KR20140038396A - 다중돌연변이체 타우 단백질 변이체 및 인간 타우 병변을 재현하기 위한 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 17번 염색체 관련 파킨슨 증상 수반 전두측두엽 치매 (FTDP-17) 상태를 야기하는 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 포함하는 타우 단백질, 및 상기의 타우 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 신경변성 질환을 치료 또는 예방하는 제제를 확인하는 방법, 및 타우 병변을 재현하는 방법에 관한 것이다.

Description

다중돌연변이체 타우 단백질 변이체 및 인간 타우 병변을 재현하기 위한 그의 용도{POLYMUTANT TAU PROTEIN VARIANTS AND THEIR USE FOR RECAPITULATING HUMAN TAUOPATHIES}

단백질성 응집체의 축적은 초기 신경세포 기능장애 및 궁극적인 세포사를 특징으로 하는 만성 치매의 전부는 아니지만 대부분의 병리학적 홀마크 (hallmark)이다. 이름이 암시하는 것처럼 타우 병변 (tauopathy)에서, 이들 응집체는 본질적으로 미세소관-연관된 단백질 타우로 구성된 신경세포원섬유 엉킴 (neurofibrillary tangles; NFT)의 형태를 취한다. 비록 타우를 코딩하는 MAPT 유전자가 유전적으로 알츠하이머병 (AD)과 관련되지는 않지만, MAPT에서의 돌연변이는 유전적인 전측두엽 치매 (FTD)를 야기하며, 미스센스 돌연변이 (missense mutation)는 또한 진행성 핵상 마비, 피질기저 퇴행, 및 피크병 (Pick's disease)과 매우 유사한 상태에서 발견되었으며, 따라서 타우 항상성의 붕괴가 신경변성-유도된 치매를 야기하기에 충분하다는 증거를 제공한다 (van Swieten & Spillantini, 2007에서 검토됨). AD에서, 증가하고 있는 증거는 (야생형) 타우가 타우 단백질의 과인산화 및/또는 재분포에 의한 아베타/아밀로이드 독성을 매개하며 [Ittner et al. 2010; Zempel et al. 2010], 타우 수준의 감소가 AD 증상을 방지할 수 있다는 것을 시사한다 [Vossel et al. 2010]. 타우 돌연변이는 다양한 타우 이소형태의 상대적 비율을 변화시키며, 더욱 중요하게는 비정상적인 입체형태를 채택하며, 따라서 필라멘트로 응집하는 경향을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 타우-매개된 신경변성은 타우 입체형태의 비정상성(abnormality)에 의해서뿐만 아니라 정상적인 타우 기능의 상실로부터 기인할 수 있는 모든 유해한 결과로부터 유발된 기능의 독성 증가의 조합에 의해서 야기되는 것으로 예상된다. 불행하게도, 타우 입체형태의 비정상성이 개시되거나 신경세포사에 기여하는 정확한 기전은 완전히 이해되지 않았다. 병리기전의 기껏해야 단편적인 이해는 치료학적 개입을 위한 인증된 표적의 결여로 인한 약물 개발에 대한 막대한 장애를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 약물 개발은 시험관내 및 생체내에서 적어도 인간 타우 병변의 관점들을 확실하게 재현시킬 수 있는 기능적 모델에서 추구된다.

NFT는 타우 병변에서 가장 두드러진 병리학적 특징이기 때문에, 본질적으로 질병의 기전을 조사하기 위해서 NFT 병리학을 재현한 동물 모델을 사용하여 NFT의 침착이 어떻게 신경변성을 야기할 수 있는지를 이해하는데 많은 관심이 집중되고 있다. 필라멘트 및 NFT로의 타우의 응집은 기능의 독성 증가를 야기하는 것으로 오랫동안 가정되어 왔다. 이러한 관점은 실질적으로, 신경세포 손실 및 기억 손상이 NFT 형성이 진행되고 있음에도 불구하고 실험적으로 치료될 수 있다는 관찰결과에 의해서 이의가 제기되고 있다 [Santacruz et al. 2005]. 일부의 동물 모델에서, 신경세포의 타우-매개된 손실은 NFT 발생이 필요하지도 않았다. 따라서, 더 큰 나선형 필라멘트로 조립되는 루트 상의 비-필라멘트상이지만 이미 응집된 구형 타우 중간체가 신경독성 타우 종을 나타낼 수 있는 것으로 추정된다.

미세소관에 결합되지 않은 유리 타우의 증가된 수준은 아마도, 미스폴딩 (misfolded)될 뿐만 아니라 결국은 불용성 필라멘트로 조립될 응집된 작은 구형 올리고머의 형성을 촉진시키는 변형 또는 입체형태 변화를 겪을 그의 가능성을 증가시킨다. AD 뇌로부터 분리된 타우 단백질은 다수의 중요한 부위에서 비정상적으로 고도로 인산화되는 것으로 발견되었고 ("과인산화 타우"), 유사(pseudo)-과인산화 (즉, 단백질에 따른 다수의 부위에서의 유사-인산화됨)는 타우 단백질의 비정상적 입체형태를 촉진시킬 수 있는 것으로 입증되었기 때문에 [Jeganathan et al. 2008], 입체형태 변화를 안정화시키는 공유적 변형은 아마도 인산화를 포함한다. 이와 관련하여, 타우 과인산화는 진단 표적으로 확인되었으며 [(WO9311231A1], 상이한 타우 관련된 키나제는 치료학적 표적으로 확인되었다 [WO2007088400A1].

타우가 정상적으로는 쉽게 응집하지 않는 매우 수용성인 단백질이라는 것을 고려하면, 이 문제는 응집에 대한 타우의 저항성으로 인하여 배양 시험을 위한 이상적인 기간 이내에, 또는 동물의 비교적 짧은 수명 이내에 실험적 모델에서 평가하기 어렵다. 타우의 높은 농도는 실험적 모델에서 타우 응집을 촉진시키는데 필요하기 때문에, 인간 타우 병변에서 신경세포 및 신경교 (glia)의 세포질 내에서 작은 구형 응집체를 형성하는 타우의 증진된 능력은 응집에 이용할 수 있는 타우의 풀 (pool)이 국소적으로 증가하는 병리학적 상태에 기인할 수 있는 것으로 믿어진다. 여전히, 다양한 타우 병변에서의 타우의 양은 인공적으로 대량의 타우 과발현을 강요한 세포 배양 및 동물 모델에서만큼 큰 것 같지는 않으며, 따라서 이러한 동물 시스템으로부터의 결과를 인간 조건에 접목시키는 데는 많은 주의가 필요하다.

추가의 복잡한 문제는 마우스 타우가 야생형 인간 타우 (htau)를 과발현하는 유전자이식 마우스에서의 타우 응집을 방지하는 것으로 보인다는 증거이다. 그럼에도 불구하고, 응집-촉진성 돌연변이를 함유하는 htau 이소형태 (예를 들어, P301L 타우)의 높은 수준을 과발현하는 유전자이식 마우스는 내인성 마우스 타우의 존재 하에서조차도 타우 병리학을 발생시킬 수 있다. 최초로 기술된 FTD 돌연변이 중에는 P301L 및 P301S 돌연변이가 있으며, 이들은 인간에게서 FTD에 대한 매우 조기의 평균 개시 (mean onset)를 나타낸다. 이들 돌연변이의 발현을 갖는 타우 유전자이식 마우스 모델은 2.5 내지 5 개월에 시작하는 타우 병리학의 최초 징후의 개시를 나타낸다 [Schindowski et al. 2006]. WO　01/53340 A2는 야생형, 또는 신경변성 질환 모델뿐만 아니라 약물 개발을 위한 도구를 생성시키기 위한 P301L 돌연변이로 지정된 것과 같은 하나의 돌연변이를 갖는 타우를 발현시키는 마우스 모델을 기술하였다. 더구나, 3개의 FTD 돌연변이를 갖는 타우 cDNA를 갖는 유전자이식 마우스 모델에서의 타우 병리학이 기술되었다 [Lim et al., 2001].

시험관내에서 타우 응집을 가속화시키기 위해서는, 다음이온성 보조인자 (polyanionic cofactors) 또는 소분자 리간드를 종종 사용하여 타우 응집을 촉진시킨다. 예를 들어, 전체 길이 타우를 과발현하는 세포 배양 모델에서는, 콩고 레드 (Congo red) 처리가 필라멘트상 타우 응집체의 형성을 자극하며, 세포 생존능을 감소시킨다 [Bandyopadhyay et al. 2007]. 이들 및 그 밖의 다른 결과는, 세포 배양 모델에서는 또한 타우 응집이 세포사를 야기하거나, 또는 적어도 그의 개시를 가속화시킨다는 것을 시사한다. 그러나, 타우의 인공적인 고농도, 또는 응집을 촉진시키거나 침전시키기 위한 독성 이상의 고용량의 화합물의 첨가에 의해서 타우의 응집을 강요하지 않는 세포 배양 모델은 지금까지 기술되지 않았다 [Ko et al. 2004, Tsukane et al. 2007, Nie et al. 2007]. 약물 개발을 목적으로 하여 타우 병변 질환 기전을 모델링하는 관점에서, 변성의 기전은 AD 뇌에 타우 병리학과는 상당히 상이할 수 있기 때문에, 두 가지 전략 모두는 인공적인 결과를 제공할 큰 위험을 갖는다.

발명의 요약

다수의 돌연변이를 갖는 타우를 발현하는 세포는 24시간의 세포 배양 이내에 신경변성의 징후를 나타내는 것으로 발견되었다. 4개의 FTDP-17 돌연변이를 갖는 타우 단백질을 발현하는 세포는 저하된 교류저항 (impedance)을 나타내었다 (실시예 2/도 5). 이것은 상이한 4x 돌연변이를 갖는 2개의 상이한 타우 단백질에 대해서 나타났다. 영향은 5개의 상이한 FTDP-17 돌연변이를 갖는 타우 단백질에 대해서 훨씬 더 현저하였다.

첫 번째 관점에서, 본 발명은 17번 염색체 관련 파킨슨 증상 수반 전두측두엽 치매 (FTDP-17) 상태와 연관된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 포함하는 타우 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 두 번째 관점은 본 발명의 타우 단백질을 코딩하는 핵산이다.

본 발명의 세 번째 관점은 본 발명의 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다.

본 발명의 네 번째 관점은 본 발명의 핵산 또는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포이다.

본 발명의 다섯 번째 관점은 24시간의 세포 배양 후에 교류저항의 저하를 나타내는, 돌연변이된 타우 단백질을 발현하는 세포이다.

본 발명의 여섯 번째 관점은

(a) 시험 화합물을 본 발명의 세포와 접촉시키고;

(b) 시험 물질이 신경변성을 나타내는 적어도 하나의 마커를 변조시키는지 여부를 측정하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 치료 또는 예방하는 제제를 확인하는 방법이다.

본 발명의 일곱 번째 관점은 신경변성의 하나 이상의 마커를 변조시킬 수 있는 제제 또는 제제들을 스크리닝하기 위한 본 발명의 타우 단백질, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드, 또는 본 발명의 세포의 용도이다.

본 발명의 여덟 번째 관점은 신경변성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 개발을 위한 본 발명의 타우 단백질, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드, 또는 본 발명의 세포의 용도이다.

본 발명의 아홉 번째 관점은

(a) 본 발명의 세포를 제공하고;

(b) 상기 세포를 비정상적 입체형태를 갖는 타우 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 타우 병변을 재현하는 방법이다.

도 1: 과- 돌연변이된 타우 발현 세포주에서의 비정상적 타우 응집. 야생형 또는 돌연변이체 타우를 동등한 수준으로 안정적으로 발현하는 SH-SY5Y 신경아세포종 세포주를 사용하여 20 nM 스타우로스포린의 적용에 의한 신경세포 분화를 유도하였다. 48시간의 분화 (+ STS)는 과-타우 발현 세포에서 비정상적 타우 응집체의 형성에 충분하다 (화살표).
도 2: 다중돌연변이체 ( polymutant ) 타우 세포주에서 비정상적 타우 입체형태. 다중-돌연변이체 타우 변이체를 개발하였으며, 이들 변이체를 사용하여 다중-돌연변이체 신경아세포종 세포주를 생산하였다. 이들 세포주에서, 생리학적 조건 하에서 비정상적/병리학적 입체형태를 채택한 타우를 관찰하였다 (MC1 비정상적 타우). 5x 돌연변이된 타우 유전자 변이체 (SH-Tau_{5x mut})는 야생형 또는 단일 돌연변이체 단백질과 비교하여 유사한 발현 수준에도 불구하고, MC1 마커에 의해서 검출되는 바와 같이 비정상적 입체형태에 대한 특히 높은 경향을 나타내었다 (적색 화살표). 인산화가 비정상적 입체형태를 안정화시킬 수 있다는 최근의 결과를 보강하여, MC1-양성 타우 종의 양은 세포를 타우 키나제 억제제 (SRN-003-556)로 처리함으로써 감소될 수 있었다. 따라서, 다중돌연변이체 타우 단백질은 분화된 신경아세포종 세포에서의 알츠하이머-유사 인산화 상태에서 존재하며, 키나제 억제는 타우 미스폴딩 (missfolding)을 감소시키며, 또한 후속 응집을 억제할 수 있다.
도 3: 신경세포 표현형으로의 분화 후에 5x 다중돌연변이체 타우 신경아세포종 세포에서의 미세소관 네트워크 병리학. 지시된 MAPT 유전자 변이체는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y 내로 형질도입시켰으며, 안정하게 발현하는 세포주를 선택하였다. 분화된 세포를 이식유전자 발현 (EGFP-타우, A₁-D₁), 및 안정한 미세소관에 대한 마커인 아세틸화된 튜불린 (A₂-D₂)에 대한 항체에 의해서 검출된 미세소관 네트워크에서의 변화에 대해서 분석하였다. 이중-라벨 형광은 미세소관-연관된 단백질에서 예상될 수 있는 바와 같이, 유전자이식 타우 (A-D, 백색 화살표)에 의해 미세소관의 국소 공동-국재화 (colacalization) 및 감염된 세포에서의 안정된 미세소관의 필라멘트상 패턴을 나타낸다. 그에 반해서, 5x 다중-돌연변이 변이체에 의해서 형질도입된 세포의 서브집단 (D, 빈 (open) 화살표)에서는 안정한 미세소관이 존재하지 않았다. 동시에, 그들의 세포는 높은 수준의 EGFP-태깅된 타우 이식유전자를 나타내고, 그들의 과정들을 상실한 것으로 보인다. (안정한) 미세소관 네트워크의 와해는 미세소관-의존적 수송의 붕괴 및 세포의 느린 위축을 야기하여 영향을 받은 세포의 사망에 이르게 하는 것으로 예상된다.
도 4: 오카다산 유도된 인공적 과인산화에 의한 결과의 교류저항 검출. 처음에는 25　nM 오카다산과의 배양은 3 h 및 6 h에 과-타우 돌연변이체 특이적 변성효과를 나타내지만, 오카다산의 비특이적 독성 부작용은 24 h 후에 모든 타우 돌연변이체에서 대량의 세포 손상을 야기하였다 (n　=　3, 2D-ANOVA, 본페로니 사후 검증 (Bonferoni post-hoc test), * p　<　0.05, ** p　<　0.01, *** p　<　0.001).
도 5: 분화는 다중-돌연변이체 타우 발현 SH - SY5Y 세포에서 신경변성을 유도한다. SH-SY5Y 세포의 분화는 20 nM 스타우로스포린과의 48　h 배양에 의해서 유도되었다. 그 후에, 세포를 24 h 동안 교류저항 측정에 의해서 모니터링하였다. 야생형 타우 및 P301L-타우 발현 세포는 교류저항의 감소를 나타내지 않은 반면에, K257q 및 dK280q-타우 세포는 저하된 교류저항을 나타내었다. 두드러지게, 과-타우 발현 세포는 신경변성의 결과로 더 유의적인 교류저항 감소를 나타내었다 (n　=　4, 2D-ANOVA, 본페로니 사후 검증, * p　<　0.05, ** p　<　0.01).
도 6: 화합물 효율의 정량적 검출을 위한 과- 타우 세포의 용도. 야생형 타우 발현 세포 (생리학적 조건)에 비해서 병리학이 분화 (48 h 동안 20 nM 스타우로스포린)에 의해서 유도된 발생된 과-타우 세포를 취하여 잠재적인 활성 약제학적 성분의 효율을 정량화할 수 있었다. 두 개의 기준 화합물, 상세하게는 키나제 억제제 SRN-003-556 및 AR-A014418의 효과를 사용하여 과-타우 기본 기능적 타우 병리학 스크리닝 시험의 스크리닝 능력을 입증하였다. SRN-003-556은 과-타우 유도된 병리학의 상당한 감소를 나타내는 반면에, AR-A014418은 유의적인 치료학적 효과를 나타내지 않는다. 24 h에 예시적으로 SRN-003-556에 대한 EC₅₀ 측정에 의해서 입증되는 바와 같이 관찰 가능한 치료학적 효과를 정량할 수 있다 (값은 WT에 대해서 표준화한다, n　=　4, 모든 그룹은 과 (Hyper) 그룹과 비교, 2D-ANOVA, 본페로니 사후 검증, * p　<　0.05, ** p　<　0.01, *** p　<　0.001).

본 명세서에서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 것으로서, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 분명하게 다른 식으로 나타내지 않는 한은 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "분자"에 대한 언급은 하나 이상의 분자 및 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 그의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. "세포"에 대한 언급은 세포의 집단에 대한 언급을 포함한다.

본 발명은 17번 염색체 관련 파킨슨 증상 수반 전두측두엽 치매 (FTDP-17) 상태와 연관된 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이을 포함하는 타우 단백질에 관한 것이다.

타우 단백질

본 명세서에서 사용된 것으로서, 문구 "타우 단백질"은 야생형 타우 단백질에 대한 서열 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직하게는, 타우 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열에 대해서 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 서열번호 1에 대한 아미노산 서열의 동일성의 정도는 문제의 아미노산 서열과 서열번호 1을 다음의 파라메터 (Matrix BLOSUM62; Open gap 11 및 extension gap 1 penalties; gap x_dropoff50; expect 10.0 word size 3; Filter: none)를 갖는 프로그램 "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" [Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250]를 사용하여 비교함으로써 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 서열 비교는 적어도 200개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 300개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 350개의 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 380개의 아미노산을 포함한다.

가장 바람직하게는, 타우 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 6 및 서열번호 8로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이들은 각각 타우 이소형태 0N4R, 2N4R 및 1N4R의 아미노산 서열이다.

타우 단백질은 바람직하게는 인간 타우 단백질 또는 그의 변이체이다. 야생형 인간 타우 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타낸다 (호모 사피엔스 (Homo sapiens) 미세소관-연관된 단백질 타우 (MAPT): NM 016834/NP_058518). 추가의 인간 타우 이소형태의 아미노산 서열은 서열번호 6 및 서열번호 8에 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "변이체"는 본 발명에 개시된 폴리펩타이드 및 단백질과 관련하여, N-말단 및/또는 C-말단에서, 및/또는 본 발명의 천연 폴리펩타이드 또는 단백질의 천연 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 부가 및/또는 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입된 모든 폴리펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. 뿐만 아니라, 용어 "변이체"는 폴리펩타이드 또는 단백질의 더 짧거나 더 긴 모든 형식을 포함한다. 변이체는 자연으로부터 분리될 수 있거나, 재조합체 및/또는 합성 방법에 의해서 생산될 수 있는 단백질 및 폴리펩타이드를 포함한다. 천연 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 절단되거나 분비된 형태, 천연적으로 존재하는 변이체 형태 (예를 들어, 스플리스-변이체) 및 천연적으로 존재하는 대립유전자 변이체를 나타낸다. 용어 "변이체" 및 "이소형태"는 본 명세서에서 상호 교환하여 사용된다.

다른 식으로 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 것으로서 인간 타우 서열에서 아미노산의 넘버링은 서열번호 2에 나타낸 것으로서, 441개의 아미노산을 갖는 타우 이소형을 언급한다.

FTDP -17과 연관된 돌연변이

본 발명의 타우 단백질은 "염색체 17과 연관된 상태인 전두측두엽 치매 및 파킨슨병" (FTDP-17) 상태와 연관된 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 포함한다. FTDP-17은 행동 및 성격 변화, 인식 손상 및 운동 증상의 3 가지 주요한 특징을 갖는 체세포 우성 신경변성 장애이다. FTDP-17은 1996년에 미시간에서의 International Consensus Conference in Ann Arbor 중에 정의되었다 [Foster NL, Wilhelmsen K, Sima AA, Jones MZ, D'Amato CJ, Gilman S: Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17: a consensus conference, Conference Participants, Ann Neurol 1997, 41:706-715]. 이 정의는 본 명세서에 참고로 포함된다. FTDP-17은 타우 유전자에서의 돌연변이에 의해서 야기된다. FTDP-17과 관련된, 타우 유전자 내에서의 적어도 38개의 상이한 돌연변이가 세계적으로 확인되었다.

본 발명에 따르면, FTDP-17과 연관된 돌연변이에는 아미노산 위치 5, 257, 260, 266, 272, 279, 296, 301, 303, 305, 315, 317, 320, 335, 336, 337, 342, 352, 369, 389, 406 및/또는 427에서의 치환; 및 아미노산 위치 280 및/또는 296의 결실이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특히, FTDP-17과 연관된 돌연변이에는 다음의 돌연변이가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다: R5H, R5L, K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, N296H, N296N, delN296, P301L, P301S, G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및/또는 R427M.

바람직하게는, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 260, 266, 272, 279, 296, 301, 303, 305, 315, 317, 320, 335, 336, 337, 342, 352, 369, 389, 406 및/또는 427에서의 치환; 및 아미노산 위치 280 및/또는 296의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 260, 266, 272, 279, 296, 301, 303, 305, 315, 317, 320, 335, 336, 337, 342, 352, 369, 389, 406 및/또는 427에서의 치환; 및 아미노산 위치 280 및/또는 296의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 260, 266, 272, 279, 296, 301, 303, 305, 315, 317, 320, 335, 336, 337, 342, 352, 369, 389, 406 및/또는 427에서의 치환; 및 아미노산 위치 280 및/또는 296의 결실로부터 선택된 적어도 4 개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 260, 266, 272, 279, 296, 301, 303, 305, 315, 317, 320, 335, 336, 337, 342, 352, 369, 389, 406 및/또는 427에서의 치환; 및 아미노산 위치 280 및/또는 296의 결실로부터 선택된 적어도 4 개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 260, 266, 272, 279, 296, 301, 303, 305, 315, 317, 320, 335, 336, 337, 342, 352, 369, 389, 406 및/또는 427에서의 치환; 및 아미노산 위치 280 및/또는 296의 결실로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, [N296H 또는 delN296], [P301L 또는 P301S], G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및 R427M으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, [N296H 또는 delN296], [P301L 또는 P301S], G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및 R427M으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, [N296H 또는 delN296], [P301L 또는 P301S], G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및 R427M으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, [N296H 또는 delN296], [P301L 또는 P301S], G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및 R427M으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, [N296H 또는 delN296], [P301L 또는 P301S], G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및 R427M으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4 개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 272, 279, 301, 305, 337, 389 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 272, 279, 301, 305, 337, 389 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 272, 279, 301, 305, 337, 389 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 5, 257, 272, 279, 301, 305, 337, 389 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

이 구체예에 따르면, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, G272V, N279K, delK280, [P301L 또는 P301S], S305N, P301L, P301S, V337M, G389R 및 R406W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 가질 수 있다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, G272V, N279K, delK280, [P301L 또는 P301S], S305N, P301L, P301S, V337M, G389R 및 R406W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, G272V, N279K, delK280, [P301L 또는 P301S], S305N, P301L, P301S, V337M, G389R 및 R406W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 [R5H 또는 R5L], K257T, G272V, N279K, delK280, [P301L 또는 P301S], S305N, P301L, P301S, V337M, G389R 및 R406W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 257, 301, 337, 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 257, 301, 337, 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 제이하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 257, 301, 337, 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 257, 301, 337, 및/또는 406에서의 치환; 및 아미노산 위치 280의 결실로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 타우 단백질은 K257T, delK280, [P301L 또는 P301S], V337M 및 R406W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 갖는다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 K257T, delK280, [P301L 또는 P301S], V337M 및 R406W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 1, 6 또는 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 타우 단백질은 적어도 5개의 다음의 상이한 돌연변이를 갖는다: 아미노산 위치 257, 301, 337 및 406에서의 치환, 및 아미노산 위치 280의 결실. 특별한 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 아미노산 위치 257, 301, 337 및 406에서의 아미노산 치환, 및 아미노산 위치 280의 결실을 제외하고는 서열번호 1, 6 또는 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 타우 단백질은 적어도 5개의 상이한 돌연변이 K257T, delK280, [P301L 또는 P301S], V337M 및 R406W, 예를 들어, K257T, delK280, P301L, V337M 및 R406W를 갖는다. 이 구체예에 따르면, 본 발명의 타우 단백질은 돌연변이 K257T, delK280, [P301L 또는 P301S], V337M 및 R406W를 제외하고는, 예를 들어, K257T, delK280, P301L, V337M 및 R406W를 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 구체예의 타우 단백질은 가장 바람직한 구체예인 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 돌연변이 K257T, delK280, [P301L 또는 P301S], V337M 및 R406W를 제외하고는, 예를 들어, K257T, delK280, P301L, V337M 및 R406W를 제외하고는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 타우 단백질은 돌연변이 K257T, delK280, [P301L 또는 P301S], V337M 및 R406W를 제외하고는, 예를 들어, K257T, delK280, P301L, V337M 및 R406W를 제외하고는 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

핵산, 벡터 및 플라스미드

본 발명은 추가로, 본 명세서에 기술된 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

용어 "핵산"은 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 모든 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일 또는 이중-가닥 RNA일 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 공지된 다수의 유용한 목적을 제공하는 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 대해서 만들어질 수 있는 것으로 인식될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산"은 예를 들어, 단순 및 복잡한 세포를 포함한 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드의 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.

적절한 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 본 명세서에 포함된 정보 및 문헌 및 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 숙련된 전문가에 의해서 쉽게 제조될 수 있다 [예를 들어, 참조: Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. 2001, CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992]. 이들 기술은 예를 들어, 게놈 공급원, 화학적 합성, 및/또는 cDNA 서열의 제조로부터의 적절한 핵산의 샘플을 증폭시키기 위한 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 타우를 코딩하는 DNA는 코드화 DNA를 취하고, 발현될 부분의 어느 한 측면에서 적합한 제한효소 인식 부위를 확인하고, DNA로부터 상기의 부분을 절단하는 것을 포함한, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 방법으로나 생성시키고, 사용할 수 있다. 돌연변이는 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이유발 (site directed mutagenesis)을 사용하여 타우-코딩화 서열 내에 도입될 수 있다.

타우 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 본 기술분야에서 공지되어 있다 (예를 들어, Gen-ID NM016834). 따라서, 숙련된 전문가는 공지된 기술에 의해서 DNA를 쉽게 조작하여 바람직한 타우 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 야생형 타우의 DNA 서열은 서열번호 4에 나타낸다.

본 발명의 추가의 관점은 본 발명의 핵산을 함유하는 벡터 및 플라스미드이다.

"벡터"는 또 다른 폴리뉴클레오타이드 분절이 상기 분절의 복제 또는 발현을 유도하기 위해서 작동적으로 삽입될 수 있는 플라스미드, 파지, 코스미드 또는 바이러스와 같은 리플리콘 (replicon)이다. 벡터는 특히, 타우 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 유전공학에서 통상적으로 사용되는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지일 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 방법을 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 제작할 수 있다; 참조: 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. 2001, CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)에 개시된 기술].

용어 "재조합체"는 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열이 서열의 2개의 다른 방법으로 분리된 분절의 인공적 조합에 의해서, 예를 들어, 화학적 합성에 의해서, 또는 유전공학 기술에 의한 분리된 폴리뉴클레오타이드의 조작에 의해서 만들어진 것을 의미한다.

발현 벡터는 mRNA 합성을 지시하도록 관심이 있는 단백질-코드화 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유할 것이다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해서 인식되는 프로모터는 잘 알려져 있다. "작동적으로 연결된"은 프로모터로부터 개시될 전사에 적합하게 위치 및 배향되고, 동일한 핵산 분자의 일부분으로서 결합된 것을 의미한다. 프로모터에 작동적으로 연결된 DNA는 프로모터의 "전사 조절 하에" 있다. 포유동물 숙주 세포 내에서 벡터로부터의 전사는 예를 들어, 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 및 열-충격 (heat-shock) 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해서 조절될 수 있으며, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상화적이어야 한다. 진핵 숙주 세포에서 사용된 발현 벡터는 또한, 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다.

본 발명에서 사용된 프로모터는 구성적이거나 유도 가능할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 발현 조절 서열은 본 발명의 폴리펩타이드의 유도된 발현을 명시한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 메센저 (messenger) RNA의 전사는 테트라사이클린과 같은 소형 화학물질 또는 엑디손 (Ecdysone)과 같은 호르몬과 같은 외부 시그날의 첨가 또는 철회 (withdrawal)에 의해서 유도된다. 외부 시그날은 또한 온도 또는 이온화 방사선의 증가 또는 감소일 수도 있다. 또한, 유도성 발현은 mRNA 안정성이 유도 가능한 방식으로 조절되는 시스템 또는 메센저 RNA의 유도성 해독 개시에 의해서 유도될 수 있다. 폴리펩타이드 생산의 유도를 허용하는 발현 조절 서열의 예는 다음의 문헌들에 기술되어 있다: 예를 들어, 문헌 [Gossen and Bujard (1992) Proc Natl Acad Sci USA, 15; 89 (12): 5547-51; 또는 Gossen et al. (1995) Science, Jun 23; 268 (5218): 1766-9; 또는 Kistner et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 10933-10938]에 기술된 테트-오프/테트-온 (Tet-off/Tet-on) 시스템뿐만 아니라 Cre-재조합효소 (recombinase) 기본 방법을 기초로 하는 발현 조절 시스템. 세포 배양 및 유전자이식 동물 둘 다에서 사용하기 위한 추가의 유도성 발현 시스템은 예를 들어, 문헌 [Hoppe et al. (2000) Mol Ther, 1: 159-164; 또는 No et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93: 3346-3351]에 기술된 곤충 호르몬 엑디손을 기초로 한다. 또 다른 유도성 발현 시스템은 26-29 도에서의 조건 발현을 허용하는 GAL4 시스템 [Ornitz et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA, Feb 1; 88 (3): 698-702], 또는 또한 라파마이신 (Rapamycin) 기본 조건 발현 시스템 [Ho et al. (1996) Nature, Aug 29; 382 (6594): 822-6; 및 Pollock et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, Nov 21; 97 (24): 13221-6]이다. 온도-민감성 발현 시스템은 신드비스 (Sindbis) 바이러스 발현 카세트 [Boorsma et al. (2000) Nat Biotechnol, Apr; 18 (4): 429-32]이며, 주로 세포 배양 시스템에서의 조절 발현에 적합하다.

본 발명의 발현 벡터는 또한, 하나 이상의 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 또는 다른 독소 (예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린)에 대한 저항성을 부여하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 포유동물 세포를 위한 선택가능한 마커의 예로는 DHFR 및 티미딘 키나제가 포함된다. 따라서, 본 발명의 전형적인 것은 복제의 기원 (origin), 적절한 경우에 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 단백질 서열(들), 전사 종결 서열, 및 마커 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터 및 플라스미드는 세포 숙주의 타입에 따라 변화하는 잘 알려진 기술에 의해서 숙주 세포 내로 전이될 수 있다 (이하 참조).

세포, 형질감염 및 형질도입

본 발명의 추가의 관점은 본 발명에 기술된 핵산 또는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포이다. 세포는 바람직하게는 분리된 세포이며, 즉 이것은 조직과 같은 그의 자연적 환경에 있지 않다. 더욱 바람직하게는, 세포는 배양 배지 내의 세포 배양 세포이다.

세포는 바람직하게는, 세포 배양액 내에서 배양될 수 있는 살아있는 세포이다. 바람직하게는, 세포는 진핵 세포이며, 더욱 바람직하게는 이것은 포유동물 세포이다. 이종 폴리펩타이드의 발현을 위해 본 기술분야에서 이용할 수 있는 포유동물 세포주에는 섬유아세포 3T3 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 (baby hamster) 신장 세포, COS 세포, 차이니즈 (Chinese) 햄스터 난소 세포, 인간 간 세포 (Hep G2); 및 기타 다수의 것이 포함된다. 특별한 구체예에서, 본 발명의 세포는 신경 세포 또는 그의 전구체이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 "신경 세포"는 마커 단백질 미세소관-연관된 단백질-2 (MAP-2)을 발현하는 세포이다. 이들은 추가로, 마커 단백질인 신경필라멘트 (neurofilament) 및/또는 칼빈딘 (calbindin)을 발현할 수 있다. 적합한 신경 세포에는 바람직하게는 중추신경계 (CNS)의 일차 신경 세포, 다능성 줄기 세포 (ES 및 iPS) 유도된 신경세포 및 전환분화된 (transdifferentiated) 신경세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 세포는 예를 들어, 문헌 [Otto et al. Journal of Neuroscience Methods 128 (2003) 173-181 (일차 신경세포); Pankratz et al., 2007, Stem Cells 25(6): 1511-1520 (ES 세포); Hu et al., 2010, PNAS 107(9): 4335-4340 (iPS 세포); 및 Vierbuchen et al., 2010, Nature 463, 1035-1041 (전환분화된 신경세포)]에 기술되어 있다.

신경 세포의 전구체 세포는 세포를 분화 자극에 노출시킴으로써 신경세포 표현형을 갖는 세포로 전환될 수 있다. 통상적으로, 신경세포 표현형으로의 분화는 세포 배양액 중의 전구체 세포에 분화제를 첨가함으로써 유도될 수 있다. 적합한 전구체 세포에는 SH-SY5Y 세포 [Agholme et al., 2010, Journal of Alzheimer's Disease 20: 1069-1082], Neuro2A 세포 [Trembley et al., 2010, Journal of Neuroscience Methods 186: 60-67], NG108-15 세포 [Zhong et al. Journal of Neurochemistry 68(6): 2291-2299; ATCC HB-12317], IMR32 세포 (ATCC CCL-127) 및 PC-12 세포 [Schimmelpfenig et al., 2004, Journal of Neuroscience Methods 139: 299-306]가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 분화제에는 스타우로스포린, 레티노산, 트리코스타틴 A, 분화 촉진성 배지 제제, 예를 들어, 뉴로베이잘 (Neurobasal) (A) + B27-보충물 (Supplement), N2-보충물 및 이들의 조합이 포함된다.

본 발명의 핵산, 벡터 또는 플라스미드는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 기술을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 도입은 어떤 이용 가능한 기술이라도 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우에, 적합한 기술은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개된 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 그 밖의 다른 바이러스, 예를 들어, 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 문헌 [Sambrook et al., supra]에 기술된 바와 같이 염화칼슘을 이용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵생물, 또는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 그 밖의 다른 세포의 경우에 사용된다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "형질도입"은 아데노바이러스, AAV, 레트로바이러스 또는 플라스미드 송달 유전자 전이방법과 같은 바이러스 매개된 송달 시스템을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 진핵 세포로 송달 및 도입시키는 것을 기술하기 위하여 사용된다. 이들 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 정확한 조성 및 실행은 본 개시내용을 고려하여 명백하다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "형질감염"은 비-바이러스 매개된 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 세포에 송달 및 도입시키는 것을 기술하기 위하여 사용되며, 이들 방법에는 예를 들어, 칼슘 포스페이트- 또는 덱스트란 설페이트-매개된 형질감염; 전기천공; 유리 추진 표적화 (glass projectile targeting) 등이 포함된다. 이들 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 정확한 조성 및 실행은 본 개시내용을 고려하여 명백하다.

형질감염 또는 형질도입은 안정하거나 일시적일 수 있다. 바람직하게는, 형질감염 또는 형질도입은 일시적이다. 이것은 일반적으로 세포 내로 도입된 DNA 구조물의 일시적인 발현을 나타낸다.

본 발명에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터에 의해서 형질감염되거나 형질도입된 숙주 세포는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 바람직한 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절한 바와 같이 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양할 수 있다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건들은 과도한 실험이 없이 숙련된 전문가에 의해서 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 최대화시키기 위한 원리, 프로토콜 및 실제 기술은 문헌 ["Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991), 및 Sambrook et al, supra]에서 찾을 수 있다.

감소된 교류저항을 갖는 세포

본 발명의 추가의 관점은 돌연변이된 타우 단백질을 발현하는 세포이며, 여기에서 상기의 세포는 감소된 전기적 교류저항 (electric impedance)을 나타낸다. 상기의 세포는 바람직하게는 분리된 세포이며, 즉 이것은 조직과 같은 그의 자연적 환경에 있지 않다. 더욱 바람직하게는, 세포는 배양 배지 내의 세포 배양 세포이다.

본 발명의 이러한 관점의 일반적 세포 타입은 상술한 것과 동일하며, 세포 배양은 정립된 방법에 따라 수행될 수 있다. 유전자 발현은 예를 들어, mRNA의 전사를 정량하는 노던 블럿팅 (Northern blotting), 또는 적절하게 라벨을 붙인 프로브를 사용하는 세포 내로 도입된 재조합 핵산의 서열에 기초한 동소 하이브리드화 (in situ hybridization)에 의해서 확인될 수 있다. 대안적으로, 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량하는 세포의 조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법에 의해서 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플 유체의 시험에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다.

돌연변이된 타우 단백질의 발현은 바람직하게는 타우에 대해 지시된 항체를 사용하여 검출된다. 대안적으로, 돌연변이된 타우 단백질은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 검출될 수 있는 라벨, 예를 들어, 이종 펩타이드 서열 (FLAG 태그, HA 태그 등)에 융합될 수 있다. 한가지 구체예에서, 돌연변이된 타우 단백질은 이종 아미노산 서열, 예를 들어, EGFP, FLAG 태그, 또는 Strep 태그에 융합된다. 이것은 항-타우 항체를 사용하여 웨스턴 블럿에서 돌연변이된 타우를 특이적으로 검출하도록 허용한다. 이 구체예에 따르면, 돌연변이된 타우는 웨스턴 블럿 상에서의 그의 상이한 크기에 기인하여 내인성 야생형 타우로부터 구분될 수 있다.

바람직하게는, 돌연변이된 타우는 세포에서 강력하게 과발현되지 않는다. 한가지 구체예에서, 세포 내의 돌연변이된 타우의 양은 바람직하게는 동일한 세포 내에서 또는 대조군 세포, 예를 들어, 동일한 세포 타입의 비-형질감염된 세포 내에서 발현된 야생형 타우의 10-배량 미만이다. 더욱 바람직하게는, 세포 내의 돌연변이된 타우의 양은 동일한 세포 내에서 또는 대조군 세포, 예를 들어, 동일한 세포 타입의 비-형질감염된 세포 내에서 발현된 야생형 타우의 5-배량 미만이다. 더 더욱 바람직하게는, 세포 내의 돌연변이된 타우의 양은 동일한 세포 내에서 또는 대조군 세포, 예를 들어, 동일한 세포 타입의 비-형질감염된 세포 내에서 발현된 야생형 타우의 2-배량 미만이다. 가장 바람직하게는, 세포의 돌연변이된 타우의 양은 동일한 세포 내에서 또는 대조군 세포, 예를 들어, 동일한 세포 타입의 비-형질감염된 세포 내에서 발현된 야생형 타우의 양의 약 75% 내지 약 150%, 또는 약 75% 내지 약 125%이다. 발현의 수준은 바람직하게는 웨스턴 블럿팅, 및 항-타우 항체 및 임의로, 항-태그 항체를 사용한 돌연변이된 타우 및 내인성 야생형 타우의 후속 검출에 의해서 결정된다. 특별한 구체예에서, 발현의 바람직한 수준은 공지된 테트-온-오프 시스템 (Tet-on-off system) (상기 참조)과 같은 유도성 발현 시스템에 의해서 수득된다.

비정상적 입체형태를 갖는 타우 단백질은 특이적 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 이러한 항체의 예로는 모노클로날 항체 MC-1 [Jicha, G.A., Bowser, R., Kazam, I.G., Davies, P., 1997. J. Neurosci. Res. 48 (2), 128-132] 및 Alz50 [Davis et al., 1994, Journal of Neuroscience Research 39(5): 589-594]이 포함된다. 특정의 구체예에서, "돌연변이 타우 단백질을 발현하는 세포"는 단백질이 모노클로날 항체 MC-1을 사용하여, 바람직하게는 이하에서 도 2에 관해 기술된 실험 조건을 사용하여 검출될 수 있다.

세포 유전성 분광학 (cellular dielectric spectroscopy; CDS) 또는 전기 교류저항 분광학 (EIS)으로 또한 공지되어 있는 교류저항 분광학을 사용하여 규정된 교류 및/또는 교류 전압을 적용함으로써 단일 세포의 수동 전기적 특성의 주파수 의존적 변화를 측정할 수 있다. 단일 세포의 생체-교류저항 (bio-impedance)은 작업 전극 및 상대 전극에 의해 측정될 수 있다. 세포기관의 세포내 막 뿐만 아니라 세포막의 정전용량 (capacitance) 및 저항성, 세포외 매질 및 내재성 세포질의 저항성, 세포외 매트릭스 및 세포와 전극 사이의 접촉과 같은 다양한 세포 파라메터가 전반적인 세포 교류저항에 기여한다. 살아있는 세포의 교류저항의 변화를 분석하기 위해서, 교번 전압을 생물학적 샘플에 적용한다. 세포-하 구획 및 분자의 유전적 특성에 따라, 적용된 전류는 활성 작업 전극으로부터 세포를 통해 흐를 수 있으며, 이에 의해서 나머지 전류는 상대 전극에 의해서 수집된다. 적용된 전압의 주파수에 따라, 특정의 세포 구획의 변화가 확인될 수 있다.

본 발명의 경우에, 교류저항 분광학은 바람직하게는 문헌 [Jahnke et al., Lab Chip, 2009, 9, 1422-1428]에 기술된 바와 같이 수행되며, 그의 기술내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 세포의 교류저항을 측정하는 장치는 EP　2103933　A1에 기술된 것일 수 있다.

이러한 관점에 따르는 세포는 대조군 세포에 비해서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 대조군 세포는 이것이 돌연변이된 타우를 발현하지 않는다는 것을 제외하고는, 돌연변이된 타우를 발현하는 세포와 동일한 세포이다. 예를 들어, 대조군 세포는 본 발명의 세포와 동일한 세포 타입의 것이지만, 상기의 돌연변이된 타우를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 대조군 세포는 본 발명의 세포와 동일한 세포 타입의 비형질감염된 세포 또는 야생형 세포이다. 또 다른 구체예에서, 대조군 세포는 모의 벡터 (mock vector), 예를 들어, 코드화 서열이 없는 플라스미드로 형질감염되었다. 아직 또 다른 구체예에서, 대조군 세포는 야생형 타우, 예를 들어, 서열번호 1, 6 또는 8로 표시되는 타우를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 의해서 형질감염된 세포이다. 후자의 구체예에서, 야생형 타우의 대조군 세포 내에서의 발현 수준은 본 발명의 세포 내에서의 돌연변이된 타우의 발현 수준과 실질적으로 동일하다.

본 발명의 세포에서, 전기 교류저항은 실시예 2/도 4에서 사용된 조건 하에서 측정된 것으로서, 돌연변이된 타우를 발현하지 않는 (비형질감염된) 대조군 세포에 비해 바람직하게는 적어도 5%만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 10%만큼, 가장 바람직하게는 적어도 20%만큼 감소된다.

본 발명의 세포는 오카다산의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포는 포스파타제 억제제, 예를 들어, 오카다산의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 세포는 오카다산 및 콩고 레드 (Congo Red)의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포는 포스파타제 억제제 (예를 들어, 오카다산) 및 콩고 레드의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 세포는 오카다산, 콩고 레드 및 포름알데히드의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 또 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포는 포스파타제 억제제 (예를 들어, 오카다산), 콩고 레드 및 포름알데히드의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 더 더욱 바람직하게는, 본 발명의 세포는 오카다산, 콩고 레드, 포름알데히드 및 그 밖의 다른 독성 물질의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 세포는 포스파타제 억제제 (예를 들어, 오카다산), 콩고 레드, 포름알데히드 및 그 밖의 다른 독성 물질의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다. 아직 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포는 포스파타제 억제제 (예를 들어, 오카다산, 콩고 레드, 포름알데히드, 다음이온성 물질 (예를 들어, 헤파린, 폴리글루타메이트) 및 그 밖의 다른 독성 물질의 부재 하에서 감소된 전기 교류저항을 갖는다.

바람직한 구체예에서, 세포는 항체 MC-1에 의해서 검출될 수 잇는 돌연변이된 타우를 발현하며, 실시예 2에서 사용된 조건 하에서 측정된 것으로서 돌연변이된 타우를 발현하지 않는 대조군 세포에 비해 적어도 10%만큼 감소된 전기 교류저항을 나타내는 신경 세포이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포는 다음의 특징에 의해서 특정화되는 신경 세포 또는 그의 전구체 세포이다:

ㆍ 상기 세포는 돌연변이된 타우 단백질을 발현한다;

ㆍ 세포 배양액 내의 세포에 분화제를 첨가한 후에, 세포는 분화제를 첨가한 후 24시간 이내에 전기 교류저항의 감소를 나타내며, 여기에서 상기의 감소는 실시예 2/도에서 사용된 조건 하에서 측정된 것으로서, 돌연변이된 타우를 발현하지 않는 대조군 세포에 비해 적어도 10%만큼이다.

바람직하게는, 전기 교류저항의 감소는 분화제를 첨가한 후 18시간 이내, 더욱 바람직하게는 12시간 이내, 가장 바람직하게는 6시간 이내에 일어난다. 또한, 세포의 배양 배지 내에 독성제는 존재하지 않는 것이 바람직하다 (예를 들어, 오카다산, 콩고 레드, 포름알데히드 등).

본 발명의 방법 및 용도

한가지 관점에서, 본 발명은 (a) 시험 화합물을 본 발명의 세포와 접촉시키고; (b) 시험 물질이 신경변성을 나타내는 적어도 하나의 마커를 변조시키는지 여부를 측정하는 것을 포함하여, 타우 병변을 치료 또는 예방하는 제제를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 신경변성 질환 또는 장애에는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증, 프리온병 (prion diseases), 피크병, 전두측두엽 치매, 진행성 핵마비, 피질기저 변성, 뇌혈관성 치매, 다중 시스템 위축증, 및 경도-인지 장애가 포함된다. 신경변성 과정을 수반하는 추가의 상태는 예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 노화-관련 황반 변성, 기면 발작, 운동 신경세포병, 신경 상해 및 수복, 및 다발성 경화증이다.

바람직하게는, 신경변성 질환은 타우 병변이다. "타우 병변(tauopathy)"은 신경세포성 타우 응집의 존재, 특히 신경원섬유 엉킴의 존재를 특징으로 하는 장애 및 질환이다. 대표적인 타우 병변은 알츠하이머병, 및 FTDP-17, 피크병, 진핵성 핵상마비, 괌(Guam)의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병-치매 컴플렉스 및 피질기저 변성과 같은 그 밖의 다른 신경변성 장애이다.

바람직하게는, 신경변성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅톤병, 타우 병변 및 프리온병으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 신경변성 질환은 알츠하이머병이다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 문구 "마커 (marker)"는 세포 수준에서 신경변성 질환의 개시 또는 존재를 나타내는 모든 파라메터를 나타낸다. 적합한 마커에는 신경원섬유 엉킴의 존재, 교류저항의 감소, 타우의 인산화, 수지상/축삭 이영양증 (dendritic/axonal dystrophy), 축삭 변성, β-아밀로이드 생산, 시냅스 이영양증, 미세소관 및 전체 세포골격 기능/완전성 (integrity)/-기본 수송/분포, 프로테아좀 (proteasomal) 기능, 세포 형태학, 세포 부착, 신호 전달, 수용체 분포/기능, 및 영향을 받을 수 있는 그 밖의 다른 모든 세포 기능이 포함된다. 바람직한 마커에는 신경원섬유 엉킴의 존재, 교류저항의 감소, 타우의 인산화, 수지상/축삭 이영양증, 축삭 변성, β-아밀로이드 생산 및 시냅스 이영양증뿐만 아니라 세포 형태학이 포함된다.

시험 화합물은 이것이 마커의 수준 및/또는 활성을 변화시키거나 변경할 수 있는 경우에, 신경변성 질환을 나타내는 마커를 "변조시킨다". 상기의 변조는 마커의 수준 및/또는 활성의 증가 또는 감소일 수 있다. 예를 들어, 상기의 변조는 타우의 인산화, 수지상/축삭 이영양증, 축삭 변성, 시냅스 이영양증 및/또는 존재하는 신경원섬유 엉킴의 양에 있어서의 증가 또는 감소일 수 있다.

세포에서 신경원섬유 엉킴의 형성은 갈리아스 은 함침 (Gallyas silver impregnation) 방법에 이은 광학/전자 현미경검사 또는 그 밖의 다른 적절한 방법에 의해서 측정될 수 있다 [Braak, H. and Braak, E. (1995) Neurobiol Aging 16, 271-8; discussion 278-84]. 이러한 그 밖의 다른 적절한 방법 한가지는 응집의 다른 상태로 존재하는 타우 분자로부터 신경원섬유 엉킴과 관련한 타우 분자를 인식 및 식별할 수 있고, 예를 들어, 형광 현미경검사 및/또는 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 기술에 이해서 검출될 수 있는 입체형태-의존적 항체의 이용을 포함한다. 신경원섬유 엉킴의 형성은 또한, 형광 편광 분광학, 형광 상관 분광학, 형광 상호-상관 분광학 (fluorescence cross-correlation spectroscopy), 형광 강도 분포 분석, 형광 수명 측정, 형광 이방성 측정, 또는 이들의 조합과 같은 그 밖의 다른 광학적 방법을 사용함으로써 검출될 수도 있다. 예를 들어, 용액 내에서 쌍나선 필라멘트 (paired helical filaments)의 형성 및 응집을 모니터링하고 정량하는 시험은 문헌 [Friedhoff et al., 1998, Biochemistry, 37: 10223-30]에 기술되었다. 바람직한 구체예에서, 상기의 입체형태-의존적 항체는 광학적으로 라벨을 붙이며, 바람직하게는 형광적으로 라벨을 붙인다.

또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은 인산화 부위 Ser198, Ser199, Ser202, T231, S235, S396, S404, S409, S413 및 S422 중의 하나 이상에서 인산화를 측정하는 것을 포함한다. 질병-특이적 인산화 부위의 인산화는 타우-형질감염된 세포가 AD-유사 변성의 과정에 있음을 확인한다: Ser202/Thr205 (AT8 부위로 알려짐)의 인산화는 진단 마커 에피토프로 확인되었으며, 즉 이것은 알츠하이머병에서의 엉킴 형성 및 신경세포 상실에 선행하는 신경변성의 초기 단계를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 Ser202 및/또는 Thr205에서의 인산화를 측정하는 것을 포함한다.

각각의 에피토프에서 타우의 인산화의 정도는 타우의 포스포에피토프 또는 타우의 비-인산화 부분을 특이적으로 인식하는 적합한 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 현재 이용할 수 있는 항체는 예를 들어, 문헌 [Johnson, G. V. and Hartigan, J. A. (1999) J Alzheimers Dis 1, 329-51]에 기술되어 있으며, 상업적으로 이용할 수 있다. 타우 포스포에피토프의 정량화는 웨스턴 블럿팅에 이어서 표준 절차에 따른 신호의 밀도측정 분석 (densitometrical analysis)에 의해 수행될 수 있다.

수지상 또는 축삭 이영양증/변성은 생화학적 측정, 시각적 검사 및/또는 적합한 마커 (등, 문헌 [Mack et al. (2001) Nat Neurosci 4, 1199-206]에 상세하게 기술된 바와 같은 신경필라멘트의 중형 이소형태 (heavy isoform)를 검출하는 항체)를 사용한 조직 절편 (염색) 라벨링에 의해서 측정될 수 있다. 형태학적으로, 축삭의 왈러리안 (Wallerian) 변성은 문헌 [Beirowski et al. (2005) BMC Neurosci 6, 6]에 상세하게 기술되어 있다.

시냅스 이영양증은 생화학적 측정, 시각적 검사 및/또는 시냅신 또는 시냅토파이신 (synaptophysin)과 같은 적합한 마커를 사용한 조직 절편 라벨링 (염색)에 의해서 결정될 수 있다 [Rutten et al., 2005, Am J Pathol 167, 161-73].

특정한 구체예에서, 상기의 방법은 추가로, β-아밀로이드 전구체 단백질 (β-APP) 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 변이체로 세포를 공동-처리하는 단계를 포함한다 (상기 참조). 대안적으로, β-아밀로이드 전구체 단백질 (β-APP) 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 변이체를 상술한 바와 같이, 바람직하게는 유도성 시스템의 조절 하에서, 세포에서 발현시킬 수 있다. 이 구체예는 상기 세포를 β-아밀로이드 전구체 단백질 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합체 벡터로 형질감염 또는 형질도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 단편은 β-아밀로이드 펩타이드 Aβ_1-42이다. β-아밀로이드 펩타이드는 몇 개의 다른 식으로 스플라이싱된 전사물인 더 큰 타입 I 막 스팬닝 (spanning) 단백질 β-APP로부터 유도된다. β-APP 및 Aβ_1-42의 아미노산 서열은 문헌 [Kang J. et al., 1987; Knauer M.F et al., 1992; Homo sapiens APP (Gen-ID): NM 201414]에 기술되어 있다. 이들 서열은 본 발명에 참고로 포함된다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "단편"은 예를 들어, 다른 식으로 스플라이싱되거나, 절단되거나, 다른 식으로 분열된 전사 생성물 또는 해독 생성물을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "유도체"는 돌연변이체, 또는 RNA-편집되거나, 화학적으로 변형되거나, 또는 다른 식으로 변경된 전사 생성물, 또는 돌연변이체, 또는 화학적으로 변형되거나 다른 식으로 변경된 해독 생성물이다. 예를 들어, "유도체"는 변경된 인산화 또는 글리코실화, 또는 아세틸화 또는 지질화와 같은 과정에 의해서, 또는 변경된 신호 펩타이드 분열 또는 다른 타입의 성숙 분열에 의해서 생성될 수 있다. 이들 과정은 해독-후에 일어날 수 있다.

시험 물질이 신경변성 질환을 나타내는 적어도 하나의 마커를 변조시키는지 여부를 측정하는 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다: (i) 시험 물질과 접촉시킨 세포 또는 세포 배양액 내의 마커를 측정하고; (ii) 시험 물질과 접촉시키지 않은 세포 또는 세포 배양액 (대조군 세포 또는 대조군 세포 배양액) 내의 마커를 측정하고; 임의로, (iii) (i) 및 (ii)에서 측정된 마커의 수준 또는 활성을 비교한다.

또 다른 구체예에서, 시험 물질이 신경변성 질환을 나타내는 적어도 하나의 마커를 변조시키는지 여부를 측정하는 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다: (i) 시험 물질과 접촉시킨 세포 또는 세포 배양액 내의 마커를 측정하고; (ii) 돌연변이된 타우를 발현하지 않고, 시험 물질과 접촉시키지 않은 대조군 세포 (또는 대조군 세포 배양액) 내의 마커를 측정하고; 임의로, (iii) (i) 및 (ii)에서 측정된 마커의 수준 또는 활성을 비교한다.

상기 방법은 신경변성 질환을 나타내는 마커의 수준 또는 활성을 감소시킬 수 있는 시험 화합물을 신경변성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제제로서 선택 또는 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 시험 화합물은 이것이 마커의 수준 또는 활성을 상당히 감소시킬 수 있다면 선택될 수 있다. 바람직하게는, 마커가 정량적 방식으로 측정될 수 있는 경우에, 시험 화합물은 이것이 마커의 수준 또는 활성을 대조군 세포 또는 대조군 세포 배양액에 비해 적어도 10% 만큼, 바람직하게는 적어도 20% 만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 30% 만큼, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40% 만큼, 가장 바람직하게는 적어도 50% 만큼 감소시킬 수 있다면 선택될 수 있다.

특별한 구체예에서, 시험 화합물은 이것이 본 발명의 세포의 전기 교류저항을 상당히 증가시킬 수 있다면 선택될 수 있다. 바람직하게는, 시험 화합물은 이것이 본 발명의 세포의 전기 교류저항을 시험 화합물과 접촉시키지 않은 대조군 세포 또는 대조군 세포 배양액과 비교하여 적어도 5% 만큼, 바람직하게는 적어도 10% 만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 15% 만큼, 더 더욱 바람직하게는 적어도 20% 만큼, 가장 바람직하게는 적어도 25% 만큼 증가시킬 수 있다면 선택된다.

또 다른 특별한 구체예에서, 시험 화합물은 이것이, 본 발명의 세포의 전기 교류저항이 돌연변이된 타우를 발현하지 않는 대조군 세포의 전기 교류저항과 10% 미만 만큼, 더욱 바람직하게는 5% 미만 만큼 상이하도록 본 발명의 세포의 전기 교류저항을 증가시킬 수 있다면 선택된다.

상기 방법은 추가로, 본 발명의 세포의 생존도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이것은 현미경 하에서의 시각적 검사; 생염료 (vital dyes) 염색, 및 정상 및 손상된 뇌에 존재하는 세포 타입 또는 부위에 대해서 특이적인 면역조직화학 시약을 사용한 염색; 신경필라멘트, 신경교 원섬유 산성 단백질, S100, 미세소관 연관된 단백질 및 시냅스 단백질에 대한 항체와의 반응; 대사 활성의 생화학적 평가; 총 또는 특이적 단백질 함량의 측정; 세포 기능의 평가; 및 신경 활성의 평가와 같은 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다.

세포 또는 세포 배양액의 생존도/완전성은 세포의 건강을 입증할 뿐만 아니라 전처리된 세포 배양액 내에 존재하는 살아있는 세포의 양의 척도를 제공하기 위해서 각각의 실험을 시작할 때 평가될 수 있다.

시험 화합물

상기 방법에서 측정 검사된 화합물은 무작위로 선택될 수 있거나, 합리적으로 선택 또는 디자인될 수 있다. 본 발명에서 사용된 것으로서, 화합물이 다른 확인된 활성 화합물의 구조를 고려함이 없이 무작위로 선택되는 경우에, 화합물은 무작위로 선택된다고 말한다. 무작위로 선택된 화합물의 예는 화학적 라이브러리, 펩타이드 조합 라이브러리, 유기체의 성장 육즙, 또는 식물 추출물의 사용이다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 화합물이 비임의적 기준으로 선택되는 경우에, 화합물은 합리적으로 선택 또는 디자인된다고 말한다. 합리적 선택은 작용의 표적 또는 미리 확인된 활성 화합물의 구조를 기초로 할 수 있다. 구체적으로, 화합물은 현재 알츠하이머병을 치료하는데 사용하기 위해서 조사되고 있는 화합물의 구조를 이용하여 합리적으로 선택되거나 합리적으로 디자인될 수 있다.

시험 화합물은 예를 들어, 펩타이드, 소분자, 및 비타민 유도체뿐만 아니라 탄수화물일 수 있다. 시험 화합물은 핵산, 천연 또는 합성 펩타이드 또는 단백질 컴플렉스, 또는 융합 단백질일 수 있다. 이들은 또한, 항체, 유기 또는 무기 분자 또는 조성물, 약물 및 상기 제제 중의 어떤 것의 모든 조합물일 수도 있다. 이들은 시험, 진단 또는 치료학적 목적으로 사용될 수 있다. 숙련된 전문가는 본 발명에 따라 사용될 시험 화합물의 구조적 성질에 관해서 제한이 없다는 것을 쉽게 인식할 수 있다.

시험 물질의 적용

실험의 시작 시점에서는, 본 발명에 따르는 세포를 포함하는 세포 배양액이 전형적으로 제공된다. 배양 배지는 세포의 도입 전에 존재하는 시험 화합물을 가질 수 있거나, 시험 화합물은 세포를 배양 접시 내에 배치한 후에 배지에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 시험 물질은 우선 DMSO, 물, 생리 식염수, 또는 배지와 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 적합한 비히클에 용해시켜 저장 용액 (stock solution)을 만든 다음에, 배지에 희석시킨다. 본 발명이 사용되는 경우에는, 비히클 대조 시험이 포함될 수 있다.

바람직하게는, 일정한 범위의 용량을 시험한다. 일차적으로 시험한 범위는 정제된 단백질, 배양액 중의 세포, 또는 다른 시험 시스템에서의 독성에 대한 시험 화합물 또는 밀접하게 관련된 물질의 효과에 대한 선행 지식에 의해서 알려질 수 있다. 이러한 지식이 없는 경우에, 용량 범위는 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 100 μM이다. 숙련된 전문가는 어떤 특별한 화합물 또는 일련의 화합물들에 대한 시험 범위를 쉽게 밝힐 수 있다.

시험 화합물은 전형적으로, 약 1시간 내지 약 21일, 바람직하게는 약 3시간 내지 약 7일, 더욱 바람직하게는 약 6시간 내지 약 3일, 가장 바람직하게는 약 18시간 내지 약 2일, 예를 들어, 약 24시간 동안 세포 또는 세포 배양액에 적용된다. 장기간 적용의 경우에는, 시험 화합물을 함유하는 신선한 배지를 주기적으로, 화학적 전환 또는 대사에 기인한 시험 화합물의 빠른 손실이 의심스러운 경우에는 더욱 빈번하게 적용할 수 있다. 특별한 구체예에서는, 본 발명의 세포를 상술한 바와 같은 분화제와 접촉시킨다. 분화제는 세포를 시험 물질에 노출시키기 전에 세포에 첨가될 수 있거나 (예를 들어, 24 또는 48시간 전에), 분화제는 시험 물질과 동시에 첨가될 수 있으며, 그 후에 세포를 더 배양한다. 이들 구체예는 필요한 변경을 가하여 상술한 방법에 적용한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 신경변성의 하나 이상의 마커를 변조시킬 수 있는 제제 또는 제제들을 스크리닝하기 위한 본 발명의 타우 단백질, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드, 또는 본 발명의 세포의 용도에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 신경변성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 개발을 위한 본 발명의 타우 단백질, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드, 또는 본 발명의 세포의 용도에 관한 것이다.

아직 또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 세포를 제공하고; (b) 상기 세포를 비정상적 입체형태를 갖는 타우 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하여, 타우 병변을 재현하는 방법에 관한 것이다.

이하에서는, 본 발명을 실시예를 참고로 하여 더 상세하게 기술된다. 그러나, 이하의 재료, 방법 및 실시예는 단지 본 발명의 관점을 설명하는 것이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 그 자체로서 본 발명에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있다.

실시예

다음의 재료 및 방법이 이하에 기술된 실시예에서 사용되었다:

EGFP-융합된 타우를 안정적으로 발현하는 SH-SY5Y 세포주의 생성

인간 야생형 타우 (0N4)로부터의 cDNA를 분리된 인간 신경 세포 mRNA로부터의 PCR에 의해서 증폭시켰다. PCR 중에, BglII 부위를 타우 유전자의 5'에 삽입하고, SalI 부위를 3'-말단에 삽입하였다. PCR 생성물을 EGFP 코드화 서열의 C-말단에서 pEGFP-C1 벡터 내에 클로닝하였다. 렌티바이러스 형질도입의 경우에는, EGFP-타우 야생형 코드화 서열을 BamHI (5') 및 XhoI (3') 제한부위와 함께 PCR에 의해서 증폭시키고, 렌티바이러스 형집도입 벡터 내에 클로닝하였다. EGFP-tau (다중)돌연변이체는 부위-지시 돌연변이유발에 의해서 수득되었다 (QuickChange Lightning, Stratagene). 렌티바이러스 바이러스 입자 생산을 위해서는, 렌티바이러스 TOPO 발현 키트 (Lentiviral TOPO Expression Kit; Invitrogen)가 사용되었다. SH-SY5Y 세포주는 렌티바이러스 입자에 의해서 형질도입시켰으며, EGFp-타우 구조물을 안정적으로 발현하는 세포는 블라스티시딘에 의해서 선택되었다.

세포 배양 및 세포 처리

인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포를 15% 소태아혈청 (FBS), 비-필수 아미노산, 글루타맥스 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지 (Invitrogen) 내에서 성장시켰다. SH-SY5Y 세포의 분화는 SH-SY5Y 세포를 20 nM 스타우로스포린 (Sigma-Aldrich)과 48시간 동안 배양함으로써 유도되었다. 적절한 실험을 위해서, 분화된 세포를 25 nM 농도의 오카다산 (Sigma-Aldrich)으로 처리하거나, 기준 화합물의 경우에는 각각 SRN-003-556 및 AR-A014418를 사용하여 시험하였다.

면역조직화학

세포를 커버슬립 (coverslips) 상에서 성장시키고, 실온에서 30분 동안 4% 포름알데히드로 고정시키고, 이어서 0.1% 트리톤 X-100으로 투과화시켰다. 세포를 실온에서 2시간 동안 항-아세틸화 타우 항체 (Abcam,　1:1000)와 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후에, 세포를 Cy3-결합 이차 항체 (Dianova,　1:100)와 1.5시간 동안 배양하였다. 핵을 DAPI (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 공초점 이미지 (confocal images)는 니콘 에클립스 (Nikon Eclipse) C1 LSM 현미경으로 찍었다.

웨스턴 블럿 분석

세포를 수확하고, 프로테아제뿐만 아니라 포스파타제 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 단백질을 초음파처리 (Hielscher GmbH)에 의해서 추출하고, 단백질 농도는 로티-나노콴트 시험 (Roti-Nanoquant Assay; Carl-Roth GmbH)을 사용하여 측정하였다. 램리 (Laemmli) 샘플 완충액을 60 ㎍ 세포 용해물에 첨가하였다. 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시키고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막 상에 전기 전이시키고, 이어서 4℃에서 밤새 항-MC1 특이 항체 (Peter Davis Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 1:100)로 면역라벨링하였다. 이차 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) 컨주게이트되었다 (Dianova,　1:5000). 특이적 단백질 신호는 화학발광 검출 키트 (Chemiluminescence Detection Kit; MobiTec) 및 ChemiDoc-XRS (BioRad)를 사용하여 검출하였다.

교류저항 측정

세포를 배양 표면에 금 전극을 포함하는 자체-개발된 96-웰 어레이 상에서 배양하였다. SH-SY5Y 세포를 96-웰 어레이 상에서 48시간 동안 분화시켰다. 교류저항 스펙트럼은 96-웰 어레이에 대해서 자체-개발된 멀티플렉서 유니트 (multiplexer unit) 및 500 Hz 내지 5 MHz (전극 사이에 0 mV 바이어스 (bias))의 주파수와 함께 10 mV의 교류 전압을 갖는 교류저항 아날라이저 애질런트 (impedance Analyser Agilent) 4294A (Agilent Technologies)로 기록하였다. 각각의 실험을 위해서, 적어도 5개의 웰을 반복하여 측정하였다. 모든 교류저항 크기 스펙트럼은 자체-개발된 소프트웨어 IDAT (Impedance Data Analysing Tool)로 분석하였다. IDAT는 세포가 없는 전극에 대비한 세포-커버된 전극의 교류저항을 계산하고 (상대적 교류저항: (|Z|_커버됨-|Z|_무-세포)　/　|Z|_무-세포　x　100%), 세포 층에 의해서 야기된 교류저항 변화가 최대인 경우의 주파수를 결정 및 선택한다 (96-웰 어레이 상의 SH-SY5Y 세포의 경우에 약 100 kHz). 시간의 경과에 따른 상대적 교류저항은 시점 0 (100　%)에 대해서 더 표준화하여 상이한 웰 및 실험이 동등하도록 만들고, 포괄적인 통계학적 분석을 허용한다. 실험은 적어도 3 회 반복하였다.

실시예 1

일차 실시예에서는, 다중-돌연변이체 타우 변이체의 다수의 조합을 생산하고, 인간 신경아세포종 세포주에서의 이식유전자로 시험하였다. 더 나은 개요 및 비교를 위해서, 단일 돌연변이체 타우 (P301L), 4x 다중-돌연변이체 타우_{△K280/P301L/V337M/R406W} (dK280q)뿐만 아니라 또한 과돌연변이체 타우 (Hyper)로도 불리는 4x 다중-돌연변이체 타우_{K257T / P301L / V337M / R406W} (K257Tq) 및 5x 다중-돌연변이체 타우_{K257T /△280/ P301L / V337M / R406W}을 나타낸다. 타우 변이체 이식유전자 발현의 동등한 수준을 보장하기 위해서, 모든 구조물을 동일한 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 발현시켰다. 유전자이식 세포주는 바이러스 감염, 및 타우 변이체 이식유전자가 그들의 게놈 내에 안정적으로 통합된 형질도입된 세포의 선택 후에 빠르게 생성되었다.

예기치 않게, 분화의 유도 (20　nM 스타우로스포린)가 오카다산과 같은 독성 보조인자의 첨가 [Jahnke et al. 2009] 또는 타우 이식유전자의 대량의 과발현의 사용이 없이, 하이퍼 (Hyper)-타우 세포주 (도 1, 화살표)에서 독점적으로 이상 타우 응집체의 형성을 초래하는 것이 발견되었다.

분자 수준에서 세포주의 더 상세한 분석은 다양한 조건 하에서 미스폴딩된 타우 단백질의 축적을 나타내었다 (도 2). 결과는 미분화된 신경아세포종 세포주에서, 단지 5 FTD 돌연변이를 포함하는 하이퍼-타우 변이체만이 입체형태-의존적 항체 MC1에 의해서 검출되는 비정상적 입체형태의 미스폴딩된 타우 종을 생기게 하였음을 나타내었다 (도 2; 상부 패널). 따라서, 이러한 5x 돌연변이 변이체는 이것이 추가의 자극 또는 처리가 없이 비정사적 MC1-입체형태로 타우 단백질의 존재를 초래하기 때문에, '과-돌연변이된' 타우 변이체로 불린다. 세포를 각각 48 또는 72시간 동안 분화시킨 후에, 야생형 변이체 세포주에서는 거의 미스폴딩된 타우 종의 대규모 증가가 관찰되었으며, 5x 돌연변이 변이체는 MC1-입체형태 타우 이소형태의 피크 수준을 나타내었다.

흥미롭게도, 병리학적으로 미스폴딩된 타우 종은 또한, 아마도 더 조밀한 입체형태에 기인하여, PAGE 전기영동 중에 생리학적 입체형태의 종 (즉, 야생형 대조 타우)보다 약간 더 빠르게 이동함으로써 그들 자체를 나타낸다 (도 2; 전체 타우를 나타내는 중간 패널; 가장 조밀하고 느슨한 입체형태 이소형태는 화살표로 표시된다). 이러한 발견은 또한, 입체형태-의존적 항체 MC1에 의해서 인식되는 AD 뇌로부터의 병리학적 타우가 응집에는 유리하지만 미세소관 안정화에는 반대되는 조밀한 '페이퍼클립 (paperclip)' 입체형태를 지속한다는 것을 시사하는 문헌 [Jeganathan et al. (2008)]으로부터의 결과와 완벽하게 일치한다.

더욱이, '과-돌연변이된' 타우 변이체는 또한, 미세소관 완전성에 관해서 독특하다. 돌연변이체 타우는 응집하는 큰 경향을 가지고, 이렇게 함으로써 그의 생리학적 기능을 상실할 수 있을 뿐만 아니라, 그 외에도 명백하게 특정한 신경독성 (신경교 세포에는 영향을 미치지 않음)을 야기하는 기능의 독성 증가를 수행하는 것으로 보인다. 그러나, 기능의 이러한 독성 증가의 정확한 성질은 아직 이해되지 않았다. 3 돌연변이된 타우 및 야생형 타우 대조군 세포주에서의 미세소관 네트워크의 안정성을 비교하였을 때 (도 3), 본 발명자들은 eGFP-태깅된 타우 이식유전자를 발현하는 세포에서 안정한 미세소관의 두꺼운 번들을 관찰하였다 (백색 화살표). 이들 세포에서, 해독-후 변형된 안정한 미세소관에 대한 마커로서 아세틸화된 튜불린은 유전자이식 타우와 강력하게 공동-국재화하여 밝은 황색의 필라멘트상 패턴을 제공하였다.

그에 반해서, 5x 돌연변이체 MAPT 유전자 변이체를 갖는 분화된 신경-타입 세포의 서브집단 (도 3, D)에서는 안정한 미세소관의 뚜렷한 손실이 관찰되었다 (빈 화살표). 이들 세포에서는, 타우 이식유전자의 뚜렷한 발현에도 불구하고 공동-국재화된 미세소관은 존재하지 않았다. 어떤 소정의 시점에서라도, 신경 세포의 분획에서 미세소관의 타우 독성-의존적 붕괴는 미세소관 네트워크의 점진적 손실을 초래할 수 있다. 다중-돌연변이체 타우 변이체는 병에 걸린 세포의 백분율을 상승시킬 수 있거나, 효과적인 미세소관 병리학-변조물질에 대한 스크리닝을 가능하게 하는 미세소관 파괴를 상당히 증진시킬 수 있다.

응집된 타우 올리고머 (도 1에서만큼 크거나, 더 작은 전구체)는 미세소관 네트워크를 공격하는 독성 타우 종을 구성할 수 있으며, 궁극적으로는 필수적인 미세소관-의존적 수송 기능의 중단에 책임이 있어서 세포를 서서히 위축시킬 수 있다. 또한, 이 결과는 미세소관-기본 축삭 및 수지상 수송 및, 따라서, 시냅스/척추 유지가 AD에서 타우-의존적 변성에 의해서 주로 영향을 받는다는 증거가 증가함으로써 확실하게 된다 [참조: 예를 들어, Zempel et al. 2010].

실시예 2

하이퍼-타우 돌연변이체 세포주의 독특한 성능을 입증하기 위해서 교류저항 분광학이 문헌 [Jahnke et al. 2009]에 상세히 기술된 무-민감성 라벨 실시간 모니터링 기술로서 사용되었다. 제1 단계에서, 본 발명자들은 타우 단백질의 과인산화에 대한 AD-관련된 시험관내 시험에서 광범하게 사용되는 독성 포스파타제-억제제 오카다산을 사용하였다 (도 4).

오카다산이 통상적으로 비-생리학적 조건 하에서의 시험관내 실험에서 타우 과인산화의 인공적 유도를 위해서 사용되는 것을 고려하여, 본 발명자들은 각각 3 및 6시간 후에 하이퍼-타우 돌연변이체 특이적 변성효과를 교류저항 측정에 의해서 검출할 수 있었다. 배양 시간이 증가함에 따라서 오카다산의 독성 부작용은 모든 타우 돌연변이체 세포주에서 전반적인 세포 독성을 초래하여 교류저항의 강력한 감소를 야기한다.

병리학의 인공적 유도를 사용하고, 이에 의해서 특이적이지만 완전히 입증되지는 않은 표적, 예를 들어, 시험관내 과인산화 및/또는 응집에 대해서 촛점을 맞춘 제한을 극복하기 위해서, 본 발명자들은 다중-돌연변이체 타우, 특히 신경 분화의 유도에 의해서만 신경병리학적 표현형을 나타내는 하이퍼-타우 돌연변이체를 이용하였다 (참조: 도 1). 따라서, 야생형 및 다중-돌연변이체 타우 발현 세포를 48시간 동안 분화시키고, 이어서 24시간 동안 교류저항을 모니터링하였다 (도 5). 4-6 회 반복한 3개의 실험으로부터의 평균값은 단일 돌연변이체 P301L 타우 발현 세포가 야생형 타우 발현 세포와 같은 동일한 교류저항적 특징을 나타낸다는 것을 드러낸다. 4x 다중-돌연변이체 K257Tq 및 dK280q는 야생형 및 P301L 타우 발현 세포에 비해 20시간 후에 이미 더 낮은 교류저항 값을 나타내는 반면에, 하이퍼-타우 발현 세포는 유도된 신경변성에 의해서 야기된 상대적 교류저항의 여전히 더 상당한 감소를 나타낸다.

실시예 3

하이퍼-돌연변이체 타우의 독특한 효과는 잠재적인 활성 약제학적 성분의 확인 및 효율 정량화를 위한 기능적 타우 병리학 시험관내 스크리닝 시험에서 사용될 수 있었다. 교류저항 분광학을 통해서 모니터링될 수 있는 병리학적 상태 (하이퍼-타우 발현 세포)와 생리학적 상태 (야생형 타우 발현 세포) 사이의 차이를 고려하여, 병리학적 세포 변성을 약화시키는 화합물의 효율을 정량적으로 측정할 수 있다.

전형적으로, 본 발명자들은 2개의 키나제 억제제를 사용하여 하이퍼-타우 기본 스크리닝 시험의 능력을 입증하였다 (도 6). 상세하게, ERK2에 대한 중등도의 특이성을 갖는 개발된 납 화합물인 SRN-003-556, 및 특이적 GSK3β-억제제인 AR-A014418을 시험하였다. 두 가지 억제제는 모두 오카다산과 같은 독성 화합물을 사용한 인공적 과인산화를 기초로 하는 타우 병리학 시험관내 시험에서 치료학적 효과를 나타내었다 [LeCorre et al. 2006, Selenica et al. 2007, Jahnke - 미공개 데이터]. SRN-003-556만이 타우 병변 마우스 모델에서 치료학적 효과를 나타낸 반면에 AR-A014418은 그렇지 않았다 [LeCorre et al. 2006, Selenica et al. 2007].

교류저항 분광학 기본 기능적 타우 병리학 시험관내 스크리닝 시험을 사용하여, 본 발명자들은 24시간째에 35 nM의 EC₅₀을 갖는 SRN-003-556의 치료학적 효과를 정량적으로 측정할 수 있었다.

이들 결과는 키나제 매개된 과인산화 (오카다산과 같은 독성 화합물을 사용함으로써 달성됨), 응집 프로모터 및 리폴딩 (refolding)/분해 프로모터뿐만 아니라 종종 거짓 포지티브 히트 (false positive hits)를 생성시키는 올리고머 또는 섬유상 타우 구조와 같은 가설적 표적에 대해서 선결정되지 않은 신규 다중-돌연변이체 타우 기본 시험관내 모델의 이점을 나타낸다. 더욱이, 교류저항 모니터링은 향신경성 효과 (도 6, SRN-003-556, 6h 및 12h, 100 nM) 또는 독성 효과 (AR-A014418, 6h 및 12h, 0.1 nM-100 nM)와 같은 잠재적 부작용을 검출할 기회를 제공한다. 기능적 타우 병리학 시험관내 스크리닝 시험에서 다중-돌연변이체 타우 변이체를 사용하는 것은 표적 확인 및 인증뿐만 아니라 잠재적 활성 약제학적 성분 효율의 예측을 매우 개선시킬 것이다.

참고문헌

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서열 목록에 나타낸 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열:

서열번호 1은 야생형 인간 타우 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (호모 사피엔스 (Homo sapiens) 미세소관-연관된 단백질 타우 (MAPT): NM 016834/NP_058518).

서열번호 2는 441개의 아미노산을 갖는 인간 타우 이소형태의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 3은 야생형 서열에 비해서 5개의 FTDP-17 돌연변이를 갖는 변형된 인간 타우 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 4는 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

서열번호 5는 서열번호 3을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

서열번호 6 및 7은 각각 다음의 상세한 사항을 갖는 인간 타우 단백질의 또 다른 이소형태의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다:

위치 NM_005910 1326 bp mRNA 선형 PRI 03-APR-2011

정의 호모 사피엔스 미세소관-연관된 단백질 타우 (MAPT), 전사물 변이체 2, mRNA.

기탁 NM_005910 REGION 323..1648

형식 NM_005910.5 GI294862262

서열번호 8 및 9는 각각 다음의 상세한 사항을 갖는 인간 타우 단백질의 또 다른 이소형태의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다:

위치 NM_001123067 1239 bp mRNA 선형 PRI 03-APR-2011

정의 호모 사피엔스 미세소관-연관된 단백질 타우 (MAPT), 전사물 변이체 5, mRNA.

기탁 NM_001123067 REGION: 323..1561

<110> Universitaet Leipzig <120> Polymutant tau protein variants and their use for recapitulating human tauopathies <130> IPA131006 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 383 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val 50 55 60 Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro 85 90 95 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 165 170 175 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 180 185 190 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu 195 200 205 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu 210 215 220 Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 225 230 235 240 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 245 250 255 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His 260 265 270 Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe 275 280 285 Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His 290 295 300 Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe 305 310 315 320 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 325 330 335 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn 340 345 350 Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala 355 360 365 Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 370 375 380 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 3 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human tau having five mutations <400> 3 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val 50 55 60 Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro 85 90 95 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 165 170 175 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 180 185 190 Pro Asp Leu Lys Asn Val Thr Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu 195 200 205 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Leu Asp 210 215 220 Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His 225 230 235 240 Val Leu Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu 245 250 255 Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys 260 265 270 Pro Gly Gly Gly Gln Met Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys 275 280 285 Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val 290 295 300 Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg 305 310 315 320 Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys 325 330 335 Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Trp His Leu Ser Asn Val 340 345 350 Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr 355 360 365 Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 370 375 380 <210> 4 <211> 1152 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60 ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120 gctggcctga aagctgaaga agcaggcatt ggagacaccc ccagcctgga agacgaagct 180 gctggtcacg tgacccaagc tcgcatggtc agtaaaagca aagacgggac tggaagcgat 240 gacaaaaaag ccaagggggc tgatggtaaa acgaagatcg ccacaccgcg gggagcagcc 300 cctccaggcc agaagggcca ggccaacgcc accaggattc cagcaaaaac cccgcccgct 360 ccaaagacac cacccagctc tggtgaacct ccaaaatcag gggatcgcag cggctacagc 420 agccccggct ccccaggcac tcccggcagc cgctcccgca ccccgtccct tccaacccca 480 cccacccggg agcccaagaa ggtggcagtg gtccgtactc cacccaagtc gccgtcttcc 540 gccaagagcc gcctgcagac agcccccgtg cccatgccag acctgaagaa tgtcaagtcc 600 aagatcggct ccactgagaa cctgaagcac cagccgggag gcgggaaggt gcagataatt 660 aataagaagc tggatcttag caacgtccag tccaagtgtg gctcaaagga taatatcaaa 720 cacgtcccgg gaggcggcag tgtgcaaata gtctacaaac cagttgacct gagcaaggtg 780 acctccaagt gtggctcatt aggcaacatc catcataaac caggaggtgg ccaggtggaa 840 gtaaaatctg agaagcttga cttcaaggac agagtccagt cgaagattgg gtccctggac 900 aatatcaccc acgtccctgg cggaggaaat aaaaagattg aaacccacaa gctgaccttc 960 cgcgagaacg ccaaagccaa gacagaccac ggggcggaga tcgtgtacaa gtcgccagtg 1020 gtgtctgggg acacgtctcc acggcatctc agcaatgtct cctccaccgg cagcatcgac 1080 atggtagact cgccccagct cgccacgcta gctgacgagg tgtctgcctc cctggccaag 1140 cagggtttgt ga 1152 <210> 5 <211> 1149 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 5 atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60 ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120 gctggcctga aagctgaaga agcaggcatt ggagacaccc ccagcctgga agacgaagct 180 gctggtcacg tgacccaagc tcgcatggtc agtaaaagca aagacgggac tggaagcgat 240 gacaaaaaag ccaagggggc tgatggtaaa acgaagatcg ccacaccgcg gggagcagcc 300 cctccaggcc agaagggcca ggccaacgcc accaggattc cagcaaaaac cccgcccgct 360 ccaaagacac cacccagctc tggtgaacct ccaaaatcag gggatcgcag cggctacagc 420 agccccggct ccccaggcac tcccggcagc cgctcccgca ccccgtccct tccaacccca 480 cccacccggg agcccaagaa ggtggcagtg gtccgtactc cacccaagtc gccgtcttcc 540 gccaagagcc gcctgcagac agcccccgtg cccatgccag acctgaagaa tgtcacgtcc 600 aagatcggct ccactgagaa cctgaagcac cagccgggag gcgggaaggt gcagataatt 660 aataagctgg atcttagcaa cgtccagtcc aagtgtggct caaaggataa tatcaaacac 720 gtcctgggag gcggcagtgt gcaaatagtc tacaaaccag ttgacctgag caaggtgacc 780 tccaagtgtg gctcattagg caacatccat cataaaccag gaggtggcca gatggaagta 840 aaatctgaga agcttgactt caaggacaga gtccagtcga agattgggtc cctggacaat 900 atcacccacg tccctggcgg aggaaataaa aagattgaaa cccacaagct gaccttccgc 960 gagaacgcca aagccaagac agaccacggg gcggagatcg tgtacaagtc gccagtggtg 1020 tctggggaca cgtctccatg gcatctcagc aatgtctcct ccaccggcag catcgacatg 1080 gtagactcgc cccagctcgc cacgctagct gacgaggtgt ctgcctccct ggccaagcag 1140 ggtttgtga 1149 <210> 6 <211> 441 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 7 <211> 1326 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60 ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120 gctggcctga aagaatctcc cctgcagacc cccactgagg acggatctga ggaaccgggc 180 tctgaaacct ctgatgctaa gagcactcca acagcggaag atgtgacagc acccttagtg 240 gatgagggag ctcccggcaa gcaggctgcc gcgcagcccc acacggagat cccagaagga 300 accacagctg aagaagcagg cattggagac acccccagcc tggaagacga agctgctggt 360 cacgtgaccc aagctcgcat ggtcagtaaa agcaaagacg ggactggaag cgatgacaaa 420 aaagccaagg gggctgatgg taaaacgaag atcgccacac cgcggggagc agcccctcca 480 ggccagaagg gccaggccaa cgccaccagg attccagcaa aaaccccgcc cgctccaaag 540 acaccaccca gctctggtga acctccaaaa tcaggggatc gcagcggcta cagcagcccc 600 ggctccccag gcactcccgg cagccgctcc cgcaccccgt cccttccaac cccacccacc 660 cgggagccca agaaggtggc agtggtccgt actccaccca agtcgccgtc ttccgccaag 720 agccgcctgc agacagcccc 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Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly 65 70 75 80 Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala 85 90 95 Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala 115 120 125 Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala 130 135 140 Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 145 150 155 160 Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr 165 170 175 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 180 185 190 Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser 195 200 205 Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu 210 215 220 Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser 245 250 255 Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys 275 280 285 Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly 290 295 300 Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 305 310 315 320 Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly 325 330 335 Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn 340 345 350 Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 355 360 365 Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser 370 375 380 Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala 385 390 395 400 Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 405 410 <210> 9 <211> 1239 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 9 atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60 ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120 gctggcctga aagaatctcc cctgcagacc cccactgagg acggatctga ggaaccgggc 180 tctgaaacct ctgatgctaa gagcactcca acagcggaag ctgaagaagc aggcattgga 240 gacaccccca gcctggaaga cgaagctgct ggtcacgtga cccaagctcg catggtcagt 300 aaaagcaaag acgggactgg aagcgatgac aaaaaagcca agggggctga tggtaaaacg 360 aagatcgcca caccgcgggg agcagcccct ccaggccaga agggccaggc caacgccacc 420 aggattccag caaaaacccc gcccgctcca aagacaccac ccagctctgg tgaacctcca 480 aaatcagggg atcgcagcgg ctacagcagc cccggctccc caggcactcc cggcagccgc 540 tcccgcaccc cgtcccttcc aaccccaccc acccgggagc ccaagaaggt ggcagtggtc 600 cgtactccac ccaagtcgcc gtcttccgcc aagagccgcc tgcagacagc ccccgtgccc 660 atgccagacc tgaagaatgt caagtccaag atcggctcca ctgagaacct gaagcaccag 720 ccgggaggcg ggaaggtgca gataattaat aagaagctgg atcttagcaa cgtccagtcc 780 aagtgtggct caaaggataa tatcaaacac gtcccgggag gcggcagtgt gcaaatagtc 840 tacaaaccag ttgacctgag caaggtgacc tccaagtgtg gctcattagg caacatccat 900 cataaaccag gaggtggcca ggtggaagta aaatctgaga agcttgactt caaggacaga 960 gtccagtcga agattgggtc cctggacaat atcacccacg tccctggcgg aggaaataaa 1020 aagattgaaa cccacaagct gaccttccgc gagaacgcca aagccaagac agaccacggg 1080 gcggagatcg tgtacaagtc gccagtggtg tctggggaca cgtctccacg gcatctcagc 1140 aatgtctcct ccaccggcag catcgacatg gtagactcgc cccagctcgc cacgctagct 1200 gacgaggtgt ctgcctccct ggccaagcag ggtttgtga 1239

Claims (24)

17번 염색체 관련 파킨슨 증상 수반 전두측두엽 치매 (FTDP-17) 상태와 연관된 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 포함하는 타우 단백질.

제1항에 있어서, 17번 염색체 관련 파킨슨 증상 수반 전두측두엽 치매 (FTDP-17) 상태와 연관된 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 포함하는 타우 단백질.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 돌연변이가 [R5H 또는 R5L], K257T, G272V, N279K, S305N, P301L, P301S, V337M, G389R, R406W, 및 결실 K280으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 타우 단백질.

제1항 내지 제3항 중의 어느 하나에 있어서, 상기의 적어도 4개 또는 상기의 적어도 5개의 상이한 돌연변이를 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 타우 단백질.

제1항 내지 제4항 중의 어느 하나에 있어서, 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 타우 단백질.

제1항 내지 제5항 중의 어느 하나에 따르는 타우 단백질을 코딩하는 핵산.

제1항에 있어서, 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.

제6항 또는 제7항의 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터.

제6항 또는 제7항의 핵산 또는 제8항의 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포.

돌연변이된 타우 단백질을 발현하며, 24시간의 세포 배양 후에 교류저항의 감소를 나타내는 세포.

제9항 또는 제10항에 있어서, 신경 세포의 표현형을 갖는 세포.

제9항 내지 제11항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 교류저항이 24시간의 배양 후에 측정된 것으로 돌연변이된 타우를 발현하지 않는 대조군 세포에 비해 적어도 10% 감소되는 세포.

제9항 내지 제12항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이된 타우 단백질이 [R5H 또는 R5L], K257T, I260V, L266V, G272V, N279K, delK280, [N296H 또는 delN296], [P301L 또는 P301S], G303V, S305N, L315R, K317M, S320F, G335V, Q336R, V337M, E342V, S352L, K369I, G389R, R406W 및 R427M으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 4개의 상이한 돌연변이를 갖는 세포.

(a) 시험 화합물을 제9항 내지 제13항 중의 어느 하나의 세포와 접촉시키고;
(b) 시험 물질이 신경변성을 나타내는 적어도 하나의 마커를 변조시키는지 여부를 측정하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 치료 또는 예방하는 제제를 확인하는 방법.

제14항에 있어서, 신경변성을 나타내는 마커가 세포 교류저항, 신경원섬유 엉킴, 타우의 인산화, 수지상/축삭 이영양증, 축삭 변성, 축삭 수송 및 시냅스 이영양증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.

제14항에 있어서, 단계 (b)가 (i) 시험 화합물의 부재 하에서 세포의 교류저항을 측정하고, (ii) 시험 화합물의 존재 하에서 세포의 교류저항을 측정하고, (iii) (i)에서 측정된 교류저항을 (ii)에서 측정된 교류저항과 비교하는 것을 포함하는 방법.

제14항에 있어서, 단계 (b)가 (i) 시험 물질과 접촉된 세포 또는 세포 배양액 내의 마커를 측정하고; (ii) 돌연변이된 타우를 발현하지 않으며, 시험 물질과 접촉되지 않은 대조군 세포 (또는 대조군 세포 배양액) 내의 마커를 측정하고; 임의로 (iii) (i) 및 (ii)에서 측정된 마커의 수준 또는 활성을 비교하는 것을 포함하는 방법.

제14항 내지 제17항 중의 어느 하나에 있어서,
(i) 세포를 배양 배지 내에서 배양하고;
(ii) 시험 화합물을 배양 배지에 첨가하고, 세포를 시험 화합물의 존재 하에서 적어도 1 시간인 기간 동안 더 배양하고;
(iii) 임의로, 단계 (ii) 이전에 상기의 마커를 측정하고;
(iv) 단계 (ii) 후에 적어도 한번 상기의 마커를 측정하는 것을 포함하는 방법.

제18항에 있어서, 상기의 기간이 적어도 12 시간인 방법.

신경변성의 하나 이상의 마커를 변조시킬 수 있는 제제 또는 제제들을 스크리닝하기 위한 제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 타우 단백질, 제6항 또는 제7항의 핵산, 제8항의 벡터 또는 플라스미드, 또는 제9항 내지 제13항 중의 어느 하나에 따르는 세포의 용도.

신경변성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 개발을 위한 제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 타우 단백질, 제6항 또는 제7항의 핵산, 제8항의 벡터 또는 플라스미드, 또는 제9항 내지 제13항 중의 어느 하나에 따르는 세포의 용도.

(a) 제9항 내지 제13항 중의 어느 하나의 세포를 제공하고;
(b) 상기 세포를 비정상적 입체형태를 갖는 타우 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 타우 병변(tauopathy)을 재현하는 방법.

제22항에 있어서, 상기의 배양이 적어도 신경원섬유 엉킴이 세포 내에서 검출될 수 있을 때까지 수행되는 방법.

제22항 또는 제23항에 있어서, 상기의 배양이 적어도 12시간 동안, 바람직하게는 적어도 18시간 동안, 가장 바람직하게는 적어도 24시간 동안 수행되는 방법.

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