JPH10505508A - Ｉｃａｍ−４物質及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規の細胞間接着分子ポリペプチド（「ICAM-4」と称する）及びその変異体をコードするDNA配列が、組換手法による当該物質の製造のための方法及び物質と共に開示される。ICAM-4に結合する分子及びその使用も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＣＡＭ−４物質及び方法 本願出願は、1992年１月27日に出願された係属中の米国特許出願第07/827,689 号の一部継続出願として1992年５月26日に出願された、米国特許出願第07/889,7 24号の一部継続出願として1992年６月５日に出願された、米国特許出願第07/894 ,061号の一部継続出願として1993年１月22日に出願された、米国特許出願第08/0 09,266号の一部継続出願として1993年８月５日に出願された米国特許出願第08/1 02,852号の一部継続出願である、1994年５月18日に出願された米国特許出願第08 /245,295号の一部継続出願である、1995年６月７日に出願された米国特許出願第 08/481,130号の一部継続出願である。 発明の技術分野 本発明は、一般に細胞接着分子に関し、さらに詳細には、細胞間接着分子の I CAM-1、ICAM-2及びICAM-Rと構造上の関連性を有する、「ICAM-4」と称するこれ までに知られていないポリペプチドをコードするDNAのクローニング及び発現に 関する。 発明の背景 この10年来における研究によって、体内での細胞−細胞間の相互作用に関与す る分子現象、特に、免疫系における細胞の挙動及び活性化に関連する現象、そし て、さらに近年では、神経系における細胞の発生及び生理的機能に関連する現象 が、かなり解明されてきている。概説的には、免疫系の細胞に関してはSpringer 、Nature、346巻、425〜434頁(1990)、ならびに神経 系の細胞に関しては、Yoshiharaら、、Neurosci.Res.、10巻、83〜105頁(1991) と、Sonderegger及びRathjen、J.Cell Biol.、119巻、1387〜1394頁(1992)を参 照されたい。細胞表面タンパク質、及び、特に所謂細胞接着分子(「CAM」)は、 相応じて、炎症部位への白血球溢出及び別異の標的組織への白血球の移動のプロ セス、さらには、神経分化及び複雑な神経回路構成の形成のプロセスに介入する ことを目的とした、製薬学的研究及び開発の主題となっている。細胞接着分子の 単離及び特徴付け、かかる分子をコードするDNA配列のクローニング及び発現、 ならびに、炎症プロセスや、神経系の発生及び機能に関連する治療及び診断薬の 開発もまた、多くの米国及び外国特許出願の主題となっている。Edwards、Curre nt Opinion in Therapeutic Patents、1(11)、1617〜1630頁(1991)及び、特にそ の中で引用されている発行済「参考特許文献」を参照されたい。 本発明の背景における重要事項は、細胞接着現象の特定のメディエーター、す なわち、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、及び顆粒球上に存在するヘテロダイマ ーの「インテグリン」細胞表面タンパク質のサブファミリーを形成する、「ロイ コインテグリン」、LFA-1、MAC-1 及びgp150.95（WHO の命名法によると、CD18/ CD11a、CD18/CD11b、及びCD18/CD11cとそれぞれ称される）の先行する同定及び 特徴付けである。例えば、前出のSpringerの文献第429頁の表１を参照のこと。 さらに、炎症プロセスに伴う現象である、白血球の活性化、接着、運動性等に影 響を与える他の一本鎖接着分子(CAM)も重要事項である。例えば、現在のところ 、炎症プロセスを特徴付ける白血球溢出に先駆けて、白血球上で構造的に発現し ているインテグリンの活性化が起こり、次に、インテグリン(例えば、LFA-1)と 、血管内皮細胞表面上及び他の白血球細胞上にて発現されているICAM-1及 びICAM-2と称される２つの相異なる細胞間接着分子(ICAM)の一方または双方との 間に堅固なリガンド／レセプター相互作用が生じると考えられている。 今日までに特徴付けられている他のCAM（例えば、1990年11月15日に公開され たPCT WO 90/13300号に記載された管接着分子(VCAM-1)；ならびにNewman ら、Sc ience、247巻、1219〜1222頁(1990)及び1991年７月25日に公開されたPCT WO 91/ 10683号に記載された血小板内皮細胞接着分子(PECAM-1))と同様に、ICAM-1及びI CAM-2は、それぞれの細胞外部分が類似のカルボキシ末端モチーフを共有する一 連のドメインを含むという点において、他の免疫グロブリン遺伝子スーパーファ ミリーのメンバーと構造的に相同である。「典型的な」免疫グロブリン様ドメイ ンは、通常、各ループ末端の２つのシステイン間のジスルフィド結合によって固 定されているループ構造を含んでいる。ICAM-1は、５つの免疫グロブリン様ドメ インを含んでおり；細胞分布の点でICAM-1と異なるICAM-2は、このようなドメイ ンを２つ含んでおり； PECAM-1は６つ含んでおり；VCAMは、接合の多様性、その 他によって、６つまたは７つを含んでいる、等である。さらに、CAMは、典型的 には、細胞表面での分子の配向に関係していると考えられる疎水性「膜貫通」領 域、及びカルボキシ末端「細胞質」領域を含んでいる。CAMの作動的配置のグラ フィックモデルでは、一般的に、細胞の細胞質にまで伸長している細胞質「テー ル」と、細胞表面から外側に向けて伸長している１以上の免疫グロブリン様ルー プとを備えた膜貫通領域にて細胞膜に固定されている分子が示される。 数多くの神経細胞が、細胞外Ig様ドメインを持ち、構造的にICAMと類似した、 表面レセプターを発現している。例えば、Yoshiharaら、前出を参照されたい。I g様ドメインに加えて、神 経系の多くの接着分子は、細胞外ドメインにタンデムに反復したフィブロネクチ ン様配列も含んでいる。 ヒト・ライノウイルスに結合するICAM-1の能力を前提とする用途を含んだ、細 胞間接着分子に対する様々な治療上の使用が計画されてきている。例えば、1992 年１月29日に公開された欧州特許出願第 468 257 A号は、リガンド／レセプター 結合活性、特にウイルス、リンパ球関連抗原及びプラスモディウム・ファルシパ ラム(Plasmodium falciparum)などの病原体に結合する際の結合活性の向上を示 すことが提案された、ICAM-1の多量体の配置及び形態の改良（全長及び欠失され た分子型を包含する）について述べている。 同様にして、細胞間接着分子に免疫学的に関連しているタンパク質について様 々な使用が計画されてきている。例えば、1991年11月14日に公開されたWO 91/16 928号には、ヒト型化されたキメラ抗ICAM-1抗体、ならびに特異的及び非特異的 炎症、ウイルス感染、及び喘息の治療におけるその使用が述べられている。抗IC AM-1抗体及びその断片は、内毒素ショックの治療に有効である旨が、1992年３月 19日に公開されたWO 92/04034号に記載されている。抗ICAM-1抗イディオタイプ 抗体及び抗体断片を用いたICAM-1依存性の炎症応答の阻害が、1992年４月16日に 公開されたWO 92/06119号に述べられている。 ICAM-1などの細胞間接着タンパク質及びLFA-1などのリンパ球相互作用性イン テグリン類の同定及び特徴付けによって細胞接着現象の基本的な洞察が得られて いるにもかかわらず、その全容解明は程遠い。一般的には、炎症プロセス及び標 的となるリンパ球の生体内における挙動には、多くの他のタンパク質が関与して いると考えられている。例えば、米国特許出願第07/827,689号、第07/889,724号 、07/894,061号ならびに08/009,266号 及び対応する公開されたPCT WO 93/14776号（1993年８月５日公開）に、ICAM-関 連タンパク質であるICAM-Rのクローニング及び発現が開示されている。これらの 出願における開示は、特に引用することにより本明細書に組み入れるものであり 、そしてICAM-RのDNA及びアミノ酸配列は本明細書中、配列番号：４にて示す。 この新しいリガンドは、ヒトリンパ球、単球及び顆粒球上で発現されていること が見出されている。 本願出願にとって特に興味深いのは、既知のいずれのICAM分子とも異なって、 組織特異的発現性を有する、さらに別のICAM様表面分子が同定されたことである 。Moriら、［Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、84巻、3921〜3925頁(1987)］は、モノ クローナル抗体271A6との特異的免疫反応性を有する、終脳特異的抗原の同定を 報告した。この表面抗原は、テレンセファリン（telencephalin）と命名された 。Imamuraら、［Neurosci.Letts.、119巻、118〜121頁(1990)］は、発現の局在 性を評価すべくポリクローナル抗体を使用して、ネコの視覚皮質（visualcortex ）におけるテレンセファリンの発現が組織の層で多様性を示すことを述べ、また 、テレンセファリンの発現は、発生の関数として変動することを報告した。Oka ら、［Neuroscience、35巻、93〜103頁(1990)］は、続いて、モノクローナル抗 体271A6を使用したテレンセファリンの単離を報告した。この発行物に、表面分 子に対する分子量が約500 kDである旨、そしてかかる分子は４つのサブユニット で構成されていて、各々が元来の分子量は130 kDであり、そしてN-グリカナーゼ 処置後にはおよそ100 kDである旨が報告されている。Yoshihiroら、［Neuroscie nce、Research Supplement、18巻、S83頁(1994)］は、ウサギのテレンセファリ ンに対するｃDNA及びアミノ酸配列を、17th Annual Meeting of the Japan Neur oscience Society in Nagoya、日本国、1993年12月７〜９日と、23rd Annual Meeting of the Society for Neuroscience in Washington，D.C.、1993年11月９日［Societ y for Neuroscience Abstracts 19(1〜3)第646頁(1993)］において報告した。報 告された、決定されたアミノ酸配列は、130 kDのテレンセファリンが、９つの細 胞外免疫グロブリン(Ig)様ドメインを持つ膜内在性タンパク質（integral membr ane protein）であることを示唆していた。これらのドメインのうち遠位の８つ は、他のICAMのIg様ドメインと相同性を示した。これと同様の情報が、Neuron、 12巻、543〜553頁(1994)にてYoshiharaらにより報告された。 かくして、当該技術分野において、ヒトの細胞−細胞間の相互作用に関与する さらなるタンパク質の発見、特に、かようなタンパク質のアミノ酸配列を特異的 に同定しかつ特徴付けるのに役立つ情報が希求されている。さらに、そのような 分子が治療薬及び診断薬の開発の基礎を形成し得る程度に、それらをコードして いるDNAが解明されることが必須である。かかる根本的な情報は、とりわけ、そ れらタンパク質の大量生産に役立ち、それらタンパク質を天然に産生する細胞の 同定を許容し、そして抗体物質またはそれらと特異的な反応性を有する他の新規 な結合タンパク質及び／もしくは関与するリガンド／レセプター結合反応を阻害 する他の新規な結合タンパク質の調製を可能にするであろう。 発明の要旨 本発明の一つの特徴において、新規なポリペプチド「ICAM-4」ならびに、ICAM -4に特異的な１以上のリガンド／レセプター結合生物学的活性及び／または免疫 学的特性を呈する、そのポ リペプチド変異体（断片ならびに欠失、置換、及び付加類似体を包含する）をコ ードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA配列、そのRNA転 写物及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）が提供される。ICAM-4特異的リガン ド／レセプター結合生物学的活性には、ICAM-4細胞外ドメイン及び細胞質ドメイ ンの両方と他の分子との相互作用（例えば、細胞間接着及び／またはシグナルト ランスダクションのプロセスにおける）が含まれる。本発明の好ましいDNA配列 には、ゲノム配列及びｃDNA配列ならびに全体または部分的に化学合成されたDNA 配列が包含される。現在のところ好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：１で 示され、ラット種のICAM-4をコードするものである。本発明のDNA配列の生物学 的複製物（すなわち、in vivoまたはin vitroで製造された、単離されたDNA配列 のコピー）も目的とされている。さらに、ICAM-4配列を組み入れたプラスミド及 びウィルスベクターなどの、自律的に複製する組換え構築体、特に、ICAM-4また はICAM-4変異体をコードするDNAが、内在性または外在性発現制御DNA配列に作動 性に連結されたベクターもまた提供される。 本発明の他の特徴によれば、特に、原核細胞及び真核細胞などの単細胞の宿主 細胞が、その細胞内での所望のポリペプチドの発現を許容するように、本発明の DNA配列で安定に形質転換される。このようなICAM-4及びICAM-4変異体産物を発 現する宿主細胞は、様々な有用な目的に役立つことができる。発現した産物が宿 主細胞表面上に「提示される」限りにおいて、細胞は、ICAM-4及びICAM-4変異体 と特異的に免疫反応性を有する抗体物質の誘起のための有用な免疫原を構成する かもしれない。本発明の宿主細胞は、好適な培養培地中で細胞を生育し、所望の ポリペプチド産物を細胞または細胞が生育している培地から単離 する工程を含む、ICAM-4及びICAM-4変異体の大量生産のための方法において、際 立って有用である。 本発明の新規なICAM-4は、天然の細胞源からの単離物として得ることができる が、ICAM-4変異体産物とともに、好ましくは、本発明の宿主細胞が関与する組換 え操作によって生産される。ICAM-4ポリペプチドに対する、現在のところ好まし いアミノ酸配列は、配列番号：２に示される。産物は、組換え生産及び／または 単離後加工作業のために選択される宿主細胞に依存して、全体的にもしくは部分 的にグリコシル化された状態、部分的にもしくは全体的に脱グリコシル化された 状態、またはグリコシル化されていない状態で得られるとよい。本発明のICAM-4 変異体は、上記にて特定し、そして、例えば、ICAM-4の結合パートナーへの結合 能力及び／または天然の結合パートナーに対するICAM-4の結合阻害能力などとい った能力を包含する、ICAM-4の生物学的または免疫学的特性を有する、１以上の ドメイン領域のすべてまたは一部を含む、水溶性または不溶性の、単量体、多量 体または環状ICAM-4断片を含みうる。本発明のICAM-4変異体はまた、１以上の特 定のアミノ酸が下記のごとく欠失または置換されたポリペプチド類似体も含むも のである： (1)ICAM-4に特異的な１以上の生物学的活性もしくは免疫学的特性が損失するこ となく、好ましくは、強化されている；または(2)特定のリガンド／レセプター 結合機能が特異的に無力化されている。多量体形成を容易ならしめる付加的なア ミノ酸（例えば、リシンまたはシステイン）残基を含む類似体ポリペプチドが、 目的とされる。 さらに、本発明では、ICAM-4またはICAM-4変異体に対して特異的な（すなわち 、ICAM-4が構造上関連している、ICAM-1、ICAM-2、及びICAM-R細胞間接着分子と 非反応性である）抗体物 質（例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、抗体断片、一本鎖抗 体、キメラ抗体、CDR移植抗体等）ならびに他の結合タンパク質（例えば、ポリ ペプチド及びペプチド）もまた目的とされる。本発明ではさらに、本発明のモノ クローナル抗体を特異的に分泌するハイブリドーマ細胞系も目的とされる。現在 のところ好ましい本発明のハイブリドーマには、127A、127H、173E、179I、及び 179Hと称されるハイブリドーマが包含される。抗体物質は、単離された天然由来 もしくは組換えの、ICAM-4もしくはICAM-4変異体、またはこのような産物を細胞 表面上に発現している細胞を使用して、つくり出すことができる。加うるに本発 明の結合タンパク質は、結合部位構造の特徴付け（例えば、ICAM-4アミノ酸配列 におけるエピトープ及び／または修飾への結合特性の感応性）のためにも有用で ある。 結合タンパク質はさらにまた、免疫用組成物において、及び本発明のポリペプ チドを精製するため、ならびに表面上にこのポリペプチドを提示している細胞を 同定するためにも有用である。これらのタンパク質はまた、ICAM-4が関与するリ ガンド／レセプター結合生物学的活性、特に特異的及び非特異的免疫系応答に関 与するICAM-4エフェクター機能をモジュレート（すなわち、ブロッキング、阻害 、または刺激）する上で明らかに有用である。抗ICAM-4抗体物質に特異的な抗イ デオタイプ抗体、及びそのような抗イデオタイプ抗体物質の免疫応答のモジュレ ーションにおける使用もまた、目的とされる。細胞表面上及び、血清または脳脊 髄液などの体液中のICAM-4の検出及び定量のためのアッセイには、例えば、「サ ンドイッチ」アッセイ様式における、単一抗体物質または複数抗体物質が包含さ れうる。体液中のICAM-4を検出する上で、本発明の抗体は、循環しているICAM-4 の増加レベルに呼応する可能性のある神経病理学的症 候の発症を評価するためにも有用である。かかる神経病理学的症候には、例えば 、血栓症、塞栓症等を包含する様々な障害に起因する脳虚血（すなわち、卒中） が含まれるが、これらに限定されることはない。 本発明のDNA及びアミノ酸配列の開示によってもたらされる情報の科学的価値 は明白である。一連の例としては、ICAM-4のcDNA配列の知識によって、ICAM-4を コードするゲノムDNA配列のDNA/DNA ハイブリダイゼーションによる単離、及び プロモーター、オペレーター等といったICAM-4発現制御調節配列の特定が可能と なる。本発明のDNA配列を用いて厳重な条件下で行ったDNA/DNAハイブリダイゼー ション法によって、ICAM-4の対立変異体をコードするDNAの単離、ICAM-4に特異 的な１以上の生物学的及び／または免疫学的特性が共通する、構造的関連性を有 する他のタンパク質の単離、そして、ICAM-4に相同な他の種に由来するタンパク 質の単離が可能になることが同様に期待される。本発明のDNAは、ICAM-4を合成 する細胞の能力を検出するためのDNA/RNAハイブリダイゼーションアッセイに有 用である。さらに、本発明によって、通常時にICAM-4を発現する細胞によるICAM -4の発現調節に関連するアンチセンス・ポリヌクレオチドが入手可能となる。他 の一連の例としては、ICAM-4のDNA及びアミノ酸配列の知識によって、ICAM-4タ ンパク質配列ならびに免疫グロブリン重鎖定常領域及び／またはヒンジ領域の存 在により特徴付けられるハイブリッド融合タンパク質（時折、「免疫接着体」と 称される）などのICAM-4変異体を、組換え手段により作製することが可能になる 。Caponら、Nature、337巻、525〜531頁(1989); Ashkenaziら、P.N.A.S．(USA) 、88巻、10535〜10539頁(1991);及び1989年４月６日公開のPCT WO 89/02922号を 参照のこと。ICAM-4変異体融合タンパク質はまた、例えば、選 択されたICAM-4の細胞外ドメイン及び他の細胞間接着分子の部分を含んでもよい 。 本発明のDNAにより、プロモーター領域に作動性に連結されたポリヌクレオチ ドの発現を特異的にプロモートする非翻訳DNA配列の同定が可能となる。かかる プロモーター配列の同定及び使用は、例えば、限られた神経環境における異種遺 伝子発現を特異的に必要としうる、遺伝子導入などといった例において特に所望 されるものである。本発明はまた、本発明のプロモーターを含むベクター、のみ ならず本発明のプロモーターが異種ポリヌクレオチド配列及び転写終止シグナル に作動性に連結された、キメラ遺伝子構築体をも包含するものである。 本発明によって提供されるDNA及びアミノ酸配列の情報により、ICAM-4の構造 及び機能の系統的分析、ならびにICAM-4が細胞外及び細胞内レベルで相互作用す るであろう分子の画定も可能になる。本発明の抗ICAM-4モノクローナル抗体のイ ディオタイプは、このような分子の代表例であり、天然の結合タンパク質（ペプ チド及びポリペプチド）を再現しうる。前記結合タンパク質を通して、ICAM-4細 胞間及び細胞内活性がモジュレーションを受けたり、または、前記結合タンパク 質によりICAM-4が細胞間及び細胞内現象のモジュレーションを行うのである。あ るいは、前記イディオタイプは、ICAM-4活性の新しいクラスのモジュレーターに 相当するかもしれない。抗イディオタイプ抗体はまた、生物学的活性を有するIC AM-4等価物の新しいクラスに相当するかもしれない。ICAM-4の活性をモジュレー トする抗体または他の化合物を同定するためのin vitroアッセイには、例えば、 ICAM-4またはICAM-4が結合する天然リガンドを固定化し、固定化していない結合 パートナーを検出可能に標識付けし、この結合パートナーを共にインキュベート し、そして、結合し た標識の量に対する試験化合物の効果を決定する工程が包含されうる。この試験 化合物の効果の決定において、試験化合物が存在しない条件下で結合した標識の 量と、試験化合物の存在下で結合した標識の量を比較し、その量の減少によって 、試験薬剤がICAM-4結合の阻害剤であることが示唆されるのである。 本発明によって提供されるDNA配列情報から、機能性ICAM-4タンパク質を発現 しないような、または変異型ICAM-4タンパク質を発現するような齧歯動物の作製 も、相同組換えまたは「ノックアウト」戦略〔例えば、Kapecchi、Science、244 巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい〕によって可能になる。かような齧歯動 物は、in vivoでのICAM-4及びICAM-4モジュレーターの活性の研究のためのモデ ルとして有用である。 発明の詳細な説明 親出願である、1993年８月５日に出願された米国特許出願第08/102,852号の開 示を、引用することにより特に本明細書に組み入れることとする。かかる出願の 実施例には、とりわけ、ICAM関連DNAのPCR増幅用のオリゴヌクレオチドプローブ の設計及び構築；ICAM-1及びICAM-2をコードするDNAと相同性を有するがこれら とは異なるヒトゲノム断片を増幅するためのプローブの使用；ICAM-Rをコードす るさらなる配列を単離するための、ゲノム断片を用いたcDNAライブラリーのスク リーニング；ICAM-Rをコードする全長のヒトcDNA配列を単離するためのcDNAライ ブラリーのスクリーニング；特にICAM-1及びICAM-2に関連する、ICAM-Rに対する DNA及びアミノ酸配列情報の特徴付け；ICAM-Rを発現する哺乳動物宿主細胞の作 製；CD18依存性及びCD18非依存性経路に関わる接着現象におけるICAM-Rの関与の 指標の評価；ICAM-R由来ペプチドによるICAM-Rへの細胞接着の阻害；ICAM-R の変異体の発現；抗ICAM-R抗体及びその断片の調製及び特徴付け；抗ICAM-Rモノ クローナル抗体によって認識されるICAM-Rエピトープのマッピング；ICAM-R及び これをコードするRNAの分布及び生化学的特徴の評価；同型の細胞−細胞間接着 及び免疫細胞活性化／増殖におけるICAM-Rの評価；ICAM-Rモノクローナル抗体の 特徴付け；ならびにICAM-Rの細胞質ドメインの、分別的（differential）リン酸 化及び細胞骨格会合の評価が述べられている。さらにまた開示されているのは、 当時ヒトICAM-Rのラット相同体であると考えられた、齧歯類のICAMをコードする DNAの同定、ならびにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をコー ドするDNAの構築及び発現のための、前記DNAの使用であった。この齧歯類のDNA がどのように同定されたかについての詳細な説明は、親出願（米国特許出願番号 第08/102,852号）の実施例６において見出すことができ、そして本明細書中、実 施例１として再現されている。齧歯類のICAMをコードする配列のさらなる部分を 同定するにつれ、齧歯類のICAMのDNAはヒトICAM-Rのラット種相同体をコードし ているのではなく、実際には、本明細書中でICAM-4と称した新規ICAMポリペプチ ドをコードしていることが明らかになった。ICAM-4の同定へと導いた成り行きを 正当に認識するために、以下発明の詳細な説明に、時間を追った経過（chronolo gy）を提供する。 第一の齧歯類ゲノムICAM-4配列を単離したが、これは、ヒトICAM-R（本明細書 中、配列番号：４として記載）のドメイン２（本明細書中、配列番号：３、及び 米国特許出願番号第08/102,852号における配列番号：２３）と相同性を有する領 域をコードしていた。第二の重複するゲノムDNA（本明細書中、配列番号：５、 及び米国特許出願番号第08/102,852号における配列番号：２６）もまた同定され 、これは配列番号：３のドメイン２ 領域、及びICAM-1に対する配列の双方をコードしていた。配列番号：３をプロー ブとして使用して、齧歯類脾臓cDNA（本明細書中、配列番号：６、及び米国特許 出願番号第08/102,852号における配列番号：２５）を同定したが、これは、ドメ イン２から５までのみならず、ICAMドメインとしてそれまでに観察されていなか った第５のドメインをコードしていた。この時点で、これらの新しく同定された 齧歯類DNAは、ヒトICAM-Rの齧歯類相同体をコードしていると思われたが、しか しながら、これらDNAの3'領域の他のICAMとのアラインメントにおける整合は困 難であることが明らかになった。 引き続きラット脾臓ライブラリーから１kbのcDNAクローンの単離、及びRT-PCR 断片の増幅を行って、cDNA及びゲノムクローンの双方の一部が配列決定されてい なかったことが示唆された。別のRT-PCR増幅産物（配列番号：７）によって、こ の遺漏が確認された。DNA配列決定の研究用にλファージからこれらの配列を単 離するために、そのクローンをEcoRI消化することによって、ゲノム及びcDNAク ローンから177 bpの断片が切除されたことがわかった。これらの他の配列に鑑み て配列番号：５及び６を再び分析すると、当初単離されたゲノム及びcDNAクロー ンに対する、より正確で完全な配列の同定が可能になり、本明細書中、配列番号 ：８及び９で示す修正された形式が提示された。 ICAM-4に対する完全なコード配列を同定するために、ラット脳cDNA（配列番号 ：１０）を単離し、そしてcDNA末端の5'迅速増幅（5’RACE）によって5'端配列 を決定し、その増幅産物を配列番号：１１で示した。RT-PCRクローン（配列番号 ：７）からの情報を組み合わせて、脳cDNA（配列番号：１０）及びRACE増幅産物 （配列番号：１１）によって、ICAM-4に対する完全なコード配列（配列番号：１ ）の同定が可能となった。 しかして本発明は、以下の実施例によって例証される。さらに詳細には、実施 例１は、部分的な齧歯類ICAM-4 DNAのクローニングを示すものである。実施例２ には、齧歯類ICAM-4転写のノザンブロット分析を記載する。実施例３には、全長 の齧歯類ICAM-4 cDNAの単離を記載する。実施例４は、脳組織における齧歯類ICA M-4のin situハイブリダイゼーションに関する。実施例５には、原核生物におけ るICAM-4融合タンパク質の作製を述べる。実施例６には、ラットICAM-4/GST融合 タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体の製造を記載する。実施例７に は、バキュロウイルス発現系における可溶性ラットICAM-4タンパク質の発現を記 載する。実施例８には、バキュロウイルス系において発現したラットICAM-4に対 して特異的なモノクローナル抗体の製造を述べる。実施例９には、ラットICAM-4 発現の、免疫細胞化学的分析を記載する。実施例１０は、ヒト・ゲノムICAM-4を コードするDNAのクローニングに関する。実施例１１には、ヒトICAM-4をコード するcDNAのクローニングを述べる。実施例１２には、ヒトICAM-4発現のノザン分 析を記載する。実施例１３には、ヒトICAM-4/GST融合タンパク質の作製を記載す る。実施例１４には、ヒトICAM-4に対して免疫的特異性を有するモノクローナル 抗体の製造を述べる。実施例１５には、特定の液体中の可溶性ICAM-4の濃度を定 量するための、捕獲アッセイの開発を記載する。実施例１６は、卒中患者の血清 中のICAM-4濃度の評価における、捕獲アッセイ方法の適用に関する。実施例１７ は、ラットのテンカンモデルにおけるICAM-4転写の評価に関する。実施例１８に は、ヒトICAM-4に対するプロモーター領域のクローニングを述べる。 実施例１ ラットICAM-関連DNAのクローニング Ａ． ラットゲノムICAM-関連ドメイン２ DNAの単離 λ EMBL3に構築されたラットゲノムライブラリーを、ヒトICAM-3のドメイン２ をコードするDNAからPCRによって作製した［³²P］−標識プローブを用いてスク リーニングした。このプローブの配列は、配列番号：１２に示す。ライブラリー のプラークは、Hybond N+ナイロン膜（Amersham社、Arlington Heights、イリノ イ州）に転写した。すべてのcDNA及びゲノムライブラリーのスクリーニングは、 標準プロトコルに従って実施した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダ イゼーションは、42℃にて、40〜50％ホルムアミド、５×デンハーツ、５×SSPE 及び1.0％SDSの溶液中で行なった。ハイブリダイゼーション溶液には、プローブ （［³²P］で標識）を10⁵〜10⁶cpm/mlの濃度で加えた。ハイブリダイゼーション を16〜18時間行った後、ナイロン膜を室温にて0.1％ SDSを含む２×SSPE中で充 分に洗浄し、続いて-80℃において一晩、Ｘ線フィルムに露光した。陽性プラー クをさらなる１以上の回数のハイブリダイゼーションに供し、クローンのファー ジを得た。陽性クローンの溶解物から調製したDNAを、pBS+へサブクローニング し、そして配列決定した。 ラットICAM-関連ドメイン２をコードする第一のゲノムクローンは、他のICAM ファミリーのメンバーにおけるドメイン２領域（例えば、米国特許出願第08/102 ,852号の表１を参照されたい）と相同であることが確かめられたものの、以前に 報告されたラットICAM-1［Kitaら、Biochem.Biophys.Acta、1131巻、108〜110頁 (1992)］またはマウスICAM-2［Xuら、J.Immunol.、149巻、2560〜2565頁(1992) ］に対するヌクレオチド配列とは異なることが同定された。このクローンに対す る核酸及び決定された アミノ酸配列は、称するところではラットICAM-Rの変異型として本出願に対する 係属中の親出願、米国特許出願番号第08/102,852号に開示されており、明細書中 それぞれ配列番号：２３及び２４として示されている。 第二の重複するクローンもまた、同じプローブを用いて同定され、配列番号： ３のICAMドメイン２配列と、ラットICAM-1の少なくとも一部をコードする5'DNA を含んでいることが確かめられた。このクローンに対する核酸配列は、本出願に 対する係属中の親出願において配列番号：２６として示され、本出願明細書中で は配列番号：５として示されている。この第二のクローンにより、第一のクロー ンのICAM-関連遺伝子断片及びラットICAM-1をコードする遺伝子が、同じラット クロモソーム上、互いに5 kb以内に位置していることが示唆された。 Ｂ． ラットICAM-関連cDNAの単離 ICAM-関連ポリペプチドに対するさらに完全なタンパク質コード配列を同定す るために、前出のＡ項で同定したラットゲノムクローンからのドメイン２配列を コードする［³²P］で標識したDNA（配列番号：３）を使用して、ラットのマクロ ファージ(Clontech社、Palo Alto、カリフォルニア州)、末梢血リンパ球（PBL） （Clontech社）、Ｔ細胞（内部（社内）で構築）、及びＢ細胞（内部（社内）で 構築）を包含する様々なラット及びマウス細胞型からの数多くのcDNAライブラリ ーをスクリーニングした。 ラット脾臓cDNAライブラリー(Clontech社)中の単一クローンを同定したが、こ れは５つのIg様ドメインを含んでおり、このうち４つはICAM-1及びICAM-Rの双方 におけるドメイン２から５までと相同であった。さらに、このクローンは、他の いかなる ICAMポリペプチドにおいてもこれまでに同定されていなかった、見かけ上第５の Ig様ドメインをコードする3'DNAを含んでいた。加えて、このクローンは、ドメ イン４と５との間に位置する部分的イントロン（後で論ずる）であることがその 後確かめられた、通常と異なる3'配列を含んでおり、このクローンが未成熟また は異常にスプライシングされた転写物であることが示唆された。独特のドメイン の存在及び、3'領域が他の既知のICAMとのアラインメントで適切に整合しないこ との確定によって、このICAM-関連DNAが潜在的に新規のラットICAMポリペプチド をコードしていることが示された。このクローンに対する核酸配列は、本出願に 対する親出願にて配列番号：２５として示され、本出願明細書中において、この 脾臓cDNAクローンに対する核酸配列は、配列番号：６に示される。 Ｃ． ラットcDNA及びゲノムDNAの再分析 1993年８月５日の米国特許出願第08/102,852号の出願に続いて、部分的なラッ ト脾臓cDNAクローン（親出願では配列番号：２５、そして本明細書中では配列番 号：６）及びラット肝ゲノムクローン（親出願では配列番号：２６、そして本明 細書中では配列番号：５）が、これらのクローンのそれぞれ一部であったが、サ ブクローニング工程でEcoRI消化でλベクターからライブラリーインサートを取 り出し、そして配列決定用ベクターへとライゲーションを行う際に喪失された、 内部177 bpのEcoRI断片を欠いていることが確かめられた。cDNA及びゲノムクロ ーンが、コード領域の断片を欠いているかもしれないとの観察は、ラット配列に おけるギャップを明示した、配列番号：７を包含する様々なRT-PCR増幅産物との 前記ラットゲノム及びcDNA配列のアラインメントを行った上で明らかになった。 プローブとして脾臓cDNAクローン（配列番号：６）を用いて引き続き行った、 脾臓ライブラリーからのcDNAの単離及び配列のアラインメントによって、脾臓cD NA及びゲノムクローンの一部が配列決定されていないことの第一の示唆が得られ た。配列番号：１４で示される5'プライマー（クローニングを容易にするために 5'XhoI制限酵素部位を含んでいるRRD3 5'Xho）、及び配列番号：１５で示される 3'プライマー（クローニングを容易にするためにHindIII部位を含んでいるRRD5 3'Hind）を用いた、ドメイン３から５までにわたるRT-PCR断片の増幅を行った上 で、さらにこの認識が明らかに確認された。 これら２つのDNAのアラインメントによって、前記cDNA及びゲノムクローンが配 列決定前に断片を喪失していたことが明らかに示され、この認識はさらに、後で 論ずるRT-PCRのDNAの配列決定に伴ってさらに支持された。配列決定に先駆けて 行ったcDNA及びゲノム断片を取り出すためのEcoRIによる制限酵素消化が、アガ ロースゲルにおけるλファージ配列からのクローンの分離の際に視覚的に検出さ れなかった177 bpの断片の切除という結果を招いたと結論付けられた。続いて配 列分析を行い、元のクローンの双方ともに、177 bpの断片に隣り合って２つのEc oRI部位が位置していることが確認された。 その177 bpのEcoRI断片は、配列番号：９に示すラットの部分的なcDNAクロー ンにおける719位と896位のヌクレオチドの間ならびに、配列番号：８に示す部分 的なゲノムクローンにおける2812位と2989位のヌクレオチドの間に位置している 。 Ｄ．RT-PCR クローンにより単離されたDNA ラットICAM-関連遺伝子に対する、さらに完全な配列情報を作 製するために、RT-PCRを利用した。ゲノムクローン（配列番号：３）からの配列 情報を使用して、cDNAクローンから確定された通りのタンパク質をコードする領 域の5'領域に相補的なセンスプライマー、及びcDNAクローン中のコード配列に対 して3'領域の配列（配列番号：６）に相補的となるように設計されたアンチセン スプライマーを設計した。 PCR反応のための鋳型cDNAは、以下の通りに調製した。ラット脾臓細胞から単 離したおよそ2μgのポリ A⁺RNAを、10μl容量中で65℃にて加熱することによっ て変性させた。変性の後、0.1μlのRNasin（Invitrogen社、San Diego、カリフ ォルニア州）、5μlの５×RTase Buffer（BRL社、Bethesda、メリーランド州） 、2μlのランダムヘキサマー（100μg/mlのpd(N)6）（Pharmacia社、Piscataway 、ニュージャージー州）、6μlのdNTP（各々2 mM）及び2μlのAMV RTase（BRL社 ）を添加して、その反応液を42℃にて60〜90分インキュベートした。反応液は、 要時まで、-20℃にて保管しておいた。 鋳型としてラット脾臓cDNAを使用したPCR反応において増幅産物を製造したオ リゴヌクレオチドプライマー対を同定するために、先ず最初の一連の実験を実施 した。PCRにおいて様々な5'センスプライマーと、内部のコード配列と相補的に なるように設計された3'プライマーとの対を形成した。その3'プライマーはRRD2 3-1と称され、配列番号：１６で示される。 （最終的に単離されたRT-PCR産物である配列番号：７（後記）において、プライ マーRRD2 3-1は、719位から736位までのヌクレオチドに対応していた。）同様に 、様々な3'アンチセンスプライマーと、別の内部のコード配列と相補的になるよ うに設計された5'プライマーとの対を形成した。これらの反応における その5'プライマーはRGen3900Sと称され、配列番号：１７で示される。 （配列番号：７（後記）において、プライマーRGen3900Sは、1719位から1736位 までのヌクレオチドに対応していた。）増幅産物のサイズ及びこれらの産物が部 分的なｃDNAクローンとハイブリダイズする能力に基づいて、一対のプライマー が最も有効であることを明らかにし、引き続いてのPCR増幅で使用した。5'プラ イマーは、Rgen780S（配列番号：１８）と称され、そして3'プライマーはRGen45 50AS（配列番号：１９）と称された。 （配列番号：７（後記）において、プライマーRGen780Sは、1位から18位までの ヌクレオチドに対応し、そしてプライマーRGen4550ASは、2197位から2214位まで のヌクレオチドに対応していた。） 増幅を至適化するために、様々な条件の下でのPCRにおいてこのプライマー対 を使用した。pH及びMg⁺⁺濃度を変化させた、合計１５の異なるPCR緩衝液を２つ の異なるアニーリング温度にて使用し、そして各反応からの産物の試料を、1％ アガロースゲルで分離した。いずれの反応条件からも、エチジウムブロマイドで 染色したゲルの視覚的な検査によって検出することができる増幅産物はなかった ので、PCR産物を検出するために、より感度の高いサザンハイブリダイゼーショ ンを用いた。 増幅したDNAのアリコートを電気泳動によって分離し、旧来のサザンブロッテ ィングのウィッキング技術を使用してHybondN+膜に転写し、そして［³²P］で標 識したラットのcDNA全体とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの条 件は、本質 的に、前出の第Ａ項でライブラリースクリーニングの方法について記載した通り であった。オートラジオグラフィーによって、反応のうち２つにおいておよそ2. 2 kbの、少量のDNAが製造されていたことが示唆され、そしてその２つの反応由 来の増幅産物の残りは、アガロースゲルで分離した。視覚的に検査した上では明 瞭なバンドは認められなかったものの、その2.2 kbの領域をゲルから溶出させ、 そして、55℃のアニーリング温度にて同じプライマー（配列番号：１８及び１９ ）、1 mMのMg^-+を含有するTris−HCl緩衝液、pH 8.0を使用した別のPCR反応にお ける鋳型として使用した。第二のPCRからの増幅産物は、ゲルで目視可能であり 、そして溶出されて配列分析用にpBS⁺プラスミド（Stratagene社、La Jolla、カ リフォルニア州）にクローニングした。 その結果得られたRT-PCRクローンは、配列番号：７に示すように、2214 bpを 含むことが確かめられた。このクローンは、ラット脾臓cDNAクローンにおいて見 出されたドメイン２から６まで、さらなるアミノ末端ドメイン１、さらなるカル ボキシ末端ドメイン７、及びさらなるカルボキシ末端ドメイン８であるように見 受けられる164 bpをコードしていた。ドメイン１に隣接した5'側は、リーダーと 第１ドメインとの間のイントロンに由来していると推量される、さらなる144 bp 配列であった。このクローンは、5'リーダー配列または、3'膜貫通及び細胞質領 域を含んでいなかった。脾臓cDNAクローンにおいて以前に同定されたドメイン６ に加えて、RT-PCRクローンにおける第７及び第８のドメインによって、このクロ ーンが新規の齧歯類ICAMであるとの仮説が支持された。 実施例２ ノザンブロット分析 実施例１で同定されたICAM-関連クローンが、独特なIg様ドメインにより示唆 されるように新規のICAMポリペプチドをコードしている可能性を詳査するために 、ヒトICAMの以前に報告された発現パターン［ICAM-1、Dustinら、J.Immunol.、 137巻、245〜254頁(1986)；ICAM-2、Stauntonら、Nature、339巻、61〜64頁(198 9)；ICAM-R、de Fourgerolles及びSpringer、J.Exp.Med.、175巻、185〜190頁(1 992)］との比較を可能とするよう、組織特異的発現をノザンブロット分析によっ て調べた。 ラット肺、脳、脊髄、肝臓、消化管、胸腺、リンパ節、及び脾臓からの細胞の 総RNAは、製造業者が示したプロトコルに従って、STAT60 RNA単離用試薬（Tel-t est "B"，Inc,、Friends-wood、テキサス州）を使用して調製した。ポリ A⁺RNA は、オリゴdTセルロースカラムを使用して総RNAから精製した。各組織に由来す るおよそ5μgのRNAを、1％ホルムアミドアガロースゲルで分離し、そしてハイボ ンド-Cニトロセルロース膜（Amersham社）に転写した。 ドメイン２から４までに対応する実施例１からのラット脾臓cDNAの断片（配列 番号：６における第１位から724位までのヌクレオチド）を、pBluescript SK⁺（ Stratagene社）にサブクローニングし、そして製造業者（Boehringer Mannheim 社、Indianapolis、インディアナ州）が示したプロトコルに従い、³²Pで標識し たUTPと直鎖にした鋳型のおよそ500 ngを使用してin vitro転写によってアンチ センスリボプローブを作製した。膜に結合したRNAは、50％ホルムアミド、５× SSC、１× PE（50 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1％ピロホスフェートナトリウム、0 .2％ポリビニルピロリドン、0.2％フィコール、5 mM EDTA、1％SDS）及び150μg /mlの変性サケ精子DNAを含有する溶液中で プレハイブリダイゼーションした。放射性同位元素標識したプローブを、煮沸に よって変性させ、最終濃度が1×10⁶cpm/mlとなるようにプレハイブリダイゼーシ ョン溶液に添加した。ハイブリダイゼーションは、65℃にて16〜18時間進行させ た。次いで、0.1％ SDSを含有する２× SSC中で65℃にて膜を洗浄し、その後３ 〜16時間Ｘ線フィルムに露光させた。 ノザンブロット分析によって、実施例１で同定されたICAM-関連cDNAはラット 脳においてのみ（他のいずれのICAMポリペプチドについてもこれまでに組織特異 性が報告されていない）発現していることが示唆された。この発現パターンによ って、他のICAMポリペプチドには存在していることが知られていない独特のIg様 ドメインと合わせて、このICAM-関連クローンがICAMファミリーのタンパク質の 新規のメンバーであることが示唆され、ICAM-4と命名された。 初めに同定されたcDNAクローンがラット脾臓ライブラリーにおいて検出された という事実によって、脾臓中の細胞のサブセットが低レベルでICAM-4を発現して いるかもしれないことが示唆された。しかしながら、正しくスプライシングされ たクローンは、多くの造血細胞のcDNAライブラリーにおいて検出することができ ず、ICAM-4タンパク質が脳以外の組織中で実際に発現されているか否かについて 、疑念がもたらされた。脾臓におけるICAM-4 cDNAの検出に対する１つの説明は 、PCRの感度によって、これらの組織が、コードされているタンパク質を発現し なくとも、痕跡程度の量の転写物が増幅されていたのかもしれないということで ある。 実施例３ 全長のラットICAM-4 cDNAの単離 Ａ． ラット脳cDNAクローンの同定 ICAM-4の組織特的発現に鑑みて、ICAM-4をコードする全長のcDNAを単離する試 みに、脳組織のmRNAを利用した。２つのプローブ、すなわち、１つはドメイン１ から２までに相補的なもの、そして第２は実施例１で同定した脾臓cDNAクローン （配列番号：７）ドメイン３から５までに相補的なものを、放射性同位体元素で 標識し、前もって内部（社内）で構築しておいたλgt10内のラット脳cDNAライブ ラリーをスクリーニングするのに使用した。ハイブリダイゼーションの条件は実 施例１に記載するとおりであり、陽性プラークは、クローンのファージを得るた めにさらなる１以上の回数のスクリーニングに供した。 ９つの陽性クローンを同定し、そのうち２つは両方のプローブとハイブリダイ ズした。２つのクローンの最長のものは、クローン７と命名され、これはプロー ブのcDNAに見出される５つのIg様ドメインのうち４つをコードする、2550 bpを 含んでいた。加えて、クローン７はプローブには見出されない４つの別のIg様ド メインをコードしていた。終止コドン、ポリアデニレーションシグナル、及びポ リAテイルが後ろに続く、膜貫通及び細胞質ドメインと推定されるドメインが同 定された。クローン７は、RT-PCRクローン（配列番号：７）との比較によって調 べた場合、少なくとも１つの5’Ig様ドメインを欠失しており、そして、リーダ ー配列も欠いていたが、ライブラリーを再スクリーニングしても、これらの配列 を含むさらに長いクローンは得られなかった。クローン７に対する核酸配列は、 配列番号：１０に示す。 Ｂ． 5' 端の確定 ドメイン１及び他の5'配列を単離するために、cDNA端部の5'迅速増幅（RACE） と称される技術［PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications 、Innisら、（編集）Academic Press: New York(1 990)、第28〜38頁］を、5’RACEキット（Clontech社）を使用して行った。この 技術には、cDNAライブラリー分子の5'端部に連結されたアダプター配列に対して 相補的な第２のプライマーと対をなした内部プライマーが利用される。従って、 このプライマー対を用いたPCRによって、介在配列が増幅され、同定が容易にな るであろう。重複配列の情報は、次いで遺伝子の完全な配列を作製するのに使用 することができる。 ラット脳からRACEで準備したcDNA（キットで供給）を、キットのオリゴヌクレ オチドとICAM-4の内部配列に基づくアンチセンスプライマーを用いたPCRに使用 した。Spot714ASと称された3'のアンチセンスプライマーは、ICAM-4のドメイン ４配列に従って設計され、そして配列番号：２０で示される。 このプライマー対から得られた増幅産物を、続いて、ICAM-4ドメイン１内の領域 と相補的な3'プライマーと対をなした、同じ5'キットプライマーを使用した第二 のPCRに供した。第二番目の3'プライマーは、RRACE2と称され、そして配列番号 ：２１で示される。 第二のPCRにおいて使用される各々のプライマーは、PCRの結果得られる増幅産物 のpBS⁺（Stratagene社）へのクローニングを容易ならしめるために、EcoRI部位 を含むものであった。これによって得られた、遺伝子の5'端を含むプラスミドDN Aは、配列番号：７の第1位から736位までのヌクレオチドに対応する、ラットICA M-4ドメイン１及び２プローブとのハイブリダイゼーションによって同定された 。ドメイン１及び疎水性リーダーに対す る部分的な配列情報は、得られた増幅産物から決定された。 5’RACE法由来の産物は、開始メチオニン残基の上流60 bp、82 bpのリーダー 配列、及びドメイン１からの80 bpの配列を含む、222 bpの長さのDNA断片であっ た。増幅産物は、配列番号：１１に示す。 Ｃ．ラットICAM-4の全長の配列 全長のICAM-4の合成クローンは、5’RACE法に由来する配列情報（配列番号： １１）、RT-PCRクローン（配列番号：７）及び脳cDNAクローン７（配列番号：１ ０）から構築した。ラットICAM-4に対する全長の遺伝子は、決定された917アミ ノ酸のタンパク質をコードする単一の読み取り枠を持つ2985 bpを含むことが確 かめられた。Kozak配列と推定される配列は、リーダー配列内のメチオニン残基 の上流に位置している。９つのIg様ドメイン、膜貫通領域及び58アミノ酸の細胞 質テイルが、27アミノ酸の疎水性リーダー配列に続いている。合成ICAM-4 cDNA は、配列番号：１に示され、そして決定されたアミノ酸配列は、配列番号：２に 示される。 他のICAMポリペプチドと同様に、ICAM-4は、細胞外、膜貫通、及び細胞質ドメ インを含んでいる。細胞外ドメインにおいて、ICAM-4のアミノ末端はアミノ酸第 1位から27位までを含んでなるリーダー配列であり、それに９つの免疫グロブリ ン（Ig）様ドメインが続くが、これは、ICAM-1、ICAM-2、及びICAM-Rがそれぞれ 、５つ、２つ、及び５つの細胞外Ig様ドメインを含むということに鑑みて、ICAM -4に独特の特徴である。ICAM-4において、ドメイン１は第28位から118位までの アミノ酸、ドメイン２は第119位から224位までのアミノ酸、ドメイン３は第225 位から321位までのアミノ酸、ドメイン４は第322位から405位までのア ミノ酸、ドメイン５は第406位から488位までのアミノ酸、ドメイン６は第489位 から569位までのアミノ酸、ドメイン７は第570位から662位までのアミノ酸、ド メイン８は第663位から742位までのアミノ酸、及びドメイン９は第743位から830 位までのアミノ酸を含んでなる。各ドメインの中で、ドメインのアミノ酸配列の 互いに反対側の端部に通常位置するシステイン残基の間のジスルフィド結合によ って、特徴的な「ループ」構造が形成される。ICAM-4の他の構造的な特徴には、 第831位から859位までのアミノ酸を含む膜貫通領域及び第860位から917位までの アミノ酸を含む細胞質領域が包含される。 ラットICAM-4における各ドメインの、他のICAM-ファミリーのメンバーとのア ミノ酸の相同性の比較は、ヒトICAM-1、ICAM-2、及びICAM-Rの対応する配列に限 定して行われた。これは、かかる３つのICAMの齧歯類の相同体に対する配列情報 が以前に報告されていないためであった。第１ドメインで、齧歯類ICAM-4は、ヒ トICAM-1、ICAM-2、及びICAM-Rとそれぞれ、２１、３０及び２８パーセントの同 一性を示している。第２ドメインはもっと保存されており、ICAM-1、-2、及び-3 とのアミノ酸の同一性の百分率が、それぞれ６０、４２、及び６２となっている 。ドメイン３〜５は、ICAM-1とは４８、４９、及び４０、そしてICAM-Rに対して は、それぞれ６０、５９、及び２９の同一性の百分率を示す。興味深いことに、 ラットICAM-4のドメイン６から８までは、ドメイン５と最も相同性を有し（２９ 〜４２％の範囲で同一である）、これはおそらく、遺伝子セグメントの重複現象 から生ずるものであろう。第９番目且つ最後の細胞外ドメインは、他のICAMドメ インとはあまり整合しないが、細胞接着に関与するタンパク質のIgファミリーの 別のメンバーである、ヒトVCAM-1の第３番目及び第６番目のドメインと、２２％ の 同一性を有している。細胞質テイルは、58アミノ酸の長さである。これはICAMフ ァミリーの他のメンバーよりも長く、ヒトICAM-1、-2、及び-3は、それぞれ28、 26、及び37のアミノ酸を含んでいる。第９ドメインの場合と同様に、ラットICAM -4の細胞質テイルは、ヒトVCAM-1の細胞質テイルと最も相同性が高く、そしてわ ずか19アミノ酸を含むのみである。ラットICAM-4の膜に最も隣接した19のアミノ 酸は、VCAM-1と７つのアミノ酸残基を共有している（３７％）。 最後に、LFA-1（CD11a/CD18）への機能的結合は、ICAMにおける第１ドメイン に位置づけられる。Vonderheideら、［J.Cell.Biol.、125巻、215〜222頁(1994) ］はインテグリン結合に関与する旨称される、配列モチーフを同定した。ドメイ ン１において、ラットICAM-4と他のICAMとの間の相同性が比較的低いということ に関わらず、この結合配列モチーフは保存されており、ICAM-4がLFA-1及びおそ らくは他のインテグリンに対するリガンドであるかもしれないことを示唆してい る。 実施例４ 脳組織におけるin situハイブリダイゼーション ICAM-4を発現する特異的な脳の組織の局在性を調べるため、ICAM-4のドメイン １及びICAM-4のドメイン３から４までのアンチセンスリボプローブを用いたin s ituハイブリダイゼーションを行った。プローブは、³⁵Sで標識したUTPを使用し て、in vitro転写により標識付けした。 正常ラットの脳の凍結組織切片を、4％パラホルムアミド中で20分間固定し、 すすいで脱水し、そして固定されたRNAを、ハイブリダイゼーションの前に70℃ にて、２× SSC、70％ホルムアミド中で２分間変性させた。組織切片は、50％ホ ルムアミド、 0.3 M NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、5 mM EDTA、10％デキストラン硫酸、１ ×デンハーツ、0.5 mg/ml酵母RNA、100 mM DTT及び50,000 cpm/μlの濃度のプロ ーブを含有する溶液中で50℃にて一晩ハイブリダイズさせた。スライドは、４× SSC、10 mM DTTで室温にて60分間１度、50％ホルムアミド、２× SSC、10 mM D TTで60℃にて40分間１度、そして室温にて30分間、２× SSC及び１× SSCで各々 30分間１度ずつ、洗浄した。ハイブリダイゼーションの特異性は、同じプロトコ ルに従うが、さらに50％ホルムアミド、１× SSC、10 mM DTTで60℃にて40分間 の、より厳重な洗浄を包含し、平行して行った実験において確かめた。洗浄後、 スライドを、NTB2乳剤（Kodak社、Rochester、ニューヨーク）の中に浸し、そし て現像及び対比染色を行うまで、２から21日間露光した。陰性の対照には、ヒト 免疫不全ウイルス（HIV-1）リボプローブに加えて、ICAM-4のドメイン１及びICA M-4のドメイン３から４までのセンスリボプローブから作製したセンスプローブ が含まれていた。 脳組織で検出されたシグナルは、主として灰白質に局在し、最も強いシグナル は、大脳皮質及び海馬にに認められた。ハイブリダイゼーションの大略は、主に 脳神経におけるICAM-4の発現に一致していた。 実施例５ ICAM-4融合タンパク質の作製 特異的なICAM-4ポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体を作製するため に、ラットICAM-4／グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質を 、原核細胞発現ベクターpGEX（Pharmacia社、Alameda、カリフォルニア州）を用 いて作製した。 ドメイン１の5'及び3'端ならびにドメイン２の5'及び3'端に対応するPCRプラ イマーを使用して、それぞれのドメインをコードするDNA断片を増幅した。得ら れた断片は、別々に、pGEX-2TのEcoRI部位にクローニングされ、DNA配列分析に よって、正しい配向及び読み取り枠が確認された。引き続き、形質転換体を、適 切な分子量の融合タンパク質をつくる能力についてスクリーニングした。 ICAM-4ドメイン１/GST及びICAM-4ドメイン２/GST融合タンパク質の双方とも、 １％SDSを含むPBS中で超音波処理することによって細菌を溶解した後の不溶性画 分中に残存していた。100 ml培養液からの不溶性タンパク質画分は、SDS負荷用 染料中にて煮沸し、10％の調製用ポリアクリルアミド-SDSゲルにて分離した。ゲ ルを、氷冷した0.4 M KCl中で染色し、融合タンパク質のバンドを切り出した。 融合タンパク質を、25mM Tris-HCl及び192mM グリシンを含有する緩衝液の中で 、透析用チューブ内のゲル片から電気溶出した。およそのタンパク質濃度は、OD₂₈₀ によって定量し、そして調製物の純度は、Coomasieブルーで染色したSDS-PAG Eで調べた。 実施例６ ラットICAM-4/GST融合タンパク質に対する モノクローナル抗体の製造 フロインド完全アジュバント（FCA）に乳化した、40〜50μgのICAM-4ドメイン −２/GST融合タンパク質（実施例５に記載）を用いて、Balb/cマウスに皮下注射 によって免疫付けを行った。２週間後、今回はフロインド不完全アジュバント中 に乳化した同じタンパク質で、皮下注射によってマウスに再度免疫付けを行った 。第２回目の免疫付けの後２週間で実施した、最後の 腹腔内投与による免疫付けは、アジュバントを用いず、可溶性抗原で、２週間の 間隔をもって行った。各々の免疫付けしたマウスからの血清を、後記のバキュロ ウイルス発現系によって製造されたラットICAM-4と特異的に反応する能力につい て、ELISAによって調べた。 マウス#1654からの脾臓を無菌的に取り出し、10 mlの無血清RPMI 1640の中に 入れた。2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、100単位／mlペニシリ ン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清のRPMI 1640(Gibco社、 Burlington、Ottawa、カナダ)の中に沈めた２つのガラス顕微鏡スライドの磨り ガラス状の（frosted）端部の間で脾臓組織を擦り潰すことによって、単一細胞 の懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、滅菌した70メッシュ Nitex細胞濾過器（Be cton Dickin-son社、Parsippany、ニュージャージー州）を通して濾過し、そし て、後に200× ｇで５分間遠心分離して、RPMIで２度洗浄した。このようにして 最後の洗浄工程から得られたペレットを、20 mlの無血清RPMI中に再懸濁した。 ３匹の未処置Balb/cマウスから取り出した胸腺細胞を、同様に調製した。 融合の前に、NS-1ミエロ−マ細胞は、11％Fetalclone血清(FBS)(Hyclone Labo ratories社、Logan、ユタ州)を含むRPMI中にて対数増殖期に３日間保持しておい た。細胞は一度採収して、200× ｇで５分間遠心分離し、そのペレットを前の段 落に記載したように２回洗浄した。洗浄の後、細胞の懸濁液を無血清RPMIで最終 容量10mlになるようにした。20μlのアリコートを取り出し、そして無血清RPMI で１：50 に希釈し、この希釈液の20μlアリコートを取り出して、0.4％トリパ ンブルー染料を含む0.85％生理食塩水（Gibco社）20μlと混合し、ヘマサイトメ −タ−（Baxter Healthcare社、Deerfield、イリノイ州）に付し て、細胞計数を行った。およそ2.425×10⁸個の脾臓細胞を、4.85×10⁷個のNS-1 細胞と合わせ、その混液を遠心分離し、そして上清を除去した。チューブを軽く たたくことにより、得られた細胞ペレットを変位させ、50％PEG 1500を含む75 m M Hepes、pH 8.0（Boehringer Mannheim社、Indianapolis、インディアナ州）の 2 mlを、１分間にわたってかき混ぜながら加えた。その後、さらに無血清RPMI 1 4ml を７分間かけて加えた。細胞懸濁液は、200× ｇで10分間遠心分離し、上清 は廃棄した。ペレットは、15％FBS、100μMヒポキサンチンナトリウム、0.4μM アミノプテリン、16μM チミジン(HAT)(Gibco社)、25単位/mlIL-6(Boehringer M annheim社)及び1.5×10⁶個の胸腺細胞/mlを含む、200mlのRPMI中に再懸濁した。 この懸濁液を、先ず、37℃にて４時間、225 cm²フラスコ（Corning社、Essex、 連合王国）の中に入れておき、その後、10個の96穴平底組織培養プレート（Corn ing社）に、ウェル当たり200μlで分配した。プレート内の細胞には、20Ｇの針 （Becton Dickinson社）を用いて各々のウエルからおよそ100μlを吸引し、そし てウェル当たり100μlの培養用（plating）培地（10単位/mlのIL-6を含み胸腺細 胞を欠いている以外は、前記に同じ）を加えることによって、融合後３、４、５ 及び６日目に栄養を供給した。 融合物のプレートは、先ず、下記の抗原捕捉ELISAによってスクリーニングし た。Immulon 4プレート（Dynatech社、Cambridge、マサチューセッツ州）を、ウ ェル当たり100 ngのドメイン１-GST融合タンパク質またはドメイン２-GST融合タ ンパク質のいずれかを含む50mMカーボネート緩衝液で、4℃にて一晩被覆してお いた。プレートを、37℃にて30分間、0.5％フィッシュスキンゼラチン（Sigma社 、St．Louis、ミズーリ州）を含むPBS、ウェル当たり100μlでブロッキングした 。ブロッキングの 後、プレートは、0.05％Tween 20を含むPBS(PBST)で３回洗浄し、そして各々の 融合物からのハイブリドーマ上清をウェル当たり50μl加えた。37℃にて３０分 間インキュベートした後、プレートを前記と同様に洗浄し、そして１：3500に希 釈した50μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスIgG（Fc）（Ja ckson ImmunoResearch社、West Grove、ペンシルバニア）を添加した。プレート を再び30分間インキュベートし、PBSTで４回洗浄した。100mMクエン酸塩、pH 4. 5中、1 mg/ml o-フェニレンジアミン（Sigma社）及び0.1μl/mlの30％H₂O₂から なる基質をウェル当たり100μｌ加えた。呈色反応を10分間進行させ、15％のH₂S O₄をウェル当たり50μl添加することにより停止させた。次いで490nmにおける吸 光度を自動化プレートリーダー（Dynatech社）で測定した。 その後、ドメイン２-GSTタンパク質に対して陽性であるがドメイン１-GSTタン パク質に対しては陽性でないウェルを、バキュロウイルス上清（後記）に対する ELISAによってスクリーニングした。ELISAは、最初にImmulon 4プレートを50 mM カーボネート緩衝液で1：4に希釈したバキュロウイルスの上清で一晩被覆してお いたことを除いては、前記の通りに行った。３つのウェル（103A、103B及び103F ）を２から３回クローニングし、続いて、RPMI、15％FBS、100μMヒポキサンチ ンナトリウム、16μMチミジン、及び10単位/ml IL-6で連続的に倍に希釈した。 クローンのプレートのウェルは、４日後に視覚的に評点し、そして最小の密度の ウェルにおけるコロニーの数を記録した。各々のクローニングの選択されたウェ ルを、ドメイン１-GSTタンパク質及びドメイン２-GSTタンパク質、またはバキュ ロウイルス上清のいずれかに対して、７から１０日までELISAによって再びアッ セイした。 そのハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体は、ELISAによっ てイソタイプに分別された。Immulon 4プレート（Dynatech社）を、50 mMカーボ ネート緩衝液、pH 9.6で1：5000に希釈した、ウェル当たり50μlのヤギ抗マウス IgA、IgG、またはIgM（Organon Teknika社、Durham、ノースカロライナ州）で、 4℃にて被覆した。ウェルを、37℃にて30分間、1％BSAを含むPBSでブロッキング し、PBSTで３回洗浄した。各プレートにハイブリドーマ培養上清の1：10の希釈 液（50μl）を加え、前記のごとくにインキュベート及び洗浄した。最後の洗液 を除去した後、50μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスIgG₁ 、G_2a、G_2b、またはG₃（Zymed社、San Francisco、カリホルニア州）（1％正常 ヤギ血清を含むPBSTで1：1000に希釈）を加えた。プレートは、前記の通りにイ ンキュベートし、PBSTで４回洗浄し、そして100μlの基質を添加した。呈色反応 は、15％H₂SO₄を50μl加えて５分後に停止させ、そしてプレートリーダー（Dyna tech社）で490 nmにおける吸光度を測定した。 その結果、抗体103A、103B、及び103Fは、すべてIgG₁タイプであることが示唆 された。これらの抗体は、引き続き免疫細胞化学的分析、ウェスタンブロッティ ングにおいて、及びバキュロウイルスにて発現したタンパク質の精製用に使用し た。 実施例７ ラットICAM-4のバキュロウイルス発現 ICAM-4のドメイン１から６までに対応する可溶性タンパク質を作製するために 、バキュロウイルス発現系（Invitrogen社）を使用した。当時ICAM-4に対するリ ーダー配列が未知であったので、発現構築体としては、正しい読み取り枠に、IC AM-1リー ダー配列の3'に連結したICAM-4に対するコード配列を含むものをつくった。ICAM -1／ICAM-4発現プラスミドの構築に関する特定の詳細は、以下の通りである。 ５つのIg様ドメインをコードするラットICAM-1 DNAは、連結プラスミドの構築 を容易にするために様々な特徴を組み込んだプライマーを使用したPCRによって 増幅した。5'オリゴヌクレオチドプライマーには、リーダー配列内の第１メチオ ニンの上流のコンセンサスKozak配列に加えて、HindIII及びBglII部位が包含さ れていた。3'オリゴヌクレオチドプライマーには、終止コドン及びHindIIIクロ ーニング部位が後に続く、６つのヒスチジンに対するコード配列が包含されてい た。PCR増幅産物は、HindIIIで消化したpBS⁺ベクターにクローニングされ、そし て配列分析によって、適切な構築体が得られたことが確認された。ICAM-1リーダ ー配列の内部のSmaI部位、及びベクターの複数のクローニング領域（ICAM-1 Ig 様ドメイン５の3'側）にある別のSmaI部位を消化して、ICAM-1コード配列のほと んどを取り出した。これらの操作の後、直線化され、平滑末端化したベクターは 、複数の上流クローニング領域の一部（複数のクローニング領域における元来の HindIII部位の制限部位の5'の制限酵素部位）、Kozak配列及びICAM-1リーダー配 列のほとんどを含んでいた。 ラットICAM-4ドメイン１から６までに対するコード配列は、前記の直線化され たベクターにこの配列をクローニングすることを許容するように設計されたプラ イマーを利用したPCRによって増幅した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、E coRV部位及びICAM-1リーダー配列を完結するのに必要なコドンを包含していた。 3'オリゴヌクレオチドプライマーは、６つのヒスチジン残基に対するコドン、終 止コドン、ならびにHindIII及びEcoRV 制限酵素部位を包含していた。このPCRからの増幅産物は、EcoRVを用いて消化し て平滑末端化した配列をつくり、次いでこれを、平滑末端化したSmaIで消化した pBS⁺直線状ベクターへとライゲートした。ICAM-4のドメイン１から６までの5'側 にICAM-1リーダー配列を含む全長の配列を、BglII及びHindIII消化で構築体から 取り出し、そして精製されたICAM-1／ICAM-4連結配列を、BglII／HindIIIで消化 したpBluesac IIIベクター（Invitrogen社）に直接クローニングした。 組換えウイルスによって製造したタンパク質は、先ず、実施例５に記載したラ ットICAM-4ドメイン−２/GST融合タンパク質を用いて免疫付けしたマウス由来の 免疫血清を使用して、ELISAによってアッセイした。その後の実験で、それらの マウスから作製したモノクローナル抗体を、SF9細胞において組換えバキュロウ イルスにより製造されたICAM-4タンパク質を精製するために使用した。 実施例８ バキュロウイルスで発現したラットICAM-4に対する モノクローナル抗体の作製 ラットICAM-4ドメイン１から６は、実施例７に記載の通りに、バキュロウイル ス発現系で発現した。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体103A（実施例６ に記載）を使用して精製した。 手短に記載すると、30 mgの精製したモノクローナル抗体103A（100 mM ホウ酸 ナトリウム、500 mM 塩化ナトリウム中）を、３グラムのActivated Cyanogen Br omide Sepharose 4B（Pharmacia社、Piscataway、ニュージャージー州）にカッ プリングさせた。組換えラットICAM-4（ドメイン１〜６）を含むバ キュロウイルス上清を、そのセファロースカラムに4℃にて一晩で付した。カラ ムは、カルシウム−マグネシウム不含のリン酸緩衝性生理食塩水（CMF-PBS）で 洗浄し、そして結合した物質は、50 mMクエン酸、500 mM NaCl、pH 4.0にて溶出 した。試料を1／10容量のTris pH 10で中和し、そして-20℃に保存した。SDS-PA GEで分離した精製タンパク質は、90％を超える純度を有していると考えられ、お よそ80 kDの位置に移動した。 実施例６に記載したと同様の方法で、精製した組換えラットICAM-4ドメイン１ 〜６タンパク質を用いてマウスを免疫付けした。マウス#1945からの脾臓を、融 合#127のために使用した。融合のプロトコルは、実施例６に記載したと同様であ る。融合ウェルは、組換えICAM-4タンパク質についてのELISAによってスクリー ニングした。第二次スクリーニングは、ラット脳切片についての免疫細胞化学的 分析（実施例９に後記）を包含するものであった。ラットICAM-4に対して特異的 な４つのさらなる抗体（127A、127E、127F及び127H）を、この融合物からクロー ニングした。ラット脳切片での各抗体の免疫細胞化学的染色パターンは、モノク ローナル抗体103Aで観察されたものと同様であった（実施例９を参照されたい） 。それらのモノクローナル抗体を、D1/GST及びD2/GST融合タンパク質（実施例５ に記載）に結合する能力について調べた。モノクローナル抗体127Aは、D1/GST融 合タンパク質を認識し、そして127Hは、D2/GST融合タンパク質を認識した。これ ら２つの異なる結合特性は、いずれのGSTタンパク質にも結合しなかった他のも のと合わせて、少なくとも３つの異なるエピトープが抗体のパネルによって認識 されていることを示唆するものである。ハイブリドーマ127A及び127Hは、郵便番 号 20852、メリーランド州、パークロウン、ロックビル 12301に所在のアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コ レクションに、1995年５月31日と1995年６月１日に、それぞれ受託番号HB11905 及びHB11911として寄託された。 実施例９ ラットICAM-4発現の免疫細胞化学 モノクローナル抗体103Aを用いた免疫細胞化学的分析を、ラット脳内のタンパ ク質産生の局在性を調べるために実施した。 脳は、正常な成熟雌性Lewisラットから採収し、矢状方向に切断し、そして30 分間氷上でRNase不含の１× PBSにて洗浄した。脳の切片を、次いでTissue Tek IIクリオモールド（Miles Laboratories,Inc.、Naperville、イリノイ州）に、 少量のO.C.T.化合物（Miles,Inc.、Elkhart、インディアナ州）と共に入れた。 脳をクリオモールドの中心に載置し、クリオモールドにOCT化合物を満たし、次 いで2-メチルブタン（Aldrich Chemical Company，Inc.、Milwaukee、ウィスコ ンシン州）と共に容器に入れて、その容器は液体チッ素に入れた。クリオモール ド中の組織及びOCT化合物が一旦凍結すれば、そのブロックは切片に切断するま で-80℃に保存した。 組織は、6μMの厚さに切断し、Vectabond（Vector Laboratories，Inc.、Burl ingame、カリホルニア州）を被覆したスライドに接着させ、そして使用するまで 一晩、室温にて風乾させた。切片は、室温にて５分間、エチルエーテル（Malinc krodt社、Paris、ケンタッキー州）中で固定した。スライドをエーテルから取り 出すと、試薬を蒸発させた。各組織切片を、50％の正常ラット血清（Sigma社） 及び2％ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma社）を含む１× PBS（リン酸ナトリ ウムのみで製造）150μlを用い、室温にて30分間ブロッキングした。ブロッキン グの後、溶液を丁寧に切片から吸い取り、そし て精製した抗体103A上清（1.65 mg/ml）をブロッキング溶液で1：10に希釈し、 各組織切片に150μlを付した。スライドは湿度を付与したチャンバーに入れ、4 ℃にて一晩インキュベートした。 次の日に、切片から抗体溶液を丁寧に吸い取り、スライドを各々の洗浄におい て４分間ずつ、１× PBSで３回洗浄した。過剰のPBSをスライドから吸引し、100 μlの二次、ラット抗マウスビオチン接合抗体（Jackson ImmunoResearch Labora tories社）を、10％の正常ラット血清及び2％BSAを含む１× PBSの溶液で1：100 に希釈して組織に付した。インキュベーションは、室温にて１時間進行させた。 切片は、各々の洗浄において４分間ずつ、１× PBSで２回洗浄し、その後、Elit e Rat IgG Vecta-stain ABCキット（Vector Laboratories，Inc.、Burlingame、 カリホルニア州）から製品の挿入記事に従って調製したABC試薬を、各切片に100 μl付した。インキュベーションは、室温にて30分間進行させた。インキュベー ションの後、スライドを１× PBSで２回（各洗浄で４分ずつ）洗浄し、そして15 0μlのVect or VIPペルオキシダーゼ基質溶液（Vector Laboratories,Inc.、Bur lingame、カリホルニア州）を、およそ10分間、各切片に付した。発色させた後 、切片を水道からの流水で５分間すすぎ、Mayer'sヘマトキシリン（Sigma社）で 20秒間対比染色して、再び水道からの穏やかな流水で５分間すすいだ。スライド は等級付けされたエタノールをくぐらせて脱水し、キシレンに通して、Accumoun t 60（Stephens Scientific社、Riverdale、ニュージャージー州）に載置した。 mAb 103Aを用いて染色したラット脳切片の免疫組織化学的分析によって、ラッ トICAM-4が海馬の神経細胞に発現されていることが示唆された。染色パターンに より、このタンパク質が神 経突起（樹状突起）に限定されているかもしれないことが示された。無関係の抗 体または第二工程の試薬のみを用いて同様に染色した脳切片は、MAb 103Aで認め られた発現パターンを示さない。 実施例１０ ヒトICAM-4ゲノムDNAのクローニング ゲノムDNAからのラットICAM-4のクローニングに際して、ICAM-4及びICAM-1が 互いに5 kb以内に位置していることが発見され、この情報を、ICAM-4のヒト相同 体をクローニングする試みにおいて利用した。 ヒトICAM-1ドメイン３のプライマー、ヒトICAM-1ドメイン３に相補的に設計さ れたセンスプライマー（H-1/D3 S）及びヒトICAM-1ドメイン３に相補的に設計さ れたアンチセンスプライマー（H-1/D3 AS）を使用したPCRによって、ヒトP1ライ ブラリーにおいて、Genome Systems Inc.（St．Louis、ミズーリ州）が断片を増 幅した。これらのプライマーは、それぞれ、配列番号：２２及び２３に示される 。 1566及び1567と名付けられた２つのクローンが同定され、さらなる分析に供さ れた。双方のP1クローンは、およそ75〜95kbのゲノムDNAインサートを含んでい た。これらのクローンをBamH1で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離して、 ナイロン膜にブロッティングした。42℃にて、低い厳重さ（30％ホルムアミド） かまたは高い厳重さ（60％ホルムアミド）のいずれかの下で、ヒトICAM-1、ICAM -3またはラットICAM-4の放射性同位元素標識したプローブを用いてサザンブロッ トハイブリダイゼ ーションを実施した（ハイブリダイゼーション用溶液の他の構成は、実施例１に 記載したと同様である）。低い厳重さのハイブリダイゼーションシリーズでは、 0.1％SDSを含む２× SSPEで室温にて洗浄を行った。高い厳重さのハイブリダイ ゼーションシリーズでは、0.1％SDSを含む２× SSPEで65℃にて洗浄した。洗浄 した膜は、3.5時間Ｘ線フィルムに露光した。 相違をもたらしたハイブリダイゼーションによって、ヒトICAM-1が5.5 kbのBa mH1断片に含まれており、一方ヒトICAM-3は、4.0 kb及び1.5 kbのBamH1断片に位 置していることが示唆された。ヒトICAM-4及びICAM-R断片は、pBS+にサブクロー ニングし、それらの同一性が、限定的な配列分析によって確認された。 高い厳重さの条件下でラットICAM-4とハイブリダイズした7.0 kbのBamH1断片 をサブクローニングして、さらにRsaI制限酵素消化によって断片化した。ラット ICAM-4とハイブリダイズした３つのRsaI断片を同定し、それらの配列を決定した 。ラットICAM-4との相同性に基づいて、これらの断片がドメイン２、３、４、５ 及び６の一部を含むと考えられた。 実施例１１ ヒトICAM-4 cDNAのクローニング ヒトICAM-4のドメイン２〜５に対応するゲノムDNAの断片（実施例１０に記載 ）を、λgt11ヒト海馬cDNAライブラリー（Clontech社、Palo Alto、カリホルニ ア州）をスクリーニングするためにプローブとして使用した。ライブラリースク リーニングのプロトコルは、本質的に実施例１に記載したと同様であった。 前記ライブラリーに見出された最長のヒトICAM-4クローン（#18）は、わずか に992 bp（配列番号：２４）であり、予測さ れた3 kbの遺伝子の概ね中央部に対応していた。クローン１８由来の、その992 bpのDNAインサート（配列番号：２４）は、λZAPIIヒト海馬cDNAライブラリー（ Stratagene社、La Jolla、カリホルニア州）をスクリーニングするためにプロー ブとして使用された。このライブラリーから、多くの陽性クローン得られた。最 長のクローンである#34は、2775 bpであった（配列番号：２５）。ラットの全長 ICAM-4とのアラインメントに基づいて、このクローンが、リーダー配列及びドメ イン１の5'端のおよそ30 bpを欠いていることが予測された。3'端のポリA⁺テイ ルは欠けていたが、翻訳終止コドンは存在していた。 最初の３つのドメインに対応するDNAの断片（クローン#34の第１位から840位 までのヌクレオチド）を、ヒト大脳皮質に由来するλgt10 cDNAライブラリー（C lontech社、Palo Alto、カリホルニア州）をスクリーニングするためにプローブ として使用した。１つのクローンである16-1（配列番号：２６）は、1557bpを有 するものとして同定され、5'非翻訳DNAの39 bp、リーダー配列及び第５ドメイン までに及ぶ配列情報を含んでいた。重複しているクローン#34（配列番号：２５ ）とクローン16-1（配列番号：２６）を使用して、全長のヒトICAM-4配列（配列 番号：２７）の合成物を作製した。 前記した全長の遺伝子は、2927 bpの長さを有しており、924アミノ酸のタンパ ク質をコードしている。ICAM-4ヌクレオチド配列は、配列番号：２７に示され、 そのアミノ酸配列を配列番号：２８に示す。全長のラットICAM-4遺伝子（配列番 号：１１）との配列のアラインメントによって、全体のDNA配列の同一性が82％ であり、アミノ酸レベルでは85％の同一性であることが明らかになった。このタ ンパク質の、見かけ上９のIg様細胞外ドメイン構造が、ラットとヒトとの間で保 存されていた。リー ダー配列は第1位から28位までのアミノ酸にわたっており、ドメイン１は第29位 から117位までのアミノ酸、ドメイン２は第118位から224位までのアミノ酸、ド メイン３は第225位から320位までのアミノ酸、ドメイン４は第321位から405位ま でのアミノ酸、ドメイン５は第406位から488位までのアミノ酸、ドメイン６は第 489位から570位までのアミノ酸、ドメイン７は第571位から663位までのアミノ酸 、ドメイン８は第664位から743位までのアミノ酸、ドメイン９は第744位から837 位までのアミノ酸、膜貫通領域は第838位から857位までのアミノ酸、そして細胞 質テイルは第858位から924位までのアミノ酸にわたる。 ヒトICAM-4（HuICAM-4）は、ICAM-1及びICAM-Rに遺伝的にリンクしている上に 、分子のファミリーとしてそれらが共に一群をなすような、特定の共通の構造上 の特徴を示していた。他のICAMファミリーのメンバーとのHuICAM-4のドメインご とのアラインメントによると、様々な程度の相同性が示される。HuICAM-4のドメ イン１のアミノ酸配列は、ICAMの1、2及び3のドメイン１と、それぞれ21、30及 び26％同一である。HuICAM-4のドメイン２は、ICAMの1、2及び3と、それぞれ61 、39及び62％同一である。HuICAM-4のドメイン３は、ICAMの1及び3と、それぞれ 50及び65％同一である。HuICAM-4のドメイン４は、ICAMの1及び3と、それぞれ54 及び64％同一である。HuICAM-4のドメイン５〜８は、ICAM-1及び3の第５ドメイ ンと最も相同性が高く、ICAM-1のドメイン５に対しては33〜47の範囲、ICAM-Rの ドメイン５に対しては21〜31の範囲の同一性百分率である。HuICAM-4の第９ドメ インは、他のICAMファミリーのメンバーとのアラインメントであまり整合しない が、HuICAM-1のドメイン３（24％同一）及び６（23％同一）とは相同性を有して いる。 実施例１２ ヒトICAM-4発現のノザン分析 ２つのヒト複数組織ノザン（MTN）ブロット膜を、Clontech社（Palo Alto、カ リホルニア州）から購入した。これらのブロットには、ホルムアミド1.2％変性 アガロースゲルに、１６の異なるヒト組織（表１に示す通り）由来の少なくとも 2μgのポリA⁺RNAを流し、そしてナイロン膜に転写したものが含まれていた。ブ ロット膜は、５× SSPE、１０×デンハーツ溶液、50％ホルムアミド、2％SDS及 び100μg/mlの変性サケ精子DNAを含有する溶液10 ml中で、42℃にて３時間、プ レハイブリダイゼーションした。このブロット膜を、放射性同位元素標識したヒ トICAM-4プローブ（クローン#18、配列番号：２４）を含む前記溶液中で、42℃ にて１６時間ハイブリダイズさせた。次の日に、ブロット膜を、0.1× SSC／0.1 ％ SDSの溶液中で室温にて洗浄し、その次には50℃にて洗浄した。ブロット膜は 、24時間、-80℃にてＸ線フィルムに露光した。この分析の結果を、以下の表１ に示す。 脳由来のRNAを含むレーンのみが、ICAM-4プローブとハイブリダイズし、およ そ3 kbに単一のバンドを与えた。さらに長期間（５日間）露光して、脳のみが検 出可能なレベルのメッセージを有していたことが確認された。すべてのレーンが 比較可能な質をもって比較可能な量のRNAを含んでいたか否かを調べるために、 同じブロット膜を、対照のβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。ブロ ット膜を0.1％SDSの煮沸溶液で15分間処置することによって、ICAM-4プローブを 取り除き、続いて、製造業者によって提供されたβアクチンプローブを用いて同 様に調べた。量に若干の変動があることを除いて、すべてのレーンに良好な質の RNAが存在することが示された。 ヒト脳の１６の異なる亜領域（表２に示す通り）に由来するポリA⁺RNAを含む 、２つのさらなるノザンブロット膜を、Clontech社から購入した。ブロット膜は 、前記組織分析のために使用したと同様に、プローブを用いて調べた。その結果 を表 ２に示す。付したRNAの質及び量は、βアクチンプローブでブロット膜を調べる ことによって確認した。 ICAM-4発現を示した領域はすべて、終脳の一部であり、例外は、間脳の一部と 考えられる視床である。海馬及び大脳皮質が、最も発現レベルが高いようであっ た。すべての例で転写物のサイズは同様で、3 kbであった。ICAM-4発現の顕著な 組織分布により、プロモーター領域は、遺伝子産物の観察された発生に応じ且つ 空間的な発現を可能とするエレメントを含んでいるかもしれないことが示唆され る。かかる情報の用途によって、一般的な神経遺伝子の発現制御の理解への洞察 が提供されるかもしれない。 実施例１３ ヒトICAM-4/IgG融合タンパク質の作製 ヒトICAM-4/IgG融合タンパク質発現プラスミドを、モノクローナル抗体作製の ためのタンパク質、及びICAM-4のリガンドの候補となるものを同定する接着アッ セイにおける使用のための タンパク質を製造するために構築した。２つの構築体をつくったが、第一の構築 体には、HuICAM-4のドメイン１〜３、そして第二の構築体は、ドメイン４〜８を コードするDNAを含んでいた。双方とも、発現を駆動するためにサイトメガロウ イルス（CMV）プロモーターを使用するベクターpCDS1内でヒトIgG1のFc領域と、 分子の分泌を促進するためのIgG4由来のシグナル配列を連結した。 PCRプライマー（以下に、配列番号：２９〜３２で示す）は、サブクローニン グのために必要なDNA断片を作製すべく設計した。ドメイン１の5'端に対する「 センス」プライマー（HI4-D1(s)、配列番号：２９）は、クローン#34において欠 けているドメイン１の30塩基対を埋めるように設計した。プライマーHI4-D1(S) （配列番号：２９）及びHI4-D3(AS)（配列番号：３０）は、ヒトICAM-4のドメイ ン１〜３をコードするDNA断片（配列番号：１においてヌクレオチド130からヌク レオチド996の領域に相当する）を作製するために使用した。プライマーHI4-D3( S)（配列番号：３１）及びHI4-D8(AS)（配列番号：３２）は、ヒトICAM-4のドメ イン４〜８をコードするDNA断片（配列番号：３０においてヌクレオチド997から ヌクレオチド2268の領域に相当する）を作製するために使用した。IgG1遺伝子に 対して5'側をサブクローニングすることを容易にするために、各5'プライマーは BamH1制限酵素部位（下記太字にて示す、GGATCC）をコードしており、そして各3 '（アンチセンス）プライマーは、XhoI部位（下記太字にて示す、CTCGAG）を含 んでいた。すべてのオリゴヌクレオチドは、制限酵素消化を許容するために、5' 端にスペーサーヌクレオチド（下記の下線部）を含んでいる。 PCR反応は、AmpliTaq酵素と共に、Perkin Elmer社によって供給された緩衝液 を使用して、50μlの容量で行った。プライマーは、最終濃度10μg/mlにて添加 し、すべての４つのdNTPは、2 mM含まれていた。反応は、変性（94℃、４分間） 、アニーリング（50℃、２分間）及び伸長（72℃、１分間）を、30サイクルまで 継続して行った。PCR産物はアガロースゲル上で可視化し、そして各反応液のア リコートを使用して、PCR産物をベクターpCRII（Invitrogen社、SanDiego、カリ ホルニア州）にサブクローニングした。増幅プロセスの結果生じる可能なエラー を検出するため、及び正しい配向を確認するために、配列分析を実施した。適切 なクローンを、BamHI及びXhoIで消化して、その断片を、アガロースゲル電気泳 動にて分離した。精製した断片を、BamHI及びXhoIで前もって消化しておいたpDC S1ベクターにライゲートし、そして得られたプラスミドを配列決定して、正しい 配向及び読み取り枠を確認した。 ヒトICAM-4ドメイン１〜３及び４〜８／IgG1融合タンパク質を、以下のCOS7細 胞への発現プラスミドの一過性のトランスフェクション及び、その培養培地から の分泌タンパク質の単離を行って得た。トランスフェクションは、以下のように 行った。およそ50〜70％の集密度にある接着性のCOS7細胞を、CMF-PBSで洗浄し 、次に6μlの0.25 Mクロロキン（Sigma社、St．Louis、ミズーリ州）を含有する 無血清DMEM培地（Gibco社、Gaithers-burg、メリーランド州）7.5 ml中で、10〜 15μgのプラスミドDNAと接触させた。150μlのDEAEデキストラン（50 mg/ml）（ Sigma社、St．Louis、ミズーリ州）を含有する無血清培地をさらに7.5 ml添加し 、そしてプレートを２〜３時間インキュベートし、その後培地を除去して10％DM SO（Mallinckrodt社、McGaw Park、イリノイ州）を含むPBSに置換した。１分間 インキュベートした後、そのDMSO溶液を除去し、5％FBSを含有する新鮮な培地に 置換した。各トランスフェクションは、複数のプレートで行い、同じタンパク質 を発現している細胞からの培地をタンパク質の単離用に集めた。 培地は、３〜４回にわたる採収について、３日ごとに集めた。35 mM Tris、15 0 mM NaCl、pH 7.5で予め平衡化しておいた、0.4〜0.8 mlのProcep Aカラム（Bi oprocessing Ltd、英国）を用いて、タンパク質を精製した。培地は、１時間当 たりカラム容量の60倍を下回る流量で、２回付した。カラムの20倍容量のTris/N aCl緩衝液、カラムの２０倍容量の0.55 Mジエタノールアミン、pH 8.5、そして カラムの２０倍容量の50 mMクエン酸、pH 5.0の各々を用いてカラムを１度ずつ 洗浄した。融合タンパク質は、50 mMクエン酸、pH 3.0を使用して１m1の画分に 溶出し、各画分は、1/10容量の1 M Tris、pH 9.5で中和した。タンパク質濃度は 、OD₂₈₀によって定量し、そして純度はSDS-PAGEを使 用して調べた。 ウシIgG由来の有意な汚染（FBS中に存在）が、認められた。ドメイン１〜３融 合タンパク質はドメイン４〜８融合タンパク質よりも小さいことが予測されたに もかかわらず、双方ともおよそ90 kDの位置に移動した。この観察に対して、小 さい方のドメイン１〜３融合タンパク質は、大きい方のドメイン４〜８融合タン パク質よりも重くなるようにグリコシル化されていることが、一つの可能な説明 となるかもしれない。 モノクローナル抗体作製のための精製タンパク質の使用に加えて、下記の通り 、タンパク質はICAM-4リガンドを同定する接着アッセイにおいても使用されよう 。 実施例１４ モノクローナル抗体の作製 実施例１３に記載した精製タンパク質を利用して、実施例６に記載した免疫付 与プロトコルを使用してモノクローナル抗体を作製した。 マウス#2250（HuICAM-4 D1-3/IgG1で免疫付けした）からの脾臓は、融合172の ために使用し、そしてマウス#2272（HuICAM-4 D4-8/IgG1で免疫付けした）から の脾臓は、融合173のために使用した。利用した融合プロトコルは、実施例６に 記載したと同様であった。融合プレートは、各HuICAM-4/IgG1融合タンパク質を 使用したELISA（本質的に、実施例６に記載の通り）によってスクリーニングし た。免疫原タンパク質を認識し、他のタンパタ質は認識しない融合物のウェルの 上清を、クローニングに付すことを考究した。ヒト海馬切片での免疫細胞科学的 分析を、第二次スクリーニングとして使用した。 各融合物からの１つの主要クローンが、免疫細胞科学的に陽 性であり、これをクローニングした。２つのクローンのうち１つは、クローニン グに際して生育しえず、追求すべき候補は唯１つ、HuICAM-4 D4-8/IgG1で免疫付 けしたマウス由来のクローン173Eのみが残された。ハイブリドーマ173Eは、郵便 番号20852、メリーランド州、パークロウン、ロックビル 12301に所在のアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクションに、1995年６月１日に、受託番号HB11 912として寄託された。 ドメイン１〜３に対応する可溶性ICAM-4断片を用いて免疫付けしたマウスに由 来する別の融合物からは、６つのクローン（179A、179B、179D、179H、179L及び 179K）が、HuICAM-4ドメイン１から３まで（D1-3）に対して特異的であることが 見出された。179シリーズの６つの抗体はすべて、歯状回における樹状突起、な らびに多形性及び錐体細胞層に結合した。モノクローナル抗体179Aは、樹状突起 に加えて、これらの野（area）から神経細胞本体を染色した。 さらなる融合を同様に実施し、特定のICAM-4領域に特異的に免疫反応性を有す る他の抗体を作製した。 実施例１５ 捕獲アッセイの開発 融合179からの６つのモノクローナル抗体が溶液中で可溶性ICAM-4を捕獲及び 検出する能力について、様々な組合せで試験した。正常及び疾患状態に関連する 、ヒト体液中の可溶性ICAM-4レベルを評価するために、このアッセイを下記のご とく確立した。 抗体1791は、Immulon 4（Dynatech社）96穴プレートに、37℃にて２時間、3μ g/mlをウェル当たり125μl被覆した。抗体溶液は、吸引により取り除き、そして ウェルを、5％Teleosteanゼラ チンを含有するカルシウム不含、マグネシウム不含のPBS（CMF-PBS）のブロッキ ング溶液300μlで、室温にて30分間ブロッキングした。ブロッキング溶液は吸引 により除去し、Omni Diluent（CHF-PBS、1％ゼラチン、及び0.05％Tween 20）で 希釈した試料液100μlを各ウェルに加え、その混合液を37℃にて30分間インキュ ベートした。プレートは、PBST（CMF-PBS、0.05％Tween 20）で３回洗浄した。 抗体179Hは、製造業者が示したプロトコルに従って、NHS-LC-Biotin（Pierce社 ）を使用して1.5mg/mlにてビオチン化し、1：2000に希釈し、そしてウェルに添 加（ウェル当たり100μl）した。得られた混合液を37℃にて30分間インキュベー トし、PBSTで３回プレートを洗浄した。各ウェルにStreptavidin-HRP（Pierce社 ）を加え（100μl、0.25μg/ml）、この混合液を37℃にて30分間インキュベート した。プレートは、緩衝性基質溶液（13.6 g/L酢酸ナトリウム三水和物、1 Mク エン酸でpH 5.5に調整、発色の直前に、150μl/Lの30％過酸化水素を添加した溶 液）で1：100に希釈した、100μlのTetramethylbenzidine（Sigma社）（DMSO中1 0 mg/mlの保存溶液）を添加する前に、PBSTで４回洗浄した。反応は、暗所で室 温にて30分間進行させ、その後、15％H₂SO₄をウェル当たり50μl加えて、反応を 停止した。吸光度は、450 nmで読み取った。 この結果、アッセイによって5〜10 ng/mlの低濃度で、可溶性HuICAM-4 D1-3組 換えタンパク質を検出することができ、相関曲線の直線部分は、10〜100 ng/ml の領域にあることが示唆された。このタンパク質の領域を1及び10μg/mlにて試 験した場合、HuICAM-4 D4-8との交差反応性は観察されなかった。 実施例１６ 卒中患者からの血清中の可溶性ICAM-4の評価 神経学的疾患及び状態におけるICAM-4の役割を評価するために、急性卒中に罹 患している２８名の患者及び２０名の若年の健常なボランティア（年齢の釣り合 いはとっていない）からの血清を、可溶性ICAM-4の血清濃度の相違について、前 記の通りにアッセイした。 その結果、健常なボランティアからの血清は検出可能なレベルのICAM-4を含ん でいないことが示唆された。しかしながら、２８名の急性卒中患者のうち２０名 は、検出可能なレベルの可溶性ICAM-4を有していた。陽性卒中患者からのシグナ ルは、標準（可溶性ICAM-4 D1-3組換えタンパク質）の5〜38 ng/mlの範囲に対応 していた。 実施例１７ テンカンのラットモデルにおける海馬中のICAM-4 mRNAレベル 興奮性（kindling）テンカン発作原性動物モデル［Lothmanら、Brain.Res.、3 60巻、83〜91頁(1985)］をつくるように処置したラットの海馬において、発現し たラットICAM-4 mRNAのレベルを評価した。このモデルにおいて、脳の領域内に 移植した電極を介した一連の亜痙攣性電気的ショックでラットの海馬が刺激され 、徐々に重篤な行動面の発作が現れる。興奮のプロセスには、１日当たり１２回 の刺激を、８日間、１日おきに付すことが包含されている。一旦完全に興奮させ れば、１回の刺激で行動面の発作及び、ヒトのテンカンと類似した組織学的変化 を出現させることができる。完全な興奮状態にあるラットに、２週間にわたって １日当たり２回の刺激を加え、そして最後の刺激の後24時間で、動物を屠殺した 。海馬を取り出し、RNA調製用に切開した。 グアニジン／フェノール／クロロホルム抽出法［Chomezyn- ski及びSacchi、Anal.Biochem.、162巻、156〜159頁(1987)］を用いて、総RNAを 各試料から調製した。RNAは、変性ホルムアルデヒドアガロースゲルで分離して 、ナイロン膜に転写し、そして放射性同位元素標識したラットICAM-4及びグリセ ルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）特異性DNAプローブと ハイブリダイズさせた。GAPDHは、ゲルに付したRNAの量におけるレーンごとの変 動を検出するための対照として一般に使用される、基礎的に発現されている遺伝 子である。ICAM-4／GAPDHの比率における変動が、ICAM-4発現レベルの変化とし て解釈される。ICAM-4及びGAPDHに対するハイブリダイゼーションのバンドは、 ホスホリメジャー（phosphorimager）で定量し、そしてICAM-4／GAPDHの比率を 決定した。 ICAM-4／GAPDHの比率は、興奮させられた試験群（n＝5）に比較して、興奮さ せられなかった対照動物（n＝5）で有意に高く、興奮のプロセスの結果として、 ICAM-4がダウンレギュレーションを受けたこととが示された。しかしながら、対 照群には何らの擬似処置も行われておらず、従って、ICAM-4のmRNAレベルは興奮 を起こす操作に関係した外科的処置に呼応してモジュレーションを受けた可能性 が存在することに留意されるべきである。 実施例１８ ヒトICAM-4上流調節DNAのクローニング及び分析 ICAM-4遺伝子発現は、空間的及び時間的に調節されており、その発現は、脳の ほとんど前方すなわち腹面領域、終脳に限定されている。ICAM-4の制限された転 写調節に呼応する遺伝子配列を同定する試みにおいて、ヒトICAM-4をコードする 配列に対して5'側のヌクレオチド領域を調べた。 7.0 kbのゲノムBamHI断片（実施例１０に記載）に由来する、2607塩基対のBam HI/PstI断片を配列決定し、ATG開始コドンの上流に1684ヌクレオチドが含まれる ことが見出された。この上流領域に対する完全な配列は、配列番号：３３に示さ れる。ICAM-4をコードする領域の位置について、ATG開始コドン（配列番号：３ ３において、ヌクレオチド1685〜1687として番号付けしている）における「A」 を、+1ヌクレオチドと称し、そしてA⁺¹ヌクレオチドに隣接する5'側のヌクレオ チドを-1と称する。しかして、配列表のヌクレオチド1からヌクレオチド1687ま での番号付けに対応して、全体の配列は、ヌクレオチド-1684からヌクレオチド+ 3にわたるものとして示される。 ゲノムHuICAM-4配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、上流調節領域内 の様々な長さのDNA分子を作製するために、PCRにて使用した。表３に示す各オリ ゴヌクレオチドは、PCR産物の酵素消化を許容するためのおよそ6〜10 bpのスペ ーサー領域（斜体で示す）、NheIまたはHindIII制限酵素部位（太字で示す）、 及び特異的なハイブリダイゼーションプライマー配列（下線部）を含んでいた。 オリゴヌクレオチドの名前は、その上流調節領域内の位置を明示する番号を含む ものである。PCR増幅において、オリゴヌクレオチドは、上流調節領域の特異的 な領域を含むDNA断片を作製するために、表４に示すごとくに対を形成させた。 各オリゴヌクレオチドの中につくられた制限酵素部位及びスペーサー領域によ って、酵素消化と、それに続く、複数のクローニング部位（MCS）に隣接した下 流にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むpGL3基本ベクター（Promega社、Mad ison、ウィスコンシン州）への個々のPCR産物の指向性クローニングが許容され た。ベクターのMCS領域にクローニングされたプロモーター活性は、トランスフ ェクトされた細胞系におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動し、 そして発現されたルシフェラーゼからの光の産出を、プロモーター活性の指標と して測定することができる。pGL3基本ベクターは、プロモーターを有しておらず 、従って、陰性の対照として役立つものであり、一方、SV40プロモーターを含む pGL3ベクターは、陽性の対照として役立つものであった。各発現構築体の配列は 、制限酵素分析及びDNA配列分析によって確証された。 表４に記載された増幅配列の各々を含むプラスミドを、製造業者が示したプロ トコルに従って、Transfection MBS Mammal-ian Transfection Kit（Stratagene 社、La Jolla、カリホルニア州）を使用して哺乳動物細胞にトランスフェクトし た。各プラスミドは、２つの異なる細胞系（COS 7及 びNT2 Precursor Cells（N tera2/D1、Stratagene社製））に導入した。COS 7細胞は、SV40で形質転換され た、一般に使用されるサル繊維芽様細胞系であり、かかる形質転換によって、陽 性対照のpGL3プロモーターベクターでトランスフェクトされた細胞におけるSV40 プロモーターの制御下の遺伝子の発現を駆動するために細胞が至適化されている 。NT2前駆細胞は、コミットされた（committed）神経前駆細胞系であり、それら はICAM-4を発現していないものの、ICAM-4を発現する細胞型をさらに代表する細 胞になるか もしれない。 ６穴の平底組織培養プレート（Falcon社）の各々のウェルに、2.5×10⁵個の細 胞を播いた。COS 7及びNT2細胞のトランスフェクションを、各ウェルに対し5μg のプラスミドDNAを使用して、二重試験で並べて行った。細胞は37℃にて48時間 培養し、溶解させて、Luciferase Assay System（Promega社）を用い、ルシフェ ラーゼ活性についてアッセイした。 実験の結果を表５にまとめるが、高いレベルのプロモーター活性が、NT2細胞 におけるICAM-4の上流調節領域の-408から-19まで及び-480から-19までに至る領 域の中に含まれていたことが示唆される。NT2細胞は神経に起源を有するので、 この細胞は、他の細胞型に見出されないICAM-4プロモーターを認識する特定の転 写因子を発現しているのかもしれない。COS細胞トランスフェクト体におけるプ ロモーター活性の最高レベルは、ヌクレオ チド-560から-19までを含むプラスミドを用いた場合に得られた。陽性の対照pGL 3プロモーターベクターはCOS細胞で良好に作動したものの、このベクターはNT2 細胞では極めて低いプロモーター活性を示し、しかして特定のプロモーター配列 に対する細胞型に特異的な優先性が立証された。 COS 7またはNT2細胞のいずれとも通常はICAM-4を発現していないので、ICAM-4 を発現しており、そしてICAM-4プロモーター活性に必要とされる転写機構を必ず 発現している初代培養のラット海馬神経を用いて同様の実験を繰り返すことが行 われるであろう。本明細書中に記載した個々のプロモーター構築体や、 他の構築体を、より神経に近い環境にトランスフェクトすることによって、上流 調節領域のいずれのヌクレオチドが、脳におけるICAM-4遺伝子の厳密な調節の原 因となっているのかをさらに正確に同定することが可能となるかもしれない。 前記の例証的な実施例は、本発明の現在のところ好ましい実施態様に関するも のであり、それらに対する多くの修正や変更が、当業者に想起されようことが予 期される。しかして、添付の特許請求の範囲に示される限定によってしか、本発 明の範囲は限定されるべきでない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｋ 14/705 // Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．神経病理学のためのクリーニング方法であって、以下の工程すなわち、 ａ）第一個体から液体試料を得て、 ｂ）ICAM-4との特異的な免疫反応性を有する抗体に、その試料を接触させ、 ｃ）試料中のICAM-4／抗体結合を定量し、及び、 ｄ）前記第一個体におけるICAM-4／抗体結合を、神経病理学的症候がないこと が知られている第二個体におけるICAM-4／抗体結合と比較する 工程を含む方法。 ２．前記液体試料が、血清である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記液体試料が、脳脊髄液である請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記ICAM-4／抗体結合が、ラジオイムノアッセイ（RIA）によって定量さ れる請求の範囲第１項記載の方法。 ５．前記ICAM-4／抗体結合が、酵素リンク免疫吸収アッセイ（ELISA）によっ て定量される請求の範囲第１項記載の方法。 ６．哺乳動物ICAM-4に対するプロモーターを含む、精製及び単離されたDNA。 ７．前記プロモーターが、ヒトICAM-4に対するプロモーターである請求の範囲 第６項記載のDNA。 ８．前記プロモーターが、配列番号：３３で示される配列に含まれるものであ る請求の範囲第７項記載のDNA。 ９．前記プロモーターが、配列番号：３３における約1204位のヌクレオチドか ら約1666位のヌクレオチドまでの配列に含まれるものである請求の範囲第８項記 載のDNA。 １０．前記プロモーターが、神経細胞において、該プロモーターに作動可能に連 結されたポリヌクレオチドの転写を特異的にプロモートすることができる請求の 範囲第６項乃至第９項のいずれかに記載のDNA。 １１．前記神経細胞が、海馬細胞である請求の範囲第１０項記載のDNA １２．ヒトICAM-4遺伝子に対するプロモーターを含む、キメラポリヌクレオチド 。 １３．前記プロモーターが、配列番号：３３における約1204位のヌクレオチドか ら約1666位のヌクレオチドまでの配列に含まれるものである請求の範囲第１２項 記載のキメラポリヌクレオチド。 １４．請求の範囲第６項または第１２項のいずれかに記載のDNAを含む発現ベク ター。 １５．請求の範囲第１４項記載のベクターで形質転換された宿主細胞。