日目頃（Dev. Biol. 38, 30-40, 1974, Brain Res. 63, 285-90, 1973)、ＢＭＰ−４の発現パターン（図４ｂ）と相補的なパターンで網膜の腹側からVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現が最初に検出された。胎生８日目に、Ventroptin（ＶＯＰＴ）は網膜の腹側から背側にかけて勾配的に発現した（図４ａ）。この勾配発現パターンは胎生８日目をピークとして、胎生６日目から１４日目にわたって観察された（図１ｃ）。網膜層構造完成前の胎生３日目には、神経網膜の層全体にわたって、Ventroptin（ＶＯＰＴ）発現細胞が見られたが、胎生８日目に層構造がより明瞭になってくると、Ventroptin（ＶＯＰＴ）発現細胞は内顆粒層に局在していた（図４ｃ）。
【００４９】
他の神経組織では、Ventroptin（ＶＯＰＴ）は前脳の脳室ゾーン（図４ｅ）と、間脳の脳室下部ゾーン（図４ｆ）に発現していた。ＢＭＰは前脳の腹背パターン形成に、重要な役割をもっていることが知られており(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2439-44, 1999)、脳室上皮部位における細胞死を含む細胞の予定運命を調節している(J. Neurosci. 19, 7077-88, 1999)。ノギンは脊索と蓋板に発現し、ノギンノックアウトマウスでは、神経管背部で腹側が未発達であることが観察された（Genes Dev. 12, 1438-52, 1998）。さらに、コーディンとノギンは両方とも前脳の発達に不可欠である（Nature 403, 658-61, 2000）。Ventroptin（ＶＯＰＴ）の発現領域は、Ventroptin（ＶＯＰＴ）がＢＭＰとの相互作用を通じて、神経組織の発達にも関わっていることを示唆している。
【００５０】
Ventroptin（ＶＯＰＴ）は肢芽においても発現し（図４ｇ、ｈ、ｉ）、胎生３日目頃に初めて検出された（図４ｇ）。翼芽と肢芽におけるVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現パターンは類似していた。肢芽におけるVentroptin（ＶＯＰＴ）の分布はＢＭＰ遺伝子の分布と相補的関係にある。前方壊死部位、後方壊死部位及び指間部のようにVentroptin（ＶＯＰＴ）が発現しない部位では、ＢＭＰがニワトリ肢芽におけるアポトーシスを仲介することが知られている(Development 122, 3725-34, 1996, Science 272, 738-41, 1996)。このことはVentroptin（ＶＯＰＴ）が、肢の発達過程における細胞のサバイバルに恐らく何らかの役割を有していることを示している。胎生７日目頃にはVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現は、指の凝集軟骨と鮮明に一致した（図４ｉ）。この発現パターンはノギンの発現パターンと似ている(Science 280, 1455-7, 1998, Dev. Biol. 197, 205-17, 1998)。ＢＭＰは、軟骨形成の強力な刺激因子であり(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1828-32, 1979, Science 242, 1528-34, 1988)、ノギンが、ＢＭＰ作用を制御することによって軟骨形成を制御するので(Science 280, 1455-7, 1998, Dev. Biol. 197, 205-17, 1998)、Ventroptin（ＶＯＰＴ）もまた、ノギンと協調して肢芽における軟骨形成を制御するものと考えられる。
【００５１】
ＢＭＰ−４は網膜の背側に選択的に発現し（図４ｂ）、網膜の背側化に関与していると考えられる(Science 287, 134-7, 2000)。Ventroptin（ＶＯＰＴ）とＢＭＰ−４の相補的発現パターンは、網膜背側で生成されたＢＭＰ−４の作用によって網膜の腹側部位が影響を受けることをVentroptin（ＶＯＰＴ）が防ぎ、腹側細胞の予定運命を確立することを示している。Ｔｂｘ５はＢＭＰ−４によってアップレギュレイトされることが知られているので(Science 287, 134-7, 2000)、網膜でのＴｂｘ５のin ovoエレクトロポレーションによってVentroptin（ＶＯＰＴ）の過剰発現の影響をテストし、上記のことを確認した。発現ベクターｐＭｉｗＣｌａＩの中にVentroptin（ＶＯＰＴ）ｃＤＮＡをもつプラスミドを、右眼小胞にエレクトロポレーションにより導入すると、Ｔｂｘ５の発現は劇的に減少し（図５ｂ）、網膜背側におけるｃＶａｘの発現が誘導された（図５ｄ）。Ｔｂｘ５やｃＶａｘを網膜に異所的に発現させると、網膜神経節細胞の視蓋への投射パターンに乱れが生じる（Science 287, 134-7, 2000, Neuron, 24, 541-53, 1999）。したがって、これらの結果はVentroptin（ＶＯＰＴ）がＴｂｘ５の発現を網膜背側に、ｃＶａｘの発現を網膜腹側に限定し、背腹軸における神経節細胞軸索の視蓋へのトポグラフィックな投射を制御しているということを示唆している。ｃＶａｘを網膜背側に異所的に発現させるとＴｂｘ５とその他の背側マーカー遺伝子の発現が減少する（Neuron, 24, 541-53, 1999）。以上のことからVentroptin（ＶＯＰＴ）はｃＶａｘの上流で働いていると考えられる。しかしながらＲＴ−ＰＣＲではＨＨ stage１５で既に頭部における低レベルのVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現が検出されるものの、in situハイブリダイゼーションではVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現（ＨＨ stage１７−１８）はｃＶａｘ（ＨＨ stage１４）（Neuron, 24, 541-53, 1999）よりも遅く検出される。これらの遺伝子の相互関係を明らかにするための実験をさらに行う必要がある。
【００５２】
以上の結果は、ＢＭＰ中和タンパク質であるVentroptin（ＶＯＰＴ）が、網膜発達の過程における腹側細胞の予定運命に対する重要な調節因子であり、Ventroptin（ＶＯＰＴ）は、ＢＭＰ活性を調節することにより、脳及び肢芽における細胞の予定運命と形態形成に対しても重要な役割を担っていることを示している。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ、タンパク質・ペプチド、タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、タンパク質・ペプチドに対する抗体、タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、視神経や脳神経の再生剤やアポトーシスの抑制剤、骨の再生、傷の修復、細胞分化、血球分化、免疫・炎症反応、細胞移動の調節剤として、あるいはインビトロ培養やブタ等を用いたインビボでの臓器の作製における使用しうる可能性があるばかりでなく、神経系における領域特異性形成の分子レベルでの機構解明に使用することができる。
【００５４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＬＣＳ法によるVentroptin（ＶＯＰＴ）の単離［参考写真１参照］
ａ；網膜の背側及び腹側のＲＬＣＳプロフィール。矢印で示した背側のスポットは網膜アルデヒド−デヒドロゲナーゼ１型。
ｂ；網膜の背側（Ｄ）、腹側（Ｖ）におけるVentroptin（ＶＯＰＴ）ｍＲＮＡ発現。ＲＬＣＳによって得られたｃＤＮＡ断片をプローブとしてＲＮＡブロットハイブリダイゼーション分析（１０μｇ全ＲＮＡ／レーン）を行った。
ｃ；抗フラッグＭ２抗体を用いたVentroptin（ＶＯＰＴ）のウエスタンブロット分析。ＲＣＡＳ／ＶＯＰＴ及びＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグでインフェクションしたＣＥＦの培養物からコンディショニングした培地を集め、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
ｄ；Ventroptin（ＶＯＰＴ）ｍＲＮＡの発達型発現。全ＲＮＡは上記ｂと同様の方法で分析した。
【図２】 Ventroptin（ＶＯＰＴ）の基本構造［参考写真２参照］
ａ；ニワトリ（ｃ）及びマウス（ｍ）Ventroptin（ＶＯＰＴ）タンパク質。ニワトリとマウス間で一致又は類似したアミノ酸をそれぞれ黒と灰色で示した。ギャップはダッシュを用いて表した。シグナルペプチド（ＳＰ）と３つのＶＷＦＣドメインの位置を示した。
ｂ；ニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）のドメイン構造。
ｃ；ニワトリVentroptin（ＶＯＰＴ）とニワトリコーディン（chordin）のＶＷＦＣドメインの配列。３以上の領域で一致又は類似したアミノ酸はそれぞれ黒と灰色で示した。＊印はＶＷＦＣドメインに保存されたシステイン残基を示している。ａ，ｂ，で示した配列はGenetics Computer Group program PileUpを用いて示した。
【図３】ＢＭＰ−４へのVentroptin（ＶＯＰＴ）の結合［参考写真３参照］
ａ；ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−４／７ヘテロ２量体、ＢＭＰ−７、アクチビンＡ及びＴＧＦ−β１タンパク質をセンサーチップ表面上で固定した。これらのチップ上に、ＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグでインフェクションしたＣＥＦでコンディショニングした上清を注入した。
ｂ；Ventroptin（ＶＯＰＴ）とＢＭＰ−４との免疫沈降。ＲＣＡＳ／ＡＰ（レーン１）又はＲＣＡＳ／ＶＯＰＴフラッグ（レーン２）でインフェクションしたＣＥＦでコンディショニングした上清を、アフリカツメガエルのＢＭＰ−４と共に４℃で２時間インキュベートし、アガロースと結合した抗フラッグ抗体と共免疫沈降した。免疫沈降物中のＢＭＰ−４量を、抗ＢＭＰ−４抗体（Ａｂ９７）を用いたウエスタンブロット法により測定した。ＢＭＰ−４スタンダードをレーン３に示した（５０ｎｇ）。
ｃ；Ventroptin（ＶＯＰＴ）による２次軸形成。キャップ化したVentroptin（ＶＯＰＴ）ｍＲＮＡ（２５０ｐｇ）単独で、又はキャップ化したＢＭＰ−４ｍＲＮＡ（１００ｐｇ）と共に、アフリカツメガエル（Laevis)の4細胞期の割卵腹側に注入した。矢頭は2次体軸を示す。
【図４】発達過程におけるVentroptin（ＶＯＰＴ）ｍＲＮＡの発現パターン［参考写真４参照］
胎生３日目のニワトリ胚のVentroptin（ＶＯＰＴ）（ａ）とＢＭＰ−４（ｂ）のホールマウントin situハイブリダイゼーション。胎生８日目の頭部セクション（ｃ）及びフラットマウント（ｄ）のin situハイブリダイゼーション。Ventroptin（ＶＯＰＴ）は網膜の腹側だけに発現した。胎生８日目のニワトリ前脳（ｅ）及び間脳（ｆ）の水平セクション。Ventroptin（ＶＯＰＴ）転写物は前脳の脳室ゾーンと間脳の脳室下ゾーンにおいて発現した。ＯＮは視神経を示している。胎生３日目（ｇ）、５日目（ｈ）、７日目（ｉ）の肢芽におけるVentroptin（ＶＯＰＴ）の発現。スケールバーはそれぞれ２００μｍ（ｃ）、６００μｍ（ｆ）、５０μｍ（ｅ）を示す。
【図５】Ｍｉｗ／ＶＯＰＴのエレクトロポレーション後のＥ３の眼におけるＴｂｘ５とｃＶａｘの発現［参考写真５参照］
対照である左眼におけるＴｂｘ５（ａ）とｃＶａｘ（ｃ）の発現パターン。遺伝子導入を行った右目ではＴｂｘ５の発現がほとんど消失している（ｂ）。これに対してｃＶａｘの発現ドメインは網膜背側に広がっている（ｄ）。矢頭は背側網膜を示す。

Claims

以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ。
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質
配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ。
請求項５記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質。
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するタンパク質。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の一部からなり、かつＢＭＰ−４中和活性を有するペプチド。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質又は請求項１１記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質又は請求項１１記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３記載の抗体。
請求項１３又は１４記載の抗体が特異的に結合し、かつＢＭＰ−４中和活性を有することを特徴とする組換えタンパク質又はペプチド。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１７記載の非ヒト動物。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物。
非ヒト動物が、マウス又はラットであることを特徴とする請求項１９記載の非ヒト動物。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質又は請求項１１記載のペプチドと、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質を発現している細胞が、請求項１６記載の宿主細胞であることを特徴とする請求項２２記載のＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は該タンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
請求項１７又は１８記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
請求項１９又は２０記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とするＢＭＰ−４中和活性促進若しくは抑制物質又は請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるＢＭＰ−４中和活性促進物質。
請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるＢＭＰ−４中和活性抑制物質。
請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現促進物質。
請求項２１〜２５のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質の発現抑制物質。