SK284161B6 - Spôsob in vitro skríningu na neuropatológiu - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa všeobecne týka celulámych adhéznych molekúl a najmä klonovania a expresie DNA, kódujúcej až dosiaľ neznáme polypeptidy označené ICAM-4, ktoré vlastnia štrukturálnu príbuznosť k intercelulámym adhéznym molekulám ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R. Konkrétnejšie sa týka spôsobu in vitro skríningu na neuropatológiu.

Doterajší stav techniky

Výskum pokrývajúci poslednú dekádu významne objasnil molekulárne udalosti, ktoré sa zúčastňujú bunkových interakcií (cell-cell) v tele, predovšetkým tie udalosti, ktoré zahŕňajú pohyb a aktivitu buniek v imunitnom systéme a v poslednom čase tie, ktoré sa týkajú vývoja a normálnych fyziologických funkcií buniek v nervovom systéme. Predstavené všeobecne v Springer, Náture, 346: 425 - 434 (1990), kde ide o bunky v imunitnom systéme a Yoshirara a kol., Neurosci. Res. 10: 83 - 105 (1991) a Sonderegger a Rathjcn, J. Ccll. Biol. 119: 1387 - 1394 (1992), kde ide o bunky v imunitnom systéme. Bunkový povrch proteínov a predovšetkým takzvané bunkové adhézne molekuly („CAMs“) boli príslušným predmetom farmaceutického výskumu a vývoja, ktoré mali ako svoju úlohu intervenciu v procesoch extravazácie leukocytov do miest zápalu a v pohybe leukocytov k charakteristickým cieľovým tkanivám, rovnako ako aj diferenciácie a tvorbu komplexného nervového systému. Izolácia a charakterizácia bunkových adhéznych molekúl, klonovanie a expresia sekvencií DNA, ktoré kódujú takéto molekuly a vývoj terapeutických prostriedkov a diagnostických činidiel týkajúci sa zápalových procesov vývoja a funkcie nervového systému, sú tiež predmetom mnohých USA a cudzích prihlášok patentových opisov. Porovnaj s Edvardsom, Current opinion in therapeutic patents, 1 (11): 1617 - 1630 (1991) a predovšetkým s publikovaným v „príručkách patentovej literatúry“ citovaných v tomto ohľade.

Základným záujmom tohto predloženého vynálezu sú predchádzajúce identifikácie a charakterizácie určitých sprostredkovateľov bunkových adhéznych sprievodcov „leukoin-tegrins“ LFA-1, MAC-1 a gp 150,95 (uvedených v WHO triedach ako CD18/CDlla, CD18/CDllb resp. CD 18/11 c, ktoré tvoria podrodinu heterodimerických „integrin“ bunkových povrchov proteínov, ktoré predstavujú B lymfocyty, T lymfocyty, monocyty a granulocyty. Porovnaj napr. s tabuľkou 1 na strane 429 (pozri uvedené, Springer). Je tiež záujem o iné jednoduché reťazce adhéznych molekúl (CAMS), ktoré boli dokázané v aktivácii, adhézii a pohyblivosti leukocytov a pod. ktoré sprevádzajú zápalové procesy. Napríklad v súčasnosti je overené, že: pred extravazáciou leukocytov, ktorá charakterizuje zápalové procesy, sa vyskytuje aktivácia integrínov konštitutívne exprimovaných v leukocytoch a nasleduje pevná interakcia ligand/receptor medzi integrínmi (napr. LFA-1) a jednou alebo obidvoma typickými intercelulámymi adhéznymi molekulami (ICAMs), ktoré sú označované ako ICAM-1 a ICAM-2, ktoré sú exprimované v krvných riečiskách endoteliálnych bunkových povrchov a do iných leukocytov.

Ako iné CAMs opísané až do dneška [napr. vaskuláme adhézne molekuly (VCAM-1), ako je uvedené v PCT WO 90/133300 publikovanej 15. 11. 1990: a krvné doštičky endoteliálnych bunkových adhéznych molekúl (PECAM-1), ako je uvedené v Newan a kol., Science, 247:1219 až 1222 (1990) a PCT WO 91/10683 publikovanej 25. 6. 1991] je možné uviesť ICAM-1 a ICAM-2 štruktúrne homológne s ostatnými členmi nadrodiny imunoglobulínových génov, v ktorých je zhrnutá každá extraceluláma časť série domén udeľujúcich podobný karboxyterminálny motív. Typické domény imunoglobulínov obsahujú slučkovú štruktúru, obvykle zakotvenú pomocou disulfidovej väzby medzi dvoma cysteínmi na konci každej slučky. ICAM-1 zahrnuje päť imunoglobulínových domén; ICAM-2, ktorý sa odlišuje od ICAM-1 pokiaľ ide o distribúciu bunky, ktorá zahrnuje dve tieto domény; PECAM-1 zahrnuje šesť; VCAM zahrnuje šesť alebo sedem, ktoré závisia od obmien pozdĺžnych väzieb atď. Okrem toho zahrnuje ICAMs typicky hydrofóbne transmembránové oblasti, o ktorých sa uvažuje, že sa zúčastňujú orientácie molekúl na bunkovom povrchu a karboxy terminálnej „cytoplasmic“ oblasti. Grafické modely operatívneho umiestenia CAMs všeobecne ukazujú molekulu zakotvenú na bunkovej membráne v transmembránovej oblasti cytoplazmaticky „tail“ rozšírenej do bunkovej cytoplazmy a jednu alebo viac imunologických slučiek predĺžených von mimo bunkový povrch.

Množstvo nervových buniek obsahuje na povrchu receptory s extracelulámymi doménami podobnými Ig, štruktúrne podobné s ICAMs. Porovnaj napr. s Yoshihara a kol. (pozri uvedené). Okrem domén podobných Ig obsahuje množstvo adhéznych molekúl nervového systému tiež tandemovo zapojené opakujúce sa sekvencie podobné fibronektínu v extracelulámej doméne.

Rôzne terapeutické použitie bolo navrhnuté pre interceluláme/adhézne molekuly, ktoré zahrnuje použitie predpokladanej schopností väzby ICAM-1 k ľudskému rinovírusu. Napríklad Európska patentová prihláška 468257A publikovaná 29. L 1992 sa týka vývoja multimerických konfigurácií a foriem ICAM-1 (so zahrnutím plnej dĺžky a skrátenej molekulárnej formy), ktoré predkladajú zvýšenú väzbovú aktivitu ligand/receptor, predovšetkým väzbu k vírusom, protilátkam pripojených lymfocytov a patogénom, ako napríklad Plasmodium falciparum.

Podobne bolo navrhnuté rôzne použitie proteínov imunologický príbuzných s intercelulámymi adhéznymi molekulami. WO 91/16928, publikovaná 14. 11. 1991 je napríklad zameraná na humanizované chimérické anti-ICAM-1 protilátky a ich použitie v liečení špecifických a nešpecifických zápalov vírusovej infekcie a astmy. Anti-ICAM-1 protilátky a ich fragmenty sú opísané ako užitočné pri liečení endotoxických šokov a to v prihláške WO 92/04034, publikovanej 19. 3. 1992. Inhibícia ICAM-1 závislá od zápalových odpovedí spolu s anti-ICAM-1 antiidiotypickými protilátkami a fragmentmi je uvedená v prihláške WO 92/06119, publikovanej 16.4. 1992.

Napriek základnému preniknutiu do fenoménu bunkovej adhézie, ktoré bolo získané pomocou identifikácie a charakterizácie intercelulámych adhéznych proteínov, ako napríklad ICAM-1 a do lymfocytovo interaktívnych integrínov, ako napríklad LFA-1, nie je obraz úplne kompletný. Všeobecne sa verí, že mnohé ďalšie proteíny sú zapletené do zápalových procesov a v cielenom pohybe lymfocytov v tele, napríklad americké patentové prihlášky č. 07/827689, 07/889724, 07/894061 a 08/009266 a korešpondujúca publikovaná PCT prihláška WO 93/1477B (publikovaná 5. 8. 1993) opisujú klonovanie a expresiu proteínu príbuzného ICAM, ICAM-R. Opisy týchto prihlášok sú špecificky začlenené v odkaze v týchto dokumentoch a DNA a sekvencie aminokyselín IVAM-R sú vyložené v mieste SEQ ID NO: 4. Tento nový ligand bol objavený, aby sprevádzal ľudské lymfocyty, monocyty a granulocyty.

Vo zvláštnom záujme k predvedenej prihláške bol ešte jeden povrch molekuly podobný ICAM identifikovaný, ktorý má špecifickú tkanivovú expresiu oproti iným známym molekulám ICAM. Mori a kol., [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 3921 - 3925 (1987)] opísal identifikáciu telencefalon-špecifickej protilátky v mozgu králikov, špecificky imunoreaktívnej s monoklonálnou protilátkou 271A6. Táto povrchová protilátka bola nazvaná telencefalín. Immuraakol., [Neurosci. Letts. 119: 118 - 121, (1990)] použitím polyklonálnej protilátky na zhodnotenie lokalizovanej expresie potvrdil, že expresia telencefalínu vo vizuálnej mozgovej kôre mačiek ukazuje zmenu vo vrstvách tkaniva a tiež podal správu o tom, že expresia telencefalínu bola premenená v závislosti od vývoja. Oka a kol., (Neuroscience 35: 93 - 103, 1990) následne opísal izoláciu telencefalínu použitím monoklonálnej látky 27A6. Táto publikácia opisuje molekulárnu váhu pre povrchovú molekulu asi 500 kD a to, že molekula bola zložená zo štyroch podjednotiek, každá z nich s prirodzenou molekulárnou váhou 130 kD a približne 100 kD nasledujúcim spracovaním N-glykanázou. Yoshihiro a kol., (Neuroscience, Research Supplement 18, p. S83, 1994) oznámil DNA a aminokyselinovú sekvenciu pre telencefalín králika na sedemnástej Výročnej konferencii Japan Neuroscience Society v Nagoya (Japonsko, 7. - 9. 12. 1193) a na dvadsiatej tretej Výročnej konferencii Society for Neuroscience vo Washingtone, D. C., 9. 11. 1993 (Society for Neuroscience Abstracts 19 (1-3) p. 646, 1993). Odvodené aminokyselinové sekvencie zaznamenali, že navrhnutý telencefalon 130 kD je integrálny membránový proteín s deviatimi extracelulámymi imunoglobulínmi (Ig)-like (podobné) domény. Distálnych osem týchto domén ukazuje homológiu s ostatnými ICAM Ig-like doménami. Táto i rovnaká informácia bola ohlásená Yoshiharaakol., v Neurón 12: 0543 - 553, 1994).

Pokračovanie spočíva teda v tom, aby boli objavené potrebné prídavné proteíny zúčastňujúce sa na ľudských bunkových interakciách (cell-cell) a predovšetkým v potrebe informácie, ktorá slúži na špecifické identifikovanie a charakterizáciu týchto proteínov podľa ich aminokyselinovej sekvencie. Okrem toho existujú také molekuly, ktoré môžu tvoriť základ pre vývoj terapeutických a diagnostických činidiel a je podstatné, že DNA, ktorá ich kóduje, je objasnená. Takéto plodné informácie by mohli zaistiť (inter alia) produkciu proteínov vo veľkom, umožniť identifikáciu buniek, ktoré ich prirodzene produkujú a dovoliť prípravu protilátkových látok alebo iných nových väzbových proteínov špecificky reaktívnych s týmito a/alebo inhibítorov inhibujúcich reakcie ligand/receptor, v ktorých sú tieto zahrnuté.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob in vitro skríningu na neuropatológiu, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa tieto kroky:

a) kontaktovanie tekutej vzorky získanej od prvého indivídua s protilátkou špecificky imunoreaktívnou s 1CAM-4, bjkvantifikáciu väzby protilátky na ICAM-4 vo vzorke a c) porovnanie väzby protilátky na ICAM-4 v prípade tohto indivídua s väzbou v prípade druhého indivídua, o ktorom je známe, že je bez neuropatológie.

Jedným z aspektov tohto predloženého vynálezu je poskytnúť čistené a izolované polynukleotidy (napr. DNA sekvencie, RNA transkripty a ich antimediátorové oligonukleotidy) kódujúce nové polypeptidy, „ICAM-1“, ako aj polypeptidové varianty (zahrnujúce fragmenty a delécie, substitúcie a prídavné analógy) a z týchto tie, ktoré prejavujú jeden alebo viac ligand/receptorov, ktoré viažu biolo gické aktivity a/alebo imunologické vlastnosti špecifické pre ICAM-4. ICAM-4 špecifický ligand/receptor viažuci biologické aktivity zahrnuje: interakcie obidvoch ICAM-4 extracelulámych a cytoplazmatických domén s ostatnými molekulami (napr. v procese bunkovej adhézie cell-cell a/alebo signálnej transdukcie). Výhodné sekvencie DNA tohto vynálezu zahrnujú genomické a cDNA sekvencie, ako aj celkovo alebo čiastočne chemicky syntetizované sekvencie DNA. Polynukleotidy, výhodne predstavené, sú vyobrazené na SEQ ID NO: 1 a kódované potkaními druhmi ICAM-4. Biologické duplikáty (napr. kópie izolovaných sekvencií DNA uskutočnených v prostredí in vivo alebo in vitro) sekvencií DNA tohto vynálezu sú predvídané. Sú tiež poskytnuté autonómne sa replikujúce rekombinantné konštrukty, ako napr. plazmid a vírusové vektory DNA, ktoré syntetizujú sekvencie ICAM-4 a najmä vektory, kde DNA kódujúca ICAM-4 alebo akýkoľvek variant ICAM-4, je operatívne zapojená do endogénnej alebo expresnej sekvencie kontrolnej DNA.

Podľa iného aspektu tohto vynálezu sú hosťujúce bunky, predovšetkým jednobunkové hosťujúce bunky, ako napr. prokaryotické a eukaryotické bunky stabilne transformované sekvenciami DNA tohto vynálezu spôsobom, ktorý dovoľuje, aby boli požadované polypeptidy týmto exprimované. Hosťujúce bunky, ktoré exprimujú ICAM-4 a rôzne produkty ICAM-4, môžu slúžiť na rôzne užitočné ciele. Do tej miery, že exprimované produkty sú „prejavené“ na povrchu hosťujúcej bunky, môžu bunky konštituovať cenný imunogén pre vývoj protilátkových látok špecificky reaktívnych s ICAM-4 variantmi ICAM-4. Hosťujúce bunky sú pozoruhodne užitočné v metódach produkcie širokého rozsahu ICAM a variantov ICAM, kde sú bunky pestované vo vhodnom kultivačnom médiu a požadované polypeptidové produkty sú izolované z buniek alebo z bunkového média, v ktorom bunky rastú.

Nové ICAM-4 tohto vynálezu môžu byť získané ako izoláty z prirodzených bunkových zdrojov, ale spolu s rôznymi produktmi ICAM-4 sú prednostne produkované pomocou rekombinantných procedúr zahrnujúcich hosťujúce bunky tohto vynálezu. Teraz sú prednostné sekvencie aminokyselín pre polypeptidy ICAM-4 vyobrazené v SEQ ID NO: 2. Produkty môžu byť získané pomocou úplnej alebo čiastočnej glykozylácie, čiastočne alebo úplne deglykozylovateľnej alebo neglykozylovateľnej formy, ktoré závisia od hosťujúcej bunky vybranej pre rekombinantnú produkciu a/alebo pre postizolačné spracovanie. Varianty ICAM-4 tohto vynálezu môžu obsahovať vo vode rozpustné alebo nerozpustné monomerické, multiméme alebo cyklické fragmenty ICAM, ktoré zahrnujú celú alebo časť jednej alebo viacerých doménových oblastí so špecifikáciou vyššie a s biologickými a imunologickými vlastnosťami ICAM-4 zahrnujúcimi napr. schopnosť väzby k väzbovému partnerovi ICAM-4 a/alebo inhibíciu väzbového ICAM-4 k prirodzene väzbovým partnerom. Varianty ICAM-4 tohto vynálezu môžu tiež zahrnovať analógy polypeptidu, kde je jedna alebo viac špecifických aminokyselín deletovaná alebo premiestená (1) bez straty a najlepšie so zvýšením jednej alebo viacerých biologických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre ICAM-4; alebo (2) sa špecifickým zneschopnením jednotlivých väzbových funkcií ligand/receptor. Sú predpokladané analógne peptidy zahrnujúce prídavné aminokyseliny (napr. lyzín alebo cysteín) zvyšky, ktoré uľahčia multiméme formovanie.

V predloženom vynáleze sú tiež zahrnuté protilátky (napr. monoklonálne a polyklonálne protilátky, fragmenty protilátky, jednoduché reťazce protilátok, chimerické protilátky, CDR-štiepené protilátky a podobne) a iné väzbové proteíny (napr. nercaktívnc s ICAM-4, ICAM-2 a ICAM-R interceluláme adhézne molekuly, s ktorými je ICAM-4 štruktúrne podobný) pre ICAM-4 alebo varianty ICAM-4. Tento vynález tiež zahrnuje hybridómové bunkové línie, ktoré špecificky vylučujú monoklonálne protilátky tohto vynálezu. Výhodne predstavujú hybridómy tohto vynálezu tie, ktoré sú označené ako 127A, 127H, 173E, 1791 a 179H.Protilátkové látky môžu byť vyvíjané použitím izolácie prírodného alebo rekombinantného ICAM-4 alebo variantov ICAM-4, alebo bunkami cxprimujúcimi takéto produkty na ich povrchu. Väzbové proteíny sú prídavné užitočné na charakterizáciu väzbových miest štruktúr(ry) (napr. epitopov a/alebo senzitivity väzbových vlastností proti modifikáciám aminokyselinových sekvencii v ICAM-4).

Väzbové proteíny sú tiež užitočné opäť v zostavách pre imunizáciu ako aj pre čistenie buniek, ktoré sa prejavujú polypeptidmi na ich povrchu. Sú tiež evidentne užitočné v modulovaní (napr. blokovaní, inhibovaní alebo stimulovaní) väzbových biologických aktivít ligand/receptor zahrnujúcich ICAM-4, najmä pokiaľ ide o tie efektorové funkcie ICAM-4, ktoré sú zahrnuté v špecifických a nešpecifických odpovediach imunitného systému. Antiidiotypické protilátky špecifické pre anti-ICAM-4 protilátkové formy a použitie týchto antiidiotypických protilátkových látok v modulačných imunitných odpovediach sú tiež predpovedané. Testy na detekciu a stanovenie množstva ICAM-4 na povrchu buniek a v telesných tekutinách napríklad v sére alebo cerebrospinálnej tekutine môžu zahrnovať napríklad jednoduchú protilátkovú látku alebo viacnásobné protilátkové látky v „sendvičovom“ testovom formáte. Pri detekcii ICAM-4 v telesných tekutinách sú protilátky tohto vynálezu tiež užitočné pri stanovení výskytu neuropatológií, ktoré môžu byť vo vzájomnom vzťahu so zvýšenými hladinami cirkulujúceho ICAM-4. Tieto neuropatológie zahrnujú, ale nie sú tak obmedzené, cerebrálnu ischémiu (napr. mŕtvicu) vznikajúcu ako následok rôznych porúch, napríklad trombózy, embolizmu a podobne.

Vedecká hodnota informácie, ku ktorej prispelo objavenie aminokyselinových sekvencii DNA tohto vynálezu, je evidentná. Jednou sériou z príkladov je to, že znalosť sekvencie cDNA pre ICAM-4 umožňuje izoláciu pomocou hybridizácie DNA/DNA genómových sekvencii DNA kódujúcich ICAM-4 a špecifikujúcich ICAM-4 pomocou expresívnych kontrolných regulátorových sekvencii, ako sú napríklad promótory, operátory a podobne. Pokiaľ ide o hybridizačné procedúry DNA/DNA uskutočnené so sekvenciami DNA tohto vynálezu a pod prísnymi podmienkami, očakáva sa, že podobným spôsobom umožnia izoláciu s DNA, ktoré kódujú alelické varianty ICAM-4, iné štruktúrne príbuzné proteíny majúce jednu alebo viac biologických a/alebo imunologických vlastností špecifických proti ICAM-4 a proteíny homológne proti ICAM-4 z iných druhov. DNA tohto vynálezu sú užitočné pre hybridizačné testy DNA/RNA, aby detegovali schopnosť buniek syntetizovať ICAM-4. Pomocou tohto vynálezu sú tiež dostupné pozitívne polypeptidy dôležité pre reguláciu expresie ICAM-4, pomocou tých buniek, ktoré obyčajne exprimujú rovnaké ICAM-4. Ďalšou sériou z príkladov je to, že znalosť DNA a aminokyselinových sekvencii ICAM-4 umožňuje vytvorenie rekombinantných prostriedkov variantov ICAM-4 ako hybridné fúzne proteíny (niekedy opisované ako „imunoadhézne“), ktoré sú charakterizované prítomnosťou proteínových sekvencii ICAM-4 a konštantnými oblasťami a/alebo pantovými oblasťami ťažkého reťazca imunoglobulínu. Porovnaj s Capon a kol., Náture, 337: 525 až 531 (1989); Ashkenazi a kol., P. N. A. S. C USA), 88: 1055 - 10539 (1991)) a PCT WO 89/02922, publikované 6.

4. 1989. Variantné fúzne proteíny ICAM-4 môžu tiež zahrnovať napríklad selektované extraceluláme domény ICAM-4 a časti ostatných bunkových adhéznych molekúl.

DNA tohto vynálezu tiež dovoľuje identifikáciu netranslátovaných sekvencii DNA, ktoré podporujú špecificky expresiu polynukleotidov operatívne napojených k oblastiam promótora. Identifikácia a použitie týchto sekvencii promótora sú predovšetkým vhodné v prípadoch napríklad génového transferu, ktorý môže špecificky požadovať expresiu heterológneho génu v limitovanom prostredí nervových buniek. Tento vynález tiež zahrnuje vektory, ktoré obsahujú promótory tohto vynálezu, ako aj konštrukty chimérických génov, kde je promótor tohto vynálezu operatívne napojený k heterológnej polynukleotidovej sekvencii a k transkripčnému terminačnému signálu.

Informácie o DNA a aminokyselinovej sekvencii poskytujú podľa predloženého vynálezu tiež možnosti systematickej analýzy štruktúry a funkcie ICAM-4 a definovanie tých molekúl, s ktorými bude reagovať na intercelulárnych a extracelulámych úrovniach. Idiotypy anti-ICAM-4 monoklonálnych protilátok tohto vynálezu sú typickým príkladom týchto molekúl a môžu napodobiť prírodné väzbové proteíny (peptidy a polypeptidy), ccz ktoré sú interceluláme a intraceluláme aktivity ICAM-4 modulované alebo pomocou ktorých ICAM-4 moduluje interceluláme a intraceluláme prípady. Alternatívne môžu predstavovať nové triedy biologicky aktívnych ekvivalentov ICAM-4. Antiidiotypické protilátky môžu opäť tiež predstavovať nové triedy biologicky aktívnych ekvivalentov ICAM-4. Skúšky v prostredí in vitro na identifikovanie protilátok alebo iných zlúčenín, ktoré modulujú aktivitu ICAM-4, môžu zahrnovať napríklad imobilizovanie ICAM-4 alebo prírodného Ugandu, ku ktorému sa ICAM-4 viaže, zistiteľné označenie neimobilizovaných väzbových partnerov, inkubovanie väzbových partnerov dokopy a stanovenie účinku testovaných zlúčenín na množstvo značených väzieb, kde zníženie počtu značených väzieb v prítomnosti testovaných zlúčenín v porovnaní s množstvom značených väzieb v neprítomnosti testovaných zlúčenín indikuje, že testovaným činidlom je inhibitor viažuci ICAM-4.

Informácia o sekvencii DNA poskytuje podľa predloženého vynálezu tiež možnosť vývoja stratégií rekombinantnej homológie alebo „knockout“ stratégie (porovnaj napr. s Kapecchi, Science, 244: 1288 - 1292, 1989) hlodavcov, ktoré neexprimujú funkčný protein ICAM-4 alebo ktoré exprimujú variant ICAM-4 proteínu. Tieto hlodavce sú užitočné ako modely na študovanie modulátorov ICAM-4 a ICAM-4 v prostredí in vivo.

Opisy materskej patentovej prihlášky USA č. 08/102852, podanej 5. 8. 1993, sú špecificky zapísané pomocou odkazu. Príklady týchto prihlášok sú zamerané, okrem iného, na: určenie a konštrukciu oligonukleotidových sond pre PCR amplifikáciu DNA vzťahujúcu sa na ICAM; použitie nukleotidových sond na amplifikovanie ľudského genómového fragmentu homológneho s DNA, ale odlišného od tých DNA, ktoré kódujú ICAM-1 a ICAM-2; skríning cDNA knižníc s genómovými fragmentmi pre izoláciu prídavných sekvencii kódujúcich ICAM-R; skríning knižníc cDNA na izoláciu úplnej dĺžky ľudskej sekvencie cDNA kódujúcej ICAM-R; charakterizáciu informácie DNA a aminokyselinovej sekvencie pre ICAM-R, predovšetkým tých, ktoré sú podobné ICAM-1 a ICAM-2; vývoj cicavčích hostiteľských buniek exprimujúcich ICAM-R; stanovenie označenie ICAM-R zúčastňujúcich sa adhéznych prípadov, ktoré zahrnujú cesty závislého CD 18 a nezávislého CD18; inhibíciu bunkovej adhézie k ICAM-R pomocou peptidov derivovaného ICAM-R; expresiu va riantov 1CAM-R; prípravu a charakterizáciu protilátok anti-ICAM-R a ich fragmentov; mapovanie epitopov ICAM-R rozpoznávajúcich pomocou anti-ICAM-R; stanovenie distribúcie a biochemickej charakterizácie ICAM-R a RNA, ktorá ho kóduje; stanovenie ICAM-R v homotypickej adhézii buniek „cell-cell“ a imunitnej bunkovej aktivácii/proliferácii; charakterizáciu monoklonálnych protilátok ICAM-R a stanovenie diferenčnej fosforylácie a cytoskeletných spojení cytoplazmatickej domény ICAM-R. Bola tiež opísaná identifikácia DNA hlodavcov, ktorá kóduje ICAM a ktorá sa súčasne zdá byť potkaním homológom s ľudským ICAM-R a ďalej použitie tejto DNA na konštrukciu a expresiu tých DNA, ktoré kódujú fúzne proteíny glutatión-S-transferázy. Podrobný opis, ako bola identifikovaná táto DNA hlodavcov, môže byť nájdený v materskej prihláške (U. S. S. N. 08/102852) v príklade 6 a je tu reprodukovaný ako príklad 1. Aj keď bolo identifikovaných viac sekvencii DNA, ktoré kódujú ICAM hlodavcov, stalo sa zrejmým, že DNA hlodavcov nekódovala potkanie druhy homológne s ICAM-R, ale kódovala vlastne nový polypeptid ICAM, tu nazývaný ICAM-4. Preto aby sa zhodnotili tie prípady, ktoré viedli k identifikácii ICAM-4, je poskytnutá chronológia, ktorá je potom podrobne opísaná vynálezom.

Prvá bola identifikovaná hlodavčia genómová sekvencia pre ICAM-4, ktorá kóduje oblasti homológne s doménou 2 (tu SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 23 v U. S. S. N. 08/102852) i ľudského ICAM-R (tu ako SEQ ID NO: 4). Ako druhá bola tiež identifikovaná prečnievajúca genómová sekvencia DNA (tu SEQ ID NO: 26 U. S. S. N. 08/102852), ktorá kóduje obidve oblasti domény 2 SEQ: ID NO: 3 a sekvencia pre ICAM-1. Použitím SEQ ID NO: 26 ako nukleotidovej sondy bola identifikovaná cDNA hlodavčej sleziny (tu SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: v U. S. S. N. 08/102852), ktorá kóduje domény 2 až 5 ako aj piatu doménu predtým neopísanú ako doménu ICAM. Teraz sa zdá, že tieto novo identifikované hlodavčie DNA kódujú hlodavčí homológ ľudského ICAM-R, ale zoradenie 3' oblasti týchto DNA s ostatnými ICAM sa ukázalo ako ťažké.

Následná izolácia klonu 1 kb cDNA z potkanej slezinovej knižnice a amplifikácia fragmentu RT-PCR ukázali, že časť obidvoch cDNA a genómových klonov nebola sekvenovaná. Ďalší RT-PCR amplifikačný produkt (SEQ ID NO: 7) potvrdil túto opomenutú vec. Bolo rozhodnuté, že fragment 177 bp bol vyrezaný z genómových a cDNA klonov pomocou štiepenia EcoRI klonov, aby boli izolované sekvencie z lambda fágu pre sekvenčné štúdie DNA. Opakované analýzy SEQ ID NO: 5 a 6 v svetle týchto iných sekvencii umožnili identifikáciu presnejších a kompletnejších sekvencii pre pôvodne izolované genómové a cDNA klony, ktoré boli prítomné v opravenej forme, tu ako SEQ ID NO: 8 a 9.

Aby bola identifikovaná kompletná kódujúca sekvencia pre ÍCAM-4, bola izolovaná potkania mozgová cDNA (SEQ ID NO: 10) a 5' koniec sekvencie stanovený pomocou 5' rýchlej amplifikácie koncov (5' RAČE);, amplifikačný produkt je vyobrazený v SEQ ID NO: 11. Kombinovaním informácie z klanu RT-PCR (SEQ ID NO: 10) a amplifikačného produktu RAČE (SEQ ID NO: 11) umožnilo identifikáciu kompletnej kódujúcej sekvencie pre ICAM-4 CSEQIDNO: 1).

Predložený vynález je takto objasnený pomocou nasledujúcich príkladov. Predovšetkým príklad 1 je zameraný na klonovanie čiastočnej hlodavčej DNA pre: ICAM-4. Príklad 2 opisuje analýzu northemového prenosu (Northem blot) transkripcie hlodavčieho ICAM-4. Príklad 3 opisuje izoláciu úplnej dĺžky hlodavčej cDNA pre ICAM-4. Príklad 4 sa týka hybridizácie v in situ hlodavčieho ICAM-4 v mozgovom tkanive. Príklad 5 je zameraný na generáciu fúznych proteínov v prokaryontoch. Príklad 6 opisuje produkciu monoklonálnych protilátok špecifických pre potkanie fuzionované proteíny ICAM-4/GST. Príklad 7 opisuje expresiu rozpustných potkaních ICAM-4 proteínov v baculovírusovom expresnom systéme. Príklad 8 je zameraný na produkciu monoklonálnych protilátok špecifických pre potkaní ICAM-4, exprimovaný v baculovírusovom expresnom systéme ICAM-4. Príklad 10 sa týka klonovania ľudskej genómovej DNA kódujúcej ICAM-4. Príklad 11 je zameraný na klonovanie ľudskej cDNA kódujúcej ICAM-4. Príklad 12 opisuje Northemovú analýzu expresie ľudského ICAM-4. Príklad 13 opisuje generáciu ľudských fúznych proteínov ICAM-4/GST. Príklad 14 je zameraný na produkciu monoklonálnych protilátok imunošpecifických pre ľudský ICAM-4. Príklad 15 opisuje vývoj hlavného testu na stanovenie koncentrácie rozpustného ICAM-4, predovšetkým v tekutinách. Príklad 16 aplikuje metódu hlavného testu na stanovenie koncentrácie ICAM-4 v sére silných pacientov. Príklad 17 sa týka stanovenia transkripcie ICAM-4 v potkaních modeloch epilepsie. Príklad 18 je zameraný na klonovanie promótorovej oblasti pre ľudský ICAM-4.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie potkanej DNA vzťahujúcej sa na ICAM

Izolácia potkanej genómovej 2 DNA domény vzťahujúcej sa na ICAM

Bol uskutočnený skríning potkanej genómovej knižnice konštruovanej v lambda EMBL3 pomocou sondy označenej [³²P] generovanej PCR z DNA kódujúcej ľudskú ICAM-3 doménu 2. Sekvencia sondy je uvedená v SEQ ID NO: 12. Časti knižnice boli prenesené na nylonové membrány Hybond N+ (Amersham, Arlington Hieghts, IL). Skríning všetkých cDNA a genómových knižníc bol uskutočnený štandardným spôsobom. Prehybridizácia a hybridizácia bola uskutočnená v roztoku 40 až 50 % formamidu, 5X Denhardtovho činidla, 5X SSPE a 10 % SDS pri 42 °C. Sondy (označené [³²P]) boli pridané v koncentrácii 10⁵ až 10⁶ cpm/ml hybridizačného roztoku. Počas nasledujúcich 16 až 18 hodín hybridizácie boli nylonové membrány dôkladne premývané pri izbovej teplote 2X SSPE s 0,1 % SDS a potom exponované rôntgenovými lúčmi cez noc pri -80 °C. Pozitívne reagujúce dosky boli s cieľom získať klony fágov podrobené jednému alebo viacerým cyklom hybridizácie. DNA získaná z lyzátov pozitívnych klonov bola subklonovaná do pBS+ a bola stanovená jej sekvencia. Pokiaľ ide o prvý genómový kloň kódujúceho pri potkanoch doménu 2 vzťahujúcu sa na ICAM, bolo zistené, že je homológny s oblasťami domény 2 u ostatných členov ICAM skupiny (pozri napríklad, tabuľka 1 patentovej prihlášky US č. 08/102852), pričom je odlišná od predtým uvedených nukleotidových sekvencii potkanieho ICAM-1 [Kita a kol., Biochem. Biophys. - Acta 1131: 108 - 110 (1992)]. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie pre tieto kmene boli uvedené v súbežnej materskej prihláške tejto prihlášky ako funkčné varianty potkanieho ICAM-R a ďalej boli uvedené ako SEQ ID NO: 23 a 24 v U. S. S. N. 08/102852. Rovnaké sekvencie sú v tejto prihláške uvedené v SEQ ID NO: 3 a 13.

Druhý, prekrývajúci sa kloň boli identifikovaný rovnakými sondami, pričom bolo zistené, že obsahuje sekvenciu

ICAM domény 2 SEQ ID NO: 3 a 5' DNA kódujúcej aspoň časť potkanieho 1CAM-1. Sekvencia nukleových kyselín pre tento kloň bola uvedená v súbežnej materskej prihláške tejto prihlášky ako SEQ ID NO: 26 a v tejto prihláške je uvedená ako SEQ ID NO: 5. Tento druhý kloň ukazuje, že fragment génu vzťahujúceho sa na ICAM prvého klonu a gén kódujúci potkaní ICAM-1 sú umiestené na rovnakom chromozóme do 5 kb od seba.

B. Izolácia potkanej cDNA vzťahujúcej sa na ICAM

S cieľom identifikácie kompletnejšej sekvencie kódujúce proteín pre polypeptid vzťahujúci sa na ICAM, sekvencia DNA značená [³²P] kódujúca doménu 2 z genómového klonu uvedeného v predchádzajúcom oddiele A (SEO ID NO: 3), bola použitá na skríning množstva knižníc cDNA z rôznych potkaních a myšacích typov buniek, zahrnujúcich makrofágy (Clontech, Palo Alto, CA), periférne krvné lymfocyty (PBL) (Clontech), T bunky (domáce konštrukty, slezinové (Clontech), myšacie PBL (Clontech), T bunky (domáce konštrukty) a B bunky (domáce konštrukty).

Jednoduchý kloň bol identifikovaný v cDNA knižnici, potkanej sleziny (Clontech), ktorá obsahovala 5 Ig podobných domén, pričom päť z nich bolo homológnych s doménou 2 až 5 v ICAM-1 a ICAM-R. Navyše tento kloň obsahoval 3' DNA kódujúcu piatu Ig podobnú doménu, ktorá doteraz nebola identifikovaná v žiadnom ICAM polypeptide. Navyše obsahoval kloň obvyklú 3' sekvenciu, o ktorej sa neskôr zistilo, že ide o parciálny intron (ďalej bližšie diskutovaný) umiestený medzi doménami 4 a 5, čo naznačuje, že tento kloň bol produktom spojenia nezrelej alebo aberantnej transkripcie. Prítomnosť unikátnej domény a zistenie, že 3' oblasť nie je správne pripojená do skupiny iných známych ICAM naznačuje, že DNA vzťahujúca sa na ICAM potenciálne kóduje nový potkaní ICAM polypeptid. Sekvencia nukleových kyselín tohto klonu bola uvedená v materskej prihláške tejto prihlášky ako SEQ ID NO: 25; v tejto prihláške je táto sekvencia pre kloň potkanej slezinnej cDNA uvedená v SEQ ID NO: 6.

C. Opätovná analýza potkanej cDNA a genómovej DNA

Následne po 5. auguste 1993, kedy bola podaná patentová prihláška US č. 08/102852, bolo zistené, že parciálny kloň potkanej slezinnej cDNA (SEQ ID NO: 25 v materskej a SEQ ID NO: 6 v tejto prihláške) a genómový potkaní pečeňový kloň (SEQ ID NO: 26 v materskej a SEQ ID NO: 5 v tejto prihláške) nemali vnútorný fragment 177 bp EcoRI, ktorý bol časťou obidvoch týchto klonov, ktorý bol ale stratený v kroku subklonovania, kedy boli inzerty knižnice odstránené z lambda vektora pomocou štiepenia EcoRI a pripojené k sekvenčnému vektoru. K zisteniu, že cDNA a genómové klony môžu stratiť kódujúci fragment, sa dospelo porovnaním potkanej genómovej a cDNA sekvencie s rôznymi RTPCR amplifikačnými produktmi obsahujúcimi SEQ ID NO: 7, ktoré odhalilo medzeru v potkanej sekvencii.

Následná izolácia a sekvenčné porovnanie c DNA zo slezinovej knižnice pri použití klonu slezinnej cDNA (SEQ ID NO: 6) ako sondy poskytli prvé zistenie, že časti slezinnej cDNA a genómových klonov neboli sekvenované. K ďalšiemu potvrdeniu tejto myšlienky došlo po amplifikácii RT-PCR fragmentu, premosťujúcej domény 3 a 5', použitím 5' priméru (RRD3 5'Xho, s obsahom reštrikčného miesta 5' Xhol uľahčujúceho klonovanie), ktorý je uvedený v SEQ ID NO: 14 a 3' priméru (RRD5 3'Hind, s obsahom reštrikčného miesta Hind III na uľahčenie klonovania), ktorý je uvedený v SEQ ID NO: 15.

GAACTCGAGGCCATGCCTCCACTTCC (SEQ ID NO: 14)

CCATAAGCTTTATTCCACCGTGACAGCCAC (SEQ ID NO: 15)

Porovnanie týchto dvoch DNA jasne dokázalo, že cDNA a genómové klony stratili pred sekvenovaním fragment; tento názor bol ďalej podložený nasledujúcou sekvenčnou analýzou ďalej uvádzanej RT-PCR DNA. Bol vyvodený záver, že reštrikčné štiepenie pomocou EcoRI na odstránenie cDNA a genómových fragmentov pred sekvenovaním, má za následok odštiepenie fragmentu 177 bp, ktoré nebolo vizuálne detegované separáciou klonu od lambda fágovej sekvencie na agarózovom géli. Nasledujúca sekvenčná analýza potvrdila umiestenie dvoch oblastí EcoRI po boku 177 bp fragmentu pri obidvoch originálnych klonoch.

Fragment 177 bp EcoRI je umiestený medzi nukleotidmi 719 a 896 v klonc potkanej parciálnej cDNA, ako je uvedená v SEQ ID NO: 9 a medzi nukleotidmi 2812 a 2989 v parciálnom genómovom klone, ako je uvedené v SEQ ID NO: 8.

D. DNA izolovaná pomocou RT-PCR klonu

RT-PCR bol použitý na vytvorenie úplnej šej informácie o sekvencii pre potkaní gén vzťahujúci sa na ICAM. Sekvenčná informácia z genómových klonov (SEQ ID NO: 3) bola použitá na určenie komplementarity negatívnych primérov k oblasti 5’ kódujúcej primérov, ako bolo určené z cDNA klonu a určenie komplementarity pozitívnych primérov ku kódujúcej sekvencii a oblastiam 3' ku kódujúcej sekvencii klonu cDNA (SEQ ID NO: 6).

Matricová cDNA pre PCR reakcie bola pripravená takto: Približne 2 pg poly A⁺RNA izolovanej z buniek potkanej sleziny boli denaturované zahriatím na 65 °C v objeme 10 pl. Po denaturácii bola pridaná 0,1 pl RNazínu (Invitrogen, San Diego, CA), 5 pl 5X RTázového pufra (BRL, Bethesda, MD), 2 pl hexaméru (pD(N)6 v 100 pg/ml) (Pharmacia, Piscataway, NJ) 6 pl dNTP (po 2 mM) a 2 pl AMV RTázy a reakcia bola udržiavaná pri 42 °C počas 60 až 90 minút. Po reakcii bola zmes až do spotreby skladovaná pri -20 °C.

Úvodná séria pokusu bola uskutočnená s cieľom identifikácie oligonukleotidových primárových párov, ktoré produkovali amplifikačný produkt v PCR reakciách použitím potkanej slezinnej cDNA ako matrice. Rôzne 5' negatívne priméry boli párované v PCR s 3’ primérmi, ktoré mali byť komplementárne k vnútornej, kódujúcej sekvencii; 3' primér boli označený RRD2 3-1 a je uvedený v SEQ ID NO: 16. AACGTGCGGAGCTGTCTG (SEQ ID NO: 16) (V konečne izolovanom RT-PCR produkte, SEQ ID NO: 7, ďalej uvedenom, primér RRD2 3-1 korešponduje s nukleotidmi 719 až 736). Obdobne boli rôzne 3' pozitívne priméry párované s 5' primérmi, ktoré boli pokladané za komplementárne k iným interným, kódujúcim sekvenciám; 5' primér v týchto reakciách bol označený RGen3900S a je uvedený v SEQ ID NO: 17.

ACGGAATTCGAAGCCATCAACGCCAGC (SEQ ID NO: 17) (V uvedenej SEQ ID NO): 7 primér RGen3900S korešponduje s nukleotidmi 1719 až 1736). Na základe veľkosti amplifikačných produktov a schopnosti týchto produktov hybridizácie s parciálnym klonom cDNA, jeden pár primérov bol určený ako najúčinnejší a bol použitý pri následných PCR amplifikáciách. Primér 5' bol označený RGen780S (SEQ ID NO: 18) a primér 3' bol označený RGen4550AS (SEQ IDNO: 19).

CATGAATTCCGAATCTTGAGTGGGATG (SEQ ID NO: 18) ATAGAATTCCTCGGGACACCTGTAGCC (SEQ ID NO: 19) (V uvedenej SEQ ID NO: 7 primér RGen780S korešponduje s nukleotidmi 1 až 18 a primér RGen 4550AS korešponduje s nukleotidmi 2197 až 2214).

Tento primémy pár bol použitý v PCR pri rôznych podmienkach, ktoré boli použité na optimalizáciu amplifikácie. Bolo použitých 15 rôznych PCR pufrov, ktoré sa líšili pH a koncentráciou Mg⁺⁺ pri dvoch odlišných teplotách a vzorky produktu z každej reakcie boli separované na 1 % agarózovom géli. Pretože vizuálnou detekciou vyfarbovacím etidiumbromidovým gélom nebolo možné detegovať žiadny amplifikačný produkt pri akýchkoľvek podmienkach, bola na detekciu PCR produktov použitá citlivejšia Southemova hybridizácia.

Alikvotné diely amplifikovanej DNA boli separované elektroforézou, prevedené na nylonovú membránu Hybond N⁺ použitím konvenčných techník Southemovej hybridizácie a hybridizované s kompletnou cDNA, ktorá bola značená [³²P]. Hybridizačné podmienky boli v zásade rovnaké, ako sú opísané pre proces skríningu knižnice v sekvencií A. Autorádiografia ukázala, že malé množstvo DNA, približne 2,2 kb, bolo generované v dvoch z týchto reakcií a zvyšok amplifikačného produktu z týchto reakcií bol separovaný na agarózovom géli. Oblasť 2,2 kb bola vymytá z gélu, aj keď pri vizuálnom pozorovaní nebola zrejmá žiadna väzba a bola použitá ako matrica pri inej PCR reakcii pri použití rovnakých primérov (SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 19), Tris-HCl pufra, pH 8,0, s obsahom 1 mM Mg‘ a teplote 55 °C. Tento amplifikačný produkt zo sekundárneho PCR bol viditeľný v géli a bol vymytý a klonovaný do pBS⁺ plazmidu (Stratagene, La Jolla, CA) na sekvenčnú analýzu.

Bolo zistené, že výsledný RT-PCR kloň obsahuje 2214 bp, ako je uvedené v SEQ ID IMG: 7. Kloň kódoval domény 2 až 6 nájdené v klone cDNA potkanej sleziny, ďalšiu aminoterminálnu doménu 1, ďalšiu karboxy terminálnu doménu 7 a 164 bp, o ktorej sa ukázalo, že je ďalšou karboxyterminálnou doménou 8. Bezprostredne nasledujúcemu koncu 5' k doméne 1 bola ďalšia sekvencia 144 bp, o ktorej sa predpokladá, že bola odvodená od intronu medzi vedúcou a prvou doménou. Tento kloň neobsahoval 5' vedúce sekvencie alebo 3’ transmembránové a cytoplazmatické oblasti. Hypotézu, že ide o nový hlodavčí ICAM, podporuje okrem najprv identifikovanej domény 6 v klone slezinnej cDNA tiež siedma a ôsma doména RT-PCR klonu.

Príklad 2

Northemova analýza

S cieľom ďalšieho zistenia možnosti, že klony príbuzné ICAM uvedené v príklade 1 kódujú nový ICAM polypeptid, ako to naznačujú unikátne Ig-podobné domény, tkanivá špecifickej expresie boli podrobené Northemovej analýze, aby bolo možné porovnanie s predtým opísaným expresnými vzorkami ľudských ICAM [ICAM-1, Dustin a kol., J. Immunol. 137: 245 - 254 (1986); ICAM-2, Staunton a kol., Náture 339: 61 - 64 (1989); ICAM-R, de Fourgerolles a Springer, J. Exp. Med. 175: 185 - 190 (1992)].

Kompletná celuláma RNA z potkaních pľúcnych lalokov, mozgu, miechy, pečene, tráviaceho traktu, týmusu, lymfatických žliaz a sleziny bola pripravená použitím izolačných reagencií STAT 60 RNA (Tel-test „B“, Inc., Friendswood: Texas) podľa návodu odporúčaného výrobcom. PolyA⁺RNA bola prečistená z celkovej RNA použitím kolón oligo dT celulózy. Približne 5 pq RNA získanej z každého tkaniva bolo separovaných na 1 % formaldehydagarózovom géli a prevedených na hybond-C nitrocelulózové membrány (Amersham).

Fragment potkanej slezinnej cDNA z príkladu 1 zodpovedajúci doménam 2 až 4 (nukleotidy 1 až 724 v SEQ ID NO: 6) bol subklonovaný do pBluescript SK^T (Stratagene) a pozitívna nukleotidová sonda rRNA bola generovaná transkripciou v prostredí in vitro použitím UTP značenej [³²P] a približne 500 ng linearizovanej matrice podľa postupu odporúčaného výrobcom (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Na membránu naviazaná RNA bola predhybridizovaná v roztoku obsahujúcom 50 % formamid, 5X SSC, IX PE (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % pyrofosfát sodný, 0,2 % polyvinylpyrolidón, 0,2 % ficoll, 5 mM EDTA, 1 % SDS) a 150 pg/ml denaturovanej spermálnej lososovej DNA. Označená sonda bola denaturovaná varom a pridaná k predhybridizačnému roztoku do konečnej koncentrácie 1 x 10⁶ cpm/ml. Hybridizácia bola ponechaná, aby prebiehala 16 až 18 hodín pri 65 °C. Membrány boli potom premyté pri 65 °C v 2X SSC obsahujúcim 0,1 % SDS a potom exponované rôntgenom počas 3 až 16 hodín.

Northemova analýza ukázala, že cDNA vzťahujúca sa na ICAM, uvedená v príklade 1, bola exprimovaná len v potkaňom mozgu, tkanive, ktoré nebolo uvádzané predtým v súvislosti so žiadnymi ICAM polypeptidmi. Táto expresná vzorka v kombinácii s unikátnou z iných ICAM polypeptidov doteraz neznámou Ig-podobnou doménou naznačuje, že ICAM príbuzný kloň bol nový člen rodiny ICAM bielkovín a bol pomenovaný ICAM-4.

Fakt, že pôvodne identifikované klony cDNA boli detegované v potkanej slezinnej knižnici, naznačuje, že časť buniek v slezine môže v malej miere exprimovať ECAM-4.

Ale vhodne pozdĺžne spojené klony nemôžu byť detegované v mnohých knižniciach hemopiotických cDNA, čo vedie k pochybnostiam, či ICAM-4 je skutočný exprimovaný v iných tkanivách ako je mozog. Jedno z vysvetlení pre detekciu ICAM-4 cDNA v slezine je také, že citlivosť PCR môže byť zvýšená stopovým množstvom transkriptu, napriek tomu, že tieto tkanivá neexprimujú kódovaný proteín.

Príklad 3

Izolácia kompletnej potkanej ICAM-4 cDNa

A. Identifikácia klonu potkanej mozgovej cDNA

Vzhľadom na tkanivovo špecifickú expresiu ICAM-4 bola použitá pri pokuse celá cDNA kódujúca ICAM-4 z mozgového tkaniva. Dve sondy, jedna komplementárna s doménami 1 až 2 a druhá komplementárna s doménami 3 až 5 klonu slezinnej cDNA identifikovanej v príklade 1 (SEQ ID NO: 7) boli rádioaktívne označené a použité na skríning potkanej mozgovej cDNA knižnice v lambdagtlO, ktorý bol predtým laboratórne pripravený. Podmienky hybridizácie boli opísané v príklade 1 a pozitívne dosky boli podrobené jednému alebo viacerým cyklom skríningu s cieľom získania klonálnych fágov.

Bolo identifikovaných deväť pozitívnych klonov, dva z nich boli hybridizované pri obidvoch sondách. Dlhší z týchto dvoch klonov, nazvaný kloň 7, obsahoval 2550 bp kódujúcich štyri z piatich IG-podobných domén nájdených v sonde cDNA. Navyše kloň 7 kódoval štyri ďalšie Ig-podobné domény nájdené v sonde. Bola identifikovaná domnelá transmembránová a cytoplazmatická doména nasledovaná stop kodónom, polydenylačným signálom a poly A koncovou skupinou. Kloň 7 stratil aspoň jednu 5' Igpodobnú doménu, ako bolo zistené porovnaním s RT-PCR klonom (SEQ ID NO: 7) a tiež stratil vedúcu sekvenciu; opätovným skríningom knižnice neboli získané žiadne dlhšie klony, ktoré obsahovali tieto sekvencie. Sekvencia nukleotidových kyselín klonu 7 je uvedená v SEQ ID NO: 10.

B. Určenie 5' konca

S cieľom izolácie domény 1 a iných 5' sekvencií bola použitá PCR metóda nazývaná „5' Rapid Amplification of cDNA ENDS C RAČE)“ [PCR Protocols: A Guide to Met hods and Applications, Innis a kol., (eds) Academic Press: New York (1990), str. 28 - 3 8]využívajúca 5' RAČE kit (Clontech). Táto metóda využíva vnútorný primér spárovaný s druhým primérom komplementárnym sekvencií adaptéra spojeného s 5' koncom molekúl knižnice cDNA. PCR s týmto primérovým párom tak zosilňuje a uľahčuje identifikáciu vloženej sekvencie. Informácia prečnievajúcej sekvencie môže byť potom použitá na vytvorenie kompletnej sekvencie génu.

Hotová RAČE cDNA z potkanieho mozgu (obsiahnutá v kite) bola použitá pri PCR s oligonukleotidom (z kitu) a pozitívnym primérom založeným na vnútornej ICAM-4 sekvencií. Pozitívny 3' primér uvedený v SEQ ID NO: 20, nazvaný Spot714AS, bol vytvorený podľa ICAM-4 sekvencie domény 4.

GARGGTGACAAGGGCTCG (SEQ ID NO: 20) Amplifikačný produkt získaný pomocou tohto primérového páru bol potom podrobený sekundárnemu PCR pri použití rovnakého 5' priméru (z kitu) spárovaného s 3' primérom komplementárnym s oblasťou ICAM-4. domény 1. Druhý 3’ primér bol nazvaný RRACE2 a je uvedený v SEQ ID NO: 21.

TATGAAATTCAGTTGAGCCACAGCGAGC (SEQ ID NO: 21)

Každý primér použitý v sekundárnej PCR obsahoval EcoRl na uľahčenie klonovania výsledných amplifikačných produktov do PBS⁺ (Stratagene). Výsledná plazmidová DNA, ktorá obsahovala 5' konce génu, bola identifikovaná hybridizáciou s potkaniou ICAM-4 doménou 1 a 2 sondy, kde zodpovedá nukleotidom 1 až 736 v SEQ ID NO: 7. Parciálna sekvenčná informácia pre doménu 1 a pre vedúcu hydrofóbnu sekvenciu bola určená z výsledného amplifikačného produktu.

Produktom metódy 5'RACE bol fragment DNA 222 bp obsahujúci 60 bp metioninový zvyšok proti smeru expresie génu, 82 bp vedúcej sekvencie a 80 bp sekvencie z domény 1. Amplifikačný produkt je uvedený v SEQ ID NO: 11.

C. Kompletná sekvencia potkanieho ICAM-4.

Kompozitný kloň kompletného ICAM-4 bol konštruovaný zo sekvenčnej informácie odvodenej z metódy 5'RACE (SEQ ID NO: 11), kloň RT-PCR CSEQ ID NO: 7) a kloň 7 mozgovej cDNA (SEQ ID NO: 10). Bolo zistené, že kompletný gén pre potkaní ICAM-4 obsahuje 2985 bp jednoduchého otvoreného čítacieho rámca kódujúcich odvodený aminokyselinový proteín 917. Odvodená Kozák sekvencia je umiestená proti smeru expresie génu metioninového zvyšku vo vedúcej sekvencií. Hydrofóbna vedúca sekvencia obsahujúca 27 aminokyselín je nasledovaná deviatimi Ig-podobnými doménami, transmembránovou oblasťou a 58 aminokyselinami cytoplazmatického konca. Kompozitná ICAM-4 cDNA je uvedená v SEQ ID NO: 1 a odvodená aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEQ ID NO: 2.

Ako iné ICAM polypeptidy, ICAM-4 obsahuje extracelulámu, transmembránovú a cytoplazmatickú doménu. V extracelulámej doméne na N-konci ICAM-4 je vedúca sekvencia obsahujúca aminokyseliny 1 až 27, ktorá je nasledovaná deviatimi imunoglobulín(Ig)-podobnými doménami, príznačnými pre ICAM-4, pretože ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R obsahujú päť, dve a päť Ig-podobných domén. ICAM-4 obsahuje v doméne 1 aminokyseliny 28 až 118, v domcnc 2 obsahuje aminokyseliny 119 až 224, v doméne 3 obsahuje aminokyseliny 225 až 321, v doméne 4 obsahuje aminokyseliny 322 až 405, v doméne 5 obsahuje aminokyseliny 406 až 488, v doméne 6 obsahuje aminokyseliny 489 až 569, v doméne 7 obsahuje aminokyseliny 570 až 662, v doméne 8 obsahuje aminokyseliny 663 až 742, v doméne 9 obsahuje aminokyseliny 743 až 830. V každej doméne s tvorí charakteristická „slučková“ štruktúra pomocou disulfídických väzieb medzi cysteínovými zvyškami umiestenými všeobecne na proti sebe stojacich koncoch aminokyselinovej sekvencie domény. Iné štruktúrne znaky ICAM-4 obsahuje transmembránová oblasť obsahujúca aminokyseliny 831 až 859 a cytoplazmatická oblasť obsahujúca aminokyseliny 860 až 917.

Porovnanie homológnych aminokyselinových sekvencií každej domény v potkaňom ICAM-4 s inými členmi ICAM rodiny bolo obmedzené na príslušné sekvencie ľudského ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R, keďže informácia pre tri hlodavčic homológy nebola zverejnená. Prvá doména hlodavčieho ICAM-4 má 21, 30 a 28 % identitu s ľudským ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-R. Druhá doména je viac zachovaná, s identitou s ICAM-1, -2 a -3 s obsahom 60, 42 a 62 percent. Domény 2 až 3 majú s ICAM-1 percentnú identitu 48, 49 a 40, s ICAM-R percentnú identitu 60, 59 a 29, zaujímavé je, že potkanie ICAM-4 domény 6 až 8 sú najviac homológne s doménou 5 (identické v rozsahu 29 až 42 %), ktorá je pravdepodobne dôsledkom duplikácií génových segmentov. Deviata a koncová extraceluláma doména sa radí k úplne iným ICAM doménam, ale má 22 % identitu s treťou a šiestou doménou ľudského VCAM-1, iného člena lg rodiny bielkovín, ktorý má podiel na bunkovej adhézii. Cytoplazmatický koniec má dĺžku 58 aminokyselín. Je dlhší ako pri iných členoch ICAM rodiny, pretože ICAM-1, -2 a -3 obsahujú 28, 26 a 37 aminokyselín. Pokiaľ ide o deviatu doménu, potkaní ICAM-4 cytoplazmatický koniec je navyše homológny s cytoplazmatickým koncom ľudského VCAM-1, ktorý obsahuje len 19 aminokyselín. Proximálnych 19 aminokyselín potkanieho ICAM-4 má spoločných 7 aminokyselinových zvyškov s VCAM-1 (37 %).

Konečne, funkčné spojenie s LFA-1 (CDlla/cdl8) patrí do prvej domény ICAM. Vonderheide a kol., [J. Celí. Biol., 125: 215 - 222 (1994)] identifikoval sekvenčný motív zahrnujúci integrínové spojenie. Nezávisle od relatívne nízkeho stupňa homológie medzi potkaním ICAM-4 a inými ICAM v doméne 1, tento spájací sekvenčný motív je zachovaný, čo naznačuje, že potkaní ICAM-4 môže byť ligand pre LFA-1 a snáď iné integríny.

Príklad 4

Hybridizácia in situ v mozgovom tkanive

S cieľom lokalizácie špecifického mozgového tkaniva, ktoré exprimuje ICAM-4, bola použitá hybridizácia in situ ICAM-4 domény 1 a ICAM-4 domény 3 až 4 a pozitívnych sond RNA. Sondy boli označené v prostredí in vitro transkripciou pri použití UTP označeného ³⁵S.

Zmrazené časti tkaniva normálneho potkanieho mozgu boli fixované v 4 % paraformaldehyde počas 20 minút, opláchnuté a dehydratované a fixované RNA denaturovaná pred hybridizáciou počas 2 minút v 2X SSC, 70 % formamidu pri 70 °C. Časti tkaniva boli hybridizované cez noc pri 50 °C v roztoku obsahujúcom 50 % formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mN EDTA, 10 % dextránsulfát, IX Denhardtovho činidla, 0,5 mg/ml kvasničnej RNA, 100 mM DTT a pri koncentrácii sondy 50 000 cpm/μΐ. Podložné sklíčka boli premyté raz v 4X SSC, 10 mM DTT pri izbovej teplote počas 60 minút, raz v 50 % formamide, 2X SSC, 10 mM DTT pri 60 °C počas 40 minút a raz tak v 2X SSC, ako aj v IX SSC počas 30 minút, každý raz pri izbovej teplote. Rozlišovacia schopnosť hybridizácie bola zisťovaná pomocou paralelných experimentov uskutočňovaných rovnakým spôsobom, ale tiež zahrnujúcich dôraznejšie premytie v 50 % formamide, IX SSC, 10 mM DTT pri °C počas 40 minút. Po premytí boli podložné sklíčka ponorené do emulzie NTB2 (Kodak, Rochester, NY) a exponované od 2 do 21 dní pred vyvolaním a spätným ofarbením. Negatívne kontrolné vzorky zahrnovali negatívne nukleotidové sondy získané z ICAM-4 domény 1 a 1CAM-4 domény 3 až 4 negatívnej sondy RNA, navyše k RNA sonde ľudského imunodeficientného vírusu (HIV-1).

Signál detegovaný v mozgovom tkanive bol primáme lokalizovaný v oblasti sivej kôry s najsilnejším signálom v oblasti cerebrálneho cortexu a hipokampu. Hybridizačný profil bol totožný hlavne s expresiou ICAM-4 v cerebrálnych neurónoch.

Príklad 5

Tvorba ICAM-4 fúznych proteínov

Potkanie ICAM-4/glutatión S-transferázové (GST) fúzne proteíny boli vytvorené použitím prokaryotického expresného vektora pGEX (Pharmacia, Alameda, CA)), aby sa vytvorili monoklonálne protilátky proti špecifickým fragmentom polypeptidu ICAM-4.

PCR priméry zodpovedajúce 5' a 3' koncom domény 1 a 5' a 3 koncom domény 2 boli použité na zväčšenie DNA fragmentov kódujúcich individuálne domény. Výsledné fragmenty boli oddelene klonované do EcoRI miest pGEX-2T. Sekvenčná analýza potvrdila správnu orientáciu a čítací rámec. Produkty transformácie boli potom podrobené skríningu z hľadiska ich schopnosti produkovať fúzny proteín s vhodnou molekulovou hmotnosťou.

Tak fúzny proteín ICAM-4 domény 1/GST, ako aj fúzny proteín ICAM-4 domény 2/GST zostali po lýze baktérií sonifíkáciou v PBS obsahujúcom 1 % SDS v nerozpustnej frakcii. Nerozpustné proteínové frakcie zo 100 ml kultúr boli varené v SDS farbive a oddelené na 10 % preparativnom polyakrylamidovom-SDS géli. Gél bol exponovaný v ľadovom 0,4 M KC1 a boli získané pásy fuznych proteínov. Fuzionované proteíny boli získané elektroelúciou z plátov gélu v dialyzačnej trubici v pufri obsahujúcom 25 mM Tris-HCl a 192 mM glycínu. Približná koncentrácia proteínu bola zistená pomocou CD₂₈o a čistota preparátu bola určená na SDS-PAGE ofarbením Coomasiovou modrou.

Príklad 6

Produkcia monoklonálnych protilátok proti potkaním ICAM-4(GST fúznym proteínom

Myši Balb/c boli imunizované subkutánnou injekciou pomocou 40 až 50 pg fúzneho proteínu ICAM-4 doména2/GST C (opísané v príklade 5), ktorý bol emulgovaný vo Freundovom kompletnom činidle (FCA). Po dvoch týždňoch boli myši opäť imunizované subkutánnou injekciou rovnakým proteínom, emulgovaným však vo Freundovom nekompletnom činidle. Dve záverečné intraperitoneálne imunizácie boli uskutočnené po ďalších dvoch týždňoch po druhej imunizácii pomocou rozpustného antigénu bez adjuvans v dvojtýždennom intervale. Sérum z každej imunizovanej myši bolo skúmané ELISA testom na ich schopnosť špecificky reagovať s potkaním ICAM-4 produkovaným opísaným baculovírusovým expresným systémom.

Slezina myši #1654 bola sterilné vybraná a umiestená do 10 ml bezsérového RPMI 1640. Suspenzia buniek bola vytvorená rozmelením slezinného tkaniva medzi dvoma chladenými mikroskopickými podložnými sklíčkami ponorenými do bezsérového RPMI 1640 (Gibco, Burlington, Ottawa, Kanada) obsahujúceho 2mM L-glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného, 100 jednotiek/ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu. Bunková suspenzia bola prefiltrovaná cez sterilné Nitexove bunkové sito s pórmi 70 mesh (Becton Dickinson, Parsipany, NJ) a dvakrát i premytá RPMI a po tom nasledovalo odstredenie pri 200 x g počas 5 minút. Výsledné pelety po konečnom premytí boli resuspendované v 20 ml bezsérového RPMI. Tymocyty získané z troch myší, s ktorými neboli doteraz uskutočnené žiadne pokusy, boli získané podobným spôsobom.

Pred vlastnou fúziou boli myelómové bunky NS-1 udržiavané v log fáze rastu v RPMI s 11 % Fetaclon séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah) počas troch týždňov. Pri spracovaní boli bunky odstredené pri 200 x g počas 5 minút a pelety boli dvakrát premyté podobným spôsobom, ako je uvedené v predchádzajúcom odseku. Po premytí bola bunková suspenzia prevedená do konečného objemu 10 ml bezsérového RPMI a 20 μΐ alikvotný diel odobratý a zriedený 1 : 50 bezsérovým RPMI a 20 μΐ alikvotného podielu tohto roztoku bolo odobratých, zmiešaných s 20 μΐ 0,4 % trypánovej modrej v 0,85 % fyziologickom roztoku (Gibco), zavedených na hemacytometer (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) a bunky boli spočítané. Približne 2,425 x 10⁸ slezinných buniek bolo skombinovaných s 4,85 x 10⁷ NS-1 buniek, zmes bola odstredená a supematant bol odstránený. Výsledné pelety boli premiestené pomocou punkcie a počas 1 minúty boli pridané pri stálom miešaní 2 ml 50 % PEG 1500 v 75 mM Hepes, pH 8,0 (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Potom bolo počas 7 minút pridaných 14 ml bezsérového RPMI. Bunková suspenzia bola odstredená pri 200 x g počas 10 minút a supernatant bol odstránený. Pelety boli resuspendované v 200 ml RPMI obsahujúcom 15 % FB, 100 μΜ hypoxantínu sodného, 0,4 μΜ aminopterínu, 16 μΜ tymidínu (HAT) (Gibco), 25 jednotiek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10^Ď tymocytov/ml. Suspenzia bola najprv umiestená do 225 cm² banky (Coming, Essex, Veľká Británia) pri 37 °C počas štyroch hodín pred nanesením na desať 96 jamkových dosiek pre tkanivové kultúry „96 well fiat bottom tissue culture“ (Coming) v množstve 200 μΙ/jamku. Bunky na doskách boli zásobené v treťom, štvrtom, piatom a šiestom dni po fúzii odobratím približne 100 μΐ z každej jamky pomocou 20 G ihly (Becton Dickinson) a prídavkom 100 μΙ/jamku opísaného platňového média s výnimkou obsahu 10 jednotiek/ml IL-6 a tým, že chýbali tymocyty.

Fuzionované dosky boli podrobené skríningu a to najprv pomocou ďalej uvedeného antigénového testu ELISA. Dosky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) boli pokryté cez noc pri 4 °C 100 ng/jamku buď fúznym proteínom domény 1-JGST, alebo domény 2-GST v 50 mM uhličitanovom pufri. Dosky boli fixované pomocou 100 μΙ/jamku 0,5 % želatíny z rybacej kože (Sigma, St Luis, MO) v PBS počas 30 minút pri 37 °C. Po fixácii boli dosky premyté 3X s PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBST) a bolo pridaných 50 μΙ/jamku hybridného supematant z každej fúzie. Po inkubácii pri 37 °C počas 30 minút boli dosky opláchnuté, ako bolo opísané a bolo pridaných 50 μΐ peroxidázy k chrenu konjugovanej s kozím antimyšacim IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvánia) v riedení 1.3500. Dosky boli opäť inkubované počas 30 minút a premyté 4X s PBST. Bolo pridaných 100 μΐ substrátu obsahujúceho lmg/ml o-fenylalaníndiamínu (Sigma) a 0,1 μΙ/ml 30 % H₂O₂ v 100 mM citrátu s pH 4,5. Farebná reakcia bola ponechaná prebiehať 10 minút a bola zakončená prídavkom 50 μΙ/jamku 15 % kyseliny sírovej. Na automatickom detekčnom prístroji (Dynatech) bola zistená absorbancia pri 490 nm.

Jamky, ktoré boli pozitívne na proteín domény 2-GST, ale nie na proteín domény 1-GST, boli podrobené skríningu testom ELISA proti supematantu Baculovírusu (opísané). Test ELISA bol uskutočnený opísaným spôsobom s výnimkou, že dosky Immulon 4 boli v úvode pokryté cez noc baculovírusovým supematantom zriedeným 1 : 4 v 50 mM uhličitanovom pufri. Tri jamky (103A, 103 a 103F) boli úspešne klonované dva až trikrát dvojitým zriedením RPMI, 15 % FBS, 100 μί hypoxantínu sodného, 16 μΜ tymidínu a 10 jednotiek/ml IL-6. Jamky dosiek s klonmi vyhodnotené vizuálne po 4 dňoch a bolo súčasne spočítané množstvo kolónií v jamke s posledným vhodným zriedením. Vybrané jamky z každého klonovania boli opäť podrobené testu ELISA po 7 až 10 dňoch proti proteínu domény 1-GST a proteínu domény 2-GST alebo baculovírusovému supematantu.

Monoklonálne protilátky produkované hybridómami boli izotypované testom ELISA. Dosky Immulon 4 (Dynatech) boli pokryté pri 4 °C 50 μί/jamku kozím antimyšacím IgA, IgG alebo IgM (Organon Teknika, Durham, NC) zriedenom 1 : 5000 v 50 mM uhličitanovom pufri s pH 9,6. Jamky boli fixované počas 30 minút pri 37 °C pomocou 1 % BSA v PBS a premyté 3X PBST.

Zriedenie 1 : 10 supematantu hybridómovej kultúry (50 μί) bolo pridané ku každej doske, inkubované a premyté uvedeným spôsobom. Po odstránení posledného zvyšku premytia bolo pridaných 50 μί chrenovej peroxidázy konjugovanej s králičím antimyšacím IgG_b G_2a, G_2b alebo G₃ (Zymed, San Francisco, CA) (zriedené 1 : 1000 v PBST s 1 % normálneho kozieho séra). Dosky boli inkubované uvedeným spôsobom, premyté 4X PBST a bolo pridaných 10 μί substrátu. Farebná reakcia bola zastavená po 5 minútach prídavkom 50 μί 15 % kyseliny sírovej a automatickým prístrojom (Dynatech) bola zistená absorbancia pri 490 nm.

Výsledky naznačujú, že protilátky 103A, 103B a 103f boli všetky izotypu IgG]. Tieto protilátky boli potom použité v imunocytochemickej analýze pomocou Westemovho prenosu a pre purifikáciu proteínu exprimované v baculovíruse.

Príklad 7

Baculovírusová expresia potkanieho ICAM-4

Baculovírusový expresný systém (Invitrogen) bol použitý na tvorbu rozpustného proteínu zodpovedajúceho doménam 1 až 6 ICAM-4. Pretože v tomto čase nebola známa vedúca sekvencia pre ICAM-4, expresný konštrukt bol vyrobený s tým, že obsahoval kódujúcu sekvenciu pre ICAM-4 fuzionovanú s vedúcou sekvenciou ICAM-1 vo vhodnom čítacom rámci. Konkrétne detaily týkajúce sa konštrukcie ICAM-1/ICAM-4 expresného plazmidu sú uvedené ďalej.

Potkania ICAM-1 DNA, kódujúca päť Ig-podobných domén, bola namnožená PCR použitím primérov, ktoré obsahovali niektoré znaky na uľahčenie konštrukcie fúznych plazmidov. 5' oligonukleotidový primér obsahujúci HindlII a Bg/II navyše v zhode s Kozák sekvenciou proti smeru expresie génu od prvého metionínu vo vedúcej sekvencii. 3’ oligonukleotidový primér obsahoval kódujúcu sekvenciu pre šesť histidinov nasledovanú stop kodónom a kódujúcim miestom HindlII. PCR amplifikačný produkt bol klonovaný do vektora HindlII-štiepeným pBS⁺, pričom sekvenčná analýza potvrdila vhodnosť konštrukcie. Vnútorné miesto Smal v ICAM-1 vedúcej sekvencii a ďalšie Smal miesto vo vektorovej viacnásobnej klonujúcej oblasti (3’ ICAm-l Ig-podobná doména 5) boli rozštiepené, čo odstránilo väčšinu ICAM-1 kódujúce sekvencie. Po tejto manipulácii linearizovaný vektor so zarovnanými koncami obsahoval časť oblasti proti smeru expresie génu viacnásobnej klonujúcej oblasti (tieto reštrikčné miesta 5’ pôvodného HindlII miesta vo viacnásobnej klonujúcej oblasti), Kozák sekvenciu a väčšinu ICAM-1 vedúcej sekvencie.

Kódujúca sekvencia pre krycie ICAM-4 domény 1 až 6 bola amplifikovaná PCR s užitím primárov, aby bolo umožnené klonovanie tejto sekvencie do uvedeného linearizovaného vektora. 5' oligonukleotidový primér obsahoval EcoRV miesta a kodóny potrebné na doplnenie ICAM-1 vedúcej sekvencie. 3' oligonukleotidový primér obsahoval kodóny pre šesť histidínových zvyškov, stop kodón a Hindlll a EcoRV reštrikčné miesta. Amplifikačný produkt z tejto PCR bol štiepený EcoRV za vzniku sekvencie so zarovnanými koncami, ktoré boli naviazané do Smalštiepeného pBS⁺ linearizovaného vektora so zarovnanými koncami. Kompletná sekvencia, obsahujúca ICAM-1 vedúcu sekvenciu 5' k ICAM-4 doménam 1 až 6, bola odstránená z konštruktu pomocou Bg/II a HindlII štiepenie a purifikovaná fúzna sekvencia ICAM-1/ICAM-4 bola klonovaná priamo do Bg/II/HindIII-štiepeného pBluesac III vektora (Invitrogen).

Proteínová produkcia rekombinantného vírusu bola skúmaná metódou ELISA, použitím imunosér z myší imunizovaných pomocou potkanieho ICAM-4 domény-2/GST fúzneho proteínu opísaného v príklade 5. Pri ďalšej práci boli monoklonálne protilátky vytvorené týmito myšami použité na purifikáciu proteínu ICAM-4 produkovaného rekombinantným baculovírusom v bunkách SF9.

Príklad 8

Produkcia monoklonálnych protilátok proti baculovírusom exprimovanému potkaniemu ICAM-4

Potkanie ICAM-4 domény 1 -6 boli exprimované v baculovírusovom expresnom systéme, ako je opísané v príklade 7. Rekombinantný proteín bol purifikovaný pri použití monoklonálnej protilátky 103A (ako je opísané v príklade 6).

V stručnosti, 30 mg purifikovanej monoklonálnej protilátky 103A (v 100 mM) borátu sodného, 500 mM chloridu sodného) bolo spojených s troma gramami prípravku Activated Cynogen Bromide Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ). Baculovírusový supematant obsahujúci rekombinantný ICAM-4 (domény 1 až 6) bol nanesený na kolónu so Sepharose a pri 4 °C ponechaný cez noc. Kolóna bola premývaná fosfátovo pufrovaným fyziologickým roztokom bez obsahu vápnika a horčíka (CMF-PBS) a naviazaný materiál bol eluovaný v 50 mM citrónovej kyseline, 500 mM NaCl s pH 4,0. Vzorka bola neutralizovaná pomocou 1/10 objemu Tris pH 10 a uložená pri -20 °C. Purifikovaný proteín oddelený na SDS-PAGE mal väčšiu ako 90 % čistotu a pohyboval sa v okolí 80 kD.

Myši boli imunizované pomocou purifikovaného rekombinantncho potkanieho ICAM-4 doména 1-6 proteínu podobným spôsobom, ako je opísané v príklade 6. Slezina z myši #1945 bola použitá pre fúziu #127. Postup fúzie bol rovnaký, ako v príklade 6. Fúzne jamky boli podrobené skríningu metódou ELISA na rekombinantný ICAM-4 proteín. Sekundárny skrining zahrnoval imunocytochémiu časti potkanieho mozgu (ako je ďalej opísané v príklade 9). Touto fúziou boli vyklonované ďalšie štyri protilátky špecifické pre potkaní ICAM-4: 127A, 127E, 127F a 127H. Imunocytochemický obraz každej z týchto protilátok časti potkanieho mozgu bol rovnaký, ako bolo zistené pre monoklonálnu protilátku 103A C pozri príklad 9). Monoklonálne protilátky boli testované na svoju schopnosť viazať Dl/GST a D2/GST fúzne proteíny (opísané v príklade 5). Monoklonálna protilátka 127A rozpoznávala Dl/GST fúzny proteín, 127H rozpoznávala D2/GST fúzny proteín. Tieto dve rozdielne väzbové špecifikácie spolu s inými, ktoré sa neviazali so žiadnym GST proteínom, naznačujú, že boli objavené aspoň 3 rôzne epitopy. Hybridómy 127A a

127H boli uložené 31. mája 1995 a 1. júna 1995 do Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod číslom HB11905 a HB11911.

Príklad 9

Imunocytochémia expresie potkanieho 1CAM-4

S cieľom lokalizácie produkcie proteínu v potkaňom mozgu bola uskutočnená imunocytochémia pomocou monoklonálnej protilátky 103A.

Mozog bol získaný z normálnej dospelej samice Lewisovho potkana, šípovito rozdelený a premývaný vbez-RNázovom IX PBS na ľade počas 30 minút. Časti mozgu boli umiestené do kryoforiem v Tissue Tek II (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) do malého množstva zlúčeniny O. C. T. (Miles, Inc., Elkhart, IN). Mozgy boli umiestené do stredu kryoforiem, tie boli naplnené zlúčeninou OCT, umiestené do zásobníka s 1-metylbutánom (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) ja kontajner bol umiestený do kvapalného dusíka. Po zmrznutí tkanív a OCT zlúčeniny v kryoformách boli bloky skladované pri -80 °C do rozdelenia na sekcie.

Tkanivá boli rozdelené na sekcie s hrúbkou 6 pm, prichytené na podložné sklíčka pokryté prípravkom Vextabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) a podrobené cez noc sušeniu na vzduchu pri izbovej teplote až do použitia. Sekcie boli fixované v etyléteri (Malinckrodt, Páriš, KY) počas 5 minút pri izbovej teplote. Po vybraní sklíčok z éteru bol reagent ponechaný sa odpariť. Každá zo sekcií tkaniva bola zablokovaná pomocou 150 μΐ 50 % normálneho potkanieho séra (Sigma) a 2 % hovädzieho sérumalbumínu (BSA) (Sigma) v IX j PBS (vyrobenom len s fosforečnanom sodným) počas 30 minút pri izbovej teplote. Po blokácii bol roztok jemne odsatý zo sekcií a purifikovaná supematantová protilátka 103A (165 mg/ml) bola zriedená v pomere 1 : 10 v blokovacom roztoku a na každú sekciu tkaniva bolo aplikovaných 150 μΐ. Podložné sklíčka boli umiestené vo zvlhčovacej komôrke a inkubované cez noc pri 4 °C.

Nasledujúci deň bol protilátkový roztok jemne dosatý zo sekcií a podložné sklíčka boli premyté trikrát v IX PBS počas štyroch minút pri každom premývaní. Prebytok PBS bol zo sklíčok odsatý a na každé tkanivo bolo aplikovaných 10 μ) sekundárnej potkanej anti myšacej-biotín konjugovanej protilátky (Jackson Immuno-Research Laboratories), zriedenej 1 : 100 v roztoku 10 % normálneho potkanieho séra a 2 % BSA v IX PBS. Inkubácia prebiehala počas jednej hodiny pri izbovej teplote. Sekcie boli premyté dvakrát v IX PBS počas štyroch minút pri každom premývaní, potom bolo na každú sekciu aplikovaných 100 μΐ ABC reagentu z kitu Elite Rat IgG Vectastain ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), pripraveného podľa návodu výrobcu. Inkubácia bola ponechaná, aby prebiehala 30 minút pri izbovej teplote. Po inkubácii boli podložné sklíčka premyté dvakrát v IX PBS (štyri minúty každé premytie) a na každú sekciu bolo počas asi desiatich minút aplikovaných 150 μΐ Vector VIP Peroxidase Substráte Solution (Vector Laboratories, Inc., (Burlingame, C A). Po farebnej reakcii boli sekcie oplachované pod tečúcou vodou počas piatich minút, podfarbené pomocou Mayerovho hematoxylínu (Sigma) počas 20 sekúnd a opäť jemne oplachované pod tečúcou vodou počas piatich minút. Podložné sklíčka boli dehydratované cez série so stúpajúcou koncentráciou etanolu, pretiahnuté xylénom a prekryté pomocou Accumount 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

Imunohistochémia sekcií potkanieho mozgu spracovaných pomocou mAbl03A ukazuje, že ICAM-4 je exprimovaný v bunkách neurónov hipokampu. Ofarbený mozog u kazuje, že proteín môže byť obmedzený na neuronálne procesy (dendrity). Sekcie mozgu ofarbené podobným spôsobom pomocou irelevantných protilátok alebo samotným činidlom použitím v druhom kroku, nemajú jasné expresné vzory, ako je to pri MAb 103A.

Príklad 10

Klonovanie ľudskej ICAM-4 genómovej DNA

Počas klonovania potkanieho ICAM-4 z genómovej DNA bolo zistené, že ICAM-4 a ICAM-1 sú umiestené do 5 kb od seba a táto informácia bola použitá pri pokuse klonovať ľudský homológ ICAM-4.

Genóme Systems Inc. (St. Luis, MO) amplifikujú fragmenty v ľudskej PI knižnici pomocou PCR pri použití ľudských primérov ICAM-1 domény 3, negatívnych primárov navrhnutých komplementárne k ľudskej ICAM-1 doméne 3 (H-l/03 S) a pozitívneho primára navrhnutého komplementárne k ľudskej ICAM-1 doméne 3 (H-1/D3 AS). Tieto primáry sú uvedené v SEQ ID NO: 22 a 23.

CCGGGTCCTAGAGGTGGACAACGCA (SEQ IDNO: 22) TGCAGTGTCTCCTGGCTCTGGTTC (SEQ ID NO: 23)

Boli identifikované dva klony, nazvané 1566 a 1567, ktoré boli ďalej podrobené ďalšej analýze. Obidva PI klony obsahovali približne 75 až 95 kb inzertov genómovej DNA. Klony boli rozštiepené pomocou BamHl, separované pomocou elektroforézy na agarózovom géli a nastrieknuté na nylonovú membránu. Southemova hybridizácia bola uskutočnená pri miernejších (30 % formamid) a drsnejších (60 % formamid) podmienkach pri 42 °C s rádioaktívne značenými sondami ľudského ICAM-1, ICAM-3 alebo potkanieho ICAM-4; ďalšie zložky hybridizačného roztoku boli rovnaké ako v príklade L Séria podrobená miernejším hybridizačným podmienkam bola premytá pri izbovej teplote v 2X SSPE obsahujúcom 0,1 % SDS. Pri drsnejšie hybridizovaných bolo premytie uskutočnené pri 65 °C v 0,2 X SSPE obsahujúcom 0,1 % SDS. Premyté membrány boli vystavené rôntgenu 3,5 hodiny.

Diferenciálna hybridizácia ukázala, že ľudský ICAM-1 je obsiahnutý v 5,5 kb BamHl fragmente, zatiaľ čo ľudský ICAM-4 je umiestený na 4,0 kb a 1,5 kb BamHl fragmentu. Ľudské ICAM-1 a ICAM-3 fragmenty boli subklonované do pBS⁺ a ich totožnosť bola potvrdená sekvenčnou analýzou.

Fragment 7,0 kb BamHl, hybridizovaný s potkaním ICAM-4 pri drsnejších podmienkach, bol subklonovaný a ďalej fragmentovaný pomocou Rsal reštrikčného štiepenia. Boli identifikované tri Rsal fragmenty hybridizované s potkaním ICAM-4 a boli určené ich sekvencie. Založené na homológii s potkaním ICAM-4, zdá sa, že tieto fragmenty obsahujú domény 2, 3, 4, 6 a Časť domény 6.

Príklad 11

Klonovanie ľudskej ICAM-4 cDNA

Fragmenty genómovej DNA zodpovedajúce doménam 2 - 5 ľudského ICAM-4 (opísané v príklade 10), boli použité ako sondy pre skríning knižnice lambdagtlO ľudskej hipokampovej cDNA (Clontech, Palo Alto, CA). Postup pri skríningu bol v zásade rovnaký, ako je opísané v príklade 1.

Najdlhší kloň ľudského ICAM-4 (#18), ktorý bol nájdený v tejto knižnici, mal len 992 bp (SEQ ID NO: 24) a zodpovedal v zásade stredu predpokladaného 3 kb génu. Inzert 992 bp DNA z klonu 18 (SEQ ID NO: 24) bol použitý ako sonda pre skríning knižnice lambdaZAPII ľudskej hipokampovej cDNA (Strategene, La Jolla, CA). Táto knižnica poskytovala množstvo pozitívnych klonov. Najdlhší kloň, #34, mal 2775 bp (SEQ ID NO: 25). Založené na porovnaní s kompletným potkaním ICAM-4 bol vyslovený predpo klad, že tento kloň stratil vedúcu sekvenciu a približne 30 bp na 5' konci domény 1. Chýbal poly A⁺ koniec na 3’ konci, ale translačný stop kodón bol prítomný.

Ako sonda k skríningu knižnice lambdagtlO cDNA odvodenej z ľudského cerebrálneho cortexu (Clontech, Palo Alto, CA) bol použitý fragment DNA zodpovedajúci prvým 3 doménam (nukleotidy 1 až 850 v klone #34). Bolo zistené, že jeden kloň 16-1 (SEQ ID NO: 26) má 1557 bp a zahrnuje 39 bp 5' netranslátovanej DNA, vedúcu sekvenciu a sekvenčné informácie piatej domény. Prekrývajúce sa klony #34 (SEQ ID NO: 25) a 16-1 (SEQ ID NO: 26) boli použité na tvorbu kompozitu kompletnej sekvencie ľudského ICAM-4 (SEQ ID NO: 27).

Kompletný gén je dlhý 2927 bp a kóduje proteín s 924 aminokyselinami. Nukleotidová sekvencia ICAM-4 je uvedená v SEQ ID NO: 27 a aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEQ ID NO: 28. Sekvenčné porovnania s kompletným génom potkanieho ICAM-4 ukázalo celkovú identitu DNA 82 % a identitu na aminokyselinovej úrovni 85 %. Zjavná 9 lb podobná extraceluláma doménová štruktúra proteínu je zachovaná pri potkanovi aj u človeka. Vedúca sekvencia siaha od aminokyseliny 1 do 28, doména 1 od aminokyseliny 29 do aminokyseliny 117; doména 2 od aminokyseliny 118 do aminokyseliny 224; doména 3 od aminokyseliny 225 do aminokyseliny 320; doména 4 od aminokyseliny 321 do aminokyseliny 405; doména 5 od aminokyseliny 406 do aminokyseliny 488; doména 6 od aminokyseliny 489 do aminokyseliny 570; doména 7 od aminokyseliny 571 do aminokyseliny 663; doména 8 od aminokyseliny 664 do aminokyseliny 743; doména 9 od aminokyseliny 744 do aminokyseliny 837; transmembránová oblasť od aminokyseliny 837 do aminokyseliny 837 a cytoplazmatický koniec od aminokyseliny 858 do aminokyseliny 924.

Ľudské ICAM-4 (HuICAM-4) navyše na to, že sú geneticky zviazané s ICAM-1 a ICAM-R, tiež majú niektoré štruktúrne znaky, ktoré ich spájajú dokopy ako rodinu molekúl. Domény pri porovnaní domén HuICAM-4 s inými členmi ICAM rodiny majú rozdielny stupeň homológie. Doména 1 aminokyselinovej sekvencie HuICAM-4 je z 21, 30 a 26 % identická s doménou 1 ICAM 1, 2 a 3. Doména 2 aminokyselinovej sekvencie HuICAM-4 je z 61, 39 a 62 % identická s doménou 2 ICAM 1,2 a 3. Doména 3 aminokyselinovej sekvencie HuICAM-4 je z 50 až 65 % identická s doménou 3 ICAM 1 a 3. Doména 4 aminokyselinovej sekvencie HuICAM-4 je z 54 až 65 % identická s doménou 4 ICAM 1 a 3. Domény 5 až 8 aminokyselinovej sekvencie HuICAM-4 sú najviac homológne s piatou doménou ICAm-1 a 3 s percentným vyjadrením identity pohybujúcim sa od 33 do 47 % pre ICAM-1 doménu 5 a od 21 do 31 % pre ICAM-R doménu 5. Deviata doména HuICAM-4 sa podobá málo iným členom ICAM rodiny, aleje homológna s doménou 3 (z 24 % identická) a 6 (z 23 % identická) HuICAM-1.

Príklad 12

Northemova analýza expresie ľudského ICAM-4

Dve súpravy ľudského dvojitého tkaniva pre Northernovu hybridizáciu boli získané od firmy Clontech (Palo Alto, CA). Obsahovali aspoň 2 pg poly A⁺RNA z 16 rôznych ľudských tkanív (ako je uvedené v tabuľke 1) spracované v denaturovanom formaldehydovom 1,2 % agarózovom géli a premiestené na nylonovú membránu. Škvrny boli predhybridizované tri hodiny pri 42 °C v 10 ml roztoku obsahujúceho 5X SSPE, 10X Denhardstov roztok, 50 % formaldehydu, 2 % SDS a 100 pg/ml denaturovanej DNA z lososovej spermy. Škvrny boli hybridizované v uvedenom roztoku s rádioaktívne značeniu sondou ľudského ICAM-4 (kloň #18, SEQ ID NO: 24) počas 16 hodín pri 42 °C. Nasledujúci deň boli škvrny premyté v roztoku O,1X SSC/0,1 % SDS pri izbovej teplote a potom nasledovalo premytie pri 50 °C. Škvrny boli exponované rontgenovým žiarením pri -80 °C počas 24 hodín. Výsledky analýz sú uvedené v tabuľke 1.

Len pruh obsahujúci RNA z mozgu hybridizované so sondou ICAM-4 poskytoval jednoduchú väzbu približne s 3 kb. Dlhšia expozícia (päť dní) potvrdila, že len mozog mal detegovateľnú úroveň odpovede. Aby sa zistilo, či všetky pruhy obsahovali porovnateľné množstva RNA s porovnateľnou kvalitou, rovnaké škvrny boli hybridizované pomocou kontrolnej beta-aktínovej sondy. Škvrny boli odstránené ICAM-4 sondou spracovaním vriacim roztokom 0,1 % SDS počas 15 minút a potom spracované rovnakým spôsobom s beta-aktínovou sondou. Až na nepatrné rozdiely v množstve, všetky pruhy mali dobrú kvalitu RNA.

Tabuľka 1

Northemova analýza tkaniva expresiou ľudského ICAM-4

tkanivo	sonda
ICAM-4	beta-aktín
srdce		+++
mozog	+	++
placenta		+++
pľúca		+++
pečeň		+++
telesná svalovina		++++
obličky		+++
pankreas		++
slezina		J-+4-
týmus		++++
žľaza predstojná		+++
vajcia		+++
vaječník		+++
tenké črevo		+++
časť hrubého čreva		+++
periférne krvné
leukocyty	-	+++

Dve ďalšie Northemove súpravy boli získané do firmy Clontech a obsahovali poly A+ RNA z 16 rôznych častí ľudského mozgu (ako je uvedené v tabuľke 2). Škvrny boli spracované podobným spôsobom, aký bol použitý na analýzu tkanív a výsledky sú uvedené v tabuľke 2. Kvalita a množstvo RNA bola skontrolovaná skúškou škvŕn pomocou beta-aktínovej sondy.

Všetky oblasti, ktoré mali expresiu ICAM-4, sú časťami teleneefalónu, s výnimkou talamusu, ktorý je považovaný za časť dieneefalónu. Hipokampus a mozgová kôra mali najvyššiu úroveň expresie. Veľkosť transkriptu bola vo všetkých prípadoch rovnaká, 3 kb. Výborná distribúcia tkanív pri expresii ICAM-4 naznačuje, že promótorové oblasti môžu obsahovať častice, ktoré umožňujú zistenú vývojovú a priestorovú expresiu génových produktov. Využitie takýchto informácií môže prispieť k porozumeniu riadenej génovej expresie všeobecne.

Tabuľka 2

Northemova analýza typu mozgovej bunky expresiou ľudského ICAm-4_____________________________

oblasť mozgu	sonda
ICAM-4	beta-aktin
amygdala	++	+++
nucleus caudatus	++	+++

Corpus sallosum	+	+++
hippocampus	++	+++
hypothalamus	-	+++
substantia nigra	-	+4-4-
subthalamické jadro	+	+++
thalamus	+	+++
malý mozog	-	+++
cerebrálny cortex	+++	+++
predĺžená miecha	-	+++
miecha	-	+4-+
okcipitálny pól	++	+++
predný lalok	++	+++
temporálny lalok	++	+++
putamen	++	+++

Príklad 13

Vytváranie ľudských ICAM-4/lgG fúzii proteínov

Expresné plazmidy ľudského ICAM-4/IgGl fúznych proteínov boh skonštruované s cieľom produkcie proteínu na výrobu monoklonálnych protilátok a na použitie v adhéznych skúškach na identifikáciu potenciálnych ICAM-4 ligandov. Boli pripravené dva konštrukty: prvý obsahoval DNA kódujúcu domény 1 až 3 HuICAM-4 a druhý domény 4-8. Obidva boli napojené na Fc oblasť ľudského IgGl vo vektore pDCSl, ktorý užíva cytomegalovírusový (CMV) promótor na riadenie expresie a signálne sekvencie z IgG4 na uľahčenie sekrécie molekúl.

PCR priméry (ďalej ako SEQ ID NO: 29 až 32) boli vytvorené na tvorbu nevyhnutných DNA fragmentov na subklonovanie. „Negatívny“ primér pre 5' konce domény 1 (HI4-D1(S), SEQ ID NO: 29) bol vytvorený na vyplnenie 39 párov báz domény 1 chýbajúcich v klone #34. Priméry HI4-D1(S) (SEQ ID NO: 29) a HI4-D3(AS) (SEQ ID NO: 30) boli použité na tvorbu DNA fragmentov kódujúcich domény 1 až 3 ľudského ICAM-4 zodpovedajúce oblasti, v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 130 k nukleotidu 996. Priméry HI4-D(3) (SEQ ID NO: 31) a HI4-D8(AS) (SEQ ID NO: 32) boli použité na vytvorenie DNA fragmentov kódujúcich domény 4 až 8 ľudského ICAM-4 zodpovedajúce oblasti v SEQ ID NO: 30 do nukleotidu 997 do nukleotidu 2268. Každý 5' primér kódoval BamHI reštrikčné miesto (CGATCC, uvedené hrubo) a každý 3' (pozitívny) primér obsahoval Xhol miesto (CTCGAG, uvedené hrubo) na uľahčenie subklonovania 5' do IgGl génu. Všetky oligonukleotidy obsahujú spacerované nukleotidy (podčiarknuté) a 5' konce na uľahčenie reštrikčného štiepenia.

HI4-D1(S) (SEQID NO: 29) GTACTTACAGGATCCGCGGTCTCGCAGGAGCCCCTT CTGGGCGGACCTACAGCCTGCGTGGCGTTC

HI4-D3(AS) (SEQ ID NO: 30) ATTTCTCTCGAGGATGGTCACGTTCTCCCGG

HI4-D4(S) (SEQ ID NO: 31)

ATTTCTGGATCCTACAGCTTCCCGGCACCACTC

HI4-D8(AS) (SEQ ID NO: 32)

ATTTCTCTCGAGTTCCACGCCCACAGTGACGC

PCR reakcie boli uskutočnené v 50 μΐ objeme použitím puffov dodávaných firmou Perkin Elmer s AmpliTaq enzýmom. Priméry boli pridané v konečnej koncentrácii 10 pg/ml a všetky štyri dNTP boli obsiahnuté v koncentrácii 2 mM. Reakcie pokračovali v 30 cykloch zahrnujúcich krok denaturácie (94 °C počas 4 minút), temperácie (50 °C počas dvoch minút) a výdrž (72 °C počas jednej minúty). PCR produkty boli zviditeľné na agarózových géloch a a likvotné diely z každej reakcie boli použité na subklonovanie PCR produktov do vektora pCRII (Invitrogen, SanDiego, CA). Na detekciu prípadných chýb následkom amplifikačného procesu a na potvrdenie orientácie, bola uskutočnená sekvenčná analýza. Príslušné klony boli rozštiepené pomocou BanHI a Xhol a fragmenty boli separované pomocou elektroforézy na agarózovom géli. Purifikované fragmenty boli naviazané do pDCSl vektora predbežne štiepeného BamHI a Xhol a výsledné plazmidy sekvenované s cieľom potvrdenia správnej orientácie čítacieho rámca.

Ľudské ICAM-4 doména 1 až 3 a 4 až 8/IgGl fúzne proteíny boli získané nasledujúcou prechodnou transfekciou expresných plazmidov do COS7 buniek a izoláciou vylučovaného proteínu z kultivačného média. Transfekcia bola uskutočnená nasledujúcim spôsobom. Adhézne COS7 bunky, s približnou súdržnosťou 50 až 60 %, boli premyté pomocou CMF-PBS a potom uvedené do kontaktu s 10 až 15 pg plazmidovej DNA v 7,5 ml bezsérovom médiu Gibco, Gaithersburg, MD) obsahujúcom 6 pl 0,25 M chlórchinónu (Sigma, St. Luis, MO). Bolo pridaných ďalších 7,5 ml bezsérového média obsahujúceho 150 μΐ DEAE dextránu (50 mg/ml) (Sigma, St. Luis, Mo) a dosky boli inkubované 2 až 3 hodiny pred tým, ako bolo médium odstránené a nahradené 10 % DMSO (Mallinckrodt, McGaW Park, Illinois) v PBS. Po jednominútovej inkubácii bol roztok DMSO odstránený a nahradený čerstvým médiom obsahujúci 5 % PBS. Každá transfekcia zahrnovala niekoľko dosiek a uskutočnilo sa zhromaždenie médií zo všetkých buniek exprimujúcich rovnaký protein s cieľom izolácie proteínu.

Médiá boli zozbierané každé tri dni po prebehnutí 3 až 4 izolácií. Proteíny boli purifikované použitím 0,4 až 0,8 ml Procep A kolóny (Bioprocessing Ltd, England), predpripravenej pomocou 35 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5. Kultivačné médium bolo nanesené na kolónu dvakrát a pri rýchlosti prietoku menšej ako 60 objemov kolóny za hodinu. Kolóna bola premývaná raz 20 objemami kolóny Tris/NaCl pufra, 20 objemami kolóny 0,55 M dietanolamínu, pH 8,5 a 20 objemami kolóny 50 mM kyseliny citrónovej, pH 5,0. Fúzne proteíny boli eluované ako jednomililitrové frakcie použitím 50 mM kyseliny citrónovej s pH 3,0 a každá frakcia bola neutralizovaná 1/10 objemu 1 M Tris, pH 9,5. Koncentrácia proteínu bola zistená OD280, čistota bola stanovená použitím SDS-PAGE.

Bola zaznamenaná závažná kontaminácia hovädzím IgG (prítomným v FBS). Napriek tomu, že sa predpokladalo, že domény 1 až 3 fúzneho proteínu budú menšie než domény 4 až 8 fúzneho proteínu, obidve skupiny postupovali približne ako 90 kD. Jedno možné vysvetlenie pre toto zistenie je, že menšie domény 1 až 3 fúzneho proteínu môžu byť viac glykozylované než väčšie domény 4 až 8 fúzneho proteínu.

Navyše pri použití purifíkovaných proteínov na výrobu monoklonálnych protilátok, ktorá je opísaná, môžu byť tiež použité proteíny v adhéznych skúškach na identifikáciu ICAM-4 ligandov.

Príklad 14

Výroba monoklonálnych protilátok

Purifikovaný protein opísaný v príklade 13 bol použitý na vytvorenie monoklonálnych protilátok pri použití imunizačného postupu opísaného v príklade 6.

Slezina z myši #2250 (imunizovaná pomocou HulCAM-4Dl-3/IgGl) bola použitá na fúziu 172 a slezina z myši #2272 (imunizovaná pomocou HuICAM-4 D4-8/IgGl) bola použitá na fúziu 173. Použitý postup fúzie bol rovnaký ako v príklade 6. Bol uskutočnený skríning fúznych dosiek pomocou testu ELISA (v zásade opísaný v príklade 6) použitím HuICAM-4/IgGl fúzneho proteínu. Fúzne supematanty, ktoré rozpoznávali imunogénny proteín a žiadny iný, boli brané do úvahy na klonovanie. Ako sekundárny skríning bola použitá imunocytochémia na časti ľudského hipokampu.

Jeden primárny kloň z každej fúzie bol imunocytochemicky pozitívny a bol klonovaný. Jeden z týchto dvoch klonov počas klonovania prestal rásť, čím zostal len jeden sledovaný objekt, kloň 173E, ktorý bol odvodený od myši imunizovanej HuICAM-4 D4-8/IgGl. Hybridom 173 E bol deponovaný 1. júna 1992 v Američan Type Culture Collection, 1203 Parklawn Drive, Rockville, Myryland 20852 a bolo mu pridelené číslo HB11912.

Pri inej fúzii, uskutočnenej pomocou myši imunizovanej rozpustným fragmentom ICAM-4 zodpovedajúcom doménam 1 až 4, bolo zistené, že šesť klonov (179A, 179B, 179D, 179H, 1791 a 179K) je špecifických pre HuICAM-4 domény 1 až 4 (Dl-3). Všetkých šesť protilátok v sérii 179 sa viaže k dendritickým procesom v dantátnom gyre, rovnako ako vrstvám polymorfných a pyramidálnych buniek. Okrem dendritických procesov monoklonálna protilátka 179A navyše lipne k bunkám neurónov z týchto polôh. Ďalšie fúzie boli uskutočnené podobne za vzniku iných protilátok špecificky imunologický reagujúcich s jednotlivými oblasťami ICAM-4.

Príklad 15

Uskutočňovanie záchytných skúšok

Šesť monoklonálnych protilátok z fúzie 179 bolo testovaných v rôznych kombináciách na ich schopnosti zachytávať a detegovať rozpustný ICAM-4 v roztoku. Tieto skúšky, ako sú opísané, boli uskutočnené, aby sa vyhodnotili úrovne rozpustného ICAM-4 v telesných tekutinách ľudí vo vzťahu k normálnym a chorobným podmienkam.

Protilátka 1791 bola nanesená na jamkové dosky Immunolon 4 (Dynatech) 96 v množstve 3 μΙ/ml, 125 μΙ/jamku počas dvoch hodín pri 37 °C. Roztok protilátok bol odstránený odsatím a jamky boli blokované 30 minút pri izbovej teplote pomocou 300 μΐ blokovacieho roztoku obsahujúceho 5 % Teleosteanovej želatíny v bezkalciovom bezhorečnanovom PBS (SMS-PBS). Blokovací roztok bol odstránený odsatím a 100 μΐ kvapaliny zo vzorky rozriedenej v Ommi Diluent (CMF-PBS, 1 % želatíny a 0,05 % Tween 20) bolo pridaných do každej jamky a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 30 minút. Dosky boli premyté trikrát PBST (CMF-PBS, 0,05 % Tween 20). Protilátka 179H bola biotinylovaná v 1,5 mg/ml pri použití NHS-LC-Biotin (Pierce) podľa návodu výrobcu, zriedenom 1 : 2000 a pridanom do jamiek (100 μΙ/jamku). Výsledná zmes bola inkubovaná 30 minút pri 37 °C a dosky boli premyté trikrát PBST. Do každej jamky bol pridaný Streptavidín-HRP (Pierce) (100 μΐ, 0,25 pg/ml) a táto zmes bola inkubovaná pri 37 °C 30 minút. Dosky boli premyté štyrikrát PBS, potom bolo pridaných 100 μΐ Tetrametylbenzidínu (Sigma) (10 mg/ml zásobného roztoku v DMSO) zriedenom 1 : 100 v pufrovanom substráte (13,6 g/L trihydrátu acetátu sodného, pH upravene na 5,5 pomocou 1 M kyseliny citrónovej, so 150 μΙ/L 30 % peroxidu vodíka pridaného bezprostredne pred reakciou). Reakcia bola ponechaná, aby prebiehala 30 minút pri izbovej teplote v temne a potom bola reakcia zastavená prídavkom 50 μΙ/jamku 15 % kyseliny sírovej. Bola zistená absorbancia pri 450 nm.

Výsledky naznačujú, že skúška bola schopná detegovať rozpustný HuICAM-4 D1-3 rekombinantný proteín v tak nízkych koncentráciách, ako 5 až 10 mg/ml, s tým, že lineárna časť krivky je v rozmedzí 10 až 100 ng/ml. Pri koncentrácii 1 až 10 pg/ml nebola zistená žiadna krížová reaktivita s HuICAM-4 D4-8.

Príklad 16

Stanovenie rozpustného ICAM-4 v sére pacientov s mŕtvicou

S cieľom zistenia úlohy ICAM-4 v neurologických chorobách a stavoch bolo analyzované sérum od dvadsiatich ôsmich pacientov trpiacich mŕtvicou a dvadsiatich mladých zdravých dobrovoľníkov (bez udania veku), ako je opísané, na rozdiely v koncentrácii rozpustného ICAM-4.

Výsledky ukazujú, že sérum od zdravých dobrovoľníkov neobsahovalo detegovateľnú úroveň ICAM-4. Dvadsať z dvadsiatich ôsmich pacientov s akútnou mŕtvicou však malo detegovateľné množstvo ICAM-4. Signál u pacientov s mŕtvicou zodpovedá intervalu 5 až 38 ng/ml štandardu (rozpustného ICAM-4 D1-3 rekombinantného proteínu).

Príklad 17

Úroveň ICAM-4 mRNA v hipokampe pri potkaňom modeli epilepsie

Úrovne expresie potkanej ICAM-4 mRNA boli zisťované v hipokampe potkanov ošetrených takým spôsobom, aby sa pri nich vytvoril model vyvolanej zvieracej epileptogenézy [Lothman a kol., Brain Res. 360: 83 - 91 (1985)]. V tomto modeli je potkaní hipokampus stimulovaný sériou subkonvulzívnych elektrických šokov pomocou elektród implantovaných do tejto oblasti mozgu, ktoré postupne vyvolávajú ťažké záchvaty. Proces vyvolávania stavu zahrnoval dvanásť stimulácií za deň, uskutočňovaných každý druhý deň počas ôsmich dní. Po úplnom rozvinutí môže jeden stimul vyvolať záchvat a histologické zmeny, ktoré sú podobné ľudskej epilepsii. Potkany, po prebehnutí procesu vyvolania, boli podrobované dvom stimuláciám za deň počas dvoch týždňov a 24 hodín po poslednej stimulácii boli usmrtené. Hipokampus bol odstránený a rozdelený na prípravu RNA.

Z každej vzorky bola pripravená kompletná RNA pri použití guanidinum/fenol/chloroformového extrakčného postupu [Chomezynski a Sachi. Anál, biochem. 162: 156 až 159 (1987)]. RNA bola separovaná na denaturujúcich formaldehydových agarózových géloch, premiestená na nylonové membrány a hybridizovaná pomocou rádioaktívne značených sond potkanieho ICAM-4 a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázovej (GAPDH) špecifickej sondy DNA. GAPDH je bazálne exprimovaný gén, ktorý je bežne používaný ako kontrola na detekciu zmien reťazcov v množstve RNA nanesených na gél.

Výchylky v pomere ICAM-4/GAPDH sú interpretované ako zmeny v úrovni expresie ICAM-4. Hybridizačné pásma pre ICAM-4 a GAPDH boli kvantitatívne určené pomocou phosphorimageru a bol stanovený pomer ICAM-4/GAPDH.

Pomer ICAM-4/GAPDH bol významne vyšší pri kontrolných zvieratách, ktoré neboli podrobené procedúre vyvolania záchvatu (n = 5) v porovnaní so skupinou, pri ktorej prebehla, čo naznačuje, že ICAM-4 bol nižší ako dôsledok procesu vyvolania záchvatu. Je potrebné však poznamenať, že kontrolná skupina sa nepodrobila žiadnemu ošetreniu, takže existuje možnosť, že úrovne ICAM-4 mRNA boli vytvorené ako odpoveď na chirurgické zákroky spojené s procesom vyvolávania záchvatu.

Príklad 18

Klonovanie a analýza regulačnej DNA proti smeru expresie génu ľudského ICAM-4

Génová expresia ICAM-4 je priestorovo a časovo regulovaná expresiou limitovanou do najviac prednej alebo ventrálnej oblasti mozgu telencefalónu. Nukleotidová oblasť 5' kódujúcej sekvencie ľudského ICAM-4 bola skúmaná v pokusoch identifikovania génových sekvencií zodpovedných za reštrikčnú transkripčnú reguláciu ICAM-4.

A 2607 pár báz fragmentu BamHI/Pstl odvodeného od genómového 7 kb fragmentu BamHI (opísaný v príklade 10) bol sekvenovaný a bolo nájdených 1684 nukleotidov proti smeru expresie génu štartovacieho kodónu ATG. Kompletná sekvencia pre túto oblasť proti smeru expresie génu je vyobrazená v SEQ ID NO: 33. Vzhľadom na pozíciu kódujúcej oblasti pre ICAM-4 je „A“ v ATG štartovacom kodóne (očíslovaný v SEQ ID NO: 33 ako nukleotidy 1685-1687) označený +1 nukleotid a nukleotid najbližší oblasti 5' k nukleotidu A⁺¹ je označený -1. Celková sekvencia je teda ukázaná ako tá, ktorá siaha od nukleotidu 1684 až k nukleotidu +3, čo zodpovedá číslovaniu v zozname sekvencií nukleotidov od 1 do 1687 nukleotidu.

Na základe genómovej sekvencie HuICAM-4 boli nukleotidy syntetizované používané v PCR na vytvorenie molekúl DNA s rôznymi dĺžkami v rozmedzí proti smeru expresie regulačnej oblasti génu. Každý oligonukleotid vystavený v tabuľke 3 obsahuje integrovanú oblasť (vyznačené kurzívou) približne 6 - 10 bp, aby umožnila enzymatické štiepenie produktu PCR, Nhe\ alebo HindlII reštrikčné miesto (vyznačené hrubo) a špecifickú hybridizáciu sekvenciu sekvencie priméru (vyznačené podčiarknuto). Oligonukleotidové mená obsahujú čísla, ktoré označujú ich lokalizáciu v rozmedzí proti smeru expresie regulačnej oblasti. V PCR amplifikáciách boli oligonukleotidy párované, ako je ukázané v tabuľke 4, aby vytvorili fragmenty DNA obsahujúce špecifické oblasti proti smeru expresie regulátorovej oblasti génu.

buniek použitím transfekcie (MBS) transfekčnou cicavčou jednotkou (Stratagene, La Jolla, CA) podľa návodu použitia daného výrobcom. Každý plazmid bol zavedený do dvoch odlišných bunkových línií, COS 7 a NT2 prekurzorových buniek (Ntera2/Dl zo Stratagene). COS 7 bunky sú bežne používané opičie bunkové línie podobné fibroblastu transformované promótorom SV40, ktorý ich vytvorí vhodnými na riadenie expresie génu pod kontrolou promótora SV40 v bunkách transfektovaných pozitívnym kontrolným promótorovým vektorom pGL3. Prekurzorové bunky NT2 sú zacielenou nervovou prekurzorovou bunkovou líniou a zatiaľ čo neexprimujú ICAM-4, môžu byť reprezentantmi bunkového typu, ktorý exprimuje ICAM-4.

Tabuľka 4

Párové priméry a ampliftkované oblasti oli9Qnukleatidové páry

H14-19CAS)

H14-19(AS>

H14-19(AS)

H14-19<AS)

H14-19ÍAS)

H14-19CAS)

H14-19(ftS) s H14-149 s H14-206 s H14-270

H14-408

H14-480

H14-19(AS) s H14-817 zodpovedajúcu regulátorová oblasť proti smeru expresie génu

-19’

-19’

-19’

-19’

-19’

-19’

114

149

206

270

408

480

560

-19 >-817

Tabuľka 3

PCR priméry používané na amplifikáciu HuICAM-4 oblastí proti smeru expresie génu

H14-19(AS)	OIGAACTAAGCTT&CAGCACDCCACÚADAGCDCSAS SEQ 10 NO: 34
H14 -114	CMCMrcCTAGCCXMCGCAACTCTCTCTS SEQ ID HO, 35
H14-149	CAACAATGCTAGCCTTGGAAACCAAGTTACC SEQ ID NO: 36
H14-2D5	CAACAATGCTAGCAGGAGCTTAGCGCACGCTCfi SEQ ID HO: 37
H14-27Ô	CAA<^TCCTMC»TCCC«5CCTCCÄCGTM SEO ID HO: 38
H14-408	CAACAATGCTACCDTCCACCTTATTATCATQ SEQ ID HO: 33
H14-430	CAACAAreCTAGCCTTAGTOOXAAATCTATC SEQ ID HO: 40
H14-560	CAACAATGCTAGCSGAGÄAGGATCAGTGAG SEQ ID NO: 41
H14-817	CAACAATOCTAGCCTCCACCCACCGAGCAGAAG SEQ ID NO: 42

Každá jamka šesťjamkovej doštičky potiahnutej tkanivovou kultúrou (Falcon) bola zaočkovaná 2,5 x 10⁵ bunkami. Transfekcie buniek CMS 7 a NT2 boli uskutočnené tesne pri sebe v dvojitom vyhotovení použitím 5 pg plazmidu pre každú jamku. Bunky boli kultivované pri 37 °C, počas 48 hodín, lýzované a testované na aktivitu luciferázy pomocou systému Luciferase Assay Systém (Promega).

Výsledky týchto experimentov, ktoré sú prehľadne uvedené v tabuľke 5, indikujú vysokú úroveň promótorovej aktivity, ktorá sa nachádza v oblastiach 408 až do -19 a -480 až do -19 regulátorovej oblasti proti smeru expresie génu v bunkách NT2 ICAM-4. Pretože bunky NT2 majú nervový pôvod, môžu exprimovať transkripčné faktory, ktoré rozpoznávajú promótor ICAM-4, ktoré nie sú nájdené v ostatných bunkových typoch. Najvyššia úroveň promótorovej aktivity v COS bunkových transfektantoch bola docielená plazmidom, ktorý obsahuje nukleotidy -560 až do -19. Zatiaľ čo pozitívny kontrolný promótorový vektor pGL3 pracuje dobre v bunkách COS, ukazuje sa veľmi nízka promótorová aktivita v bunkách NT2, čo ilustruje špecifickú preferenciu bunkového typu pre určité promótorove sekvencie.

Reštrikčné miesta a intergenová oblasť, generované vnútri každého nukleotidu, umožňujú enzymatické štiepenie a nasledujúce priame klonovanie individuálneho produktu PCR do nákladného vektora pGL3 (Promega, Madison, WI), ktorý obsahuje reportérový gén luciferázy bezprostredne exprimovaný v smere expresie génu viacnásobného klonovacieho miesta (MCS). Promótorová aktivita klonovaná do oblasti MCS vektora riadi expresiu reportérového génu luciferázy v transfektovaných bunkových líniách a slabá produkcia z exprimovanej luciferázy môže byť meraná ako indikátor promótorovej aktivity. Základný vektor pGL3 nemá promótor a preto slúži ako negatívna kontrola, zatiaľ čo vektor pGL3 obsahujúci promótor SV40 slúži ako pozitívna kontrola. Sekvencia každého expresívneho konštruktu bola prekontrolovaná pomocou reštrikčnej analýzy a sekvenovaním DNA.

Plazmidy obsahujúce každú z amplifikovaných sekvencií opísaných v tabuľke 4 boli transfektované do cicavčích

Tabuľka 5

Promótorová aktivita 5' oblastí ICAM-4

oblasť proti smeru expresie génu	luminiscencia
COS	NT2
-114 až do -19	0, 003	0, 376
-149 až do -19	0, 008	0. 628
-206 až do -19	0, 443	0, 622
-270 až do -19	0, 056	1, 140
-408 až do -19	0. 401	7, 970
-480 až do -19	0, 274	4.630
-560 až do -13	3, 227	1, 232
-817 až do -19	0. 035	4. 4S3
pGL3 promútorový vektor	29, 070	0. 063
pGL3 promótorový vektor	0, 008	0, 014

Pretože ani COS ani NT2 bunky normálne neexprimujú ICAM-4, bol opakovaný rovnaký experiment použitím pôvodne kultivovaných potkaních neurónov hipokampu, ktoré exprimujú ICAM-4 a bezpodmienečne exprimujú transkripčnú mašinériu požadovanú pre promótorovú aktivitu ICAM-4. Pomocou transfekcie jednotlivých promótových konštruktov tu opísaných, ako aj ostatných, do prirodzenejšieho prostredia, môže byť pravdepodobné identifikovať presnejšie, ktoré nukleotidy v regulátorovej oblasti proti smeru expresie génu sú zodpovedné za pevne stanovenú reguláciu génu ICAM-4 v mozgu.

Predtým uvedené ilustratívne príklady sa týkajú súčasne preferovaných realizácií vynálezu a ich početné modifikácie a variácie budú očakávané v rovnakej realizácii aj pre odborníka, ktorý sa vyzná v stave techniky. Teda len takéto obmedzenie, ako sa prejavuje v pripojených nárokoch, by malo byť zaznamenané v rozsahu predloženého vynálezu.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

(i) prihlasovateľ: Gallatin, W. Michael

Kilganon, Patric D.

(ii) názov vynálezu: ICAM-4 materiály a metódy (iii) počet sekvencii: 42 (iv) korešpondenčná adresa:

(A) adresát: Marshall, O’ Toole, Gestein,

Murray & borun (B) ulica: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears

Tower (C) mesto: Chicago (D) štát: Illinois (E) krajina: United States of America (F) PSC: 60606-6402 (v) počítačovo čitateľná forma:

(A) typ média: floppy disk (B) počítač: kompatibilný s IBM PC (C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) softvér: Patent/In Release #1.0, verzia #1.25 (vi) údaje o súčasnej prihláške:

(A) číslo prihlášky:

(B) dátum podanie:

(C) klasifikácia:

(vii) údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 07(827, 689 (B) dátum podanie: 27. 1. 1992 (vii) údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 07/889, 724 (B) dátum podania: 26. 5. 1992 (vii) údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 07(894, 061 (B) dátum podania: 5. 6. 1992 (vii) údaje o predchádzajúce prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 08/009, 266 (B) dátum podania: 22. 1. 1993 (vii) údaje o predchádzajúce prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 08/102, 852 (B) dátum podania: 5.8. 1993 (vii) údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 08/245,295 (B) dátum podania: 18. 5. 1994 (vii) údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) číslo prihlášky: US 08/485, 604 (B) dátum podania: 7. 6. 1995 (viii) informácie o zástupcovi/agentovi:

(A) meno: Williams, JR. Joseph A.

(B) registračné číslo: 38, 659 (C) garant/číslo registra: 27866/33321 (ix) telekomunikačné informácie:

(A) telefón: 312-474-6300 (B) telefax: 312-474-0448 (C) telex: 25-3856 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 1:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 2988 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (ix) charakteristika:

(A) názov/kľúč: CDS (B) umiestenie: 61..2814 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

360

ATG

CCG

GGG

CCT

TCA

CCA

GGG

CTG

CGC

CGA

ACC

CTC

CTC

GGC

CTC

TGG

108

Het

Pro

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Leu

Arg

Arg

Thr

Leu

Leu

Gly

Leu

Trp

1

5

10

15

GCT

GCC

CTG

GGC

CTG

GGG

ATC

CIA

GGC

ATC

TCA

GCG

GTC

GCG

CTA

GAA

156

Ala

Ala

ku

Gly

Leu

Gly

íle

Leu

Gly

íle

Ser

Ala

Val

Ala

Leu

Glu

20

25

30

CCT

TTC

TGG

GCG

GAC

CTT

CAG

CCC

CGC

CTG

GCG

CTC

GTG

GAG

CGC

GGG

204

Pro

Phe

Trp

Ala

Asp

Leu

Gin

Pro

Arg

Val

Ala

Leu

Val

Glu

Arg

Gly

35

40

45

GGC

TCG

CTG

TGG

CTC

AAC

TGC

AGC

ACT

AAC

TGT

CCG

AGG

CCG

GAG

CGC

252

Gly

Ser

Leu

Trp

Leu

Asn

Cys

Ser

Thr

Asn

Cys

Pro

Arg

pro

Glu

Arg

SO

55

50

GGT

GGC

CTG

GAG

ACC

TCG

CTA

CGC

CGA

AAC

GGG

ACC

CAG

AGG

GGT

CTG

300

Gly

Gly

Leu

Glu

Thr

Ser

Leu

Arg

Arg

Asn

Gly

Thr

Gin

Arg

Gly

ku

65

70

7S

BO

CGC

TGG

CTG

GCT

CGA

CAG

CTG

CTG

GAC

ATC

CGA

GAG

CCT

GAA

ACC

CAG

348

Arg

Trp

Leu

Ala

Arg

Cln

Leu

Val

Asp

íle

Arg

Glu

Pro

Glu

Thr

Gin

85

SO

95

CCC

CTC

TCC

TTC

TTC

CCC

TCC

GCG

CGC

CCC

ACA

CTC

CAA

CCG

CCT

GGG

396

Pro

Val

Cys

Pha

Phe

Arg

Cys

Ala

Arg

Arg

Thr

Leu

Gin

Ala

Arg

Gly

100

105

110

CTC

ATC

CGA

ACT

TTC

CAG

CGA

CCG

CAT

CGG

GTA

GAG

CTA

GTG

CCT

CTG

<444

Leu

íle

Arg

Thr

Phe

Gin

Arg

Pro

Asp

Arg

val

G1U

Leu

Val

Pro

Leu

115

120

125

CAG

TTA

ÁÄT

GTC

ACA

JUG

AAT

GAC

GAC

AAG

CGG

GGC

TTC

TTC

TGC

GAC

1212

Gin

Leu

A*n

Val

Thr

Ly·

Asn

Aep

Aep

Lys

Axg

Gly

Ph·

Phe

Cys

Asp

370

175

360

GCT

GCC

CTC

GAT

GTG

GAC

GGG

GAA

ACT

CTG

AGA

AAG

AAC

CAG

AGC

TCT

12(0

Ala

Ala

Uu

A»p

Val

A»p

Cly

Clu

Thr

Leu

Arg

tya

Asn

Gin

Ser

Ser

165

390

395

400

GAG

CTT

CGT

GTT

CTG

TAC

GCA

CCT

CGG

CTG

GAT

GAC

TTG

GAC

TGT

CCC

1308

Glu

Leu

Arg

Val

Leu

Tyr

Ala

Pro

Axg

Leu

A*p

Aep

Leu

Asp

Cy.

Pro

405

UO

415

AGG

AGC

TGG

ACG

TGG

CCA

GAG

GGT

CCA

GAG

CAG

ACC

CTC

CAC

TGC

GAG

1356

Axg

Ser

Trp

Thr

Trp

Pro

Glu

Gly

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

His

Cys

Glu

420

425

<30

GCC

CCT

GGA

AAC

CCT

GAG

CCC

TCC

GTG

CAC

TGT

GCA

AGG

CCT

GAC

GGT

1404

Ala

Arg

Gly

Α1Π

Pro

Glu

Pro

Ser

Val

Nís

Cye

Ala

Arg

Pro

Asp

Gly

«35

440

445

GGG

GCG

GTG

CTA

GCG

CTG

GGC

CTG

TTG

GGT

CCA

GTG

ACC

CGT

GCC

crc

2452

Gly

Ala

Val

beu

Ala

Leu

Cly

Leu

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Arg

Ala

Leu

«50

455

46P

GCG

GGC

ACT

TAC

CGA

TGT

ACA

GCA

ATC

AAT

GGG

CAA

GGC

CAG

GCG

GTC

1S00

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

Thr

Ala

Ila

Asn

Gly

Gin

Cly

Gin

Ala

Val

<45

470

47S

480

AAG

GAT

GTG

ACC

CTC

ACT

GTG

GAA

TAT

GCC

CCA

GCG

CTG

GAC

AGT

GTA

1548

Ly.

Asp

val

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

Tyr

Ala

Pro

Ala

Leu

Asp

Ser

Vel

<85

450

<95

GGC

TGC

CCA

GAA

CGT

ATT

ACT

TGG

CTG

GAG

GGG

ACA

GAG

CCA

TCG

CTT

1598

Gly

Cys

Pro

Slu

Arg

íle

Thr

Trp

Leu

Glu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ser

Leu

500

SOS

S10

AGC TGT GTC GCA CAC GGG GTC CCA CCA CCT AGC CTG ACC TCT GTG CGC

1644

Ser

Cys Val 515

Ala His

Gly

Val Pro 520

Pro

Pro Ser val ser Cys Val Axg 52S

TCT

GGA

AAG

GAG

GAA

GTC

ATG

GAA

GGG

CCC

CTG

CGT GTG GCC 1

CGG <

1ÄG

2692

Ser

Gly

Lys

Glu

Glu

Val

Het

Glu

Gly

Pro

Leu

Arg Val Ala i

Axg l

Clu .

530

535

540

CAC

GCT

GGC

ACT

TAC

CGA

TCC

GAA

GCC

ATC

AAC

CCC AGG GGA '

rCÄ i

CCG

1740

His

Al*

Gly

Thr

Tys

Axg

Cye

Clu

Ala

Íle

Asn .

Ala Axg Gly 1

Ser Ala

$45

550

555

$60

GCC

AAA

AAT

GTC

GCT

GTC

ACG

GTG

GAA

TAT

GGT

CCC AGT TTT i

3AG <

3AG

1788

Ala

Lys

Asn

Val

Ala

Va2

TTtr

Val

Glu

Tyr

Gly

Pro Ser Phe <

Slu Glu

565

570

575

TTG

GGC

TCC

CCC

ACC

AAC

TCG

ACT

TCG

GTA

GAA 1

GGA TCT GGA AAA 1

CTC

1836

Uu

Gly

cy«

Pro

Ser

Axn

Trp

Thr

Trp

Val

Glu

Gly Str Gly ;

Lye 1

Leu

580

585

590

TTT

TCC

TGT

GAA

GTT

GAT

GGG

AAG

CCG

GAA

CCA 1

CGC GTC GAG TGC GTG

1884

Phe

Ser

Cys

Glu

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Glu

Pro .

Axg Val Glu <

/al

cae

ÍOO

605

GGC

TCG

GAG

GGT

GCA

AGC

GAA

GGG

GTA

GTG

TTC

CCC

CTU

STO

tcc

TCG

1932

Gly

Ser

Glu

Gly

Ala

Ser

Glu

Gly

Val

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ser

Ser

610

615

620

AAC

TCT

GGT

TCC

AGA

AAC

TCT

ATG

ACT

CCT

GGT

AAC

CTC

TCA

CCG

GGT

1980

Asn

Sar

Gly

ser

Arg

Asn

Ser

Met

Thr

Pro

Gly

Asn

Leu

Ser

Pro

Gly

62$

630

635

640

ATT

TAC

CTC

TGC

AAC

GCC

ACC

AAC

CGS

CAT

GGC

TCC

ACA

GTC

AAA

ACA

2036

Xle

Tyr

Leu

Cys

Asn

Ala

Thr

Asn

Arg

Hi.

Gly

Ser

Thr

val

Ly.

Thx

645

6SO

655

GTC

CTC

CTC

ACC

ccs

CAA

TCA

CCG

CCA

CAG

ATG

GAT

GAA

TCC

AGT

TGC

2076

Val

val

Val

Ser

Al*

Clu

Ser

Pro

Pro

Gin

Met

Asp

Glu

Ser

Ser

cys

660

665

670

CCG

AGT

CAC

CAG

ACA

TCG

CTG

GAA

GGA

GCC

GAG

GCT

ACT

GCG

CTG

GCC

2124

Pro

Ser

Kí s

Gin

Thr

Trp

Leu

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

Thr

Ala

Leu

Ala

675

6S0

685

TGC

AGT

GCC

AGA

GCC

CGC

CCC

TCT

CCA

CCC

GTG

CCC

TGT

TCC

AGG

GAA

2172

Cys

Ser

Ala

Arg

Cly Arg

Pro

Ser

Pro

Axg

Val

Arg

cys

Ser

Arg

Glu

690

695

700

GGT

GCA

GCC

AGG

CTC

GAG

AGG

CTA

CAG

GTG

TCC

CGA

GAG

GAT

GCG

GGG

2220

Gly

Ala

Ala

Arg

Leu

Glu

Arg

Leu

Cln

Val

Ser

Arg

Glu

Asp

Ala

Gly

705

730

715

720

ACC

TAC

CTC

TGT

GTC

CCT

ACC

AAC

GCG

CAT

GGC

ACG

GAT

TCA

CGG

ACC

2268

Thr

Tyr

Leu

Cys

Val

Ala

Thr

Asn

Ala

Hi.

Gly

Thr

Asp

Sex

Arg

Thr

725

730

735

GTC

ACT

GTG

GGT

GTG

GAA

TAC

CGG

CCT

GTG

GTG

GCT

GAG

CTC

GCA

GCC

2316

Val

Thr

Val

Gly

Val

Glu

Tyr

Arg

Pro

Val

Val

Ala

Glu

Leu

Ala

Ala

740

745

750

TCG

CCC

eCA AGC

GTC

CGG

CCT

CGC

GGA

AAC

TTC

ACT

CTG

ACC

TCC.

.CGT

2164

Ser

Pro

Pro

Ser

Val

Arg

Pro

Cly

Gly

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

Cye

Arg

75S

760

765

GCA

GAG

GCC TGG

CCT

CCA

CCC

CAG

ATC

AGC

TGG

CGC

GCG

CCC

CCG

GGA

2432

Ala

Glu

Ala

Trp

Pro

Pro

Ala

Gin

íle

Ser

Trp

Arg

Ala

Pro

Pre

Gly

770

77S

7B0

CCT

CTC

AAC

CTC

GCT

CTC

TCC

ACC

AAC

AAC

AGC

ACG

CTG

AGC

GTG

GCG

2460

Ala

Leu

Asn

Leu

Gly

Leu

Ser

Ser

Asn

Asn

Ser

Thr

Leu

Ser

Val

Ala

785

750

795

800

GGT

GCC

ATG

GGC

AGC

CAT

CGT

CGC

GAG

TAT

GAG

TGC

GCA

GCC

ACC

AAT

2508

Gly

Ala

Het

Gly

Ser

Kis

Gly

Gly

Glu

Tyr

Glu

cy.

Ala

Ala

Thr

Asn

805

810

81S

CCG

CAT

GGG

CGC

CAC

GCA

CGG

CGC

ATC

ACG

GTC

CGC

GTG

GCC

GGT

CCA

3556

Ala

His

Gly

Arg

His

Ala

Arg

Arg

íle

Thr

Val

Arg

Val

Ala

ciy

Pro

820

B25

830

TGG

CTG

TCG

GTC

GCT

GTC

GGC

GGT

GCG

GCA

GGG

GGC

GCG

CCG

CTC

CTC

2604

Trp

Leu

Trp

Val

Ala

Val

Gly

Cly

Ala

Ala

Gly Gly

Ala

Ala

Leu

Leu

e

35

•

GCC

GCA

GGG

GCC

GGC

CTO

GCC

TTC

TAC

GTC

CAG

TCC

ACC

GCT

TGC

AAG

2652

Ala

Ala

Gly

Ala

Gly

Leu

Ala

Phe

Tyr

Val

Gin

Str

Thr

Al*

cys

Lys

B50

8S5

860

AAG

GGA

GAG

TAC

AAC

GTC

CAG

GAG

GCT

GAG

AGC

TCA

GGC

GAG

GCG

GTG

2700

Ly.

Gly

Glu

Tyr

Aan

Val

Gin

Glu

Ala

Glu

Ser

Ser

Gly

Glu

Ala

Val

165

870

875

880

TGT

CTC

AAT

GGC

GCG

GGC

GGG

ACA

CCG

GGT

GCA

GAA

GGC

GGA

GCA

GAG

274 8

cys

Leu

Ara

Gly

Ala

Gly

Gly

Thr

Pre

Gly

Ala

Glu

Gly

Gly

Ala

Glu

885

890

85$

ACC

CCC

GGC

ACT

GCC

GAG

TCA

CCT

GCA

GAT

GGC

GAG

GTT

TTC

GCC

ATC

2796

Thr

Pro

Gly

Thr

Ala

Glu

Ser

Pro

Ala

Asp

Gly

Glu

Val

Phe

Ala

Zle

900

905

910

(2) Informácie pre SEQ ID MO: 2:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 917 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Met Pro Gly Pro Ser Pro Gly Leu Arg Arg Thr Leu Leu Gly Leu Trp 15 1015

Ale Ale Leu Gly Leu Gly íle Leu Gly íle Ser Ale Val Ala Leu Glu 20 2530

Pro Phe Trp Ala Asp Leu Gin Pro Arg Val Ala Leu Val Glu Arg Gly 15 <045

Gly Ser Leu Trp Leu Asn Cys Ser Thr Asn Cys Pro Arg Pro Glu Arg

55 .(0

Cly Gly Leu Glu Thr Ser Leu Är9 Arg Asn Gly Thr Gin Arg GlyLeu

70 75SO

Arg Trp Leu Ala Arg Gin Leu Val Asp íle Arg Glu Pro Glu ThrGin

3095

Pro Val Cys Phe Phe Arg Cys Ala Arg Arg Thr Leu Gin Ala Arg Gly 100 105110

Leu Xle Arg Thr Phe Gin Arg Pro Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Leu 115 120125

Pro Pro Trp Gin Pro Val Gly Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val DO 135U0

Pro

Gly

Ala

Gly

Pro

Arg

Ala

Ser

Uu

Thr

Uu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

145

150

155

160

Gly

Gin

Glu

Leu

íle

Arg

Arg

Ser

Phe

Val

Gly

Glu

Pro

Pro

Arg

Ala

165

170

175

Arg

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Ala

Thr

Val

U u

Ala

Arg

Axg

Glu

Asp

HÍS

180

1B5

190

Arg

Ala

Asn

Phe

Ser

Cys

Leu

Ala

Glu

Leu

Asp

Uu

Axg

Pro

His

Gly

195

200

205

Leu

Gly

Leu

Phe

Ala

Asn

Ser

Sex

Ala

Pro

Arg

Gin

Leu

Arg

Thr

Phe

210

215

220

Ala

Met

Pro

Pro

Leu

Ser

Pro

Ser

Uu

ne

Ala

Pro

Arg

Phe

Uu

Glu

225

230

235

240

val

Gly

Ser

Glu

Axg

Pro

val

Thr

Cys

Thr

Uu

Asp

Gly

Uu

Phe

Pro

24S

250

255

Ala

Pro

Glu

Ala

Gly

Val

Tyr

Leu

Ser

Uu

Gly

Asp

Gin

Arg

Uu

His

250

265

270

Pro

Asn

Val

Thr

Leu

Asp

Cly

Glu

Ser

Uu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

215

280

285

Thr

Ala

Ser

Glu

Glu

Gin

Glu

Gly

Thr

Lys

Gin

Leu

Met

cys

íle

Val

290

295

300

Thr

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Arg

Glu

Thr

Gin

Glu

Asn

Uu

Thr

Val

Tyr

305

310

315

320

Ser

Phe

Pro

Ala

Pro

Leu

Uu

Thr

Uu

Ser

Glu

Pro

Glu

Ala

Pro

Glu

325

330

335

Gly

Lys

Met

Val

Thr

Val

Ser

Cys

Tip

Ala

Gly

Ala

Arg

Ala

Leu

Val

340

345

350

Thr

Leu

Glu

Gly

íle

Pro

Ala

Ala

Va)

Pro

Gly

Gin

Pro

Ala

Glu

Uu

355

360

36S

Gin

Leu

Asn

Val

Thr

Lys

Asn

Asp

Asp

Lys

Arg

Gly

Phe

Phe

Cys

Asp

370

375

380

Ala

Ala

Leu

Asp

Val

ASp

Gly

Glu

Thr

Uu

Arg

Lys

Asn

Gin

Ser

Ser

385

390

395

400

Glu

Leu

Arg

Val

Leu

Tyr

Ala

Pro

Arg

Uu

Asp

Asp

Leu

Asp

cys

Pro

405

410

415

Arg

Ser

Trp

Thr

Trp

Pro

Glu

Gly

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

HÍG

Cys

Glu

420

<25

430

Ala

Arg

Gly

Asn

Pro

Glu

Pro

Ser

Val

His

Cys

Ala

Arg

Pro

Asp

Gly

435

440

445

CAG CTG ACA TCT TCC TGÄSCCTGTA TCCäGCTCCC CCäGGOGCCT CGAMJ5CACA Gin Leu Thr Ser Ser

915

2851

GGGGTGGACG TÄTOTATTGT TCACTCTCTA TTTÄTTCAAC TCCAGGGGCG TCGTCCCCGT 2911

TTTCTACCCA TTCCCTTAAT ΑΛΑΟΓΓΓΣΤΑ TA5GAGAAÄA AAAAAAAAAA AAAXAAAAAA 2511

AAAAAAAAAA AAÄAAAA 2)88

Gly

’ Ala

Val

Leu

i Ala

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Arg

Ala

Leu

450

455

460

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

Thr

Ala

íle

Asn

Gly

Gin

Gly

Gin

Ala

Val

465

470

475

480

Lys

Asp

Val

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

Tyr

Ala

Pro

Ala

Leu

Asp

Ser

Val

485

490

49S

Gly

Cye

Pro

Glu

Arg

íle

Thr

Trp

Leu

Glu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ser

Leu

500

SOS

510

Ser

Cys

Val

Ala

His

Gly

Val

Pro

Pro

Pro

Ser

Val

Ser

Cys

Val

Arg

515

S2O

525

Ser

Gly

Lys

Glu

Glu

val

Met

Glu

Gly

Pro

Leu

Arg

Val

Ala

Arg

Glu

S30

535

S4O

His

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

Glu

Ala

Zle

Aan

Ala

Arg

Gly

Ser

Ala

545

550

555

560

Ala

Lys

Asn

Val

Ala

Val

Thr

Val

Glu

Tyr

Gly

Pro

Ser

Phe

Glu

Glu

565

570

575

Leu

Gly

Cys

Pro

Ser

Asn

Trp

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Ser

Gly

Lys

Leu

580

585

530

Phe

Ser

cye

Glu

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Glu

Pro

Arg

Val

Glu

Cys

Val

595

600

6 OS

Gly

Ser

Glu

Gly

Ala

Ser

Glu

Gly

Val

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ser

Ser

610

61S

620

Asn

Ser

Gly

Ser

Arg

Asn

Ser

Met

Thr

Pro

Gly

Asn

Leu

Ser

Pro

Gly

€25

(30

635

640

íle

Tyr

Leu

cys

Asn

Ala

Thr

Asn

Arg

His

Gly

Ser

Thr

Val

Lys

Thr

64 5

€50

6S5

Val

Val

val

Ser

Ala

Glu

Ser

Pro

Pro

Gin

Met

Asp

Glu

ser

Ser

cys

660

665

670

Pro

Ser

His

Gin

Thr

Trp

Leu

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

Thr

Ala

Leu

Ala

«75

680

685

Cys

Ser

Ala

Arg

Gly

Arg

Pro

Ser

Pro

Arg

Val

Arg

Cys

Ser

Arg

Glu

690

(95

700

Gly

Ala

Ala

Arg

Leu

Glu

Arg

Leu

Gin

Val

Ser

Arg

Glu

Asp

Ala

Gly

705

71D

715

720

Thr

Tyr

Leu

Cys

Val

Ala

Thr

Asn

Ala

His

Gly

Thr

Asp

Ser

Are

Thr

725

730

735

Val

Thr

Val

Gly

Val

Glu

Tyr

Arg

Pro

Val

Val

Ala

Glu

Leu

Ala

Ala

740

745

750

Ser

Pro

Pro

Ser

Val

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

Cys

Arg

755

760

765

Ala Glu Ala Trp Pro Pro Ala Gin Ila Ser Trp Arg Ala Pro Pro Gly 770 775780

Ala Leu Asn Leu Gly Leu Ser Ser Asn Asn Ser Thr Leu Ser ValAla

785 790 795800

Gly Ala Het Gly Ser His Gly Gly Glu Tyr Glu Cys Ala Ala ThrAsn

805 810815

Ala His Gly Arg His Ala Arg Arg íle Thr Val Arg Val Ala Gly Pro 820 825830

Trp Leu Trp Val Ala V,al Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu 835 840845

Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Val Gin Ser Thr Ala Cye Lys 850 855860

Lys Gly Glu Tyr Asn Val Gin Glu Ala Glu Ser Ser Gly Glu AlaVal

865 870 875680

Cys Leu Asn Gly Ala Gly Gly Thr Pro Gly Ala Glu Gly Gly AlaGlu

885 890895

Thr Pro Gly Thr Ala Glu Ser Pro Ala Asp Gly Glu Val Phe Ala íle 900 905910

Gin Leu Thr Ser Ser

915 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 3:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 315 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (ix) charakteristika:

(A) názov/kľúč: CDS (B) umiestenie: 1..315 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

CCG

GAT

CGG

GTA

GAG

CTA

GTG

CCT

CTC

CCT

CCT

TGG

CAG

CCT

GTA

GGT

48

Pro

Aj p

Arg

Val

Glu

Leu

Val

Pro

Leu

Pro

Pro

Trp

Gin

Pro

Val

Gly

1

S

10

1S

GAG

AÄC

TTC

ACC

TTC

AGC

TCC

AGG

G7C

CCG

CGG

GCA

GGA

CCC

CGA

GCG

36

Glu

Asn

Phe

Thr

Leu

Ser

cy»

Arg

val

Pro

Gly

Ala

Gly

Pro

Arg

Ala

20

25

30

ÄGC

CTC

ACA

TTC

ACC

TTC

CTC

CGA

CGC

CGA

CAG

GAG

CTC

ATT

CCC

CGA

144

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

Gly

Gin

Clu

Leu

íle

Arg

Arg

35

40

4S

AGT

TTC

GTA

GGC

GAC

CCA

CCC

CGA

CCT

CGG

TCT

GCG

ATG

CTC

ACC

CCC

192

Ser

Phe

Val

Gly

Glu

Pro

Pro

Arg

Ala

Arg

cy·

Ala

Mec

Leu

Thr

Ala

50

55

60

ACG

CTC

CTC

GCG

CGC

AGA

GAG

GAT

CAC

AGG

CAC

AAT

TTC

TCA

TGC

CTC

24 0

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Arg

Glu

Asp

His

Arg

A*p

Asn

Phe

Ser

cy*

Leu

65

70

75

80

CCC

GAG

CTT

GAC

CTG

CGG

ACA

CAC

GGC

TTG

GGA

CTG

TTT

GCA

AAC

AGC

288

Ala

Clu

Leu

Asp

Leu

Arg

Thr

His

Gly

Leu

Gly

Leu

Pha

Ala

Asn

Ser

85

90

95

TCA

GCC

CCC

AGA

CAG

CTC

CGC

ACG

TTT

315

Ser

Ala

Pro

Arg

Gin

Leu

Arg

Thr

Phe

100 105 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 4:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 1781 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(A) názov/kľúč: CDS (B) umiestenie: 16..1659 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

CAGCTCTCTG TCAGA ATG GCC ACC ATG GTA CCA TCC GTG TTC TGG CCC AGG Sl

Me

t Ala Th

r Met Val Pro Ser Val Leu Trp Pro Arg

1

5

10

GCC

TGC

TGG

ACT

CTG

CTG

CTC

TCC TCT

CTG

CTG

ACC

CCA

GGT

GTC

CAG

39

Ala

cys

Trp

Thr

Leu

Leu

Val

Cys Cys

Leu

Leu

Thr

Pro

Gly

Val

Gin

15

20

25

GGG

CAG

GAG

TTC

CTT

TTG

CGG

GTG GAG

CCC

CAG

AAC

CCT

GTG

CTC

TCT

147

Gly

Gin

Glu

Phe

Leu

Leu

Arg

Val Glu

Pro

Gin

Asn

Pro

Val

Leu

Ser

30

35

40

CCT

GGA

GGG

TCC

CTG

TTT

CTG

AAC TGC

AGT

ACT

GAT

TCT

CCC

AGC

TCT

193

Ala

Gly

Gly

Ser

Leu

Phe

Val

Asn Cys

Ser

Thr

Asp

Cys

Pro

Ser

Ser

45

SO

55

(0

GAG

AAA

ATC

GCC

TTC

GAG

ACG

TCC CTA

TCA AAG

GAG

CTG

GTG

GCC

AGT

243

Clu

Lya

íle

Ala

Leu

Clu

Thr

Ser Leu

Ser

Ly·

Glu

Leu

Val

Ala

Ser

65

70

73

GGC

ATG

GGC

TGG

GCA

GCC

TTC

AAT CTC

AGC

AAC

GTG

ACT

GGC

AAC

AGT

291

Gly

Het

Gly

Trp

Ala

Ala

Phe

Asn Leu

Ser

Asn

Val

Thr

Gly

Asn

Ser

80

85

30

CGG

ATC

CTC

TCC

TCA

GTG

TAC

TCC AAT

CGC

TCC

CAG

ATA

ACA

GGC

TCC

339

Arg

íle

Leu

cys

Ser

Val

zyr

Cys Asn

Gly

Ser

Gin

íle

Thr

Gly

Ser

3S

100

105

TCT

AAC

ATC

ACC

GTG

TAC

GGG

CTC CCG

GAG

CCT

GTG

GAG

CTG

CCA

CCC

187

Ser

Aan

Íle

Thr

Val

Tyr

Cly

Leu Pro

Glu

Arg

Val

Glu

Leu

Ala

Pro

110

lis

120

CTG CCT CCT ŤGG CAG CCG GTG GGC CAG AÄC TTC ACC CT3 CGC TCC CAA 435

Leu Pro Pro Trp Gin Pro Vil Gly Gin Asn Phe Thr Leu Arg Cys Gin

125 do 135 140

GTG GAG Val Glu

GGT GGG Gly Gly

TCG CCC CGG ACC AGC CTC ACG GTG GTC CTG CTT CCC

<83

Sar Pro 145

Arg Thr

Ser

Leu Thr Val Val Leu Leu

Arg

150

155

TGG

GAG

GAG

GAG

CTC

AGC

CGG

CAS

CCC

CCA

CTG

GAG

GAG

CCA

GCG

GAG

S31

Trp

G1U

Glu

Glu 160

Leu

Ser

Arg

Gin

Pro 165

Ala

Val

Glu

Glu

Pro 170

Ala

Glu

GTC

ACT

GCC

ACT

GTG

CTC

GCC

AGC

AGA

GAC

GAC

CAC

GGA

GCC

CCT

TTC

579

Val

Thr

Ala 175

Thr

Val

Leu

Ala

Ser 180

Arg

Asp Asp

Kis

Gly 185

Ala

Pro

Phe

TCA

TGC

CGC

ACA

GAA

CTG

GAC

ATG

CAG

CCC

CAG

GGG

CTG

GGA

CTG

TTC

627

Ser

Cys 190

Arg

Thr

Glu

Leu

Asp 195

Met

Gin

Pre

Gin

Cly 200

Leu

Gly

Leu

Phe

GTG

AAC

ACC

TCA

GCC

CCC

CGC

CAG

CTC

CGA

ACC

TTT

GTC

CTC

CCC

GTC

«75

Val 205

Asn

Thr

ser

Ala

Pro 210

Arg

Gin

Leu

Arg

Thr 215

Phe

Val

Leu

Pro

Val 220

ACC

CCC

CCG

CGC

CTC

GTG

GCC

CCC

CGG

TTC

TTC

GAG

GTC

GAA

ÄCG

TCG

723

Thr

Pro

Pro

Arg

Leu 225

Val

Ala

Pro

Arg

Phe 230

Leu

Glu

Val

Glu

Thr 235

Ser

TGG

CCG

GTG

GAC

TGC

ACC

CTA

GAC

GGG

CTT

TTT

CCA

GCC

TCA

GAG

GCC

771

Trp

Pro

Val

Asp 240

Cys

Thr

Leu

Asp

Gly 245

Leu

Phe

Pro

Ala

Ser 250

Glu

Ala

CAG

GTC

TAC

CTG

GCG

CTG

GGC

GAC

CAG

ATG

CTG

AAT

GCG

ACA

GTC

ATC

819

Gin

Val

Tyr 25S

Leu

Ala

Leu

Giy

2 60

Gin

Het

Leu

Asn

Al* 265

Thr

Val

Met

AAC

CAC

GGG

GAC

ACG

CTA

ACG

GCC

ACA

GCC

ACA

GCC

ACG

CCG

CGC

GCG

867

Asn

MiB 270

Gly Asp

Thr

Leu

Thr 27S

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala 280

Thr

Ala

Arg

Ala

GAT

CAG

GAG

GGT

GCC

CGG

GAG

ATC

GTC

TCC

AAC

GTG

ACC

CTA

GGG

GGC

915

Asp 285

Gin

Glu

Gly

Ala

Arg 230

Glu

Íle

Val

Cy»

Asn 29S

Val

Thr

Leu

Gly

Gly 300

GAG

AGA

CGG

GAG

GCC

CGG

GAG

AAC

TTG

ACG

GTC

TTT

ÄGC

TTC

CTA

GGA

963

G1U

Arg

Arg

G1U

Ala 305

Arg

G1U

Asn

Leu

Thr 310

val

Phe

Ser

Phe

Leu 315

Gly

CCC

ATT

GTG

AÄC

CTC

AGC

GAG

CCC

ACC

GCC

CAT

GAG

GGG

TCC

ACA

GTG

1031

Pro

íle

Vil

Asn 320

Leu

Ser

Glu

Pro

Thr 325

Ala

His

Glu

Gly

Ser 330

Thr

Val

ACC

GTC

AGT

TGC

ATG

GCT

GGG

GCT

CGA

GTC

CAG

CTC

ÄCG

CTG

GAC

GGA

1QS9

Thr

Val

Ser 33S

Cys

Met

Ala

Gly

Ala 340

Arg

Val

Gin

Val

Thr 345

Leu

Asp

Gly

GTT

CCG

GCC

GCG

GCC

CCC

GGG

CAG

ACA

CCT

CAA

CTT

CAG

CTA

AAT

GCT

1307

val

Pre 350

Ala

Ala

Ala

Pre

Gly 3SS

Gin

Thr

Ala

Gin

Leu 360

Gin

Leu

Asn

Ala

ACC

GAG

ACT

GAC

GAC

GGA

CGC

ÄGC

TTC

TTC

TGC

AGT

GCC

ACT

CTC

GAG

3155

Thr 365

Glu

Ser

Asp

Asp

Gly 370

Arg

Ser

Phe

Phe

cy» 37S

Ser

Ala

Thr

Leu

Slu 380

GTC

GAC

GGC

GAG

TTC

TTG

CAC

AGG

AAC

ACT

ÄGC

GTC

CAG

CTG

CGA

GTC

2203

Val

Asp

Gly

Glu

Phe 385

Leu

His

Arg

Asn

Ser 390

Ser

Val

Gin

Leu

Arg 395

Val

CTC TAT GCT CCC ΑΛΑ ΛΓΤ CAC CGÄ GCC AGA TGC CCC GAG CAC TTC ΛΚΑ

Uu Tyr Gly Pro Lys 11« Aap Arg Ala Thr Cy· Pro Gin Hl· Leu Lya

400 40& «IC

TGC

l AAA

. GAT

' AM

. ACC

> AG*

. CAC

: gtc

: CTG

; CAG

l TGC

: Cää

. GCC

AGG

GGC

: AAC

1299

Trp

Ly*

Arp

Lyr

Thr

Arg

HÍ8

Val

Leu

Gin

cys

Gin

Ala

Arg

Sly

Asn

415

420

425

CCG

TAC

CCC

GAG

CTG

CGG

TOT

TTG

AÄG

GAA

> GGC

TCC

AGC

CGG

GAG

GTG

1347

Pro

Tyr

Pro

Clu

Leu

Arg

cy«

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

Ser

Arg

Glu

Val

430

435

44 D

CCG

GTG

GGG

ATC

CCG

TTC

TTC

GTC

AAC

GTA

ACA

CAT

ÄÄT

GGT

ACT

ΓΑΤ

1395

Pro

V*1

Gly

Zle

Pro

Phe

Phe

Val

Ara

Val

Thr

Hl*

Asn

Gly

Thr

Tyr

<45

4S0

<55

<60

CAC

TGC

CAA

GCG

TCC

ÄGC

TCA

CGÄ

GGC

AAA

TAC

ACC

CTG

GTC

GTG

GTG

Gin

cy·

Gin

Al*

S«r

Ser

Ser

Arg

Gly

Ly*

Tyr

Thr

Leu

Val

Val

Val

4S5

470

47S

ÄTG

GAC

ΑΤΓ

GAC

GCT

GCC

ACC

TCC

CAC

GTC

CCC

GTC

TTC

GTG

GCG

1491

Nec

Ä«p

íle

Glu

Ala

Gly

Ser

Ser

Mís

Phe

Val

Pro

Vel

Phe

Val

Ala

480

415

490

GTG

TTA

CTG

ACC

CTG

GGC

GTG

GTG

ACT

ATC

GTA

CTG

GCC

TTA

ATG

TAC

1539

V*1

Leu

Leu

Thr

Leu

Gly

V*1

Val

Thr

Xle

Val

Leu

Ala

Leu

Met

Tyr

495

500

505

GTC

TTC

ÄGG

GAG

CAC

CAA

CGG

ÄGC

GCC

AGT

TAC

CAT

GTT

AGG

GXG

GAG

1587

v«i

Phe

Arg

Glu

Hl*

Gin

Arg

Ser

Gly

Ser

Tyr

Hŕ*

Val

Arg

Glu

Glu

510

515

520

ÄGC .

ACC

TAT

CTG

CCC

CTC ,

ACG

rcT

ATG

CAG

CCG

ACA

GAA

GCA

ATG

GGG

1635

Ser S2S

Thr

Tyr :

Leu

Pro

Leu 530

Thr

Ser

Het

Gin

Pro S3S

Thr

Glu

Al*

Het

Gly 540

lSfiS

GÄA GAA CCC TCC AGA CCT GAG TCACGCTGGG ATCCGGGATC AAAC7TGCC9 Glu Glu Pro Ser Arg XI* Glu

545

GGGGCTTGGC TGTGCCCTCX GATTCCGCAC CÄATAÄAGCC TTCAÄÄCTCC CAAÄÄÄAAAA aaaaaaaxaa AAAAAAÄAAA XääääXAAAA AÄAÄA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 5:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 4900 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

CCGAACGCTC CTCGGCC7CT GCTCTKCTCT GGŇCCTGGGG XTCCTAGGCA TCTCÄGGTAA40

GAASACCCCC CCCGTGGAGC KAGOTGGATA ÄGCCGGGGCC GGAATTGAÄC GACCAGAGM120

GGCGGCCCGG GTGTCCCCCT CCAGGCTCCG CCCTCTTCTA GCTTCCCACG CTTCTGTCAC180

CACCTGGAGW TCGGGGCTTC TCCCCGTCCT TCCTCCACCC CAACACACCT CÄXTCTTTCA240

GAJíCTGÄÄCC CAGCÄCCTTľ TCTGGÄKTNG GGCNNTTGCA CCTÄACCTffT CTCAGGAGAM300

ACTGTOCCTC TCCTGTCCTC TCC7GCTCTG TNATGCCCTA TGGTTCACAG ACTGGCATCA360

TCCCTATTCA TGATCCTCAA AGACNCCATC TCCTCAÄCTG TCATAACTCA GAGCTCTATT420

CCCCCTCCAC CTGGÄGCCCT GGAÄÄCCGGC TTTCTAGGGC TTTTCTCCGC GGTTCmCC480

CGGAGTTCAG CGTTGTGGCT TTTTGTCCAA GTTXCTCAAG 'ľl IGGGGACA ATCTCCTZTA540 agcctttcac tgagtctcat ttccactttg cttttocccc aagcctctgt gtctctccccíďo

CATTTCCTGA CGÄTCTGTCÄ GAGTCTTÄÄG AGTGATTTGG TTCCCCATCC CCCCTCCAÄC660

TOGÄGTCTCC TCCTCACTAT TGATGTGTGC ATCTGÄGACC CCCATCCCCO CACCGAGTTT720

CCCCATCTCT GTCAGTAAAG AGCÄÄ5GCTT CCAGÄGACAA CCCTCTAATA GCGCGTCAGT780

CCCGAATCTT GAGTGGGATG CGGGÄCTCCC ffTGCTÄTTK TTGGC6GAGG TCTTTCCTGG84 0

TCCTTATGGÄ CACCCCTGGT TTGGGÄTÄTG GGGGCCGCTA AGATTTCAGA GXTGGGGTCC900

CTAGGCTGAG NCCGCGTTTT CCC0GGCÄGC GGTCGCGCTA GAXCCTTTCT GGGCGGACCT5<0

TCAGCCCCGC GTGGCGCTCG TGGAGCQCGG GGGCTCGCTG TGGCTCAACT GCäGCäCTAA1020

CTGTCCGAGG CCGGAGCGCG GTGGCCTGGA GACCTCGCTA CGCCGAÄACG GGACCCAGäG1080

GGGTCTGKAC TGWCTOGCTC GACACCTOGT GGÄCÄTCCGA GANCCTGÄAA CCCXGCCGGT1140

CTGCTTCTTC QiCTGCGCGC GCCGCAGÄCT CCÄAGCCCGT GCGCľTCATCC GAACTTTCCG1200

TGÄGTTCAGG GTGGGCAOiC CCCTTGGG7C TCTGGÄCCTC CCCCTCAÄGC TCCTCCCACC12ÍO

CGCCCTCTGA TCCICCTGCT TCTTC7GÄÄA GTXCTXCXGC TGGCTAGAGC GGÄGTTTTTG1320

GTCCCTTGCA GÄGCGACCGG ATCGGGTäGA GCTÄG7GCCT CTGCCTCCTT GGCAGCCTOT1380

AGGTGAGAAC TTCACCTTGA GCTGCAGGCT CCCGGGGGCA GGACCCCGäC CGäGCCTCXC1440

ÄTIGACCTIG CTGCGAGGCG GCCAGGAGCT GÄTTCGCCGA AGTTICCTäG GCGAGCCACC1500

CCGAGCTCGG GCTGCGATGC TCXCCGCCXC GGTCCTGGCG CGCäGAGACG ÄTCACAGGGC1550

CAA7TTCTCA TCCCTCGCCG ACCTTGACCT GCGNCCÄCAC GGCTTGGGAC TGTTTGCÄXÄ1620

CXGCTCAGCC CCOÄÍiÄCÄGC tccgcäcgt: tgctgagtgt ggaccctaac tgacagätttιββο

TAAGXAGTTT AGGGCAGCCA GCCCTvGTvC CATOG7GTCG TACSGCCCTXÄ GTCCCAGCCC1740

AXGCAGÄNCT AAGKCGGÄTC TCTnnGÄAT TÄÄAÄCTCrA GCTCGTCTAC ÄTÄACGAGGW1800

CTGCATAGTT AAXTCCCCCA ÄXIOTCTÄXG CÄCtľTXCCCC TTACTTCCW CACAAG7ÄCT1860

ÄGC7TAXGTA CTÍTCTCCTO 7VaCXTTTT CCTľTXTGTÄ 7TTACTCC7T GÄQÄGÄAÄÄA1920

GÄGACTGTGT GTACGTGCCT T7ÄTGCACÄT GCCCCAGTCC TTGTA7GGXA GTTAAAGAAT1980

AÄGGAGGCGT 7CTGCCCTTC CXTCCTGTGG GTCCTÄGGGG TGGTATTÄCC TCCTCAGGCT2040

ΤΠΪΤΓΑΟΤΗΑ CAÄGCGCCTA GGCTTGGGGA GCCXTCTCGC CCGCTCCTCT GTATVľlTÄG2100

GGTGAAACCA CACAATGCAT GCAÍATIGCT TGATCAtCAC TGAATGTITX CTTCGTAAÄT2160

TCAAGCTCTG TTCTTTGTCT TCCTCACCCA TGCCTCCACT TTCCCCCGÄG CCTTATTGCC 2320 CCACGATTCT TAGAAGTGÔC CTCÄGAAAGG CCGCTGACKT GCACTTTGGA TGGACTGTTT 2280 CCTGCCCCAG AAGCCGGGGT TTACTTCTCT CTGGGAGÄTC AGAGGCTTCA TCCTAATGTG 234 0 ACCCTCGACG GGGAGÄGCCT TGTGGCCACT GCCÄCAGC7Ä CÄGCAAGTGA ÄGAACÄGGÄA 24 00 GGCACGAAAC AGCTGATCTG CATCGTGÄCC CTCGGGGGCG XXAGCAGGGA.GACCCAGGAA 2460

174í

1781

AACCTGACTO TCTACAGTAA GGGGAATCCA GGGGCTGGGT CTGGGTCTGG GGCCAGAGTC GACCTCCACA CCAGAÄCAÄG CCGGGCGGGA GÄAÄTTAATA GÄTTGGGTTG ACT7CCCTCA CCCCAGGCTT CCCGGCTCCT CTTCTtlACTT TGGTGACCGT AAGCTGCTGG GCAGGGGCCC GGACCCTCTT ACCGGCCCCX TCTTTAÄCCT ACGCACCTCG GCTGGATGÄC TTGGACTCTC AGCAGACCCT CCACTGCGAG GCCCGTGGäA CTGACGGTCG GGCGGTGCTA GCGCTGGGCC GCACTTÄCCG ÄTGTACÄGCA ATCXÄTGGGC CTCTGGAATG TGAGTAGGGG GÄGGTGGCCA TGGGAGACTG GCTATACGGA AäGGÄAÄGAA TGAAGGAAAG TGGTGTGGTG TTTÄCÄÄÄCT AÄÄCAGACAG CCAÄGÄGÄGT GTGCCTGGGA CAACASCACC CTGÄGA7CTC AGGAAAGGGG GCAGGAAGAG AGAACGCCCÄ CCTTTTCCTG

ACAAGACCTT CAATAGCTCÄ GACTGGG3CT2520

7CÄCÄAAGGC GGAGCCTATA AAGTGSGCGG2ΞΒ0

GAGTTCCÄGG GCAGGAGCÄG ATAGAAGrTG264 0

GTGGGGAGTO AACCCCÄCCC AÄTTCTCTGT2700

TAÄGTGÄGCC ÄGAASCCCCC GÄGGGÄAAGA2750

GAGCCCTTGT CACCTTGGAG GGAATTCCAA2820

TATC6TÄTCC CCTCTGCCrC ATGCCCGCÄG2880

CCAGGAGCTG GACGTGGCCA GAGGGTCCAG2940

ACCCTGAGCC CTCCGTGCAC TGTCCAAGGC3000

TCTTGGGTCC AGIGACCCGT GCCCTCGCGG3050

ÄAGGCCÄGGC GGTCAÄGGAT GTGACCCTGÄ312 0

TGCT7XTCCC TTTAÄGGTCA CGGAGTCTÄC3180

GCCTAGGT7C ÄGCAGGGÄTT GGGAÄAACAC324 0

TAÄCGGTGGT AÄCTGGGCXC GOTCTGGCÄA3300

XGCTGCAÄTG GGGGCTTTGT GGGAÄTTGGT3360

CCTGAAGTTA TCTCCAGAAC CCATGTGAAG34 20

CTCCCCCCÄA CCCCCCCCCA CATATCACAC3480

GGÄGTATATA AXTÄAATÄAA ÄTGGCTCCTG CCGGXGGGÄG TGAGÄAGCTG TCTCCTGCÄG 3540 GCTCAGÄGCA GTGGTXGTGC XTCCCTTTÄÄ TCCCAGCAtľT CGGTAGGCAA XGGCXGGCXG 3 600 ÄTCTCTGTGA ATGTGGGGCC XGCCTGG7CT GTACXGXGXÄ ÄTCCTGTCTC AAAACXÄACC 3 660 AGCAÄÄCAÄA CAAAäCCXAÄ XTCäXTTCCA GÄTGCCCCAG CGCTGGACÄG TGTXGGCTGC 3720 CCAUGACC7A TTACITCKCT GGAGGGGÄCA GAGSCCTCGC TTAGCTGTGT CGCACACGGG 3780 GTCCCACCAC CTÄGCG7GAfi C7GTGTGCGC TCTGGXÄXGG AGGäACTCRT GGäXGGGCCC 3840 CTGCGTGTGG CCCGGGACCA CGCTGGCXCT TXCCGATGCG AAGCCXTCAÄ CGCCXGGGGX 3900 TCAGCGGNCA AÄAATGTO3C TGTCÄCGGTG GÄXTGTCÄGT AGGGGTGGCT XCGGAAÄTGT 3960 CCACXCCTGC GTCCTCIGTC CTCÄGTGTGA ÄCTCCTÄTTT CCCTGCTTCC TAGATGGTCC 4020 CAGTTNTUAG GXfiTTGGGCT GCCCCXGCAA CTGSXCTTGC GTACÄAGGXT CTGGAAAXCT 4080 GTrrTCCTGT GAACTTGATG GGAACCCGGA ACCACGCGTG GASTGCGTGG GCTCGCAGGG 414 0 TGCAAGCGAA SGGCTACIGT TGCCCCTGGT CTCCTCGAAC TCTGGTTCCA GAAACTCTAT 4200 GACTCCTGGT AACCTGTCAC CGGGTATTTA CCTCTGCAAC GCCACCAACC GCCATGGCTC 4260 CACAGTCAAA ACÄGTCGTCC TGAGCGCGGA ATGTGAGCAG GG3CCCAGGT GGGCGSAGAC 4320 TACCGGGTGT CCCÄGGATCT TTTCTTTCCC TGATGCCCCT CCTTÄTGSTG GCTGATCTOC 4380 ACCACCGCCA CAGÄTGGATG ÄATCCXGTTG CCCGÄffTCAC CAGACXTGGC TGGAAGGAGC 4440 CGAGGCTACT GCGCTGGCCT GCAG7GÄCAG GGGNCGCCCC TCTCCACGCG TGCGCTGTTC 4500 CXGGGAAGCT GCAGCCÄGGC TGGAGAGGCT ÄCAGGTGTCC CGAGXGGATG CGGGGACCTA 4560 CCTGTCTGTO GCTXCCAACG CGCATGGCXC GGATTCXCGG XCCGTCACTG TGGGTGTGGA 4420 ATGTGAGTGA GGACACCGCT GAATCAAGÄC GACTCAfiACC GCCAGXAAAG TGCCTTGAGG 4580 CCTGGGATGT ATGATCCAGT GGGTAfiÄGTG CTCAÄTTAGC ACTCACTÄAA ATGTÄTATTC 4740 TATTCCTÄÄT ACTCTTTAÄT TTTASCCTrr GGGAGCCAGA GAGAGCGAGA TCTCTCTTCC 4100 GGGATXACCT GCTCTCTGTC TAGGACACCT TGGTCTACAG AGGGGNTACA GGCCCCCCCT 4460 CCCAAGATTG KÄTAGCXACC CTCTGGCTCC CTGTCTCTCT <300 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 6:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 1295 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: c DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

NGÄATTCCGG CGGATCGGGT AGAGCTAGTG CCTCTGCCTC CTTGGCAGCC TGTäGGTGAC 40 ÄACTTCACCT TGAGCTGCAG GGTCCCGGGG GCAGGACCCC GAGCGASCCT CACATTGACC 120 TTGCTGCGAG GCGGCCAGGA GCTGÄ7TCGC CGAAGTTTCG TAGGCGAGCC ACCCCtAGCT 140 CGGGGTGCGA TCCTCXCCGC CXCGGTCCTG CCGCGCAGXG AGGATCXCAG GGCCAÄTTTC 240 TCATGCCTCG CGmXGCTIGA CCTGCGGCCA CACGGCTTGG GACTGTITGC AÄACAGCTCÄ 300 GCCCCCAGÄC AGCTCCGCAC CTTTGCCATG CC7CCXCTTT CCCCGAGCCT TÄTTGCCCCA 360 CGÄTTCTTÄC AAGTGGGCTC AGÄXASGCCG GTGäCTTGCä CTrTGGATGG ACTGTTTCCT 420 GCCCCAGAXG CCGGGCTITA CCTC7CTCTG GGAGÄTCAGA GGCTTCATCC TAÄTGTGACC 440 CTCGACGGGG AfiÄCCCTTGT GGCCAC7CCC XCAGCTACAG CAAGTGAAGA ACAGCAAGGC 54 0 ACCAAACAGC TGATGTGCAT CGTGACCCTC GGGGGCGAAA GCAGGOAGAC CCAGGAAÄAC «00 CTGACJGTCT ACAGCTTCCC GGCTCC7CTT CTGÄCTTTAA GTGXGCCXGA AGCCCCCGAG 6$0 GGAAXGATGG TGXCCGTXAG C7GCTGGGCA GGGGCCCGXG CCCTTGTCAC CTTGGAGGGA 720

ACTGTGGCTC ťTGTCCTC TCCTGCTCTO TKATGCCCTA TGGTTCACAG ACTGGCATCA

360

ATTCCAAGGA CCCTCTTACC GGCCCCATCT TTAACCTTAT CGTATCCCCT CTGCCTCÄTC 710 CCCGCAGACG CACCTCGGCT GGATGACTTG GACTGTCCCA GGAGCTGGAC GTGGCCAGÄG 840 GCTCCAGAÄC ACACCCTCCÄ CTÚČGäÚGCC CSTCGAAACC CTGAGCCCTC CCTGCACTGT !00 GCAAGGCCTG acggtggggc GGTGCTAGCG ctgggcctgt TGGGTCCÄGT GÄCCCGTGCC 340 CTCGCGGGCA CTTÄCCGATG TACAGCÄÄTC AATGGGCAAG GCCAGGCGGT CAÄGGATGTG 1020 ACCCTGACTG TOGAATATGC CCCAGCGCTG GACAGTGTAG GCTCCCCäHÄ ACCTATTACT 1010 TGGCTGGAGG GGACAGAGGC ATC6CTTÄGC TGTGTGGCAC ACGGGGTCCC ACCACCTACC 1140 GTGAGCTGTG TGCGCTCTGG XAAGGAGGAÄ GTCATGGAAfl GGCCCCTGCG TTTTCGCCGG 1200 GACCACCCTG GCACTTACCC ATGCGÄÄGCC ÄTCAACCCCA GGGGATCAfiC GGCCAAAAAT 1240 GTOGCrGTCA CGGTGGAATA TGGTCCCCOG AATTC 1235

TCCCTATTCA TGATCCTCÄÄ AGAQICCÄTC TCCTCAACTG TCATAACTCA GAGCTCTATT ccccctccac ctggagccct ggaaacccgc tttctagggc ttttctccgc ggttctttcc CGGAGTTCÄG CGTTGTGGCT TTTTGTCCAA CTTACTCAAG; ITTGGGGACA ATCTCC'ITJ'A

AGCCTTTGAC TCAGTCTCAT TTCCACTTTG CATTTCCTGA CGATCTGICA GÄGTCTTAÄG TGGÄGTCTCC TCCTCACTAT TGATGTGTGC CCCCÄTCTCT GTCAGTAÄÄG ÄGCÄÄGGCTT CCCGAATCTT GÄGTGGGATG CGGGACTCCC TCCTTATGGA CACCCCICGT TTCGSATATG

CTTTTGCCCC ÄAGCCTCTGT GTCTCTCCCC 600 AGTGATTTGG TTCCCCATCC CCCCTCGAAC 660 XTCTGAGACC CCCÄTCCCCG CACCGAGTTT 720 CCAGAGÄCAA CCCTCTAATA CCGCGTCACT 780 GTGCTATTTC TTGGCGGAGG ICTTTCCtM 840 GGGGCCeCTA ÄGATITCÄGA GÄTGGGGTCC 900 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 7:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 2214 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: c DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 7

CTAGGCTGAG NCCGCGTTTT CCCGGGCAGC GGTCGCGCTA GAACCTTTCT GGGCGGACCT

7CAGCCCCGG GTGGCGCTCG TGGÄfiCGCGG CTGTCCGAGG CCGGAGCGCG GTGGCCTGGA GGGTCTGXAC TGNCTGGCTC GACAGCTGGT CTGCTTCTTC CKCTGCGCGC GCCGCACAC7

GGGCTCGCTG TGGCTCAÄCT GCAGCACTAÄ 1020 GACCTCGCTA CGCCGAÄACG GGACCCAGAG 1080 GGACÄTCCGA GANCCTGÄAA CCCAGCCGGT 1140 CCAAGCGCGT GGGCTCATCC GÄACTTTCCG 1200

TGAGTTCACG GTGGGCACKC

CCCTTGGGTC TCTGGACCTC

CCCCTCAÄGC TCCTCCCACC

1260

CGCCCTCTGA TCCTCCTGCT TVTICTGÄÄA GTACTACAGC

TGGCTAGAGC

GGAGITTTTG

1320 □TCCCTTGCA. CAGCGÄCCGG ÄTCGSGTAGA GCTÄGTGGGT

AGGTGAGAAC TTCACCTTGA CCTGCAGGGT

CTGCCTCCT7

GGCAGCCTOT

138 5

CCCGGGGGCA GGACCCCGAG

CGAGCCTCAC

1440

CGAATCTIGA GTGGGATGCG CGACTCCCGT CCTÄT7TCT7 GGCGGAGGTC TTTCCTGGTCÍ0

CTTATGGACA CCCCTOGTTT GGGÄTÄTGGG GGCCGCTAAG ATTTCAGäGä TGGGGTCCCT120

AGGCTGAGCC CGCGTTTTCC CGGGCÄGCGG TCGCGCTÄGA ACCTTTCTGG GCGGACCTTC180

AGCCCCGCGT CGCGCTCGTG GAGCGCGGGG GCTCGCTCTG CCTCAÄCTGC AGCACTÄACT240

GTCCGÄGGCC GGAGCGCGGT GCTCTGGAGÄ CCTCGCTACG CCGAAACGGG ÄCCCÄGAGGG300

GTCTGCGCTG GCTOGCTCGA CAGOTJGTGG ACATCCGAGA CCCTGAAACC CAfiTCGGTCT360

GCTTCTTCCG CTGGGCGCGC CCCÄCÄCTCC ÄÄGBGÄGTDG GCTCATCCGA ACTTTCCAGC<20

GACCGGATCG GGTÄGÄGCTA GTGZCTCTGH CTCC7TGGCA GCCTGTAGGT GAGAACTTCA<80

CCTTGAGCTG CAGGGTCCCG GGGGCAGGAC CCCGÄGCGAG CCTCACÄTTG ACCTTGCTGC540

GAGGCGGCCA GGAGCTGÄTT CGCCGÄAGTT TCGTÄGGCGA GCCACCCCGA GCTCGGGGTGÍ00

CGATGCTCAC CGCCACGGTC CľGGCGCGCA GAGAGGATCÄ CAGGGCCAÄT TTCTCATGCC«0

TCGCGGAGCT TGACCTGCGG ACACXCCGCT TGGGXCTGTT TGCÄÄACAGC TCAGCCCCCA720

GACAGCTCCG CACGTTTGGC ATGCCTCCAC TTTCCCCGÄG CCTTATTGNC CCACGATTCT710

TÄGAAffTOGG CTCÄGÄAAGG CCGGTGACTT GCACTTTGGA TGGACIGITf CCTGCCCCN3840

AAGCCGGGGT TTACCTCTCT CTGGGÄGATC ÄGAGGCTTCA TCCTAATGTG ACCCTCGACO900

GGGÄGÄGCCT TGTGGCCACT GBCÄCÄGMTA CAGCÄAGTGA AGÄACAGGÄA GGCACCAAAC860

AGCTGATGTG CATCGTGACC CTCGGGGGCG ÄAAGCAGGGA GACCCAGGAA AACCTGäCTG1020

TCTACÄCCTT CCCGGCTCCT CTTCTGACTT TAAGTGAGCC ÄGAAGCCCCC GAGGGAAAGA1080

TGGTGACCGT AAGCTOCTGG GCÄGGGGCCC GAGCCCTTOT CACCTTGGAG GGAATTCCAG1140

CTGCGGTCCC TGGGCAGCCC GCTGAGCTCC AGTTAAATCT CACAAAGAAT GACGACÄÄGC1200

CGGGCTTCTT CTGCGACGCT GCCCTCGATG TGGACGGGGÄ AACTCTGAGA AAGÄACCÄGA1260

GCTCTGAGCT TCGTGTTCTG TACGCÄCCTC GGCTCGATGÄ CTTGGACTGT CCCÄGGACCT1320

GGACGTGGCC AGAGGGTCCA GÄGCAGÄCCC ICCÄCTGCGÄ GGCCCGTGGA AACCCTGÄGC1380

CCTCCGTGCA CTGTGCAÄGG CCTGÄCGGTG GGGCGGTGCT AGCGCTGGGC CTGTTGGGTC1440

CAGTGACCCG TGCCCTCGCG GGÄAC7TACC GATGTACAGC ÄATCÄÄTGGG CAAGGCCAGG1S00

CGGTCAAGGA TGTGACCCTG ÄCTG7GGÄAT ÄTGCCCCAGC GCTGGACAGT GTAGGCTCCC1S60

CAGAACGTAT TÄCTTGGCTG GÄGGGGACXG AGGCATCCCT TAGCTGTGTG GCACACGGGG1620

TCCCACCACC TAGCGTGAGC TGTGTGCGCT CTGGAÄÄGGA GGÄAGTCATG GÄÄGGGCCCC1685

TGCGTGTGGC CCGGGAGCAC GCTGGCÄCTT ACCGATGCGÄ AGCCATCAAC GBCAGGGGÄT1740

CAGCGGWCAA AAATGTGGCT GTCÄCGGTGG ÄATATGGTCC CAGTTTOGAG GAG7TGGGCT1800

GCCCCAGYAA CTGGACTTGG GTÄGÄÄGGAT CTGGÄÄAACT GTTrTCCTGT GÄAGTTGATG1860

GGAÄGCCGGA ÄCCACGCGTG GäGTGCGTCG GCTCGGAGGG TGCAAGCGAA GGGGTAGTGT192 0

TGCCCCTGGT GTCCTCGÄAC TCTGG7TCCA GAAACTCTÄT GACTCCTGG“ AACCTGTCAC1980

CGGGTATTTA CCTCTGCÄAC GCCÄCCÄÄCC GGKATGGNTC CACAGTCÄAA ACAGTCGTCG2040

TGÄGCGCGGA ÄTCÄCCGCCA CAGÄTGGATG AÄTCCäGTTG CCCGAGTCAC CACÄCATCGN2100

TGGAAGGACC CGAGGNTACT GCGCTGGCCT GCÄGTGCCAS AGGNCGCCCC TCTCCACGCG2160

TGCCCTGTTC CAGGGAAGGT GCÄGXCÄSGC TGGÄGÄGGKT ACAGGTGTCC CGAG2214

ATTGACCTro CTGCGAGGCG GCC1GGÄGCT

GATTCGCCGA AGTTTCGTAG

GCGA5CCÄCC

1500

CCGAGCTCGG GGTGCGATCC 7CACCCCCAC GGTCCTGGCG

CAATTTCTCA TGCCTCGCGG AGCTIGACCT GCGNCCÄCAC

CGOAGAGAGG ATCACAGGGC

GGCTTGGGAC TGTTTGCANÄ

CAGCTCAGCC CCCAGACAGC TCCGCXCGTT TGGTGAGTOT GGACCCTAÄC TGACAGATTT

TAAGAAGT7T AGGGCAGCCA CGCGTGGTGG

AAGCAGANCT AAGHCGGATC TC7TOTGAÄT

1560

1620

1680

CATGG7GTC0 TAGGCCCTAA GTCCCAGCCC

ΤΑΑΑΑΟΤΓΓΑ GCTCGTCTAC A7AACGAGCH

CTGCATAGrr AÄATCCCCCA AAAGTCTAAC CAGC7AGCCC

TTACTTCCAA CACÄAGTACT

1740

1800

1860

AGCTTAAGTA C7TTCTCCTG TGAGCTTriT CCTTľATTTA TTTÄCTCGTT GÄQAGAAAÄA 1320 GAGAGTGTGT GTACGTGCCT TTATGCACAT GCCGCAGTGC TTGTATGGAÄ CTTÄAAGAÄT 1980

AAGGXGGCGT TCTGCCCTTC TTGTTAGTNA CAAGCGCCTA GGTGAÄÄCCA GACÄATGCÄT TCÄÄGCTCTG TTCTTTGTCT

CÄ7CCTGTGG GTCCTAGGGG GGCTTGGGGA GCCÄ7CTCGC GCÄÄA7TGGT TGATCSACAC TCCTCXGCCA TGCCTCCXCT

TGGTATTAGC TCCTCAGGCT CCGCTGCTCT GTATCTrTAfi TGAATGTTTÄ GTTCGTAAAT TTCCCCCGAS CCTTATTGCC

2040

2100

2160

2220

CCACGAKCT TAGAAGTGGG CTCAGAAAGG

CCGGTGACCT GCACTTTGGA TGGACTGTTT

CCTGCCCCAG AAGCCGGGGT 7TAC7TCTCT

CTGGGAGA7C

ÄGAGGCTTCA TCCTÄATGTC

2280

2340

ACCCTCGACG GGGÄGAGCCT TGTGGCCÄCT

GCCÄCAGCTA CAGCÄAGTGA

GGCäCCAAAC AGCTGÄTGTG CÄTCGTGACC

ÄGÄÄCAGGAA

2400

CTCGGGGGCG AÄAGCÄGGGA GACCCAGGAA

AACCTGACTG TCTACÄGTAA GGGGAATCCA

ÄCAAGACCrr CÄÄ7AGCTCA

GGGGCTGGGT CTGGGTCTGG GGCCAGAGTC

GACTGGGGCT

TCÄCÄAÄGGC GGAGCCTATA AAGTGGGCGG

GACCTCCACA CCAGÄACAAS CCGGGCGGGA GAGTTCCAGG GCAGGAGCAG ATÄGAÄGTTG

GAÄATTAATA GATTGGGTTG AGTTCCCTGA

GTGGGGAGTG AACCCCACCC XATTCTCTGT

2460

2520

2S80

2640

2700 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 8:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 5077 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

CCGÄACGCTC CTCGGCCTCT GGTCTKCTCT GGKCCTGGGG ATCCTAGGCA TCTCAGOTÄA60

GAAGAGCCCG CCCGTGGACC KÄGGTCGÄTA ÄGGCGGGGGC GGAATTGAAG GACCAGAGÄG120

GGCGGCCCGG GTGTCCCCCT CCÄSGCTCCG CCCTCTTCTA GCTTCCCACG CTTCTGTCAC110

CACCTGGAGH TCGGGGCFrC TCCCCGTCCT TCCTCCACCC CAACACACCT CAÄTCTITCA24 0

GÄNCTGAACC CAGCACCTTT TCTCGAjm.'G GGGNinTÚCA CCTAÄCCTCT CTCAGGÄCAN300

CCCCÄGGCTT CCCGGC7CCT CTTCTGACTT TAAGTGAGCC AGAAGCCCCC GAGeGAAAGA2760

TCGTGACCCT AAGCTCCTGG GCAGSGGCCC GÄCCCCTTGT CACCTTGGAG GGÄATTCCAG2820

CTGCGGTCCC TGGGCAGCCC GCTGAGCTCC ÄGTTAAATGT CACAAAGAAT GACGACAAGC2880

GGGGCTTCrr CTGCGACGCT GCCCTCGATG TGCACGGGGA AACTCTGAGA ÄÄGÄACCÄGÄ2940

GCTCTGAGCT TCGTGTTCTO TGTGAGTGGA TGTTGÄCTTT ATCTCTGTGA ATTCCAAGGA3000

CCCTCTTACC GGCCCCATCT TTAACCTTAT CGTATCCCCT CTGCCTCÄTC CCCCCAGACG3060

CACCTCGGCT GGATGACTTO GÄCTGTCCCA GGAGCTGGAC GTGGCCAGAG GGTCCAGAGC3120

AGÄCCCTCCA CTCCGÄGGCC CCTGGÄÄÄCC CTGAGCCCTC CGTGCACTGT GCAAGGCCTG3180

ACGGTGGGGC GGTGCTAGCG CTOKCCTCT TGGGTCCÄGT GACCCGTGCC CTCGCGGGCA3 240

CTTACCGATG TÄCASCAATC AATGGGCäAG GCCAGGCGGT CAÄGGATGTG ACCCTGACTG3300

TGGAATGTGA GTAGGGGGÄG GTCOGCATGC TTÄTCCCTTT AAGGTCACGG AGTCTACTGG3360

GAGÄCTGGCT ATACGGAAAG GAÄACÄACCC TAGGTTCAGC AGGGATTGGG AÄAACACTGA3420

AGGAÄAGTOG TGTGGTGTTT ACAAACTTAA CGGTGGTAAC TGGGQACGGT CTGGCAAAAA3480

CAGACAGCCA AGAGAGTCTG CC7GGGÄÄGC TGCAATGGGG GCTTTGTGGG AATTGGTCAA354 0

CAGCACCCTG AGATCTCACG ÄÄÄGGGGCCT GAAGTTATCT CCAGÄACCCA TGTGAAGGCA3 600

GGÄAGAGÄGA ACGCCCÄCCT TTTCCTGCTC CCCCCÄÄCCC CCCCCCACÄT ATCACACGGA3 660

GTATATÄAAT AÄATAÄAÄTG GCTCCTGCCG GAGGGÄGTGÄ GAAGCTGTCT CCTGCAGGCT3720

CAGÄGCAGTG GTAGTGCÄTG CCTTTAÄTCC CäGCACTCGG TAGGCAAAGG CAGGCÄGÄTC3780

TCTGTGAATG TGGGGCCAGC CTGGTC7GTA CACAGAAÄTC CTGTCTCAÄA ACAAACCAfiC384 D

AAäGAAACAA AACCAAÄATC ÄÄTTCCÄCäT CCCCCASCGC TGGACAGTGT ÄGGCTGCCCA3900

NGACGTATTA CTTGNCTGGA GWGÄCAGÄG

CCÄCCACCTA GCGTGACCTG TG7GCGCTCT

GCATCGCTTA GCTGTGTOGC ACÄCGGGGTC

GGÄAAGGÄGG AAGTCATGGA ÄGGGCCCCTG

CGTGTGGCCC GGGAGCÄCGC TO5CÄCTTÄC CGATGCGAÄG CCATCÄÄCGC

CAGGGGATCA

GCGGNGAMA ATGTCGCTGT CÄCGG7GGÄA TGTGÄGTAGG GGTGGCTÄCG GÄÄATGTCCA

CACCTGCGTC CTCTGTCCTC AGTGTGAACT TTNTGAGGAG TTGGGCTGCC CCAGCÄACTG TTCCTGTGÄÄ OTTGATGGGA AGCCGGÄACC AAGCGAAGGG GTÄGTGTTGC CCCTGGTGTC TCCTGGTÄAC CTGTCACCGG GTATTTACCT AGTCAAAACA GTCGTCGTGA GCGCG3ÄATG CGGGTGTCCC AGGATCrTTT CTTTCCCTGA ACCGCCACAG ATGGATGAAT CCÄGTTGCCC GGCTACTCCG CTGGCCTGCA CTGÄCÄGGGG

3960

4020

4080 <14 0

CCTATTTCCC TGCTTCCTAO ATGGTCCCAG 4200 GACTTGGCTA CAAGGATCTG GAAÄACTGTT 4260 ACGCGTGGAG TGCGTCGGCT CGGACGGTGC 4320 CTCGAACTCT GGTTCCAGAA ACTCTATGAC 4380 CTGCAACCCC ACCAACCGGC ATGGCTCCAC 4440 TGAGCAGGGG CCCÄGGTGGG CCGAGAGTAC 4500 TGCCCCTCCT TATGGTGGCT CATCTGCAGC <560 GAGTCÄCCAG AOATGGCTGG ÄAGGAGCCGA 4 620 NCGCCCCTCT CCACGCGTGC GCTGTTCCAG 4 680

1380

GGAÄSCTGCA GCCÄGGCTGG AfiÄGSCTACA GGTGTCCCGA GÄGGÄTGCGG GGACCTACCT 4740 GTGTGTOGCT ACCAACGCGC ATGGCÄCGGA TTCÄCGGÄCC GTCACTGTOG GTGTOGÄATG 4800 TQÄGTGÄGGÄ CÄGCGCTGAA TGAAGÍCGAC TCÄGÄCCGCC ÄGAAÄAGTGC CTTGÄGGCCT 4860 GGGATGTATG ATCCAGTGGG TAGÄGTGCTC AATTAGCACT CACTAAAATC TATATTCTAT ' 4520 TCCTÄATACT σΠΤΑΆΤΓΤΤ ANCCÍ77GGG ASGCAGÄGAC ÄGGCAGATCT CTGTTCCGGG 4380 ÄTAÄCCTCCT CTCTGTCTAG GÄCAGCTTCC TCTXCAGÄGC GGNTÄCAGGC CCCCCCTCCC 5040 AAGÄTTGKÄT ÄGCAACCCTC TOOCTCCCTO TCTCTCT SO37 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 9:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 1472 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

HGÄÄTTCCGG CGGATCGGGT AGÄGCTäSTO CCTCTOCCTt CTTO&tAGCC TCTÄGGTGAG É0 ÄÄCTTCACCT TGAGCTOCäG GGTCCCWGG GCAOGACCCC GÄGCGÄGCCT CACATTGACC 120 TTGCTGCGAG GCGGCCAGGÄ GCTGÄCTTOC CGÄAGTJTCG TAGGCGAGCC ÄCCCCGAGCT 110 CGGGGTOCGÄ TOCTCACCGC CÄCTGCTCTG GCGCGCACAG AGGÄTCÄCAG GGCCAATTTC 240 TCATOCCTCG CGGÄGCTTGA CCTGCG3CCA eACGGCTTOG GACTGTTTOC ÄÄÄCAGCTCÄ 300 CCCCCCÄGÄC ÄCCTCCGCAC G7T7CCCATG CCTCCACTTT CCCCGAGCCT TATTGCCCCA 260 CGÄTTCTTÄG AÄGTOGGCTC AGAääGGCCG GTOÄCTTGCA CTTTGGÄTGG ACTGTTTCCT <20 GCCCCÄGAAG CCGGGGTTTA CCTCTCTCTG GGAGÄTCAGA GGCTTCATCC TAATGTGACC 410 CTCGACGGGG AGAGCCTTO7 GGCCXCTGCC ACAGCTACÄQ CÄAGTGAAGA ÄCAGGÄAGGC 540 ACCÄÄACAGC TGATÚTGCÄT CGTOÄCCCTC GGGGGCGASA GCAGGGAGAC CCACGÄAÄAC 600 CTGACTGTCT ÄCAGCTTCCC GGCTCCTCTT CTGACTTTAA GTGAGCCAGA AGCCCCCGÄG 6C0

TGACCGTÄÄG CTGCTCGCCA GGGGCCCGAG CCCTTGTCAC CTTGGAGGGA 720

ATTCCAGCTG CGGTCCCTGG GCäGCCCGCT GÄGCTCCAGT TÄAATGTCAC AÄASÄÄTGAC 780 GACÄAGCGGG GCTTCTTCTG CGÄCGC7GCC CTCGÄTGTGG ACGGGGAAAC TCTGAGAÄAG Ba o AÄCCAGAGCT CTGACCTTCG TGTTCTGTGT GÄGTGGATCT TCÄCTTTÄTC TCTCTGÄÄTT 900 CCAAGGACCC TCTTACCGGC CCCÄTCTTTÄ ÄCCTTÄTCGT ÄTCCCCTCTO. CCTCATGCCC 960 GCAGACGCAC CTCGGCTGGA TGACTTGGAC TGTCCCAGGÄ GCTGGACGTG GCCRGÄGGGT 1020 CCÄGAGCAGA CCCTCCACTG CGÄGGCCCGT GGAAACCCTG AGCCCTCCCT GCACTGTOCA 1080 ASGCCTGACG STGGGGCGGT GCTAGCGCTG GGCCTCTTOG GTCCAGTGAC CCGTGCCCTC 114 0 GCGGGGACTT ACCGATOTAC ASCAATCAAT CGGCÄAGfiCC AGGCÔGTCÄA GGATGTGACC 1200 CTGACTOTGG AATATGCCCC AOCCCTOCAC AGTOTAGGCT GCCCAGAACG TÄTTACTTGG 1260 CTOGAGGGGA CAGAGCCATC GCCTäSCTGT GTGGGACÄCG GGGTCCCACC ACCTAGCGTG 1320 ÄGCTGTGTGC GCTCTGGAÄA GGÄGGAXGTC ATOGÄAGGGC CCCTSCffTTT TGGCCGGGAG 1380 CACGCTGGCA CTTÄCCGATG CGAAGCCATC AACGCCäGGG GÄTCAGCGGC CÄSAAÄTGTG 1440 GCTGTCACGG TGGAATATOG TCCCCGGAÄT 7C 1472

ÄCGGTCGAÄT ATGGTCCCÄG TTTTGÄGÄÄG TTCGGCTGCC CCAGCAÄCTG GÄCTTCGGTA GÄÄGGATCTG GAÄAACTGTT TTCCTCJTGAA CTTGATGGGA AGCCGGÄACC ÄCSCGTGGÄG TGCGTGGGCT CGGASGGTGC AACCGAAGGG CTAOTCTTOC CCCTGGTGTC CTJ&AACTCT GGTTCCÄ1ÄÄ ACTCTATGAC TCCTGGTÄAC CTGTCÄCCGG GTATTTÄCCT CTCCAACGCC ÄCCAACCGGC ATGGCTCCAC AGTCXAÄÄCA GTCGTCCTGA GCGCGGAÄTC ACCGCCACÄG ATGGATGAAT CCAGTTGCCC GAGTCACCAG ÄCATGGCTGG AÄGGAGCCGA GGC7ACTGCG CTGGCCTGCA GTOCCÄGAGG CCGCCCCTCT CCACGCGTOC GCTGTTCCAG GGAAGGTGCA CCCAGGCTOG AGAGGCTACÄ GCTGTCCCGA GAGGATGCGG GGACCTACCT GTGTGTOGCT ACCAACGCGC ATGGCACGGA TTCACGGACC GTCÄCTGTGG GTGTGGAATA CCGGCCTGTO GTGGCTGACC TCGCAGCCTC CCCCCCÄÄGC GTGCCCCCTC GCGGAÄÄCTT CACTCTGACC TOCCGTGCAG AGGCCTGGCC TCCAGCCCAG ATCÄGCTGGC 6CGCGCCCCC GGGAGCTCTC AACCTCGGTC TCTCGAGCÄA GAAGÄGCACG CTGACCGTOG CGGGTGCCAT GGGCAGCCAT ggtggcgägt atgägtccgc agccaccäät gcgcätgkc gccacgcacg gcgcätcacg GTGCCCGTGG CCGGTCCÄTG gctgtogotc gctotoggcg gtgcggcagg gggcgcggcg ctoctggccg CäGQGGCCGG cctogccttc tacgtgcagt ccaccgctto cääcaaggga GAGTACAACG tccaqgaggc tcagwctca ggcgäggcgg tgtotctcaa tggcgcgggc gggacäccgg gtgcagaagg cggägcäcag acccccggcä ctgccqägtc ACCTGCAGAT GGCGAGGTIT TCGCCATCCA GCTGACÄTCT TCCTGÄSCCT GTATCCAGCT CCCCCAGGGG CCTCQAÄÄGC ÄCÄCGGGTGG ÄCGTÄTGTAT TGTTCÄCTCT CTATTTATTC AACTCCAGG5 GCGTCGTCCC CGTmCTÄC CCATTCCCTT AATAAASTTT CTATÄGGÄSÄ ÄÄÄAÄÄÄAÄA ÄÄAAÄÄAAAA ÄÄÄÄÄAAAÄÄ AÄÄIAÄÄAAÄ (2) In formácie pre SEQ ID NO: 11:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 222 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:

1440

1500

1560

1620

168D

1740

1800

1860

1920

1380

2040

2100

2160

2220

2280

3240

2400

2460

2520

2550 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 10:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 2550 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

CCTCTGCCTC CTTCGCÄGCC GCAGGÄCCCC GAGCGAQCCT CGAXGTCTCG TAGGCGAGCC GCGCGCAGÄG AGGATCACAG CACGGCTTGG GACTGTTTOC CCTCCÄCTT7 CCCCGAGCCT GTOÄCTTGCA CTTTGGATGG GGAGATCÄGA GGCTTCATCC ACAGCTACAG CAWTGÄÄGÄ

TGTÄ&GTOAC AACTTCACCT CÄCATTOACC TTCCTGCGÄG ÄCCCCGAGCT CWGGTGCGA

GGCČAATTTC TCA7GCC7CG AAACAGCTCA GCCCCCAGAC TATTOCCCCA CGATTCCTÄ3 ÄCTGT7TCCT GCCCCÄGAAG TAÄTGTOACC CTCGACGGGG ACAGGAAGGC ACCAAACAGC

TGAGCTGCÄG GGTCCCGGGG GCGGCCAGGA GCTCATTCGC TOCTCACCGC CACGGTCC7G CGGÄGCTTGA CCTGCGGCCA AGCTCCGCAC GTTTGCCATO AAGTGGGCTC AGAÄÄGGCCG CCGGGGTTTA CCTCTCTCTG AGAGCCTTCT GGCCACTGCC TGATGTGCAT CGTOACCCTC «0

120

180

240

300

350

420

480

540

AÄTTCGÄTCA CTCGCGCTCC CCTCGCCTTC TCCGCTCTCC CCTCCCTGGC AGCGGCGGCA60

ÄTCCCGGGGC C7TCACCÄGG CCTGCGCCGA ÄCGCTCCTCG GCCTCTGGGC TGCCCTGGGC120

CTGGSGATCC TAGGCATCTC AGCCÍTCGCG CTAGAACCTT TCTGGSCGGA CCTTCAGCCC150

CGCGTOGCGC TCGTGGAGCG CGGGGGCTCG CTGTOGCTCA ÄC222 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 12:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 292 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

TGTGÄÄGCTC GCACCCCTCC CTCCTTG3CÄ GCCGGTOGGC CAGÄÄCTTCA CCCTGCGCTG60

CCÄAGTGGÄG GGTGGGTCOC CCK5ACCAC CCTCA2CCTG GTCCTGCTTC CCTOGGÄGGÄ120

GGÄGC7GÄGC CGGCÄGCCCG CÄCTGGÄ5GÄ GCCÄGCGGÄG GTCÄCTGCCA CTOTOCTOGC1S0

CAGCAGÄCÄC GACCäCGGÄG CC2CTTTCTC ATOCC3CÄCA GAACTC-GACA TOCAGCCCCÄ240

GGGGCTGGGÄ CTGTTCGTGÄ äCACCTCÄGC CCCCCGCCAG CTCCGAACCľ Tľ252 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 13:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 105 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:

GGGGGCGÄÄA GCAGGGAGAC CCAGGAAÄÄC CTGACTGTCT ÄCAGCTTCCC GGCTCCTCTT

500

CTGACTTTAA GTGAGCCAGA AGCCCCCGAG

GGÄAÄGA7GG TGACCGTAAG CTGCTGGGCA

660

GGGGCCCGAG CCCTTGTCAC CTTGOAGGGA ATTCCAGCTG CGGTCCCTGG

OCÄCCCCGCT

720

GÄGCTCCAGT TAÄATGTCÄC ÄÄAGÄÄTGAC GACAAGCGGG

GCTTCTTCTG CGXCSCTGCC

780

CTCGÄTGTGG ACGGGGAÄAC TCTGAGAAAG

AACCAGÄGCT CTGACCTTCG

TCTTCTGTÄC

840

GCÄCCTCGGC TGGATGACTT GCACTGTCCC

AGGAGCTGGA CGTGGCCÄGA GGGTCCAGAG

30Ď

CAGACCCTCC ACTGCGAGGC COGTCGAAäC

CCTCACCCCT CCGTGCACTG TGCAÄGGCCT

360

GACGGTGGGG cggtgctägc gctgggcctg

TTGGGTCCÄG TGACCCGTGC CCTCGCGGGC

1020

ACTTACCGAT GTÄCAGCÄAT CAATCGGCAA GGCCÄGGCGG

TCAÄGGATGT GACCCTOÄCT

1080

Pro

λιρ Λτσ

Val

G1U

Leu

V41

Pro

Leu Pro Pro Trp

Gin

Pro Val

Gly

l

5

10

15

Glu

Asn

Phe

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Val Pro Gly Ala Gly

Pro Arg

Ala

20

2S

30

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly Gly Gin

Glu

Leu

íle Arg

Arg

35

40

45

Ser

Phe

Val

Gly Glu

Pro

Pro Ara

Ala Arg Cys

Ala

Hec

Leu Thr

Ala

50

55

60

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Arg

Glu

Aap

His Arg Asp

Asn

Phe

Ser cys

Leu

65

70

7S

ao

Ala

Glu

Leu

Asp

Leu

Arg

Thr

HiB

Gly Leu Gly

Leu

Phe

Ala Asn

Ser

BS

90

95

sex

Ala

Pro

Arg

Gin

Leu

Arg

Thr

Phe

100

105

GCCÄCTTÄCC GA7CCGÄAGC CATCAACGCC

AGGG3A7CW CGGCCAAÄÄA TG7GGCTGTC

1320 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 14:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:

gaactcgacc ccatgcctcc ACirrec ₂₂ (2) Informácie pre SEQ ID NO: 15:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 30 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (xi) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:

CCATAAGCrr TATTCCACCG TCACACCCAC 3 C (2) Informácie pre SEQ ID NO: 16:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 18 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

AACOTSCCGGA GCTCTCK ..

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 17:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:

ACGGAATTO3 AACCCATCAA CGCCAAGG 77 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 18:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

CATGAATTCC GMTGTTGAG TGGGATG 27 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 19:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

ATAGAATTCC TCGGGACACC TGTAGCC 27 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 20:

(i) charakterizácia sekvencie (A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:

CARGGTOACA AGGCCTCG 10 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 21:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:

TATGAATTCA GTTGAGCCAC AGCGAGC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 22:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:

CCGGGTCCTA GAGGTGGACA CGCA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 23:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:

TGCAGTGTCT CCTGCCTCTG CTTC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 24:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 992 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

GCGAÄAACCG GGAOACCCGG GÄGAACtnUÄ CCÄTCTAOG CTTCCCGGCÄ. CCACTCC7GA CCCTGAGCGA. ACCCAGCGTC TCCGÄGGÍGC ACATGGIGÄC AGTJACCTGC. GCACCTOGGG CCCAAGCTCT GGTCACACTG GAGGGAGTTC CA5CCGCGGT CCCGGGGCAG CCCGCCCÄGC TTCACCTAAÄ TGCCACCGÄG AACGACGžCA gacgcagctt cttctccgac GCCÄCCCTCG ATGTGGACGG GGAGACCCTG ATCäAGAAGA GGAGCGCäCA GCTTCGTGTC CTATACGCTC CCCGGCTÄGÄ CGATTCGGAC TCCCCCAGGA GTrJCACtTM GCCCGÄCGGC CCÄGAGCÄGA CmCTCCGCTG CGÄGGCCCGC GGGAACCiAO ÍACCCTCAG7 CCÄCTGTGCG CGC7CCGACG GCGGGGCCGT GC7GGCTCTG G3CCTGC77XJ GTG^AGTCäC tggggcgctc tcwjgcactt ÄCCCC7GCÄA GGCGGCCÄÄT GA7CAAMCG AGGCGGTCÄA GGACGTAACG CTAÄCGG7GG ÄGTACGCÄCC AGCGCHKAC ÄSCGTGGGCT GCCCíGÄÄCG CATtACTTGG CTGGÄfiGGÄA CAGAAGCC7C GCTGÄGCTGT GTG-SCGCACG GGGTäCCGCC GCCTGATG7G ÄTCIGCGTGC GCTC7GGÄCA ACTCGGGGCC GTCATCCAGG GGCTGTTGCO TCTGGCCCGG GÄGCATGCGG CCSCTTÄCCG CTGCGAAGCC ACCAACCGTC GCCCCTCTCC GGCCÄAÄAAT GTGGCCGTCA

120

1B0

240

100

360

420 «40

540

600

660

720

740

CGGTOGAATA TGGCCCCÄGG TTXAGGAGC CGÄCCTGCCC CAGCAATTGG ACATGGGTGS840

ArGGATCTTJG GCGCC7G7T7 TCCÄG7GAGG TCGA7GGGAA GCCACAGCCA ÄGCG7GAAST900

GCG7GGCCTC CGGGGGCACC ÄCTGAMGGG TSC7GCTGCC GCTCGCACeC CCiGACCCTA9 60

GTCCCÍ.GLÄGC TCCCACÄATC CCTäGIGTCí: TG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 25:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 2775 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:

CCAGCCTCGC GTGGCGTTCG 7GGAGCGCGG CGGC7CGCTG TGGCTGÄÄTT CCÄSCACCAÄ 60 CTGCeCTCOG CCGGÄJ3CGCG GTCGCCTGGA GACCTCGCTG CGCCGAÄACG GGÄCCCÄGAG 120 ©GGTTIÚCGT TGGTTGGCGC GOCAGCTGGT GGACATTCCC GÄGCCGGAGA CTCAGCCCGT 140 CTOCTTCTTC CGCTGCGCGC G3CCCACÄCT ACAGGCGCG7 GGGCTCATTC GCACTITCCA 240 GCGACCAGAT CGCGTAGAGC TCATGCCGCT GCCTCCCTOG CAGCCGGTGG GCGÄGAACTT 300 CÄCCCTGÄGC TGTACGGTCC CCG3CGCCGG GCCCCGTGCG AGCCTCACGC TGACCCTGCT 360 GCGGGGCGCC CAGGAGCTGÄ TCCGCCGCAG CTTCGCCGGT GÄACCACCCC GAGCGCGGGG 420 CGCGGTGCTC ACAGCCÄCGC TACTGCCTCG GäSGGäGGAC CATGGAGCCA ATTTCTCGTG 440 TCBCCCCGAe CTGGACCTeC GGCCGCÄCGG ACTGGGACTC TTTQAAAACA GCTCGGCCCC 54 0

CAGAGABCK CGAXCCTTCT CCCT3TCTCC CTTO&AGTT GGCTCGGAAA GGCCCGTGAJ3 AGÄGGCCAG3 GTCTACCTCG CACTGGGGGA AGGGGACGCA TTCGTCGCCA CTCCCACAGC GCAGCTGGTC TCCAACOTCA CCCTGGGGG3 CATCTACACC TTCCCGGCAC CACTCCTCäC GATGGTGäCä ctaäcctscc cagctggggc AGCCGCGGTC CCGGGGCAGC CCGCCCÄGCT ACGCÄGCTTC TTCTCCGACG CCÄCCCTCGA GAGCGCÄGAG CTTCGTGTCC 2ATACGCTCC TIGGÄCGTCG CCCGAGGGCC CÄSASCAGAC ACCCTCAGTG CACTGTGCGC GCTCCGACGG TCCAGTCACT CGGGCGCTCT CAGGCACTTA GGCGGTCAAG GACGTAACCC TAÄCGGTGGA CCCHSAACGC ATTACTTCGC TGGAGGGÄAC GGTACCGCCG CCTGATGTGA TCTCCCTGCG GCTGTTGCGT GTCGCCCGGG AGCATCCGGG GGGCTCTGCG GCCAAAÄATC TGGCCGTCAC GÄGCTGCCCC AOCAXTTGGA CÄTGGGTCGA CGATOGGAÄG CCÄCAGCCAA GCSTGAAOTG acncnscco ctogcacccc cagaccctao GGCACCCGGT ATCTÄCGTCT GCAÄCGCCÄC CGTCGTCAGC GCGGAGTCGC CÄCCGGAfiAT GTGGCTGGÄA GGGGCTGAGG CTTCCCCGCT

GGATGCCCCG CGCCTCGCTG CTCCCCGGCT 601 CTGCACTCTC GACGGACTCT TTCCAGCCTC 6«0 CCAGAATCTC AGTCCTGATG TCACCCTCGA 720 CACAGCTAGC GCAGAGCAjGG AGGGTGCCAG 780 CGAAXACCGG GAGACCCGGG AGÄACGTGAC 84 0 CCTCAGCGAA CCCAGCGTCT CCGAGGGGCA 900 CCAÄGCTCTG GTCACACTGG AGGGAGTTCC 960 TCAGCTÄÄAT GCCACCGAGA ACGACCÄCAG 1020 TCTGGACGGG GAäÄCCCtga TCÄAGÄÄCÄ3 10S0 CCGCCTAGAC GATTCGGACT GCCCGAGGÄO 1140 GCTGCGCTCC GÄGGCCCGCG GGÄACCCAGA 1200 CGGGGCCGTG CTGGCTCTCS GCCTGCTGGG I2Í0 CCGCTCCÄÄG GCGGCCAATG ATCÄAGGCGA 1320 GTACGCACCA GCGCTGGACA GCGTGGGCTC 1380 ZGAACCCTCG CTGAGCTCTG 7GGCGCACGG 1440 CTCTGGAGAA CTCGGGGCCG TCÄTCGAGGG 1500 CACTTÄCCGC TCCGAÄGCCA CCAÄCCCTCG 1560 CGTGGAATAT GGCCCCAGST TTCĽUPSAGCC 2<20 AGGÄTCTCCG CGCCTGTTTT CCTGTGAGGT 1480 COTCGGCTCC GGGGGCACCA CTGAGGGGGT 1740 TCCCAGiGCT CCCAOAATCC CTAOAGTCCT 1800 CAACCGCCAC GGCTCCGTCG CCAAAACM3T 1860 GGATCAÄTCT ACCTCCCCAA GTCACCAGAC 1920 GGCCTGCCCC GCCCGGCGTC GCCCTTCCCC 1960

AGGAGTGCGC TGCTCTCGGG AAGGCATCCC GGACGCGGGC ACTTACCACT GTGTGGCCAC CACTGTGGGC CrTGGÄATACC GGCCAGTGOT CGTGCGCCCA OGAGGAAÄCT TCACCTTGAC GATCAGCTGG CGCGCGCCCC CGAGÔSCCCT actcagcgto gcagscgccm tgggaägcca CGCGCACGGG CGCCACGCGC GGCGCATCAC CGCCGTGGGC GOCGCGGCGG GGGGCCCGGC CTACGTGCAG TCCACCGCCT GCAAGAAGGG AGGCGÄGGCC GTGTGTCTGA ACGGACCGGG GGGCGGACCC GAGGCGGCGG GGGGCCCGGC CATACňGCK ACATO3GCGT GAGCCCGCTC CTCACACGW GCC7TA7TTÄ TTGCTTTATT

ACTCCAAGGG AATTC

ATOGCCTGAG CAGCAGCGCG TCTCCCGAGA 2010 CAATCCGCAT GGCACGGACT CCCGGACCCT 2100 GGCCGÄAC7T GCTOCCTCCC CCCCTGGAGG 2160 CTCCCGCGCG CAGGCCTGCC CTCCAGCCCA 2230 CAACATCGGC CTGTCGAGCA ACAACAGCAC 2280 CGGCGGCGAS TÄCGASTGCG CACGCACCM 2360 GGTCCGCGTG GCCGGTCCGT GGCTATOGGT 2400 GCTCCTGGCC GCGGGGGCCG GCCTGGCCTT 24 $0 CGÄGTACAAC GTGCAMAGG CCGAGAGCTC 2520 CGGCGGCGCT GGCGGGGCGG CÄGGCGCGGA 2580 CGXGTCGCCG GCGGAGGGCG AGGTCTTCGC 2640 CCCTCTCCGC &3GCCGGGAC GCCCCCCAGA 2700 TATTTAC7TA TTCATTTÄTT TATGTATTCA 2760

2775 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 26:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 1557 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 26:

CGCCCTCTCC TCGCCTCCTC TCCTTCCCCC GCCGCS5CGA TCCGAGGGCC TTCGCCAGGG

CTGCCCCGGG CCCTACTCGG CCTCTGGGCT CCGGTCTCGC AGGAGCCCTT CTGGGCCGAC GGGGCCTCGC TCTGGCTGAA TTGCÄGCACC GAGACCTCGC TGCGCCGAAA CGGGACCCAG GTCGACÄTTC GCGAGCCGGA GACTCÄGCCC CTACAGGCGC GTGGGCTCAT TCGCACTITC CTCCCTCCCT GGCAGCCGGT GGGCGAGAAC BGGCCCCGTO CGAGCCTCAC GCTGACCCTC ACCZTCGCCO GTGAACCÄCC CCGAGCGCGG CGGAGGGAGG ACCA7GGACC CAATITCTCC GGACTGCGAC TGTTIGAAAA CAGCTCG3CC CCGGÄTGCCC CCCGCCTCGC TCCTCCCCGG AGCTGCXCTC TGGACGGACT GTCTCCÄSCC GACCÄttAATC TGAGTCCTGA TOTCACCCTC GCCACAGCTA GCGCAGÄGCÄ GGAGGGTGCC GGCGAAAACC GGGACACCCG GCXGAAMTG ACCCTGACCG AACCCAGCCT CTCCGAGGW GCCCAÄGCTC TGGTCACACT GGACGGA5TT CTTCACCTAA. ATGCCACCGÄ CAACGACGÄC GATGTGGACG GGGAGACCCT GATCAXGAAC CCCCGGCTAG ACGATTCGGA CTOCCCCAGG ACGCTCCCCT GCGAGGCCCG CGGGAACCCA GGCGGGGCCG TOCTGGCTCT GGGCCTGCTG TACCGCTGCA AGGCGGCCAA TGATCAAKC GAGTACGCAC CAGCGCTGGA CAGCGTtWGC

GCTCTGGGCC TGGGGCXCTT CGGCCTCTCA120

CTGCAGCCTC GCGTGCCGTT CGTGGAGCGC180

AACTGCCCTC GGCCGGAGCG CGGTGGCCTG240

AGGGGTTTGC OTTGGTXGGC GCGGCAGCTG300

GTCTGCTTCT TCCGCTCCGC GCGGCGCÄCÄ360

CÄGCGÄCCAG ATCGCGTAGA GCTQATGCCG430

TTCACCCTGA GCTGTÄGGGT CCCCGGCGCC<»o

CTGCGGGGCG CCCAGGAGCT GATCCGCCGC540

CGCGCGOTGC TCACAGCCAC GGTACTGGCT«00

TCTCGCGCCG ÄGCTGGACCT GCGGCCGCAC6<0

CCCAGAGÄCC TCCGAACCTT CTCCCTCTCT720

CTCTIGGAAG mKCTCGGÄ AAGGCCCGTC710

TCAGAGGCCA GGGTCTACCT CGCACTOGGG840

GAAGGGGACG CATTCGTGGC CACTGCCACA900

ACGCAGCTGG TCTGCAACGT CACCCTGOGGMO

ACCÄTCTACA GCTTCCCCGC ACCÄCTCCTG1020

CAGATGGTGA CAGTÄACCTG CGCAGCTGGG1080

CCAGCCGCCG TCCCGGGGCA GCCCGCCCAG1140

ACACGCÄGCT TCTTCTGCGA CGCCACCCTC1200

ÄGGAGCGCAG AGCTTCGTGT CCTATACGCT12í 0

AGTTGGACGT GGCCCGAGGG CCCACAGCAG1320

GAACCCTGÄG TOCACTGTGC GCGCTCCGAC1380

GGTCCAGTCA CTCGGGCGCT CTCÄGGCACT 14 4 0

GAGGCGGTCA AGGACGTAAC GCTAACGGTG1S00

TCCCCAGiAC GCATTACTTG GCTOGAG1557 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 27:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 2927 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (ix) charakteristika:

(A) názov/kľúč: CDS (B) umiestenie: 40..2814 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:

CGCGCTCTCC TCGCCTCCTG TCCTTTCCCC GCCQCGGCG ATG CCA GGG CCT TCG54

Mec pro Gly Pxo s<r

L5

CCA GGG CTG CGC CGG CCG C7A CTC GCC CTC TGG GCT GCT CTG CGC CTG102

Pro Gly L«u Axj Arg Ala Uu Uu Gly Leu Tqp Ala Ala Ĺ«u Cly Leu

1520

CGG CTC TTC GGC CTC TCA GCG GTC TCG CAG GAG CCC TTC TGG CCG GAC150

Gly Leu Phe Gly Lea Ser Ala Val Ser Gin Glu Pro Phe Τϊρ Al* Aep

3035

CTG CAG CCT CGC GTG GCG TTC CTG GAC CGC GGG GGC TCG CTG TGG CTG

198

Leu Cln

Pro Arg Val 40

Ala

Phe val 45

Glu

Arg

Gly Gly Ser Leu Trp 50

Leu

AAT

TGC

AGC

ACC

AAC

TCC

CCT

CGG

CCC

GAG

CGC GGT

GGC

CTO

ACC

246

Aan

Cy· 55

Ser

Thr

Aen

cy·

Pro (0

Arg

Pro

Glu

Arg

Gly 65

Gly

Uu

Glu

Thr

TCG

CTG

CGC

CGA

AAC

CGG

ACC

CAC

AGG

GCT

TTC

CCT

TGG

TTC

CCG

CGG

394

Ser 70

Leu

Arg

Arg

Aen

Gly Thr 75

Gin

Arg

Gly

Leu 80

Arg

Trp

Leu

Ala

Arg BS

CAG

CTG

GTG

GAC

ATT

CGC

GAG

CCG

GAG

ACT

CAG

CCC

CTC

TGC

TTC

TTC

342

Gin

Leu

Val

Aep

XI e 90

Arg

Glu

Pro

Glu

Thr »S

Gin

Pro

Val

Cy*

Pha 100

Pha

CGC

TGC

GCG

CGG

CGC

ACA

CTÄ

CAG

GCG

CCT

GGG

CTC

ATT

CCC ACT TTC

390

Arfl

cy·

Ala

Arg 105

Arg

Thr

Leu

Gin

Ala 110

Arg Gly

Leu

11·

Arg 115

Thr

Phe

CAG

CGA

CCA

GAT

CGC

GTA

GAG

CTC

ATC

CCC

CTC

CCT

CCC

TGG

CAG

CCG

436

Cln

Arg

Pro 120

Aep

Arg

Val

Glu

Leu 125

Kcc

Pro

Leu

Pro

Pro 130

Trp

Cln

Pro

GTG

GGC

GAG

AAC

TTC

ACC

CTG

AGC

TGT

AGC

GTC

CCC

GGC

GCC

GGG

αχ

486

val

Gly 13S

Glu

Am

Phe

Thr

Leu 110

Ser

Cy.

Arg

Val

Pro 145

Gly

Ala

Gly

Pro

CCT

GCG

AGC

CTC

ACG

CTG

ACC

CTG

CTG

CGG

GGC

GCC

CAG

GAG

CTG

ATC

514

Arg 150

Ala

Ser

Leu

Thr

Leu 153

Thr

Leu

Uu

Arg

Gly 160

Ala

Gin

Glu

Leu

Íle 165

CGC

CGC

ACC

TTC

GCC

GGT.

GAA

CCA

CCC

CGA

GCG

CGG

GGC

GCG

GTG

CTC

582

Arg

Arg

Ser

Phe

Ala 170

Gly

Glu

Pro

Pro

Arg 17S

Ale

Arg

Gly

Ala

V«1 180

Leu

ACA

GCC

ACG

GTA

CTG

GCT

CGG

AGG

GAC

GAC

CAT

GGA

GCC

AAT

TTC

TCG

630

Thr

AJa

Thr

Vel 185

Leu

Ala

Arg

Arg

Glu 130

Aep

Hl*

Gly

Ala

Aen 195

Phe

Ser

TGT

CGC

GCC

GAG

CTC

GAC

CTC

CGG

CCG

CAC

GGA

CTG

GCA

CTC

TTT

GAA

«71

cys

Arg

AJ* 200

G1U

L4U

A*P

Leu

Arg 205

Pro

Hl·

Gly

Leu

Gly 210

Leu

Phe

Glu

AAC

AGC

TCG

GCC

CCC

AGA

GAG

CTC

CGA

ACC

TTC

TCC

CTC

TCT

CCG

GAT

726

Ae.n

Ser 215

Ser

Ale

Pro

Arg

Glu 220

Leu

Arg

Phe

Ser 225

Leu

Ser

Pro

Aap

GCC Ala 230

CCG CGC CTC GCT

GCT Ala 335

CCC CGG CTC TTC GAA GTT GGC TCG GAA AGG

774

Pro

Arg Leu Ala

Pro

Arg

Leu Leu

Glu 240

Val

Gly

Ser Glu Arg 245

CCC

GTC

A0C

TCC

ACT

CTC

BAC

GGA

CTG

TTT

CCA

GCC

TCA

GAG

GCC

AGG

822

Pro

Val

Ser

Cy.

Thr

Leu

Aí?

Gly

Lau

Phe

Pro

Ala

Ser

Glu

Ala

Arg

250

25$

360

GTC

TAC

CTC

GCA

CTG

GGG

GAC

CAG

AAT

CTG

AGT

CCT

GAT

GTC

ACC

CTC

870

Val

Tyr

Leu

Ale

Leu

Gly Aep

Gin

Aen

Leu

Ser

Pro

Asp

Val

Thr

Leu

265

270

275

GAA

GCG

GAC

GCA

TTC

GTC

GCC

ACT

GCC

ACA

GCC

ACA

GCT

AGC

GCA

GAG

916

GJu

Gly

Aep

Ala

Phe

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

Ser

Ala

Glu

280

265

290

CAG

GAG

GGT

GCC

AGG

CUi

CTC

GTC

TGC

AAC

GTC

ACC

CTG GGG

GGC

GAA

966

Gin

Glu

Gly

Ala

Arg

Gin

Leu

Val

cy·

Asn

Val

Thr

Leu

Gly Gly

Glu

29S

300

305

AAC

CGG

GAC

ACC

CGG

GAG

AAC

GTG

ACC

ATC

TAC

ABC

TTC

CCG

CCA

CCA

1014

Aen

Arg

Glu

Thr

Arg

Glu

A*3

Val

Thr

Íle

Tyr

Ser

Phe

Pro

Ala

Pro

310

3XS

320

325

CTC

CTG

ACC

CTC

AGC

GAA

CCC

AGC

GTC

TCC

GAG

GGG

CAC

ATC

GTC

ACA

1062

Leu

Leu

Thr

Leu

Ser

Glu

Pro

Ser

Val

Ser

Glu

Gly Gin

Nec

Val

Thr

330

335

34 0

GTA

ACC

TGC

GCA

GCT

GGG

GCC

CAA

GCT

CTG

GTC

ACA

CTG

GAG

GGA

GTT

1110

Val

Thr

Cy·

Ala

Ala

Gly

Ala

Gin

Ale

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Gly

Val

345

350

355

CCA

GCC

GCG

GTC

CCG

GGG

CA2

CCC

GCC

CAG

CTT

CAG

CTA

AAT

GCC

ACC

1158

Pro

Ala

Ala

val

Pro

Gly

Gin

Pro

Ala

Gin

Leu

Gin

Leu

Asn

Ala

Thr

360

365

370

GAG

AAC

GAC

GAC

AGA

CGC

AGC

TTC

TTC

TOC

GAC

CCC

ACC

CTC

GAT

GTC

1206

Glu

Aen

Aep Asp Arg

Arg

Ser

Phe

Phe

cy·

Aep

Ala

Thr

Leu

Aep

Val

375

360

385

GAC

GGG

GAG

ACC

CTG

ATC

AAG

AAC

AGG

AGC

GCA GAG

CTT CGT

GTC

CTA

1254

Aep

Gly

Glu

Thr

Leu

íle

Lys

Aen

Arg

Ser

Ale

Glu

Leu

Arg

Val

Leu

390

395

400

405

TAC

GCT

CCC

CGG

CTÄ

GAC

CAT

TCG

CAC

TCC

CCC

AGG

AGT

TGG

ACG

TCG

1302

Tyr

Ala

Pro

Arg

Leu

Aep Asp

Ser

Aep

cys

pro

Arg

Ser

Tx-p

Thr

Trp

410

415

420

CCC

GAC

GGC

CCA

GAG

CAG

ACG

CTG

CGC

TCC

GÄG

CCC

CGC

CGG

AAC

CCA

1350

pro

Glu

Gly

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

Arg

cy·

Glu

Ala

Arg

Gly

Asn

Pro

42S

430

<35

GAA

CCC

TCA

GTG

CAC

TGT

GCG

CGC

TCC

GAC

GGC

GGG

GCC

GTG

CTG

CCT

1398

Glu

Pro

Ser

Val

Hie

Cye

Ala

Arg

Ser

Asp

Gly Gly

Ala

Val

Leu

Ala

440

445

450

CTC

GGC

CTG

CTG

GGT

CCA GTC ACT

CGG

GCG

CTC

TCA

GGC

ACT

TAC

CGC

1446

Uu

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro Val

Thr

Arg

Al*

Leu

Ser

Oly

Thr

Tyr

Arg

4*4

íín

4£R

TGC AAG GCG GCC AAT GAT CAA GGC GAG GCG GTC AAG GAC GTA ACO CTA cy» * ..... ’...... - 470

Lys Ala Ala Asn Aap Cln Gly Clu Ala Val Lys Aap Val Thr Leu *7S 480 485

ACG

Thr

GTG GAG TAC GCA CCA CCC CTC GAC AGC GTC GGC TGC CCA GAA CCC val Clu Tyr Ala Pro Ala Uu Aip Ser Val Gly Cys Pro GJu ‘ 490 49S 500

Ärg

ATT

ACT TGG CTG GAG GGA ACA CAA GCC TCG CTG AGC TGT GTG GCG lía Thr Trp Leu Glu Gly TFír Glu Ala Ser Leu Ser Cys Val Ala 505 510 515

Gly Thr Gii

CAC Hie

GOQ

GGG GTA CCG CCG CCT GAT GTG ATC TGC GTG CGC TCT GGA GAA CTC

Gly Val Pro Pro Pro Aep val íle Cys val Arg Ser Gly Glu Leu Gly 520 525 S30

GCC GTC ATC GAG CGG CTG TTG CGT GTG GCC CGG GAG CAT GCG GGC ACT Ala Val íle Glu Gly Leu Leu Arg Val Ala Arg Glu His Ala Gly Thr 535 5*0 545

149*

Met 1

Pro Gly

Pro Ser Pro Gly Leu Arg Arg Ala

Leu Leu

Gly

Leu 1S

Trp

S

10

1542

Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Phe

Gly

Leu

Ser

Ala

val

Ser

Gin

Glu

20

25

30

1590

Pro

Phe

Trp

Ala

Aep

Leu

Gin

Pro

Arg

Val

Ala

Phe

Val

Glu

Arg

Gly

35

40

45

1638

Gly

Ser SO

Leu

Trp

Leu

Asn

Cys ss

Ser

Thr

Aen

Cye

Pro 60

Arg

Pro

Glu

Arg

Gly Gly

Leu

Glu

Thr

Ser

Leu

Arg

Axg

Asn

G3y

mr

Gin

Arg Gly

Leu

268«

65

70

75

80

Arg

Trp

Leu

Ala

Arg

Gin

Leu

Val

Asp

Xle

Arg

Glu

Pro

Glu

Thr

Gin

11W

TAC CGC TGC GAA GCC ACC Tyí Arg Cy· Glu Al.

S50 ______;C CCT CCG GGC TCT GCG GCC AAA AAT GTG Thr Aan Pro Arg Gly Ser Ala Ala Lys Aan Val SSS S60 S6S

1781

Pro Val Cys Phe Phe Arg Cys Als Arg Arg Thr Leu Gin Ala

100 105 110

Arg Gly

1B3C

GTC GAT GGG AAG CCA CW CCA AGC GTG AAG TCC GTG GGC TCC GGG GCC Val Aep Cly Ly» Pro Gla Pro Ser Val - - - . -«

600 605 »N

Lye Cy» Val Gly Sar Gly Gly

610

1871

PTO US

Leu

Pro

íle

Arg

Thr

Phe

Gin

Arg

Pro

Asp

Arg

Val

Glu

Leu

Met

Pro

115

120

125

Pro

Trp

Gin

Pro

Val

Gly

G1U

Aen

Phe

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

130

135

140

Gly

Ala

Cly

Pro

Arg

Ala

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

150

155

Leu

Val

Gly

160

ACC ACT GAG GGG GTC CTG CTG CCG CTG Thr Thr Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu 615 630

GCA CCC CCA GAC CCT AGT CCC Ala Pro Pro ASp

625

Pro Ser Pro

AGA GCT CCC AGA ATC CCT AGA GTC CTC Arg Ala Pro Arg íle

630

Pro Arg Val Leu

635

GCA CCC GGT ATC

Ala Pro Cly Xle 640

TAC GTC TGC

Tyr val cys

6*5

AAC GCC ACC AAC CGC

Aan Alt Thr Asn Arg

6S0

CAC GGC TCC GTC Hit Gly Ser Val

GTC GTG AGC Val Val Ser

660

1926

Ala

Gin

Glu

Leu

íle

Arg

Arg

Ser

Phe

Ala

Gly

Glu

Pro

165

170

1974

Arg

Gly

Ala

Val 180

Leu

Thr

Ala

Thr

Val 185

Leu

Ala

Arg

Arg

Gly

Ala

Asn

Phe

Ser

Cys

Arg

Ala

Glu

Leu

ASp

Leu

Arg

2022

195

200

205

Pro Arg Ala

175

Glu Asp Ηίβ

190

Pro His Gly

GCG GAG TCC CCA CCG GLG ATC GAT GAA TCT ACC TGC CCA AGT CAC CAG

Ala Olu Ser Pro Pro Glu Asp Glu Ser Thr Cys Pro Ser Bis Gin 663 670 67S

2070

Leu Gly Leu Phe Glu Asn Ser

210 215

Ser Ala Pro Arg Glu Leu Arg Th:

220

Phe

2118

Sar Leu Ser Pro Aep Ala Pro Arg Leu Ala Ala Pro Arg Leu Leu Glu 225 230 235 240

GGT CGC CCT TCC CCA GGA GTG CGC TCC TCT CGG CAA GGC ATC CCA TGC

Gly Arg Pro Ser Pro Gly v«l Arg Cys Ser Arg Glu Gly íle Pro Trp 615 700 70S

2166

CCT CAC CAC CAG CCC GTC TCC CGA GAG GAC CCC GGC ACT TAC CAC TCT Pro Glu Gin Gin Arg Val Ser Arg Glu Aap Ala Cly Thr Tyr His Cys 710 715 720 72S

2214

Val	Gly	Ser	Glu	Arg	Pro	Val	Ser	Cys	Thr	Leu	ASp
				245					2SO
Ala	Ser	Glu	Ala	Arg	Val	Tyr	Leu	Ala	Leu	Gly	Asp
			260					26$
Pro	Asp	Val	Thr	Leu	Glu	Gly	Asp	Ala	Phe	Val	Ala

275

280

Gly Leu Phe Pro

25S

Gin Asn Leu ser

270

Thr Ala Thr Als 285

GTG GCC ACC AAT GCG CAT GGC ACG GAC TCC CGG ACC GTC ACT GTO GGC

Val Ala Thr Ain Ala His Gly Thr Asp Ser Arg Thr Val Thr Val Gly

730 735 740

2242

Thr Ala Ser Ala Glu Cln 290

Clu

295

Gly Ala Arg

Gin Leu Val Cys Asn Val

300

CTG GAA TAC CGC CCA CTG CTG GCC GAA CTT GCT CCC TCG CCC CCT GGA Val Glu Tyr Arg Pro Val Val Ala Clu Leu Ala Ala Ser Pro Pro Gly 745 750 755

2310

Thr Leu Cly Cly Glu Asn

305 310

Arg

Glu Thr Arg

Glu Asn Val Thr íle Tyr

315 320

GGC GTG CGC CCA GGA GGA AAC TTC ACG TTG ACC TGC CGC GCG GAG GCC

Gly val Arg Pro Gly Gly Asn Phe Thr Leu Thr Cys Arg Ala Glu Ala 760 765 770

2358

Ser Phe Pro Ala Pro Leu

325

U-j

Thr Leu Ser

330

Glu Pro Ser Val Ser Glu

335

TGG CCT CCA GCC CAG ATC AGC TGG CGC GCG CCC CCG AGG GCC CTC AAC Trp Pro - — - **

775

Pro Ale Gin lle Ser Trp Arg Ala Pro Pro Arg Ala Leu Aan

780 78S

2406

Cly Gin

Het Val Thr

340 val Thr cye Ala Ala

345

Gly Ala Gin Ala Leu Val

350

Thr Leu

ÄTC GGC CTC TCC AGC AAC AAC ACC ACA CTG ACC GTC GCA GGC GCC ATC Ila Cly Leu Ser Ser Asn Asn Ser Thr Leu Ser Val Ala Gly Ala Kat 790 795 B00 805

2*54

Glu Gly Val

355

Pro Ala Ala Val Pro

360

Gly Cln Pro Ala Gin Leu

365

Gin Leu

370

Asn Ala Thr

GGA AGC CAC GGC GGC GAG TAC GAG TGC GCA CGC ACC AAC GCG CAC GGG Gly Ser His Gly Cly Clu Tyr Glu Cys Ala Arg Thr Asn Ala His Gly

810 815 820

2502

CGC CAC GCG CGG CGC ÄTC ACG GTG CGC GTC GCC GGT CCG TGC CTA TGG

Arg His Ala Arg Arg Ila Thr Val Arg Val Ala Gly Pro Trp Leu Trp

82S 830 835

2550

GTC GCC GTG GCC GCC CCC GCC GGG GGC GCG GCG CTG CTG GCC GCG GGG Val Ala Val Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ala Ala Gly 8*0 8*5 850

2558

GCC GGC CTG GCC TTC TAC GTC CAG TCC ACC CCC TGC AAG AAG GCC GAG

Ala Gly Leu Ala Phe Tyr Val Gin Ser Thr Ala Cys Lye Lys Gly Glu B55 »60 865

Ala Phe Tyr Val Git »60

2446

TAC AAC GTG CAG GAG GCC GAG AGC TCA GGC GAG CCC GTG TGT CTC AAC Tyr Aan Val Gin Glu Ala - - 870 I7S

Glu Ser Ser Gly Clu Ala Val Cys Leu Asn

880 88S

269*

GGA GCG GGC GGC GGC GCT GGC GGG GCG CCA GGC GCG GAG GGC GGA CCC Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Aii

890

Ala Cly Ala Clu Cly Gly Pro

895 900

274 2

GAG GCG GCG GGG GGC GCG CCC GAG TCG CCG GCG GAG CGC GAG GTC TTC

Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Glu Ser Pro Ala Glu Cly Glu Val Phe 905 910 915

2790

GCC ATA CAG CTG ACA TCG GCC TGACCCCGCT CCCCTCTCCG CGGGCCGGGA Ala íle Gin Leu Thr Ser Ala

920

28*1

92S

2101

2J27 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 28:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 924 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 28:

Ala

Thr

Leu

Asp

Val

Asp

Gly

Glu

Thr

Leu

íle

Lys

Asn

Arg

Ser

Ala

385

390

39S

400

Glu

Leu

Arg

Val

Leu

Tyr

Ala

Pro

Arg

Leu

Asp

Asp

Ser

Asp

Cye

Pro

405

410

415

Arg

Ser

Trp

Thr

Trp

Pro

Glu

Gly

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

Arg

Cys

Glu

<20

425

430

Ala

Arg

Gly

Asn

Pro

Glu

Pro

Ser

Val

His

cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Gly

435

440

445

Gly

Ala

val

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Arg

Ala

Leu

450

455

460

ser

Gly

Thr

Tyr

Arg

cys

Lys

Ala

Ala

Asn

Asp

Gin

Gly

Glu

Ala

Val

465

470

475

4B0

Lys

Aep

Val

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

Tyr

Ala

Pro

Ala

Leu

ÄBp

Ser

Val

485

4 90

495

Gly

Cys

Pro

Glu

Arg

Xle

•Thr

Trp

Leu

Glu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ser

Leu

500

SOS

510

Ser

Cys

Val

Ala

His

Gly

Val

Pro

Pro

Pro

Asp

Val

Xle

Cys

Val

Arg

515

520

525

Ser

Gly

Glu

Leu

Gly

Ala

Val

lle

Glu

Cly

leu

Leu

Arg

Val

Ala

Arg

530

53$

540

Glu

His

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

Glu

Ala

Thr

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

545

550

555

560

Ala

Ala

Lys

Asn

Val

Ala

Val

Thr

Val

Glu

Tyr

Gly

Pro

Arg

Phe

Glu

S6S

570

575

Glu

Pro

Ser

Cys

Pro

Ser

Asn

Trp

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Ser

Gly

Arg

580

585

590

Leu

Phe

Ser

Cye

Glu

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Gin

Pro

Ser

Val

Lys

Cys

595

600

605

Val

Gly

Ser

Gly

Gly

Thr

Thr

Glu

Gly

Val

Leu

Leu

Pro

Leu

Ala

Pro

610

41$

620

Pro

Asp

Pro

Ser

Pro

Arg

Ala

Pro

Arg

íle

Pro

Arg

val

Leu

Ala

Pro

62S

630

635

640

Gly

íle

Tyr

Val

Cys

Aan

Ala

Thr

Asn

Arg

His

Gly

Ser

Val

Ala

Lys

645

650

655

Thr

Val

Val

Val

Ser

Ala

Glu

Ser

Pro

Pro

Glu

Met

Asp

Glu

Ser

Thr

¢¢0

670

665

Cys

Pro

Ser

His Gin

Thr

Trp

Leu

Glu Gly

Ala

Glu

Ala

Ser

Ala

Leu

675

600

685

Ala

Cys

Ala

Ala Arg

Gly

Arg

Pro

Ser Pro

Gly

Val

Arg

cys

Ser

Arg

690

655

700

Glu

Gly

íle

Pro Trp

Pro

Glu

Gin

Gin Arg

Val

Ser

Arg

Glu

Asp

Ala

705

710

11S

720

Gly

Thr

Tyr

His Cys

Val

Ala

Thr

Asn Ala

KÍ8

Gly

Thr

ASp

Ser

Arg

725

730

735

Thr

Val

Thr

Val Gly

Val

Glu

Tyr

Arg Pro

val

Val

Ala

Glu

Leu

Ala

740

74 5

750

Ala

Ser

Pro

Pro Gly

Gly

val

Arg

Pro Gly

Gly

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

755

760

765

Cys

Arg

Ala

Glu Ala

Trp

Pro

Pro

Ala Gin

Zle

Ser

Trp

Arg

Ala

Pro

770

715

780

Pro

Arg

Ala

Leu Asn

Zle

Gly

Leu

Ser Ser

Asn

A»n

Sar

Thr

Lau

Ser

785

790

795

800

Val

Al*

Gly

Ala Her

Gly

Ser

His

Cly Gly

Glu

Tyr

Glu

Cye

Ala

Arg

805

810

815

Thr

Asn

Ala

His Glv

Arg

His

Ala

Arg Arg

íle

Thr

Val

Arg

Val

Ala

820

825

830

Gly

Pro

Trp

Lau Trp

Val

Ala

Val

Gly Gly

Ala

Ala

Gly

Gly

Ala

Ala

835

840

845

Leu

Leu

Ala

Ala Gly

Ala

Gly

Leu

Ala Phe

Tyr

Val

Gin

Ser

Thr

Ala

850

£55

060

cys

Ly»

Lys

Gly Glu

Tvr

Asn

Val

Cln Glu

Ala

Glu

Ser

Ser

Gly

Glu

865

870

875

B80

Ala

Val

Cys

Leu Aen

Gly

Ala

Gly

Gly Gly

Ala

Gly

Gly

Ala

Ala

Gly

885

890

895

Ala

Glu

Cly

Gly Pro

Glu

Ala

Ala

Gly Gly

Ala

Ala

Glu

Ser

Pro

Ala

900

905

910

Clu

Gly

Glu

Val Phe

Ala

íle

Gin

Leu Thr

Ser

Ala

915 920 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 29:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 65 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:

CTXCTTACXS CATCCCCGCT CTCCCAGCA.G CCCTTCTGtM CGCACCTACA GCCTGCGTGCCCTTC ⁶ (2) Informácie pre SEQ ID NO: 30:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 31 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 30:

ATTTCrCTCG AjGATGGTCA CGTTCTCCCG C 31 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 31:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie, SEQ ID NO: 31:

ATrTCTCGAT CCTACACCTT CCCSGCACCA CTC 33 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 32:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 32 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:

ATrrCTCTCG ACTTCCACCC CCACAGTOAC ,GC 32 (2) Informácie pre SEQ ID NO, 33:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 1687 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 33:

GGÄTCCTTT3 XfiCCCTGAAA GTCGAGGTTS CAGTGAGCCT TGÄTCGTGCC ACTGCACTCC«0

ACCCTCGCGG ÄCAGÄCCACG ACCCTCTCTC CAAAAATÄÄÄ ΑΤΛΜΜΤΜ AAATAAATAT120 tggcgggggä accctctooa ätcaätaaac GCTrccrr>A ccagcctctc tcctgtgacciío

TAAGGGTCCG CATTACTGCC CTJĽ.'.CGGÄ GGÄACTOTTT ΊϋΓΠΤΤβΠ GTTGTICTTG240

TTTTTGCGAT CÄCTTTCTCC ÄÁGTTCCTTG TCTCCCTGÄG GGGMICTGAG GTITCCTCAC300

TCAGGGCCCA CCTGGGGTCC CGAAGCCCCA GACTCTGTGT ÄTCCCCÄGCG CGTGTCACAG360

AAACCTCTCC TTCTOCTGGC CTTATCSAGT CGGATCA3CG CGGCCGGCGA GAGCCACGGG<23

CWGGCCGGG GTQGGGTTCA TGGTATO5CT TTCCTCATTO GCGCCGCCGC CACCACGCCG<80

CAGCTCTGAT TGGATGTTAA CHTCCTATC CCASCCCCAC CTTCÄGACCC TOTGCTTrCCSíO

TGGAGGCCAA ACAACTGTGG AGCGÄGAACT CATCTCCAAA ATÄACTTÄCC ACGCTGGA£ŤT(SO

GAGACCACGA ÄTCGTGOGGA GGGGAGGGTC CCACGGACAT ÄTTGÄGGGAC CTGGATACGC660

AGAÄOAGSTA TCCATGTGGT GGCAGCCGGG AAGGGGTGAT CAGATGGICC ACAGGGAA7A720

TCACAAACTC GAATTCTGAC GATOTTCTGG TÄGTCACCCA CCCACATGAG CGCATGGAGT780

TGGCGOTGGC GGGTGTCAAA GCTTGGGGCC CGGAAGCOGA GTCÄÄAAGCA TCACCCTCGO840

TCCCTTGTTC TCGCGTG3AT GTCAfiCGCCT CCÄCCCÄCCG AGCAGÄÄGGC GGXCTCÄGGG500

GCCCTCCAGG GTGGCTCGAG CTCACACACG CIGACTACAC ÄCGTCCCCGC TGCACCCTOG560

GTAAATACAG ACCCGGAGCC GAGCGGATTC TAATTTAGAC GCCCGCGAAC GCTGCGCGCA1020

CGCACACGTS TCCTCGGCTC GCTOGCACTT TCGTCCCGCC CCCTCCGTCG CGTOCCGOAO1080

CTÚACCCGGA GGGGTGCTTA GAGGTATGGC TCCGCGGGGT CAÄAAGGAGÄ AGGATCAGTG1140

AGÄGÄGGATC CCCACÄCCCT CCCCTAGÄAC TGTCCrrTCC CCATCCAGTG CCTCCCÄAÄT1200

CTCTCTTAGT CCCCAAATGT ATCCCCGCCC TAAGGGGCGC TGGTGGGACG AGCTAAÄTGT1260

GGGG5CGGÄG CTCGGAGTCC ACC7TÄ7TAT CATCGCA7CT CAGCCAGGGC TGGGGTAGGG1320

GTTTGGGAAG GGCAACCCAG CAICCCCCGA TCCCAGAGTC GCGGCCGGGG ATGACGCGAG1380

AGAGCGTXJGT CGCCCCCtóÄ W3GCCCTOG3 CCÄTCATGCC GGCCTCCACG TAGACCCCAJ3144 0

GGGTCGCTCA CTCCTGCCAC CTCGCCTTCA CCAAGGCCAG GAGCTTAGCC CACGCTCGCC1500

TCCCGCCCCC CCSCCGCCTG TSCCGCCGCC CCCTGCTTCG AAACCAAGTT ACCAACGTTA1560

AACCÄATCCC CÄÄOCGCAAC TCTGTCTCCC CCACÄCCCCA CCCGCCGCGC CGCGCGGAGC1620

CGTCCTCTÄG CCCÄGCTCCT CGGCTCGCGC TCTCCTCGCC TCCTGTGCTT TCCCCGCCGC1680

GGCGATG ³-6fi7 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 34:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 36 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 34:

CAGAÄTTAÄS CTTACZvGGÄG GCGAGGAGÄG CGGGAG 35 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 35:

(i) charakterizácie sekvencie:

(A) dĺžka: 31 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 35:

CAACAATCCT ACCCAAGCCC AACTCTGTCT C 3] (2) Informácie pre SEQ ID NO: 36:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 31 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:

CAACAATCCT ASCCTTGGAA ÄCCAAGITAC C 31 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 37:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:

CAACAATGCT AGCAGGAGCT TAGCGCACGC TCC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 38:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 32 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:

CAACAATGCT AGCCATOCCG GCCTCCACGT AG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 39:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 31 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:

CAACAATGCT AGCGTCCAGC TTATTATCAT G (2) Informácie pre SEQ ID NO: 40:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 32 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 40:

CAACAATGCT AGCCTTAGTC CCC/AATCTA “C (2) Informácie pre SEQ ID NO: 41:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 30 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:

CAACAATGCT AGCGGAGAAG GATCAGTG.AG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 42:

(i) charakterizácia sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: jednoduchý (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 42:

CAACAATGCT AGCCTCCACC CACCGAGCAG fMl

4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že kvantifikácia väzby protilátky na ICAM-4 sa stanoví pomocou rádioimunologického stanovenia (RIA).

5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že kvantifikácia väzby protilátky na ICAM-4 sa stanoví pomocou enzymatického imunostanovenia na pevnom nosiči (ELISA).

6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že neuropatológia je mŕtvica.

7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že neuropatológia je epilepsia.

Koniec dokumentu

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob in vitro skríningu na neuropatológiu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa tieto kroky: a) kontaktovanie tekutej vzorky získanej od prvého indivídua s protilátkou špecificky imunoreaktívnou s ICAM-4, b) kvantifikáciu väzby protilátky na ICAM-4 vo vzorke a c) porovnanie väzby protilátky na ICAM-4 v prípade tohto indivídua s väzbou v prípade druhého indivídua, o ktorom je známe, že je bez neuropatológie.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tekutá vzorka je mozgovomiechový mok.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tekutá vzorka je sérum.