JPH10504446A

JPH10504446A - Ｆａｓ会合タンパク質

Info

Publication number: JPH10504446A
Application number: JP8502462A
Authority: JP
Inventors: ジョンシー．リード，; タカアキサトー，
Original assignee: ラホヤキャンサーリサーチファウンデーション
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 1998-05-06
Also published as: US5632994A; WO1995034661A1; CA2192844A1; AU2705395A; US5876939A; DE769060T1; EP0769060A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物タンパク質チロシンホスファターゼであるヒト４型PTP-BAS、ヒト5a型PTP-BASおよびマウス5b型PTP-BAS(これらは、それぞれ、Fas会合タンパク質(FAP)である)、４型PTP-BASまたは５型PTP-BASをコードする核酸分子、および４型PTP-BASまたは５型PTP-BASに対して特異的な抗体を提供する。本発明はまた、FAPを同定する方法を提供する。FAPは、Fasと会合し得、そしてアポトーシスを調整し得る。本発明はまた、FAPとFasとの会合を有効に変化させ得、従って細胞におけるアポトーシスのレベルを増加させるかまたは減少させ得る薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。本発明はさらに、細胞に、PTP-BASまたはPTP-BASのフラグメントをコードする核酸分子、あるいはアンチセンスヌクレオチド配列(これは、PTP-BASをコードする核酸分子の部分に相補的である)を導入することによって、その細胞におけるアポトーシスを調整する方法を提供する。本発明はまた、FAPに特異的に結合する試薬を使用して、細胞におけるアポトーシスレベルの増加または減少によって特徴づけられる病状を診断する方法を提供する。本発明はまた、細胞と、細胞におけるFATおよびFasの会合を有効に変化させるかまたは細胞におけるFAPの活性を変化させる薬剤とを接触させることによって、その細胞におけるアポトーシスを調整する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 Fas会合タンパク質発明の背景発明の分野本発明は、一般に分子生物学および分子医学の分野に関し、そしてより詳細には、プログラム細胞死に関連するタンパク質の同定およびこれらのタンパク質の会合に関する。背景情報プログラム細胞死は、ホメオスタシスを確実にする生理学的プロセスであり、本質的に全ての自己再生組織における細胞生成と細胞代謝回転との間が維持される。多くの場合、「アポトーシス」と呼ばれる特徴的な形態学的変化が死ぬべき細胞（dying cell）に生じる。同様の変化が異なるタイプの死ぬべき細胞に生じるので、細胞死は異なる細胞タイプにおいて共通の経路を介して進行するようである。組織のホメオスタシスを維持する他に、アポトーシスはまた、種々の外部刺激に応じて生じ、外部刺激には、成長因子損失（deprivation）、カルシウムレベルの改変、フリーラジカル、細胞傷害性リンホカイン、特定のウイルスの感染、放射線、およびほとんどの化学療法剤が挙げられる。このように、アポトーシスは、例えば代謝経路において生じると同様の調節メカニズムを受けるような誘導可能な事象である。この観点から、アポトーシスの調節不全もまた生じ得、そして、例えば、特定のタイプのガン細胞においては対応する正常細胞よりも長い時間生存し、そして神経変性疾患においては神経は早期に死ぬことが観察される。ウイルス感染では、アポトーシスの誘導が疾患プロセスの病理生理学において顕著に現れ得る。プログラム細胞死に関連するいくつかのタンパク質が同定され、これらのいくつかのタンパク質間の会合が記載されている。しかし、これらのタンパク質がそれらの活性を媒介するメカニズムについては未知のままである。細胞死に関連するタンパク質の同定およびこれらのタンパク質間の会合の理解は、細胞におけるアポトーシスのプロセスを操作する手段を提供し得、従って、細胞の相対寿命（ relative lifespan）を選択的に調節する。 Fasとして知られる細胞表面タンパク質（APO-1およびCD95とも呼ばれる；以下「Fas」という）は、乳房ガン細胞、結腸ガン細胞、前立腺ガン細胞、および膵臓ガン細胞を含む種々のタイプのヒト細胞上で発現され、アポトーシスを引き起こし得る。Fasは、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、例えば、神経成長因子レセプターも含む。これらのレセプタータンパク質は、細胞外シグナルを細胞内に変換し、そしてその結果として細胞死を誘導するかまたは細胞生存を促進し得る。しかし、Fasのような細胞表面レセプターが細胞死を調節するメカニズムは知られていない。 Fasは細胞表面に存在するので、その作用はおそらく１つまたはそれより多い細胞内タンパク質に結合するFasにより媒介され、最終的には細胞死をもたらす。Fasと会合し得、そのためアポトーシスに関連し得るこのような細胞内タンパク質の同定は、細胞におけるアポトーシスを調整するための手段としてこの会合の操作を可能にする。このように、Fasと会合するタンパク質を同定する必要がある。本発明は、この必要を満たし、そしてさらに他の利点を提供する。発明の要旨本発明は、４型PTP-BASおよび５型PTP-BASと命名されたFas-会合タンパク質（ FAP）を提供し、あるいは、これらは好塩基球（PTP-BAS）から初めに単離されたタンパク質チロシンホスファターゼ（PTPase）の二者択一的にスプライスされた形態である。さらに、５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーが開示され、これには触媒ホスファターゼドメインを欠くヒト５ａ型PTP-BASおよびマウス５ｂ型PTP-BASを含む。本発明はまた、４型PTP-BASまたは５型PTP-BASをコードする核酸分子、これらの核酸分子を含むベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、４型PTP-BASまたはｔ型PTP-BASに特異的に結合し得る抗体を提供する。本発明はまた、PTP-BASのようなFAPとFasとの会合を効果的に改変し得る薬剤（agent）を同定するために有用なスクリーニングアッセイを提供する。FasとFA Pとの会合を改変することにより、効果的な薬剤は細胞におけるアポトーシスのレベルを上昇または低下させ得る。例えば、FasとFAPとの会合を効果的に減少または阻害する薬剤は、アポトーシスのレベルを上昇させ得るが、FasとFAPとの会合を効果的に増加させる薬剤はアポトーシスのレベルを低下させ得る。本発明はさらに、アポトーシスのレベルを調整し得る、細胞中のFAPの量を増加または減少する方法を提供する。例えば、細胞中のFAPの量は、FAPをコードする核酸配列を細胞中に導入しそして発現することにより増加し得る。細胞中のFA Pの量を増加することにより、細胞をアポトーシスに対して比較的抵抗性にし得る。さらに、細胞中のFAPの量は、FAPをコードする核酸分子の一部に相補的であるアンチセンスヌクレオチド配列を細胞中に導入しそして発現することにより減少し得る。また、PTPase活性を欠くFAPのフラグメントが、細胞中で発現され得、そしてFAPの優勢なインヒビターとして作用し得、それにより細胞中のFAP活性を低下する。細胞中のFAPの量または活性を減少することにより、細胞をアポトーシスに対して比較的感受性にし得る。本発明はまた、FAPの活性を改変する方法、および結果として細胞中のFasの活性を改変する方法を提供し、ここでFAPまたはFasの活性のこのような上昇および低下は、細胞におけるアポトーシスのレベルを調整し得る。例えば、細胞中のFA Pの活性は、FAPをコードする核酸配列を細胞中に導入しそして発現することにより上昇し得、それにより、発現したFAPはホスファターゼ活性を有する。さらに、細胞中のFAPの活性は、FAPをコードする核酸分子の一部に相補的であるアンチセンスヌクレオチド配列を細胞中に導入しそして発現することにより低下し得、それにより低下したFAPの発現は、細胞中のPTPase活性を低下させる。本発明はまた、FAPを特異的に結合し得る試薬またはFAPをコードする核酸分子に結合し得るヌクレオチド配列を用いて、細胞中のFAPのレベルの上昇または低下によって改変したアポトーシスのレベルにより特徴づけられる病状を診断する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ツーハイブリッドアッセイシステム（two hybrid assay system）に使用するためのLexA融合タンパク質を生成するために用いた、プラスミドpEG202 のマップを提供する。pEG202は、細菌にアンピシリン耐性を与える遺伝子（AmpR ）および細菌におけるプラスミドの複製を可能にするcolE1複製起点を含む。このプラスミドはまた、ヒスチジン非存在下でプラスミド含有酵母細胞を増殖可能にする遺伝子（HIS3）および酵母における複製を可能にする酵母２ミクロン複製起点を含む。 LexA融合タンパク質は、Fasの細胞質ドメインのオープンリーディングフレーム（アミノ酸191〜335）をコードするcDNAを、LexA（LexA 202）をコードする核酸配列の下流にあるポリリンカーのEco RI/Bam HI部位に挿入することにより生成された。LexA融合タンパク質が生成されるように挿入した配列中にLexAのオープンリーディングフレームを維持するように、クローニングを行った。融合タンパク質をコードする核酸は、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH-P ）から発現されており、そしてADH終止部位（ADH-term）で終結する。図２は、B42融合タンパク質を生成するために用いたプラスミドpJG4-5のマップを提供する。このプラスミドは、２ミクロン（２μm）酵母複製起点およびトリプトファンを含まない培地でプラスミド含有酵母細胞の増殖を可能にする遺伝子（TRP1）を含む。B42融合タンパク質は、示すように、FAPをコードし得るHeLa 細胞由来cDNA配列を、開始メチオニン（ATG）、SV40核局在化シグナル（Nuc．Lo c.）、B42トランスアクチベータードメイン（B42）、およびヘマグルチニンHA1 エピトープタグをコードするカセットの下流に位置するEco RI/Xho I部位に挿入することにより生成された。B42融合タンパク質をコードする核酸は、ガラクトース-誘導性プロモーター（GAL1-P）から発現される。このプラスミドはまた、この融合タンパク質をコードする配列の転写を終結するADH終止シグナル（ADH-t erm）を含む。図３は、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）をコードするリポーターlacZ遺伝子を含む、プラスミドpSH18-34のマップを提供する。このプラスミドは、細菌の複製起点（ori）およびアンピシリン耐性遺伝子（amp）を含む。このプラスミドはまた、酵母２ミクロン（２μm）複製起点およびウラシルの非存在下でプラスミド含有酵母細胞の増殖を可能にする遺伝子（URA3）を含む。lacZ遺伝子は、ガラクトース-誘導性プロモーター（GAL1）に連結される。ガラクトースの他に、lac Z遺伝子の発現は、LexAオペレーター配列（LexA Op）へのLexAの結合およびトランスアクチベーションに依存する。pSH18-34は８つのLexAオペレーター（LexA結合部位）を含む。図４は、LexA/Fas融合タンパク質を生成するためにも使用されるプラスミドpB MT-116のマップを提供する。このプラスミドは、細菌の複製起点（ori）およびアンピシリン耐性遺伝子（amp）を含む。このプラスミドはまた、酵母２ミクロン（２μm）複製起点およびトリプトファンの非存在下でプラスミド含有酵母細胞の増殖を可能にする遺伝子（TRP1）を含む。LexA/Fas融合タンパク質は、Fas の細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を、マルチクローニング部位に位置するEco RI/Bam HI部位に挿入することにより生成された。LexA/Fas融合タンパク質が生成されるように挿入した配列中にLexAのオープンリーディングフレームを維持するように、クローニングを行った。図５は、VP-16トランスアクチベーションドメインとの融合タンパク質を生成するために用いたプラスミドpVP-16のマップを提供する。このプラスミドは、細菌の複製起点（ori）およびアンピシリン耐性遺伝子（amp）を含む。f1は、アンチセンス鎖の生成に関する調節エレメントである。このプラスミドはまた、酵母２ミクロン（２μm）複製起点およびロイシンの非存在下でプラスミド含有酵母細胞の増殖を可能にする遺伝子（LEU2）を含む。VP-16融合タンパク質は、マウス胚mRNAから調製されたcDNAライブラリーを、ATG開始コドンおよびVP-16コード配列（Nuc.Loc.VP16）の下流のNot I制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することにより生成された。転写は、ADHプロモーター（ADHp）から開始され、そしてA DH終止配列（ADHt）により終結される。図６は、Fasタンパク質（FAS/APO-1）および以下のようなFasのフラグメントに連結されたグルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質（GST）を含む種々の融合タンパク質を概略的に示す：Ａ）Fas(191-335)；Ｂ）Fas(191-290)；Ｃ） Fas(246-335)；Ｄ）Fas(246-290)；Ｅ）Fas(191-320)およびＦ）Fas(321-335)。 TMは、Fasの貫膜領域を示す。数字は、完全長のFasタンパク質に対するアミノ酸の位置を示した。図７は、PTP-BASタンパク質を概略的に示し、保存されたグリシン−ロイシン −グリシン−フェニルアラニン（GLGF）領域およびPTP-BASの細胞質ドメインの触媒ドメインを示す。ツーハイブリッドアッセイを用いて得られる２つのcDNAクローン（pVP16-31およびpVP-16-43；実施例Ｉを参照のこと）によりコードされる相同領域、ヒト脳cDNAライブラリーから得られる２つのcDNAクローン（HFAP10 およびHFAP20）によりコードされる相同領域、およびマウス肝臓cDNAライブラリーから得られるcDNAクローン（MFAP23；マウス５ｂ型PTP-BAS）によりコードされる相同領域もまた示される。数字は、ヒト１型PTP-BASに対するアミノ酸の位置を示す。C-末端は、「COOH」により示される。VLFDKは、HFAP10（４型PTP-BAS ）およびHFAP20（５ａ型PTP-BAS）のGLGF2における挿入を示す。HFAP20のC-末端の黒塗り枠およびMFAP23のC-末端の点描枠は、PTP-BASファミリーのタンパク質の他のメンバーとは異なる（diverge）アミノ酸配列を示す。HFAP20およびMFAP2 3は、示されるように終結し、従って触媒ホスファターゼドメインを含まない。図８は、pVP16-31によりコードされるポリペプチドがFasの種々のフラグメントと会合する能力を示す。完全長のFasタンパク質の概略図を示す。Fasの略図の下方の実線は、pVP16-31によりコードされるポリペプチドへの結合について検査した種々のFasのフラグメントを示す。「β-ガラクトシダーゼ活性」とラベルしたカラムは、pVP16-31ポリペプチドを結合して（＋）、その結果、ツーハイブリッドアッセイ（実施例Ｉを参照のこと）で転写により活性複合体を生成したフラグメントまたは結合しなかったフラグメント（−）を示す。「インビトロ結合アッセイ」とラベルしたカラムは、GST/HFAP10ポリペプチド融合タンパク質に結合したFasのフラグメント（＋）または結合しなかったフラグメント（−）を示す。図９は、GST/Fas融合タンパク質を生成するために用いたプラスミドpGEX-2TX のマップを提供する。このプラスミドは、細菌の複製起点（ori）およびアンピシリン耐性遺伝子（AmpR）を含む。GST融合タンパク質をコードする配列の転写は、tacプロモーター（ptac）から調節される。LacIqはlacリプレッサーを示す。このベクターはまた、トロンビンおよびエンテロキナーゼ切断部位、FLAG^TMペプチド、心筋キナーゼ認識部位（HMK認識）、および示されるような種々の独特の制限エンドヌクレアーゼ部位をコードするポリペプチド配列をコードする。図１０は、GST/Fas(119-335)（GST/FAS）融合タンパク質またはGSTのいずれか単独を用いてプローブしたマウスS49 T細胞タンパク質のファーウエスタンブロットのオートラジオグラフである。分子量マーカーを右に示す。矢印はGST/Fas( 119-335)を特異的に結合したFAPの移動を示す。図１１は、PTP-BASファミリーのタンパク質の６つのメンバーのアミノ酸配列を概略的に示し、これには、新たに開示された４型ヒトPTP-BAS、および５型PTP -BASタンパク質のサブファミリーの２つのメンバーであるヒト５ａ型PTP-BASおよびマウス５ｂ型PTP-BASが含まれる。２型PTP-BASおよび３型PTP-BASの二者択一的にスプライスされた形態中の欠失したセグメントが示されている（Maekawa ら、FEBS Lett. 337:200-206（1994）、これは本明細書中に参考として援用される）。数字はヒト１型PTP-BASに対するアミノ酸の位置を示す。種々のPTP-BASイソ型のアミノ酸配列を実線で示し、そして図の上部に示すドメインに対応させる（GLGFは図６に示される）。破線は、ヒト４型PTP-BAS、ヒト５ａ型PTP-BAS、およびマウス５ｂ型PTP-BASの推定アミノ酸配列を示す。VLFDKは、ヒト４型PTP-BA Sおよびヒト５ａ型PTP-BAS中のGLGF2における挿入についての１文字表記アミノ酸コードを示す。ヒト５ａ型PTP-BASの黒塗り枠領域およびマウス５ｂ型PTP-BAS の点描枠は、PTP-BASファミリーの他のメンバーとは異なるアミノ酸配列を示す。図１２は、クローン化４型PTP-BAS（HFAP10）に対応する推定アミノ酸配列（配列番号１）を掲載する。１文字表記アミノ酸コードを用いる。数字は１型PTP- BASにおけるアミノ酸１に対するアミノ酸の位置を示す。下線を引いたアミノ酸はGLGFリピートを示す。太文字および斜体文字はGLGF2中のVLFDK挿入を示す。図１３は、クローン化４型PTP-BAS（HFAP10）のヌクレオチド配列（配列番号２）を掲載する。数字は、１型PTP-BASをコードする核酸分子の転写開始部位に対するヌクレオチドの位置および対応するアミノ酸の位置を示す。下線を引いたヌクレオチドはGLGFリピートをコードする配列を示す。太文字および斜体文字は GLGF2中のVLFDK挿入をコードする配列を示す。図１４は、クローン化ヒト５ａ型PTP-BAS（HFAP20）に対応する推定アミノ酸配列（配列番号３）を掲載する。１文字表記アミノ酸コードを用いる。数字は１型PTP-BASにおけるアミノ酸１に対するアミノ酸の位置を示す。下線を引いたアミノ酸はGLGFリピートを示す。太文字および斜体文字を合わせたものはGLGF2中のVLFDK挿入を示す。斜体文字単独は、PTP-BASファミリーの他のメンバーとは異なるアミノ酸配列を示す。＊はSTOPコドンの位置を示す。図１５は、クローン化ヒト５ａ型PTP-BAS（HFAP20）のヌクレオチド配列（配列番号４）を掲載する。数字は１型PTP-BASをコードする核酸分子の転写開始部位に対するヌクレオチドの位置および対応するアミノ酸の位置を示す。下線を引いたヌクレオチドはGLGFリピートをコードする配列を示す。太文字および斜体文字を合わせたものはGLGF2中のVLFDK挿入をコードする配列を示す。斜体文字単独は、PTP-BASファミリーの他のメンバーとは異なる配列を示す。［-------］は、未だ配列決定されていない約600ヌクレオチドを示す。下線および斜体文字を合わせたものは、STOPコドン（TGAおよびTAA）およびポリアデニル化シグナル（AA TAAA）を示す。図１６は、クローン化マウス５ｂ型PTP-BAS（MFAP23）に対応する推定アミノ酸配列（配列番号５）を掲載する。１文字表記アミノ酸コードを用いる。数字はヒト１型PTP-BASにおけるアミノ酸１に対するアミノ酸の位置を示す。斜体文字は、PTP-BASファミリーの他のメンバーとは異なるアミノ酸配列を示す。＊はSTO Pコドンの位置を示す。図１７は、クローン化マウス５ｂ型PTP-BAS（MFAP23）のヌクレオチド配列（配列番号６）を掲載する。数字はヒト１型PTP-BASをコードする核酸分子の転写開始部位に対するヌクレオチドの位置を示す。斜体文字は、PTP-BASファミリーの他のメンバーとは異なる配列（位置6022で始まる）を示す。下線はSTOPコドン（TAAおよびTAG）を示す。図１８は、抗Fas抗体により誘導されるアポトーシスにおける４型PTP-BAS発現の効果を示す。示されるような種々の腫瘍細胞株の生存率を、トリパンブルー排除により測定した。白抜き棒は抗Fas抗体の非存在下（FasAb；「−」）で測定されるコントロールの生存率（100％に標準化される）を示す。抗Fas抗体に曝した（「＋」）細胞の生存率を黒塗り棒により示す。腫瘍細胞により発現されたFas （FasAg）および４型PTP-BAS（PTP-BAS4）の相対量を示す（「−」は検出される発現がないことを意味する）。図１９は、ヒト４型PTP-BASを発現するように安定にトランスフェクトされたJ urkat細胞が抗Fas抗体誘導アポトーシスに対して比較的抵抗性であり、抵抗性の量が細胞で発現される４型PTP-BASの量に相関することを示す。種々の安定にトランスフェクトされたクローン（C9、C14、C10、およびC8）で発現される４型PT P-BAS（「FAP-1」）の相対量を、ノーザンブロット分析により測定した（オートラジドグラフを示す）。クローンC19はコントロールプラスミド（「NEO」）でトランスフェクトした。細胞を抗Fas抗体で４時間処理し、次いで、アポトーシスによりフラグメントになったDNAを有する細胞を、ビオチン化dUTPおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）続いてFITC-アビジンを用いる3' OH-DNAの末端標識により検出し、そしてフローサイトメトリーにより検査した。結果を相対細胞数（ｙ軸）および蛍光強度の対数（「LOG(FL)」；ｘ軸）として表す。未処理細胞（-Ab）および抗Fas抗体処理細胞（＋Ab）を示す。百分率は死んだ細胞のパーセントを示す。発明の詳細な説明本発明は、４型PTP-BASおよび５型PTP-BASと命名された新規なFas-会合タンパク質（FAP）を提供し、これらは好塩基球（PTP-BAS）から初めに単離されたタンパク質チロシンホスファターゼ（PTPase）の二者択一的にスプライスされた形態である。既に記載されているPTP-BASのイソ型とは異なり、４型PTP-BASおよび５型PTP-BASはそれぞれ、その他の点ではPTP-BASファミリーのタンパク質のメンバーの間で保存されている配列中に、５アミノ酸の挿入を含む。さらに、本発明は、ヒト5ａ型PTP-BASおよびマウス５ｂ型PTP-BASのような５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーを提供し、これらはＣ末端でPTP-BASファミリーのタンパク質の他のメンバーとは異なる。この配列の相違（divergence）の結果として、５型 PTP-BASタンパク質は触媒ホスファターゼドメインを欠き、従って、PTP-BASの非触媒形態である（図７および１１を参照のこと）。本明細書で用いられる用語「Fas会合タンパク質」または「FAP」は、アポトーシスに関連する細胞表面レセプターであるFasに特異的に結合し得るタンパク質を意味する。FAPは、例えば、実施例ＩおよびIIに記載の結合アッセイを用いて同定され得る。種々のFAPが本明細書中に開示され、PTP-BASファミリーのタンパク質のメンバー（図１１）および78キロダルトン（kDa）のグルコースで調節されるタンパク質（GRP78；以下に記載される）が挙げられる。他のFAPは本明細書中に開示される方法を用いて同定され得る。用語「FAP」が一般的に用いられるが、本明細書中に記載のアッセイを用いて同定されるFAPが候補FAPであると考えられるタンパク質の一部であり得ることを認識すべきである。本明細書中で用いられる用語「候補FAP」は、Fasを結合し得るが完全長タンパク質の一部のみからなるポリペプチドに相当するタンパク質をいう。例えば、４型PTP-BASまたは５型PTP-BASのようなFAPは、cDNAライブラリーからcDNA配列を得ること、cDNA配列によりコードされるポリペプチドを発現させること、およびFasを結合し得るポリペプチドを検出することにより同定され得る。このようなポリペプチドはFAPであると考えられるが、cDNAライブラリーから得られるcDNA配列が完全長タンパク質を必ずしもコードし得ないことは周知である。従って、cDNAは、完全長タンパク質の一部のみであるが、それにもかかわらずFasを結合するような適切なコンホメーションをとる４型PTP-BASまたは５型PTP-BASのようなポリペプチドをコードする。しかし、完全長タンパク質において、ポリペプチドは、例えば、Fas結合部位の立体的ブロッキングのため、Fas を結合しないコンホメーションをとり得る。このような完全長タンパク質は候補 FAPの例である。議論の便宜上、本明細書中で用いられる用語「FAP」は候補FAP を包含することを意図する。従って、FAPは、Fasを結合し得るタンパク質または Fasを結合し得るタンパク質のポリペプチド部分であり得る。 Fasがアポトーシスに関連するので、FAPとFasとの会合は細胞におけるアポトーシスのレベルに影響し得る。Fasは、細胞においてアポトーシスを引き起こし得る細胞表面タンパク質である（Itohら、Cell 66:233-243（1991）；これは本明細書中に参考として援用される）。Fasは319アミノ酸を含む36kDaのポリペプチドである。Fasのシステインリッチな細胞外ドメインは、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）のp55形態およびp75形態、ならびに、神経成長因子レセプターおよび OX40、CD30、およびCD40と命名されたレセプター（Oehmら、J ．Biol．Chem. 267 :10709-10715(1992)）を含むTNFRファミリーの他のメンバーに類似している。TN FRファミリーのレセプターのこれらのメンバーは、細胞生存に影響を与える（im pact）細胞外シグナルを変換し得る。Fasの細胞質ドメイン（アミノ酸191〜335 ）は、TNFRと非常に相同であり、そしてFas機能に必須である。従って、Fasの細胞質ドメインに結合し得るタンパク質は、Fas媒介細胞死経路におけるシグナル変換分子であり得る。本発明は、Fasの細胞質ドメインと会合し得、従ってアポトーシスの調節に関連し得るFAPを提供する。 Fasは、乳房、結腸、前立腺、および膵臓の固体腫瘍を含む種々のタイプのヒト細胞で発現する。Fasレセプターに対するリガンドは、クローニングされており、細胞傷害性Ｔリンパ球上に存在する（Sudaら、Cell 75:1169-1178(1993)）。Ｔ細胞上のFasリガンドの存在は、免疫系のエフェクター細胞がガン細胞を認識しかつ攻撃することを可能にする標的として、Fasが作用し得ることを示す。本明細書中の種々のFAPの同定は、Fasにより制御されるシグナル変換経路への必要な洞察を提供し、そしてFAPとFasとの会合を効果的に改変する薬剤を同定するために有用であるアッセイの開発を可能にしている。このような薬剤は、例えば、被験体においてガンの効果的な治療を提供すること、または自己免疫疾患を処置することに有用であり得る。４型PTP-BASまたは５型PTP-BASのようなFAPは、FAPとFasとの会合を検出することにより同定され得る。このような会合は、酵母ツーハイブリッドアッセイ（実施例Ｉを参照のこと）のようなインビボアッセイ、またはインビトロアッセイ（実施例IIを参照のこと）を用いて同定され得る。本明細書中で用いられる用語「会合する」または「会合」は、FAPおよびFasがそれぞれ互いに相対的に特異的に結合し得、従って結合複合体を形成し得ることを意味する。特に、FAPとFasとの会合は十分に特異的であり、そのため結合複合体が細胞においてインビボでまたは適切な条件下インビトロで形成され得る（実施例IIを参照のこと）。タンパク質がFasを結合し得るかどうか、従ってタンパク質がFAPであるかどうかを決定する他の方法は公知であり、例えば、平衡透析を包含する。正常細胞において、定常状態のレベルのFAPとFasとの会合が生じているようである。特定の細胞タイプにおけるFAPとFasとの会合のこの定常状態のレベルは、その細胞タイプにおけるアポトーシスの正常レベルを決定し得る。細胞における FAPとFasとの会合の定常状態のレベルの上昇または低下は、被験体の病状となり得る細胞における上昇または低下したアポトーシスのレベルを生じ得る。細胞におけるFAPとFasとの正常会合は、例えば、変異体FAPまたは変異体Fasの細胞中での発現のため改変され得、変異体のいずれかは、細胞でFasに正常に結合するFAP との結合について競合し得、従って細胞におけるFAPとFasとの会合を減少させ得る。用語「変異体」は本明細書中で一般的に用いられており、通常は特定の細胞タイプで見出されるFAPまたはFasとは異なるFAPまたはFasをそれぞれ意味する。さらに、細胞におけるFAPとFasとの正常会合は、例えば、細胞におけるFAPとFas との会合を効果的に改変し得る薬物のような薬剤と細胞との接触のために増加または減少され得る。新たに記載された４型および５型PTP-BASを含むいくつかのFAPを、酵母ツーハイブリッドシステム（FieldsおよびSong、Nature 340:245-246(1989)；Vojtekら、Cell 74:205-214(1993)、これらはそれぞれ本明細書中に参考として援用されている）を用いて同定した。酵母ツーハイブリッドシステムのようなインビボ転写活性化アッセイは、タンパク質の会合を同定しかつ操作するために特に有用である。さらに、このようなアッセイで観察される結果は、細胞において天然に生じる事象をおそらく反映する。従って、このようなインビボアッセイで得られる結果は、ヒト被験体のような被験体の細胞において生じ得る結果の予測であり得る。酵母ツーハイブリッドシステムのような転写活性化アッセイは、機能的に分離可能なDNA結合ドメインおよびトランスアクチベーションドメインからなる転写因子の調節性質（modular nature）に基づく。別々のタンパク質として発現される場合、これらの２つのドメインは遺伝子転写を媒介しない。しかし、DNA結合ドメインおよびトランスアクチベーションドメインが、例えば、２つのタンパク質の会合のためともに架橋される場合、転写活性化活性は回復され得る。DNA結合ドメインおよびトランスアクチベーションドメインは、例えば、ドメインに融合されるタンパク質が互いに会合し得る場合、DNA結合ドメインおよびトランスアクチベーションドメインを融合タンパク質（ハイブリッド）として発現することにより架橋され得る。２つのハイブリッドの非共有結合架橋は、DNA結合ドメインおよびトランスアクチベーションドメインをともに有し、そして転写により活性な複合体を生成する。タンパク質の会合は、リポーター遺伝子の転写活性化を観察することにより測定される（実施例Ｉを参照のこと）。本明細書中で例示した酵母ツーハイブリッドシステムは、ハイブリッドタンパク質を発現するベクターの宿主細胞として、S．cerevisiaeの種々の株を用いる。転写活性化アッセイもまた、例えば、哺乳動物細胞を用いて行い得る。しかし、酵母ツーハイブリッドシステムは、酵母を用いる作用の容易性およびアッセイが行われ得る速度のため、特に有用である。例えば、LexAオペレーター配列に連結されたlacZリポーター遺伝子を含む酵母宿主細胞を、PTP-BASがFasと相互作用し得ることを示すために用いた（実施例Ｉ）。DNA結合ドメインは、LexA DNA結合ドメインからなり、これは、Fasの一部、およびcDNA配列（このいくつかはFAP をコードしていた）に融合されたB42酸性領域またはVP16トランスアクチベーションドメインのいずれかからなるトランスアクチベーションドメインに融合されたLexAプロモーターを結合する。LexAドメインがFAPに融合したトランスアクチベーションドメインに非共有結合架橋された場合、FasとFAPとの会合はリポーター遺伝子の転写を活性化した。 FAPはまた、例えば、実施例IIに記載されるようなグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質を利用するアッセイのようなインビトロアッセイを用いて同定され得る。このようなインビトロアッセイは、FAPを同定および単離するための簡単、迅速、かつ安価な方法を提供する。このようなインビトロアッセイは、インビボで得られる結果を確認することにおいて特に有用であり、そしてFAPの特異的結合ドメインを特徴付けするために用いられ得る（実施例II を参照のこと）。例えば、GST/Fas融合タンパク質が発現され得、そして固定化グルタチオンを含むアフィニティーマトリックスに結合することにより精製され得る。所望の場合、FAPまたはFAPの活性フラグメントを含み得るサンプルは、結合したGST/Fasを含むアフィニティーカラムを通過させ得、そしてFasに結合する FAPが得られ得る。さらに、GST/FasはcDNA発現ライブラリーをスクリーニングするために用いられ得、ここで、Fas融合タンパク質のクローンへの結合は、クローンがFAPをコードするcDNAを含むことを示す。これらのインビトロおよびインビボアッセイを用いて、種々のFAPが同定されており、これらには、新たに記載されたヒト４型PTP-BAS、ヒト５ａ型PTP-BAS、およびマウス５ｂ型PTP-BASが挙げられる。PTP-BASは、最初にヒト好塩基球からクローニングされたPTPaseである（Maekawaら、FEBS Lett. 337:200-206、1994 、これは本明細書中に参考として援用される）。PTP-BASの３つのイソ型は、二者択一的スプライシングのため生じる天然のインフレーム欠失によって形成され、本開示の前に公知であった。PTP-BASは、元来、PTPase間で保存されている配列に関するプライマーを用いる逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応クローニング法により同定された。PTP-BASの機能は本開示の前には知られておらず、PTP-BAS がFasの細胞質ドメイン、特にFasのC-末端領域と会合し得、そして細胞における PTP-BASの発現レベルがFas誘導アポトーシスに対する細胞の抵抗性に相関することを証明する（実施例Ｖを参照のこと）。 PTP-BASの既述のイソ型は、１型（2,485アミノ酸）、２型（2,466アミノ酸）、および３型（2,294アミノ酸）と命名され、これらは本明細書に開示されるようにFAPである。２型PTP-BASおよび３型PTP-BASは、１型PTP-BASのオルタナティブにスプライスされた形態であり、そしてそれぞれ19アミノ酸および191アミノ酸の欠失を含む（図１１を参照のこと）。これらの欠失は、グアニレートキナーゼで見られる配列に相同な、３つのグリシン−ロイシン−グリシン−フェニルアラニン（GLGF）リピートのすぐ上流に位置する（図１１）。１、２、および３型PTP-BASはそれぞれ、そのカルボキシ末端に単一のPTPase 触媒ドメインを含む（図１１を参照のこと）。これらの３つのPTP-BASイソ型はまたそれぞれ、いくつかの細胞骨格会合タンパク質に存在するドメインに配列が類似するアミノ末端膜結合ドメインを有する。さらに、本明細書に開示されるように、１、２、および３型PTP-BASはFasを結合し得る（実施例Ｉを参照のこと）。本発明は、実質的に精製された哺乳動物の４型PTP-BASタンパク質および５型P TP-BASタンパク質を提供し、これらはPTP-BASの二者択一的にスプライスされた形態である。４型および５型PTP-BASタンパク質はFasを結合し得るので、これらはFAPである。これまでに知られているヒト１、２、および３型PTP-BASとは対照的に、ヒト４型および５ａ型PTP-BASは、その他の点では保存されたGLGF2リピートに５アミノ酸挿入を含む（図１１を参照のこと）。さらに、５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバーのＣ末端は、PTP-BASファミリーのタンパク質の他のメンバーとは配列が異なり、そしてその結果として、ヒト５ａ型PTP-BA Sおよびマウス５ｂ型PTP-BASのような５型PTP-BASタンパク質は、触媒ホスファターゼドメインを含まない（図７および１１を参照のこと）。本発明は、図１３に示すヌクレオチド配列（配列番号２）に由来した図１２に示すヒト４型PTP-BASの実質的なアミノ酸配列（配列番号１）を含む、実質的に精製された哺乳動物４型PTP-BASを提供する。さらに、本発明は、例えば、図１５に示すヌクレオチド配列（配列番号４）に由来した図１４に示すヒト５ａ型PT P-BASの実質的なアミノ酸配列（配列番号３）、または図１７に示すヌクレオチド配列（配列番号６）に由来した図１６に示すマウス５ｂ型PTP-BASの実質的なアミノ酸配列（配列番号５）を含む、実質的に精製された哺乳動物５型PTP-BAS タンパク質のサブファミリーを提供する。４型PTP-BASおよび５タンパク質は、このタンパク質ファミリーの他のメンバーとの相同性に基づくPTP-BASファミリーのタンパク質のメンバーとして特徴付けされている（図７および１１を参照のこと；実施例IIIおよびIVも参照のこと）。本明細書で用いられる用語「実質的なアミノ酸配列」は、ヒト４型PTP-BAS（配列番号１）、ヒト５ａ型PTP-BAS（配列番号３）、またはマウス５ｂ型PTP-BAS （配列番号５）についての開示されたアミノ酸配列、ならびに、配列番号１、配列番号３、または配列番号５にそれぞれ類似であるが、４型PTP-BASまたは５型P TP-BAS様に機能するためにコードされたタンパク質の能力を実質的に改変しない、そして例えば、Fasを結合する、１つまたはそれより多いアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を意味する。本明細書で用いられる用語「実質的に精製された」は、細胞内でタンパク質と通常は会合する脂質、タンパク質、核酸、または他の細胞性物質が比較的混入していない形態にあるタンパク質を意味する。実質的に精製されたヒト４型PTP-BAS、ヒト５ａ型PTP-BAS、またはマウス５ｂ型PTP-BASタンパク質は、例えば、周知の生化学的精製方法を用いて、またはそれぞれ配列番号２、配列番号４、または配列番号６として示される核酸分子のようなPTP-BASをコードする組換え核酸分子を発現させることにより得られ得る。さらに、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも一部からなるアミノ酸配列は、化学的に合成され得るか、または、それぞれ配列番号２、配列番号４、または配列番号６として示されるヌクレオチド配列の一部を発現させることにより生成され得る。本明細書で用いられる用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、細胞性遺伝子によりまたは組換え核酸配列によりコードされ得るかあるいは化学的に合成され得るアミノ酸の配列を意味するための最も広い意味で用いられる。ある場合では、用語「ポリペプチド」は、完全長タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部をいうために用いられる。以下に定義されるFAPの活性フラグメントは、このようなポリペプチドの一例であり得る。タンパク質は完全な全長遺伝子産物であり得、アミノ酸改変のないコアタンパク質であり得、または、リンタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質、および核タンパク質のような翻訳後改変された形態のタンパク質であり得る。４型PTP-BASまたは５型PTP-BASのようなFAPに関して、タンパク質は、主として、Fasと会合するその能力により特徴付けられる。本明細書で用いられる用語「Fas」は、完全長Fasタンパク質、またはFasのFas(191-335)若しくはFas(321-3 35)部分のような完全長Fasタンパク質の一部分を意味し、それらのいずれもFAP と会合し得る(実施例IIおよび図６を参照のこと)。FAPがFasと会合する能力が、４型PTP-BASについておよび５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバーについて本明細書で開示されるように、完全長FAPの一部分に起因し得ることも認識されるべきである。従って、FAPは、完全長タンパク質の活性フラグメントであり得る。本明細書で用いられる用語「活性フラグメント」は、完全長タンパク質の一部分であるFAP(この一部分が対応する完全長タンパク質の特徴である活性を有するという条件で)を意味する。例えば、本明細書で開示されるような４型PTP-BAS若しくは５型PTP-BASポリペプチドのようなFAPの活性フラグメントまたはPTP-BASのGLGF2ドメインは、Fasを結合する能力のような活性を有し得、または抗FAP抗体を得るために用いられる得る免疫原としての活性を有し得る。従って、本発明はまた、４型PTP-BASの活性フラグメントまたは５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバーを提供し、これらは以下に述べるアッセイを用いて同定され得る。本明細書で用いられる用語「５型PTP-BASタンパク質のサブファミリー」は、触媒ホスファターゼドメインを含まないPTP-BASタンパク質を意味する(例えば図７を参照のこと)。本明細書で開示されるように、ヒト５ａ型 PTP-BASおよびマウス５ｂ型PTP-BASは、５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバーの例である。用語「５型PTP-BAS」は、本明細書では、一般に、５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバーをいうために用いられる。本発明はまた、抗４型PTP-BAS抗体および抗５型PTP-BAS抗体(例えば、抗ヒト５ａ型PTP-BAS抗体または抗マウス５ｂ型PTP-BAS抗体を含む)を提供する。本発明の抗体が特定の型のPTP-BASにのみ存在するエピトープに特異的であり得、または１つ以上の型のPTP-BASに共通であるエピトープに特異的であり得る。例えば、抗５型PTP-BAS抗体は、ヒト５ａ型PTP-BASタンパク質のような５型PTP-BAS タンパク質のサブファミリーの単一メンバーに特異的であり得、またはこのサブファミリーの１つ以上のメンバーに対して特異的であり得ることを認識すべきである。本明細書で用いられる用語「抗体」は、その最も広い意味で用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに特定の抗原に対して少なくとも約１×10⁵Ｍ^-1の特異的結合活性を保持する抗体のポリペプチドフラグメントを含む。当業者は、抗４型PTP-BAS抗体フラグメントまたは抗５型PTP-BAS抗体フラグメント(Fab、F(ab')₂、FvおよびFdフラグメントなど)が、４型PTP-BASまたは５型PTP-BASに対して、特異的結合活性をそれぞれ保持し得、そしてそれ故、抗体の定義内に含まれることを知る。さらに、本明細書で用いられる用語「抗体」は、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体および結合活性を保持する抗体のフラグメントを含む。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築され得、組換えにより産生され得、または、例えば本明細書に参考として援用されるHuseら、Science 246：1275-1281(1989)に記載のように、可変重鎖および可変軽鎖からなる組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより得られ得る。抗４型PTP-BAS抗体または抗５型PTP-BAS抗体は、例えば、本明細書に参考として援用される、HarlowおよびLane、Antibodies ：A laboratory manual(Cold Spr ing Harbor Laboratory Press、1988)に記載のような周知の方法を用いて調製され得る。４型PTP-BASまたは５型PTP-BASタンパク質、あるいは４型PTP-BASまたは５型PTP-BASタンパク質の一部分は、免疫原として用いられ得る。このような免疫原は、天然の供給源から調製され得または組換えにより産生され得、またはタンパク質の一部分の場合は化学的に合成され得る。４型PTP-BASまたは５型PTP -BASタンパク質の非免疫原性ペプチドは、例えば、HarlowおよびLane、前述、19 88に記載のように、ハプテンを、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のようなキャリア分子に結合することにより免疫原性に作成され得る。さらに、４型PTP-BASまたは５型PTP-BAS融合タンパク質は、実施例IIに記載のように発現され得る。このような融合タンパク質は容易に精製され、そして免疫原として用いられ得る。これらの方法を用いて、種々の抗FAP 抗体が得られた(示されていない)。ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギで惹起され得る。さらに、モノクローナル抗体は、周知の方法を用いて得られ得る(例えば、本明細書で参考として援用されるReedら、Anal ．Biochem. 205：70-76(1992)を参照のこと；また、Harlo wおよびLane、前述、(1988)を参照のこと）。例えば、免疫マウス由来の脾臓細胞を、SP/02ミエローマ細胞のような適切なミエローマ細胞株に融合して、ハイブリドーマ細胞を生成し得る。クローン化ハイブリドーマ細胞株は、４型PTP-BA Sまたは５型PTP-BASのような標識免疫原を用いてスクリーニングし、モノクローナル抗体を分泌するクローンを同定し得る。所望の特異性および親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離し得、そして抗体の連続的な供給源として利用し得る。当業者は、モノクローナル抗体の頼りになる供給源が、例えば、以下に記載の診断キットを調製するために望ましいことを知り得る。本発明はまた、哺乳動物４型PTP-BASをコードし、図13に示されるようなヒト４型PTP-BASをコードする実質的なヌクレオチド配列(配列番号２)を含む実質的に精製された核酸分子を提供する。さらに、本発明は、哺乳動物５型PTP-BASをコードし、例えば、図15に示されるようなヒト５ａ型PTP-BASをコードする実質的なヌクレオチド配列(配列番号４)を含む、または図17に示されるようなマウス５ｂ型PTP-BASをコードする実質的なヌクレオチド配列(配列番号６)を含む、実質的に精製された核酸分子を提供する。本明細書で用いられる用語「実質的に精製された」は、細胞内で核酸分子と通常会合している混入脂質、タンパク質、核酸または他の細胞性物質が相対的にない形態である核酸分子を意味する。実質的に精製された核酸分子は、例えば、本明細書で記載されたような、組換えDNA法により得られる得(本明細書に参考として援用される、Sambrookら、Molecular Cloning ：A laboratory manual(Cold Sp ring Harbor Laboratory Press 1989)もまた参照のこと)、または化学的に合成され得る。本明細書で用いられる用語「実質的なヌクレオチド配列」は、ヒト４型PTP-BAS(配列番号２)、ヒト５ａ型PTP-BAS(配列番号４)、またはマウス５ｂ型 PTP-BAS(配列番号６)について開示されたヌクレオチド配列、および、例えば、配列番号２、配列番号４または配列番号６で示されたとは異なるヌクレオチドであるが、遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号１、配列番号３または配列番号５にそれぞれ示されるような実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む類似の配列を意味する。さらに、本発明の核酸分子はまた、４型PT P-BASまたは５型PTP-BASタンパク質の一部分(例えば、４型PTP-BASまたは５型PT P-BASタンパク質の活性フラグメントを含む)をコードし得る。本発明はまた、４型PTP-BAS若しくは５型PTP-BAS、または４型PTP-BASおよび５型PTP-BASの両方をコードする核酸分子の一部分に、比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を提供し得る。そのようなヌクレオチド配列は、長さが少なくとも10ヌクレオチドであるべきであり、そして例えば、４型PTP-BASまたは５型PTP-BASをコードするクローン化核酸分子の制限エンドヌクレアーゼ消化により、図13(配列番号２)、図 15(配列番号４)、または図17(配列番号６)に示される核酸分子の一部分のPCR増幅によりまたは化学的合成により調製され得る。比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は経験的に決定され得、または、例えば、ハイブリダイズするヌクレオチド配列および標的配列の相対GC:AT含量、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の長さ、ならびにもしあればハイブリダイズするヌクレオチド配列と標的配列との間のミスマッチの数を基に推定され得る。所望であれば、ハイブリダイズするヌクレオチド配列は検出可能に標識されてプローブとして用いられ得、またはPCRのプライマーとして用いられ得る。ヌクレオチド配列を検出可能に標識する方法は当該技術分野で周知である(例えば、Sambrookら、前述、1 989を参照のこと；また、本明細書で参考として援用される、Ausubelら、Curren t Protocols in Molecular Biology (Greene Publ.，NY 1989)を参照のこと)。簡便さのために、用語「PTP-BAS」を本明細書で一般的に用い、例えば、先に知られている１型PTP-BAS、２および３、ならびに新たに開示された４型PTP-BAS および５を含む、PTP-BASの任意のまたはすべてのイソ型を意味する。さらに、P TP-BASは、１つまたは小数のアミノ酸付加、欠失または置換を含むPTP-BASである、PTP-BASの変異体形態(変異体PTP-BASがFasを結合し得るという条件で)であり得る。例えば、変異体PTP-BASは、Fasを結合する変異体PTP-BASの能力に著しい影響を与えずにPTPase活性の損失を生じ得る単一のアミノ酸置換を有し得る。変異体PTP-BASは、例えば、PTP-BASをコードする核酸分子の部位特異的変異誘発および変異誘発された核酸分子のスクリーニングにより得られ得、Fasを結合し得るがPTPase活性を欠く変異体PTP-BASを発現する核酸分子を同定する。Fasを結合し得るが、触媒活性を欠くPTP-BAS(例えば、５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバー、変異体PTP-BAS、または本明細書で開示される４型PTP-BAS の一部分などPTP-BASの一部分のような)の細胞中の発現は、触媒PTP-BASのFasへの会合を改変し得、そしてそれ故、細胞におけるアポトーシスのレベルを調整し得る。本明細書で用いられる用語「調整する」は増大または減少を意味する。本発明はまた、78,000ダルトンのグルコースで調節されるタンパク質(GRP78) である、FAPの別の例を提供する。GRP78は、細胞の小胞体に位置するストレス関連タンパク質であり、そして主要なヒートショックタンパク質と配列相同性を共有する(TingおよびLee、DNA ７：275-278(1988)；Sugawaraら、Canc ．Res.53：6 001-6005(1993)、それぞれ本明細書に参考として援用する)。細胞中のGRP78の発現は、T細胞媒介細胞傷害性に対する細胞の感受性を減少し得る。本明細書で開示されるように、GRP78はFasと会合し得、そしてそれ故FAPである。従って、GRP 78は、そのFasとの会合の程度に基づいて細胞中でアポトーシスを調整し得るようである。アポトーシスに関連するFasを結合し得るFAPの同定は、FAPのFasとの会合を効果的に改変し得る薬剤を同定するための手段を提供する。従って、本発明は、FA PのFasとの会合を改変し得る有効な薬剤を同定するために有用であるスクリーニングアッセイを提供する。Fasはアポトーシスに関連するので、そのような有効な薬剤の同定は、増大したまたは減少したレベルのアポトーシスにより特徴付けられる病状を有する被験体中の細胞におけるアポトーシスのレベルを調整するために有用であり得る。本明細書で用いられる用語「薬剤」は、単純なまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプチド模倣物(peptido-mimetic)、タンパク質またはオリゴペプチドのような、FAPとFasの会合を改変するまたはFAPの活性を改変する能力を有する化学的または生物学的分子を意味する。さらに、本明細書で用いられる用語「有効薬剤」は、FAPとFasの会合を実際に改変し得る、またはFAPの活性を実際に改変し得る薬剤を意味する。本明細書で用いられる用語「会合を改変する」は、FAPとFasとの会合が有効薬剤の存在に起因して増大または減少するいずれかを意味する。細胞中のFAPとFas の会合が改変される結果、Fasの活性またはFAPの活性が増大または減少し得、それによって細胞におけるアポトーシスのレベルを調整する。本明細書で用いられる用語「活性を改変する」は、薬剤が細胞中のFAPの活性を増大または減少し得、それによって細胞におけるアポトーシスのレベルを調整することを意味する。例えば、有効薬剤は、PTP-BASのFasとの会合に影響することなくPTP-BASのホスファターゼ活性を増大または減少し得る。本明細書で開示されるように、細胞におけるPTP-BASの発現は、発現したPTP-BASが触媒ホスファターゼドメインを含む場合、Fas誘導アポトーシスに対する細胞の抵抗性を増大し得る(実施例V参照)。有効薬剤は、FAPとFasが会合する能力を妨害することにより作用し得、または結合したFAP-Fas複合体の解離を引き起こすことにより作用し得、ここでは結合したFAP-Fas複合体の遊離のFAPおよびFasに対する比が細胞におけるアポトーシスのレベルに関連する。例えば、リガンドのFasへの結合が、順に、Fasの(PTP-B ASの触媒形態のような)FAPへの結合を可能にし得る。Fasと触媒PTP-BASとの会合は、例えば、PTP-BASのホスファターゼ活性の活性化または阻害を生じ得る。有効薬剤の存在下で、触媒PTP-BASとFasとの会合が改変され得、そのことが細胞中のPTP-BASのホスファターゼ活性を改変し得る。改変されたホスファターゼ活性の結果、細胞におけるアポトーシスのレベルが増大または減少し得る。従って、 FasとFAPの会合を改変する有効薬剤の同定は、細胞におけるアポトーシスのレベルを増大または減少する有効薬剤の使用を可能にし得る。有効薬剤は、例えば、ガン細胞(これは、その正常細胞等価物と比較したとき減少したレベルのアポトーシスを有することにより特徴付けられる)のような細胞におけるアポトーシスのレベルを増大するために有用であり得る。有効薬剤はまた、例えば、後天性免疫不全症候群のようなウイルス疾患を有する被験体中の Tリンパ球(これは正常T細胞と比較したとき感染T細胞中の増加したアポトーシスのレベルにより特徴付けられる)のような細胞におけるアポトーシスのレベルを減少させるために有用であり得る。従って、有効薬剤は、増大したまたは減少したアポトーシスにより特徴付けられる病状を有する被験体におけるアポトーシスのレベルを改変する医薬として有用であり得る。さらに、有効薬剤は、例えば、アポトーシスのレベルを減少し、そしてそれ故、培養中のハイブリドーマ細胞のような細胞の生存時間を増大するために用いられ得る。インビトロでの細胞の生存を延長する有効薬剤の使用は、工業的組織培養用途におけるバイオ生産収率を顕著に改善し得る。触媒活性を欠くがFasと会合する能力を保持するPTP-BASは有効薬剤の例である。何故なら、細胞における非触媒PTP-BASの発現が、触媒PTP-BASとFasの会合を改変し得るからである。従って、FAPが、例えば、特定の細胞タイプで起こる正常なFAP-Fas会合に依存する有効薬剤であり得ることを認識すべきである。さらに、PTP-BASのまたはGRP78の活性フラグメントは、この活性フラグメントが細胞におけるFAPとFasの会合を改変し得る場合、有効薬剤であり得る。このような活性フラグメントは、約５アミノ酸程度の小さいペプチドであり得、例えば、ペプチドライブリーをスクリーニングし(例えば、本明細書に参考として援用されるL adnerら、米国特許第5,223,409号を参照のこと)、Fasを結合し得るペプチドを同定することにより同定され得る。同様に、Fasのペプチドまたはポリペプチド部分はまた有効薬剤であり得る。例えば、FasのC末端15アミノ酸がFAPと会合し得る(実施例II；図８参照のこと) 。FasのC末端ペプチドのようなペプチドは、例えば、細胞におけるFAPとFasの会合を、FAPに対する結合について競合させることによって減少するために有用であり得る。天然には存在しないペプチド模倣物がまた、有効薬剤として有用であり得る。このようなペプチド模倣物は、例えば、N置換グリシン、またはオリゴカルバメートを含むペプチド様配列であるペプトイドを含み得る。ペプチド模倣物は、例えば、インビボにおける酵素的分解に対して増大した安定性を有することに起因して有効薬剤として特に有用であり得る。有効薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイは、ツーハイブリッドシステムを用いてインビボで実施され得、または本明細書で開示されるようにインビトロで実施され得る。酵母ツーハイブリッドシステムが、例えば、FasとFAPの会合を改変する有効薬剤を同定するための薬剤のパネルをスクリーニングするために用いられ得る。有効薬剤は、リポーター遺伝子の改変された転写レベルを検出することにより同定され得る。例えば、FasおよびFAPハイブリッドによるDNA結合ドメインとトランスアクチベーションドメインとの架橋に起因するリポーター遺伝子の転写のレベルは、薬剤の非存在下および存在下で測定され得る。FasとF APとの間の会合を改変する有効薬剤は、薬剤の非存在下で転写のコントロールレベルと比較したときのリポーター遺伝子の比例して改変された転写レベルにより同定され得る。いくつかの場合では、薬剤は酵母細胞壁を通過できないかもしれず、そしてそれ故、酵母細胞に侵入しFAPとFasの会合を改変し得ない。細胞壁を欠く酵母細胞である酵母スフェロプラストの使用はこの問題を解決し得る(本明細書で参考として援用される、SmithおよびCorcoran、Current Protocols in Molecular Biol ogy (Ausubelら編；Greene Publ.，NY 1989))。さらに、薬剤は、細胞に侵入する際、酵母に存在し得ない細胞機構による「活性化」を必要とし得る。薬剤の活性化は、例えば、薬剤の代謝プロセッシングまたは薬剤を有効な薬剤に転換するために必要であり得る、薬剤のリン酸化のような改変を含み得る。この場合、哺乳動物細胞株が薬剤のパネルをスクリーニングするために用いられ得る。実施例Ｉに記載の酵母ツーハイブリッドシステムのような転写アッセイは、周知の方法を用いて哺乳動物細胞における使用のために適合され得る(例えば、本明細書で参考として援用される、Fearonら、Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA 89：7958-796 2(1992)を参照のこと；また、Sambrookら、前述、1989；Ausubelら、前述、1989 を参照のこと)。本発明はまたインビトロスクリーニングアッセイを提供する。FAPとFasの会合またはFAPの活性を効果的に改変し、そして、それによってアポトーシスを調整する薬剤を同定するために、このようなスクリーニングアッセイは、それらが自動化され得、そのことは、例えば、ランダムにまたは合理的にデザインされた薬剤(薬物、ペプチド模倣物またはペプチドなど)の高処理量のスクリーニングを可能にするのに特に有用である。インビトロスクリーニングアッセイは、例えば、 FAPまたはFAP-グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質(GST/FAP；実施例II参照のこと)のようなFAP融合タンパク質を利用し得る。インビトロスクリーニングアッセイにおける使用には、FAPまたはFAP融合タンパク質は、固体基質に対する親和性およびFasと会合する能力を有するべきである。例えば、FAPをアッセイに用いる場合、固体基質は、共有結合した抗FAP抗体を含み得る。あるいは、GST/FAP融合タンパク質がアッセイで使用され得、そして固体基質は、共有結合グルタチオンを含み得、それにGST/FAP融合タンパク質のGST成分が結合する。同様に、FasまたはGST/Fas融合タンパク質が、本明細書で記載されるようにインビトロアッセイで用いられ得る。インビトロスクリーニングアッセイは、例えば、FAPまたはFAP融合タンパク質を固体支持体に結合させ、次いでFasおよび試験されるべき薬剤を加えることにより、実施され得る。薬剤を含まないコントロール反応は、平行して実施され得る。例えば、特定のFAPおよびFasの結合を可能にする、適切な緩衝液濃度および pHおよび時間および温度を包含する適切な条件下でのインキュベーション後、薬剤非存在下および薬剤存在下で会合したFAPおよびFasの量が、測定され得る。FA PおよびFasの会合は、例えば、検出可能な部分（例えば、放射性核種または蛍光標識）をFasに結合し、そして固体支持体と会合した標識の量を測定することにより、検出され得、ここで検出された標識の量は、FasおよびFAPの会合量を示す。結合のコントロールレベルと比較して、薬剤存在下での特異的結合の量を比較することにより、FAPおよびFasの結合を変化させる有効な薬剤が、同定され得る。このようなアッセイは、有効な薬剤を検出するために、ペプチドライブラリーのような薬剤のパネルをスクリーニングするのに特に有用である。本発明はさらに、細胞にFAPまたはFasをコードする核酸分子あるいはアンチセンスヌクレオチド配列を導入することにより、細胞中のアポトーシスを調節する方法を提供する。このアンチセンスヌクレオチド配列は、FAPまたはFasをコードする遺伝子領域に相補的であり、そして遺伝子または遺伝子から転写されたmRNA とハイブリダイズし得る。細胞中のアポトーシスのレベルは、細胞中でのFAPまたはFasの発現を増加させるか、または減少させることにより、調節され得る。これはFAPおよびFasの正常な定常状態の会合を変化させ得、これにより、細胞中でのFAPまたはFasの活性が増加するか、または減少する。例えば、細胞中での４型ヒトPTP-BASの発現は、細胞中でのアポトーシスの正常レベルと比較して、Fas 誘導性アポトーシスに対して細胞を相対的に抵抗性にし得る（実施例Ｖおよび図 19を参照のこと）。従って、上記のような核酸分子またはアンチセンスヌクレオチド配列は、その正常細胞の対応物（counterpart）と比較して、細胞中でのアポトーシスのレベルの増加または減少により特徴付けられる病状を処置するための薬品として有用であり得る。 FAP（例えば、PTP-BASまたはGRP78）あるいはFAPの活性フラグメントをコードする核酸配列は、周知の発現ベクターおよび遺伝子移入法（Sambrookら、上記、 (1989)）を用いて、細胞中で発現され得る。標的細胞と適合するウイルスベクターは、FAPをコードする核酸を細胞に導入するのに特に有用である。例えば、一般的または組織特異的プロモーターを有する組換えアデノウイルスは、FAPをコードする核酸を、種々の組織中の種々の細胞型に送達するために使用され得、そして標的細胞中での核酸の発現を指示し得る。組換えアデノ随伴ウイルスはまた、FAPをコードする核酸を、細胞に導入するのに有用であり、そして組換えウイルスが、休止非増殖細胞（例えば、中枢神経系および末梢神経系のニューロン）のクロマチンに、安定に組込まれ得るというさらなる利点を有する（Lebkowski ら、Mol.Cell.Biol．8:3988-3996(1988)、これは本明細書中に参考として援用される）。このようなウイルスベクターは、FAPをコードする核酸を、例えば、遺伝子治療のために被験体中の細胞に導入することが所望である場合に、特に有用である。ウイルスは、宿主防御機構を逃れ得、そして特定の細胞型に感染し増殖し得る専門化感染因子である。特に、特定の細胞型に対するウイルスベクターの特異性は、予め決定された細胞型を標的化するために使用され得る。従って、ウイルスベクターの選択は、部分的には、標的化されるべき細胞型に依存する。例えば、神経変性疾患が、疾患に冒されたニューロン細胞中のFAPレベルを増加させることにより処置される場合、ニューロン細胞を標的化するウイルスベクターが使用され得る。単純ヘルペスウイルス由来のベクターは、ニューロン細胞を標的化するウイルスベクターの例である（Battlemanら、J.Neurosci. 13:941-951(1993) 、これは本明細書中に参考として援用される）。同様に、造血系の疾患または病理学的症状が処置される場合、特定の血液細胞またはその前駆体細胞に特異的なウイルスベクターが、使用され得る。ヒト免疫不全ウイルスに基づくベクターは、このようなウイルスベクターの例である（Carrollら、J.Cell.Biochem. 17E:2 41(1993)、これは本明細書中に参考として援用される）。さらに、ウイルスベクターまたは他のベクターが、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーをベクターに取り込むことにより、組織特異的様式で、FAPをコードする核酸を発現させるために構築され得る（Daiら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:10892-10895(19 92)、これは本明細書中に参考として援用される）。レトロウイルスベクターは、FAPをコードする核酸をインビボで細胞に導入するのに特に有用であり得る。レトロウイルスベクターが、感染粒子として機能するか、または感染の最初の一回のラウンドのみを行うために構築され得る。前者の場合、ウイルスゲノムは、新規ウイルスタンパク質およびRNAを合成するために必要な遺伝子、調節配列およびパッケージングシグナルを維持するように改変される。しかし、これらのウイルスの腫瘍形成能を与える遺伝子は、破壊される。ウイルスタンパク質が合成された後、宿主細胞は、RNAを新規ウイルス粒子にパッケージングし、このウイルス粒子は、さらなる感染のラウンドを行い得る。ウイルスゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードし発現するように操作される。非感染ウイルスベクターの場合、ヘルパーウイルスゲノムは、RNAをウイルス粒子に封入するために必要とされるウイルスパッケージングシグナルを破壊するように変異され得る。しかし、ヘルパーウイルスは、目的の遺伝子を含む同時導入される組換えウイルスをパッケージングするために必要とされる構造遺伝子を保持する。パッケージングシグナルなしでは、ウイルス粒子は、ゲノムを含まず、従って、引き続く感染のラウンドを進行し得ない。ウイルスベクターを構築し、使用する方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、MillerおよびRosman 、Biotechniques 7:980-990(1992)（これは本明細書中に参考として援用される）に概説されている。特定の型のベクターは、意図される用途に依存する。これらのベクターは、周知であり、そして当該分野で用意に入手可能であるか、または当業者により構築され得る。遺伝子治療のために、FAPまたはFasをコードする核酸あるいはアンチセンスヌクレオチド配列を含有するベクターは、種々の方法により、被検体に投与され得る。例えば、ウイルスベクターが使用される場合、投与は、ベクターの標的特異性を利用し得る。このような場合、ベクターを疾患部位に局所的に投与する必要がない。しかし、局所投与は、FAPをコードする核酸を投与する特に有効な方法であり得る。さらに、投与は、被検体への静脈内注射または皮下注射により、なされ得る。注射後、ウイルスベクターは、感染に対して適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで、循環される。脊髄液へのウイルスベクターの注射はまた、例えば、神経変性疾患の処置において、有効な投与様式であり得る。レセプター媒介DNA送達アプローチもまた、架橋分子を介して核酸分子と非共有的に複合体化される組織特異的リガンドまたは抗体を用いる組織特異的様式で、FAPをコードする核酸分子を細胞に送達するために使用され得る（Curielら、H um.Gene Ther. 3:147-154(1992)；WuおよびWu、J.Biol.Chem. 262:4429-4432(19 87)、これらは本明細書中に参考として援用される）。むき出しの（naked）または、例えば、カチオン性リポソームに封入された核酸分子の直接注射もまた、インビボでの非分裂細胞または分裂細胞への安定な遺伝子移入に使用され得る（Ul merら、Science 259:1745-1748(1993)、これは本明細書中に参考として援用される）。さらに、FAPをコードする核酸分子は、パーティクルボンバードメント（W illiamsら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:2726-2730(1991)、これは本明細書中に参考として援用される）を用いて種々の組織へ移入され得る。このような核酸分子は、転写および翻訳に必要とされる適切なヌクレオチド配列に連結され得る。 FAPをコードする核酸の特に有用な投与様式は、疾患または病理学的症状の部位での局所的直接接種による。局所投与は、有利であり得る。なぜなら、希釈効果がなく、それ故標的化細胞の大部分が核酸分子と接触する可能性が増大するからである。従って、局所接種は、他の投与形態で必要な標的化必要条件を軽減し得、そして所望であれば、接種領域の全ての細胞型を感染させるベクターが使用され得る。発現が、接種領域内の特定のサブセットの細胞のみにおいて所望される場合、所望のサブセットの細胞に特異的なプロモーター、エンハンサーまたは他の発現エレメントが、核酸分子に連結され得る。このような核酸分子および調節エレメントを含むベクターは、ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミドなどであり得る。リポソームのようなトランスフェクションビヒクルもまた、非ウイルスベクターをレシピエント細胞に導入するために使用され得る。このようなビヒクルは、当該分野で周知である。細胞中でのアポトーシスを調節する別の方法は、アンチセンスFAPまたはFasをコードするヌクレオチド配列を細胞に導入し、そして細胞中でこのアンチセンスヌクレオチド配列を発現させることである。このようなヌクレオチド配列は、上記方法およびベクターを用いて細胞に導入され得、そして細胞中で発現され得る。化学的に合成されたヌクレオチド配列もまた、細胞に直接投与され得る。合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、周知の方法を用いて調製され得るか、または市販供給元から購入し得、そして所望であれば、ヌクレオチドアナログを取り込んで、細胞中のヌクレアーゼによる分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増加し得る。本発明はまた、アポトーシスのレベルの増加または減少が、例えば、細胞中でのFAPの発現の増加または減少によるのか、あるいは変異体FAPの発現によるのかを決定して、細胞中でのアポトーシスのレベルの増加または減少により特徴付けられる病状を診断する方法を提供する。細胞中でのFAPおよびFasの会合の変化に起因し得るこのような病状の同定は、上記のような有効な薬剤または核酸分子またはアンチセンスヌクレオチド配列を用いる干渉治療（intervention therapy）を可能にし得る。一般に、試験サンプルは、アポトーシスの増加または減少により特徴付けられる病状を有する被検体から得られ得、そして正常な被検体由来のコントロールサンプルと比較され得、試験サンプル中の細胞が、例えば、FAP発現の増加または減少を有するかどうかを決定する。細胞中のFAPレベルは、サンプルを薬剤（例えば、抗FAP抗体またはFas、これらのいずれもFAPを特異的に結合し得る）と接触させることにより、決定され得る。例えば、細胞中のFAPレベルは、抗FAP抗体を用いる周知の免疫アッセイまたは免疫組織化学的方法（例えば、Reedら、上記、1992を参照のこと；HarlowおよびLane、上記、(1988)も参照のこと）により、決定され得る。本明細書で使用される用語「薬剤」は、FAPまたはFasあるいは結合したFAP-Fas複合体に特異的に結合し得る化学的分子または生物学的分子を意味する。例えば、抗FAP抗体またはFasのいずれもが、FAPに対する薬剤であり得、一方、抗Fas抗体またはFAPのいすれもが、Fasに対する薬剤であり得る。本明細書で使用される用語「試験サンプル」は、被検体から得られ、そしてサンプル中の細胞でのFAPの発現について試験されるべき細胞または組織検体を意味する。試験サンプルは、例えば、手術中または針生検により得られ得、そして本明細書に記載される方法を用いて試験され得、アポトーシスの増加または減少により特徴付けられる病状を診断し得る。試験サンプル中の細胞でのFAPの発現の増加または減少は、特定の細胞型において予想されるFAPの正常レベルとの比較により、決定され得る。種々の細胞型におけるFAPレベルの正常範囲は、統計学的に有意な数の正常被検体をサンプリングすることにより、決定され得る。さらに、コントロールサンプルは、アポトーシスの増加または減少により特徴付けられる病状が、FAPの発現の増加または減少によるのかどうかを決定するために、試験サンプルと平行して評価され得る。試験サンプルは、例えば、上記のような免疫組織化学方法を用いて試験され得るか、またはサンプルは、さらに処理されて試験され得る。例えば、試験サンプルの抽出物が調製され得、そしてサンプル中の細胞で発現されるFAPが、コントロール細胞由来のFAPと同様の様式でFas と会合し得るかどうか、または、代わりに、変異体FAPが細胞中で発現されているかどうかを決定するために試験され得る。試薬（例えば、抗FAP抗体またはFas）を取り込む診断アッセイキットは、細胞中での変化したFAP発現による病状を検出するのに有用であり得る。このようなキットは、特に有用である。なぜなら、このようなキットは、アッセイ条件の標準化を可能にするからである。キットは、試薬に加えて、アッセイを実施するに適切な反応条件を提供する反応カクテル、および既知量のFAPを含有するコントロールサンプルを含み得る。さらに、キットは、試薬に対して特異的である抗体を含み得る。診断アッセイは、試薬に結合される、サンプル中のFAPの量を検出する簡単な方法を包含すべきである。周知の方法（抗体の標識について、例えば、HarlowおよびLane、上記、1988；第９章、を参照のこと）を用いて、試薬を標識し、そして標識の存在を検出することにより、検出が行われ得る。試薬は、種々の検出可能な部分（放射線標識、酵素、ビオチンまたは蛍光色素を包含する）で標識され得る。試薬を標識するための物質は、診断キットに含まれ得るか、または市販の供給元から別個に購入され得る。標識試薬と試験サンプルおよび、所望であればコントロールサンプルとの接触後、特異的に結合した試薬が、特定の部分を検出することにより、同定され得る。試薬を特異的に結合し得る標識抗体はまた、非標識試薬の特異的結合を同定するために使用され得る。例えば、試薬が抗FAP抗体である場合、第２の抗体が、抗FAP抗体の特異的結合を検出するために使用され得る。第２の抗体は、一般的に第１の抗体の特定のクラスに対して特異的である。例えば、抗FAP抗体がIgGクラスの抗体である場合、第２の抗体は、抗IgG抗体である。このような第２の抗体は、市販の供給元から容易に入手可能である。第２の抗体は、上記のような検出可能な部分を用いて標識され得る。サンプルが第２の抗体を用いて標識される場合、サンプルは、まず第１の抗体と接触させられ、次いでサンプルは、標識された第２の抗体と接触させられ、この第２の抗体は第１の抗体と特異的に結合し、そして標識サンプルを生じる。以下の実施例は、本発明を説明するように意図され、本発明を限定するようには意図されない。実施例Ｉ酵母ツーハイブリッドシステムを用いるFAPの同定この実施例は、Fasの細胞質ドメインと会合し得るタンパク質をコードするcDN A配列を同定するための、酵母ツーハイブリッドシステムの使用を説明する。Ａ．宿主／ベクターシステム２つの異なる酵母宿主／プラスミドベクターシステム（本明細書では「EGY48 システム」および「L40システム」と示す）を使用して、FAPをコードするcDNA配列を同定した。１．EGY48システムいくつかの実験において、S.cerevisiae EGY48株酵母細胞を、ツーハイブリッドアッセイのために宿主細胞として使用した（「EGY48システム」）。EGY48株細胞は、MATα trpl ura3 his3 LEU2::pLexAop6-LEU2遺伝子型を有する。酵母をYP D培地中で増殖させた。示すように、EGY48株細胞は、LexAopに連結したLeu2遺伝子を含み、それゆえ転写能力のあるLexA DNA結合ドメイン存在下で、ロイシン欠乏培地中で増殖し得る。プラスミドであるpEG202（図１）およびpJG4-5（図２）を、EGY48酵母細胞中でハイブリッドタンパク質を発現させるために使用した（Zervousら、Cell 72:2 23-232(1993)；Gyurisら、Cell 75:791-803(1993)；Golemisら、Current Protoc ols in Molecular Biology （Ausubelら編；Green Publ.;NY 1994）、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。プラスミドpEG202は、プラスミドLexA202+PL由来であり（Rudenら、Nature 350:250-252(1991)；MaおよびPta shne、Cell 51:113-119(1987)、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）、そしてクローニングのためのさらなる唯一のポリリンカー部位（ unique polylinker sites）を含む。プラスミドpEG202を、唯一のSal I部位（これはLexAの下流のポリリンカーに存在する）でLexA202+PLを切断し、そしてSal I部位を再生し、かつ新規なNco I、Not IおよびXho I部位をも含む22マーを挿入することにより作製した。 22マーを、２つのオリゴヌクレオチド、5'-TCGACCATGGCGGCCGCTCGAG-3'（配列番号７）および5'-TCGACTCGAGCGGCCGCCATGG-3'（配列番号８）を合成し、そしてオリゴヌクレオチドの相補領域をアニーリングすることにより構築した。この22 マーをLexA202+PLのSal I部位に連結して、pEG202を作製した。図１に示すように、pEG202はまた、酵母の２μmの複製起点およびヒスチジン選択マーカーを含む。LexA融合カセットの発現は、強力な構造性ADH1プロモーターからである。オープンリーディングフレームをコードするcDNAを、pEG202のEco RI、Bam HI、Sa l I、Nco I、Not IまたはXho I部位に挿入することにより、LexA融合タンパク質が産生される。プラスミドpJG4-5は、pUCプラスミド由来であり、そしてガラクトース誘導性プロモーターを含む（図２）。cDNAを、Eco RIまたはXho I部位に挿入することにより、融合タンパク質が産生される。この融合タンパク質は、B42トランスアクチベーションドメインを有し、そしてSV40核局在化シグナルおよびヘマグルチニンエピトープタグを含む（Zervousら、上記、1993；Gyurisら、上記、1993）。 EGY48システムに使用されるβ-galレポーター遺伝子構築物は、プラスミドpSH 18-34であり、これはLexAオペレータ配列に連結したlacZ遺伝子を含む（図３；H anesおよびBrent、Cell 57:1275-1283(1989)；HanesおよびBrent、Science 251: 426-430(1991)、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。（5'-TCGACTGCTGTATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACTGCTGTATATAAAACCAGTGGTTATA TGTACAGTACG-3'；配列番号９）および（5'-TCGACGTACTGTACATATAACCACTGGTTTTAT ATACAGCAGTACTGTACATATAACCACTGGTTTTATATACAGCAG-3'；配列番号10）をアニーリングすることにより形成される２つの78塩基対オリゴヌクレオチドを、プラスミドpLR1Δ1（Westら、Mol.Cell.Biol. 4:2467-2478(1984)、これは、本明細書中に参考として援用される）のXho I部位に挿入することにより、８コピーのLexA オペレータ配列を含むプラスミドpSH18-34を構築した。各オリゴヌクレオチドは、LexA DNA結合タンパク質のための４つの結合部位を含む。pSH18-34を含む安定に形質転換されたEGY48株酵母細胞株を、ウラシルを欠く培地中でのその増殖能力に基づいて得た。２．L40システムいくつかの実験において、S.cerevisiae L40株酵母細胞を、ツーハイブリッドアッセイのための宿主細胞として使用した（「L40システム」；Vojtekら、上記、1993）。L40株細胞は、MATa、trp1、leu2、his3、ade2、LYS2:(lexAop)4-HIS3 、URA3::(lexAop)8-lacZ遺伝子型を有し、そしてヒスチジンシンセターゼ（HIS3 ）およびlacZレポーター遺伝子（これらの両方とも、lexAオペレータの制御下にある）で安定に形質転換されている。L40株細胞を、YPD培地中で増殖させた。プラスミドpBMT-116（図４）およびpVP-16（図５）を、L40株細胞を用いるアッセイに使用した。プラスミドpBMT-116は、ADHプロモーターの制御下で、LexA DNA結合ドメインをコードする（図４）。L40株細胞中にpBMT-116が存在することにより、トリプトファン欠乏培地中で細胞が増殖し得る。プラスミドpVP-16は、またADHプロモーターの制御下の、トランスアクチベーティングドメインをコードする（図５）。L40株細胞中にpVP-16が存在することにより、ロイシン欠乏培地中で細胞が増殖し得る。Ｂ．ハイブリッドタンパク質をコードするベクターの調製コントロールとして、そして偽陽性クーロンを除去するために、Bcl-2タンパク質をコードするcDNA配列（pSKII-bcl-2α由来;Tanakaら、J ．Biol．Chem. 268 :10920-10926(1993)（これは本明細書中に参考として援用される））もまた、以下に記載のプライマーを用いるPCR変異誘発（Higuchiら、上記、1990）により修飾し、そしてpEG202中にインフレームでサブクーロン化した。発現タンパク質の核への潜在的な標的化を防止するために、Bcl-2の貫膜ドメインに対応する配列を欠失させ（Tsujimoto およびCroce、Proc ．Natl．Acad．Sci.,USA 83:5214-52 16(1986)、これは本明細書中に参考として援用される）、そしてオープンリーディングフレームの末端に終止コドンを挿入した。１．EGY48システムヒトFasの細胞質ドメインをコードするcDNA配列（アミノ酸191〜335；図６参照；Itohら、上記、1991）を、以下に記載のプライマーを用いるPCR変異誘発（H iguchiら、PCR Protocols（Innesら編；Academic Press；San Diego CA 1990、これは本明細書中に参考として援用される）により修飾し、そしてpEG202中へインフレームでサブクーロン化し、pEG/Fas(191-335)を生成した。上記のように、 pEG202は、ADHプロモーターを使用して、Ｎ末端LexA DNA結合ドメインを含有する融合タンパク質の発現を構成的に駆動する。ヒトFasの細胞質ドメインのcDNA 配列を、pEG202のEco RI部位に、上流LexA配列とインフレームでサブクーロン化した。正方向プライマーおよび逆方向プライマーは、Eco RI部位（下線）または BclI部位（イタリック）を含有し、以下の通りであった（太字は終止コドン；TC AをコードするDNAを示す）：(i)Fas（アミノ酸(aa)191〜335）（5'-GGAATTCAAGA GAAAGGAAGTACAG-3'；配列番号11）および（5'-TGATCACTAGACCAAGCTTTGGAT-3'；配列番号12）；(ii)Bcl-2（aa１〜218）（5'-GGAATTCATGGCGCACGCTGGGAGAAC-3' ）；配列番号13）および（5'-TGATCACTTCAGAGACAGCCAC-3'；配列番号14）。 pJG4-5プラスミドは、ガラクトース誘導性プロモーター(GALl-p)を用い、Ｎ末端B42トランスアクチベーションドメインを含有する融合タンパク質の発現を誘導的に駆動する（図２）。HeLa細胞cDNAライブラリーをpJG4-5のEco RIまたはXh o I部位中にクローニングすることにより（pJG/HeLa）、FAP候補をコードするB4 2融合タンパク質を産生した。２．L40システム細胞質ドメインの種々のフラグメントをコードするcDNA配列（Itohら、上記、 1991）を、PCR（Higuchiら、上記、1990）により、以下の通りのEco RI部位（下線）およびBcl I部位（イタリック）（太字は終止コドンTCAを示す）を含有する正方向（Ｆ）プライマーおよび逆方向（Ｒ）プライマーを用いて生成させた：1 ）5'-GGAATTCAAGAGAAAGGAAGTACAG-3'（F1；配列番号11）；2）5'-GGAATTCAAAGGC TTTGCTTCGAAAG-3'（F2；配列番号15）；3）5'-GTGATCACGCTTCTTTCTTTCCATG-3'（ R1；配列番号16）；および4）5'-CTGATCACTACACCAAGCTTTGGAT-3'（R2；配列番号 12）。プライマーの以下の組み合わせの使用は、示されるFasフラグメントを産生した：1）F1+R2=Fas(191-335)；2）F1+R1=Fas(119-290)；3）F2+R1=Fas(246-3 35)；および4）F2+R2=Fas(246-290)。Fas(321-335)を、SpeIを用いる制限エンドヌクレアーゼ消化により生成させ、そしてT4 DNAポリメラーゼを用いてフィルインして終止コドンを生じさせた。Fas(119-335)をコードする配列を、pBMT-116にインフレームでサブクローン化し、pBMT/Fas(191-335)を生成した。 pVP-16プラスミドは、ADHプロモーターを用いて、Vp-16トランスアクチベーションドメインを含有する融合タンパク質の発現を駆動する。cDNAライブラリーを、リン酸化ヘキサマーを用いて、9.5〜10.5日のCD1マウス胚ポリ-Ａ⁺mRNAのランダムプライム合成により調製した。プライマーのテンプレートに対する比を調節し、RNA分子あたりの複数の合成反応を促進させた。これにより、平均約500ヌクレオチドのサイズの第１鎖を生成した。RNAse H、DNAポリメラーゼI、およびE. coli DNAリガーゼを用いる第２鎖合成の後に、cDNAをT4 DNAポリメラーゼを用いて修復し、そして以下のリンカーを結合した：反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分画し、そして350〜700のヌクレオチドのDNAフラグメントを収集した。DNAフラグメントを、Millipore フィルターカラムを通して抽出し、次いでフェノール：クロロホルム（１：１）抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。多量のcDNAを生成させるため、サイズ選択した DNAを、5mMのMg⁺²の存在下、上記由来のセンスプライマー（配列番号９）を用いて増幅した。ほぼ飽和までの増幅の後、反応物を10倍希釈し、そして増幅をさらに１サイクル続けた。放射能標識されたヌクレオチドの取り込みにより、１サイクルあたり1.9の増幅効率が示された。最初の増幅可能なcDNAは、全部で１×10⁸ 分子を越えると見積もられた。増幅されたDNAを一晩10ユニットNot I/μg DNAとインキュベートし、次いでpVP-16にクローン化した（pVP／胚；Vojtekら、上記、1993）。 pVP-16中のNot I挿入物の配列決定のために、cDNA挿入物を11個のヌクレオチドパリンドローム（そのうちの９個はGC塩基対を形成する）に隣接させる。この挿入物を、センスプライマー(5'-GGTACCGAGCTCAATTGCGG-3'；配列番号19)（これはNot Iパリンドロームの一部をカバーする）を用いて配列決定し得る。あるいは、Taq DNAポリメラーゼを用いて高温で配列決定を行い得る。Ｃ．アッセイ方法プラスミドDNAを、LiCl方法またはLiOAc方法（Itoら、J ．Bacteriol. 153:163 -168(1983)；Gietzら、Nucl ．Acids Res. 20:1425(1992)；Schiestlら、Curr ．G enet. 16:339-346(1989)、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）によって酵母細胞中に形質転換した。EGY48システムを用いる実験において、形質転換細胞を、それぞれpSH、pJG、またはpEG由来プラスミドの存在について選択するために必要に応じてウラシル、トリプトファン、またはヒスチジンを欠いている完全最少培地中で増殖させた。さらに、ロイシンを欠く培地での増殖は、転写活性なLexA/B42複合体の形成を示した。L40システムを用いる実験において、形質転換細胞を、それぞれpBMTまたはpVP由来プラスミドの存在について選択するために必要に応じてそれぞれトリプトファンまたはロイシンを欠いている完全最少培地中で増殖させた。さらに、ヒスチジンを欠いている培地中での増殖は、転写活性なLexA/VP16複合体の形成を示した。１．EGY48システム種々の融合タンパク質の発現の後、酵母細胞抽出物を、スフェロプラスト方法（SmithおよびCorcoran、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、Green Publ.；NY 1989、これは本明細書中に参考として援用される）を用いて調製し、そしてLexA-またはB42-融合タンパク質の発現を、それぞれポリクローナル抗LexA抗血清（BrentおよびPtashne(Nature 312:612-615(1984)、これは本明細書中に参考として援用される）により記載されているように調製され得る）、または抗HA1物モノクローナル抗体（クローン12CA5；Boehringer Mannheim ；Indianapolis IN）を用いるイムノブロットアッセイにより確認した。 EGY48酵母細胞を、pSH18-34（これは、lexAオペレーターからのレポーターIac Zを発現する）で安定に形質転換した。次いで、この細胞をpEG/Fas(191-335)で形質転換し、そしてヒスチジンを欠く最少培地中での増殖について選択した。選択されたコロニーを、pJG/HeLa cDNAライブラリーを用いて形質転換し、そしてヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠く培地上にプレーティングし、 FAP候補をコードするクローン化cDNA配列を同定した。約1.7×10⁷コロニーを、各々20枚のプレートにプレーティングした。Fasの完全な細胞質ドメインを用いてスクリーニングされた1700万個の酵母形質転換細胞のうち、約1210個の独立した細胞のコロニーがLeu⁺表現型であった。４つのレプリカを、1210個全てのLeu⁺形質転換株から作製し、以下のようにプレーティングした：1)グルコース、X-gal、ロイシン；2)ガラクトース、X-gal、ロイシン；3) グルコース；および4)ガラクトースプレート。85個の形質転換株が、ロイシンを欠く培地上で増殖し、ガラクトース誘導性β-gal活性を示した。 27個のクローンを選択し、そしてヒスチジン含有培地中で細胞を増殖させることにより、LexA/Fasをコードするプラスミドの「キュアリング」をした。次いで、キュアリングされた細胞を、LexA/Fas、LexA/Ras、LexA/CD40、LexA/Bcl-2(sh ort)またはLexA/lamin融合タンパク質（Vojtekら、上記、1993；Bartelsら、Bio techniques 、14：920-924(1993)、これらは、本明細書中に参考として援用される）のいずれかを産生した種々のプラスミドを含有するａ型酵母(RFY206株{Mata 、ura3、trp1、leu2})のパネルに対して接合させた。接合された細胞を、ヒスチジンおよびトリプトファンを欠いている培地中の増殖について選択し、pJG＼HeL aクローンおよびLexA-融合タンパク質の両方を含有する細胞を得た。15個のクローンを部分的に配列決定し、そしてデーターベースサーチを実施して相同性について分析した。４個のクローンは、78kDaのグルコースに調節されるGRP78タンパク質をコードする核酸配列と同一であった（示していない；TingおよびLee、上記、1988）。２．L40システム pBMT/Fas(119-335)プラスミドをL40細胞中に導入した。L40細胞は、LexAオペレーターの制御下でヒスチジンシンセターゼ(HIS3)およびβ-ガラクトシラーゼ( lacZ；β-gal)レポーター遺伝子を含有する。得られた形質転換株をトリプトファンを欠いている培地上で増殖する能力について選択した。なぜなら、pBMT-116 プラスミドは、宿主株における欠損を相補するTRP1遺伝子を含有するからである。次いで、pBMT/Fas(191-335)を含有するL40細胞を、pVP-16/胚cDNAライブラリで形質転換した。形質転換株を、pVP-16ベクター中のLEU2遺伝子の存在に基づいて、ロイシンを欠いているプレート上での増殖により、選択した。 FAP候補をコードするcDNA配列を発現するコロニーを、それらの酵母細胞中のl exAop/HIS3レポーター遺伝子構築物の発現による、ヒスチジンを欠いている培地中での増殖能力によってまず同定した。約３億の形質転換株をスクリーニングし、そして395個のHis+ コロニーを同定した。これらの395個のクローンを、β-ga l比色定量分析フィルターアッセイ(BreedenおよびNasmyth、Cold Spring Harb ． Symp ．Quant．Biol. 50:643-650(1985)、これは本明細書中に参考として援用される)を用いてさらに検査し、lacZレポーター遺伝子（これは、lexAオペレーターの制御下にある）の発現を同定した。この第２のスクリーニング手順の後、84 個のポジティブクローンを得た。 84個のクローンを、トリプトファン含有培地中で細胞を増殖させることにより LexA/Fasをコードするプラスミドのキュアリングをした。次いで、キュアリングした細胞を、EGY48システムについて上記したように種々の融合タンパク質を含有するａ型酵母(NA-8711-A株{a、leu2、his3、trp1、pho3、pho5})プラスミドのパネルに対して接合させた。接合させた細胞を、トリプトファンおよびロイシンを欠いている培地中での増殖について選択し、pVP＼胚クローンおよびLexA-融合タンパク質の両方を含有する細胞を得た。選択された84個のクローンのうち、２個が、β-galフィルターアッセイ（Bree denおよびNasmyth、上記、1985）によって測定したところ、LexA/Fasタンパク質と特異的に反応した。２つのクローンのDNA配列分析により、約350塩基対（bp; pVP16-31）および380bp(pVP16-43；図７参照)の挿入物が示された。これらのマウスcDNAクローンとその他とのアラインメントは、それらが重複する独立したcD NA配列を表すことを示した。cDNAクローンを配列決定し、そしてデータベースサーチにより、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP-BAS)をコードするヒトcDN A配列との95％を越える相同性が示された。特に、cDNA配列は、PTP-BAS中の第２のGLGF反復と相同であった（図７）。以下の実施例II.C.に記載のように、ツーハイブリッドシステムを用いて得られたこのcDNA挿入物を用いて、λファージヒトcDNAライブラリをスクリーニングした。 pVP16-31プラスミドを、Fasの種々のフラグメントをコードする核酸配列を含有するpBMT-116プラスミドと共にL40細胞中に同時導入(cointroduce)し（図８参照）、そしてlacZ遺伝子からの転写活性化を、β-galフィルターアッセイ（Bree denおよびNasmyth、上記、1985）を用いてアッセイした。図８に示すように、Fa sのＣ末端15アミノ酸を含むFasのフラグメントは、pVP16-31中のcDNA挿入物によってコードされるポリペプチドを結合し得、そしてこの結果、lacZレポーター遺伝子の転写を活性化した。実施例II FAP を同定するためのインビトロアッセイこの実施例は、FAPをインビトロにおいて検出し、そして特徴付けるために有用な融合タンパク質を構築するための方法を記載する。A ．GST/Fas融合タンパク質の生産 pGEX-2TX（図９；Pharmacia；Piscataway NJ）に基づくFLAG^TMペプチド（エンテロキナーゼ認識部位および心筋キナーゼ（HMK）基質ドメイン）を含有するクローニングベクターを、GST/Fas融合タンパク質の構築のために使用した（図６）。このベクターは、誘導性tacプロモーター、Schistosoma japonicum由来のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子、マルチクローニング部位、免疫学的検出および精製のためのFLAG^TMペプチド、GST遺伝子とマルチクローニング部位との間に位置するトロンビンおよびエンテロキナーゼ切断部位ならびに融合タンパク質の放射性標識のためのHMKキナーゼドメインを含む（以下を参照のこと）。一連のGST/Fas融合タンパク質を、pGEX-2TXを使用してE．coliにおいて生産した（図６および８を参照のこと）。上記の種々のFasフラグメントをコードする核酸配列を、pBluescript^TM（Stratagene；San Diego CA）にサブクローン化するか、またはpGEX-2TXプラスミドに直接クローン化した。GST/Fas融合タンパク質をコードする核酸分子を、Sequenase version 2.0キット（U.S．Biochemical ；Cleveland OH）を使用して配列決定して、リーディングフレームが適正であり、そして誤ったヌクレオチドがPCR増幅の間に導入されなかったことを確認した。GST-融合タンパク質は、以下のFas細胞質ドメインのセグメントを含んでいた：(A)アミノ酸残基191〜335、これは細胞質ドメイン全体に対応する（GST/Fas (191-335)）；(B)残基191から290、これは貫膜ドメインから保存領域の末端に至る領域を表す（GST/Fas(191-290)）；(C)残基246〜335、これは保存領域の始めからFasのＣ末端までの領域である（GST/Fas(246-335)）；(D)残基246〜290、これはTNFRファミリーのタンパク質のメンバー間で保存されているFasの領域を含む；(E)残基191〜320、これはＣ末端の15アミノ酸を除く細胞質ドメイン全体を含む（GST/Fas(191-320)）および(F)残基321〜335、これは負の調節ドメインを構成するFasのＣ末端アミノ酸を表す（GST/Fas(321-335)；図６）。 GST/Fas融合タンパク質を、１mMのIPTGでtacプロモーターからの発現を誘導することによりE．coliにおいて発現させた。約１〜10μｇのGST/Fas融合タンパク質を、１mlの細菌培養物から得た。GST/Fas融合タンパク質を、細菌溶解物からグルタチオン-Sepharose 4B（Sigma；St．Louis MO）でのアフィニティークロマトグラフィーにより部分精製した。SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によるGS T/Fas融合タンパク質の分析によって、E．coli溶解物から精製した融合タンパク質が予想される分子量を有したことを確認した（示さず）。いくつかの実験において、³²P標識GST/Fas融合タンパク質を用いて、FAPの存在を検出する。³²P-GST/Fasをウシ心筋キナーゼ（Sigma）を用いて生成させる。簡潔に述べると、GST/Fasを、グルタチオン-Sepharoseカラムに結合させることにより固定化する。結合したGST/Fasを１×HMK緩衝液（20 mM Tris-HCl（pH 7.5 ）、100 mM NaCl、12 mM MgCl₂）で洗浄し、そしてコートされたビーズを１単位 /mlのcAMP-依存性プロテインキナーゼの触媒性サブユニット（Sigma）、１mCi/m lのγ[³²P]-ATP（6000 Ci/mmol、10 mCi/ml；Dupont/NEN；Boston MA）および１ mMのジチオスレイトール（DTT）を含有する１×HMK緩衝液の２〜３ビーズ容量（ vol）中に再懸濁する。キナーゼ反応を、室温（RT）で60分間進行させ、次いで１mlのHMK停止緩衝液（10 mMリン酸ナトリウム（pH 8.0）、10 mMピロリン酸ナトリウム、10 mM EDTA、１mg/ml BSA）を添加することにより停止させる。遊離 γ[³²P]-ATPを、反応混合液を停止緩衝液中に再懸濁し、グルタチオンSepharose ビーズを遠心分離によりペレット化し、そして緩衝液を除去することにより除去する。これらの工程を４回繰り返し、次いでSepharoseビーズを少なくとも５回HMK緩衝液で洗浄する。洗浄後、ビーズを溶出緩衝液（５mMグルタチオン、50m M Tris-HCl（pH 8.0）、120 mM NaCl）中に再懸濁して４℃で保存する。B ．種々の組織におけるFAPの同定ファーウェスタンブロッティング（リガンドブロッティング）を使用して、種々の細胞タイプにおけるFAPの存在を検出した。１つの実験において、50μgのマウスS49T細胞由来の全タンパク質を分析した。タンパク質を、Reedら、Canc ．Re s. 51:6529-6538(1991)（本明細書中に参考として援用される）に記載のように、10 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.1% SDS、１%デオキシコール酸ナトリウム、１% Triton X-100およびプロテアーゼインヒビター中で細胞を溶解し、次いで12% SDS-ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分画することにより得た。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロースに移し、そしてこのニトロセルロースフィルターを一連の変性/再生工程により処理した。フィルターを、６Ｍグアニジン-HClを含有するHBB緩衝液（20 mM Hepes（pH 7.5）、５mM MgCl₂、１mM KCl、５mM DTT）とともにインキュベートして、タンパク質を変性させた。穏やかに振とうしながら10分間インキュベーションした後、この溶液を除去し、そして同じ手順を２回目に繰り返した。10分後、この溶液を除去し、次いでフィルターを連続的に３Ｍグアニジン-HCl、1.5Mグアニジン-HCl、0.75Mグアニジン- HCl、0.38Ｍグアニジン-HClを含有するHBB緩衝液で各々５分間インキュベートし、次いで５%スキムミルクを含有するHBB緩衝液中で振とうして30分間インキュベートした。溶液を除去し、そして１%スキムミルクを含有するHBB緩衝液に置換し、そして振とうを10分間継続した。次いで、フィルターを、１%スキムミルクおよび１μg/mlのGST/Fas(191-335)（これはFas細胞質ドメイン全体を含む）またはGST（コントロール）を含有するHBBの溶液中で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、フィルターを３回PBST緩衝液（137 mM NaCl、2.76 mM KCl、4.3 mM KNa₂HPO₄、0.2% triton X-100）で15分間洗浄し、次いでリン酸緩衝化生理食塩水中に1:1000希釈のマウス抗GSTモノクローナル抗体（GS7；Sant a Cruz Biotechnology；Santa Cruz CA）を含有する溶液に移した。このフィルターを穏やかに振とうして２時間室温でインキュベートし、次いで３回PBSTで10 分間洗浄した。洗浄の後、フィルターを３mlの抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ（１mg/ml；1:7000希釈；Promega；Madison WI）中に１時間室温で浸漬し、次いで３回PBST緩衝液で洗浄し、そしてNBT/BCIP（ニトロブルーテトラゾリウム /5-ブロモ-4,クロロ-3-インドリル-ホスフェート）を用いて複合体を発色させた。 FAS/APO-1結合タンパク質を同定する予備的な試みとして、Fasの細胞質ドメイン全体を含むGST/Fas融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてγ³²P-ATPおよびcAMPキナーゼの触媒性サブユニットを使用してインビトロで放射性標識した。³²P-GST/Fasをタンパク質ブロットとともにインキュベートした。32、30、および18 kDaの分子量を有する少なくとも３つの FAPを、マウスS49T細胞タンパク質抽出物において同定した（図10）。36kDa Fas タンパク質に相当するバンドは検出されなかった。同様のサイズのFAPを、ヒト乳ガン（MCF7）、卵巣ガン（A278）、肺ガン（H460）および結腸ガン（Caco-2）細胞株ならびに正常マウスＴ細胞およびマウスＢ細胞リンパ腫株（RS11846）においても検出した（示さず）。2 ．cDNA発現ライブラリーのスクリーニング ³²P標識GST/Fasタンパク質を、λgt11 cDNA発現ライブラリーの直接的なスクリーニングに使用し得る。λgt11 cDNA発現ライブラリーは市販の供給源から得られ得（Clontech，Palo Alto CA）、または周知の方法を用いて構築され得る（ Sambrookら、前出、1989）。放射性標識GSTおよびGST/Fasを上記のように得る。ファージをニトロセルロースフィルターに移し、これをプラスチックバッグ中に入れる。ハイブリダイゼーション緩衝液（１%ミルク、20 mM Hepes-KOH（pH 7.7 ）、75 mM KCl、0.1 mM EDTA、2.5 mM MgCl₂）を添加し、そして約250,000 cpm/ mlのGST/Fas（またはGST）を添加する。フィルターを４℃で一晩、20倍モル過剰の非標識GSTタンパク質の存在下でインキュベートする（例えば、Kaelinら、前出、1992を参照のこと）。ポジティブプラークを選択し、そして上記のようなさらなる回のスクリーニングに供する。３〜４回のスクリーニングの後、プラーク精製したファージのcDNA 挿入物を、ベクタークローニング部位に隣接するプライマーを使用してPCRにより増幅するか、あるいは精製ファージDNAの制限消化によりファージから放出する。これらのcDNA配列をpETベクターであるpET5c（Novagen；Madison WI）（これは、挿入されるcDNAとインフレームであるT7/Protein 10融合タンパク質を生産する）のEcoRI部位にサブクローン化する。組換えタンパク質の発現を、IPTG を使用してE．coli内で誘導し、SDS-PAGEにより分画し、そしてニトロセルロースフィルターに移す。生じるブロットを、ライブラリーをスクリーニングするためにもともと使用したのと同じGST/Fas融合タンパク質を使用して、上記のようにファーウェスタン法を用いて分析する。GST/Fasプローブを結合するFAPを生産するクローンを配列決定し、そしてそのアミノ酸配列を推定する。これらの配列をヌクレオチドデータベースおよびタンパク質データベースに対してチェックして、新規または以前に記載のタンパク質を同定する。上記のタンパク質相互作用クローニング技術を介して得られたポジティブcDNA 配列を使用して、種々の組織をノーザンブロット分析によりスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブを作製する。次いで、適切なクローンを、適切な組織から調製された市販のλファージcDNAライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用して、種々のFAPのオープンリーディングフレーム全体をコードするcDNAを得る。あるいは、5'-または3'-RACE法を用いて、逆転写されたRNA由来のcDNAの領域を直接増幅し得る（Fr ohmanら、Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA 85:8998-9002(1988)、これは本明細書中に参考として援用される）。C ．FAPのFasへの結合の特徴付け上記の酵母ツーハイブリッドシステムを使用して同定されたFAPの、GST/Fas融合タンパク質に会合する能力を検討した。HFAP10中のcDNA配列をBluescriptベクターであるpSK-II（Stratagene）中にサブクローン化し、そして³⁵S-L-メチオニンの存在下で、カップルしたインビトロ転写/翻訳システム（TNT lysate；Prome ga）およびT7 RNAポリメラーゼを使用して、内部のメチオニンコドンからインビトロ翻訳した。³⁵S-標識タンパク質を、緩衝液Ａ（150 mM NaCl、50 mM Tris（p H 8.0）、５mM DTT、２mM EDTA、0.1% NP-40、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μg/mlロイペプチン）中で16時間４℃でグルタチオン-Sepharoseビーズに固定化した種々のGST/Fas融合タンパク質とインキュベートした。インキュベーションの後、ビーズを激しく10回緩衝液Ａ中で洗浄し、そして結合したタンパク質をグルタチオン-Sepharoseビーズを用いて遠心分離により回収し、沸騰 Laemmli緩衝液中に溶出し、そしてSDS-PAGEおよびフルオログラフィーにより分析した。ヒトPTP-BAS由来のポリペプチドは、GST/Fas(191-335)（これはFas細胞質ドメイン全体を含む）、GST/Fas(246-335)（これはFasの保存領域からＣ末端までを含む）、およびGST/Fas(321-335)（これはFasのＣ末端15アミノ酸を含む）に特異的に結合した（図８；「インビトロ結合アッセイ」）。対照的に、このポリペプチドは、保存領域のみを含むGST/Fas融合タンパク質、貫膜ドメインから始まって保存領域の末端までのFasの領域、GST単独、２つの形態のTNFRのいずれか、またはCD40には結合しなかった（示さず）。これらの結果は、上記のツーハイブリッドアッセイの結果と相関し、そしてFasのＣ末端15アミノ酸が、FasとFAP（P TP-BASなど）との会合のために十分であり、そしてFAPがFasとは特異的に会合するが、TNFRファミリーのその他のメンバーとは会合しないことを示す。実施例III ４型PTP-BASおよび５ａ型PTP-BASの特徴付けこの実施例は、ヒト４型PTP-BASおよびヒト５ａ型PTP-BASの特徴を記載する。クローンpVP16-31およびクローンpVP16-41(上記参照)をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、λ gtll(Clontech)に調製したヒト胎児脳cDNAライブラリーおよびマウス肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングした(実施例IVを参照のこと)。ヒトcDNAライブラリーから、２種のクローンを得た(図７；HFAP10およびHFAP20)。cDNAインサートを上記のように配列決定し、そしてアミノ酸配列を推定した(図12および14を参照のこと)。これらのcDNA配列によりコードされるポリペプチドを４型PTP-BASおよび５ａ型PTP-BASとそれぞれ命名した。 HFAP10は、1814ヌクレオチドインサート(図13；配列番号２)を含んでおり４型 PTP-BASの604アミノ酸(図12；配列番号１)をコードしていた。図11に示すように、４型PTP-BASのアミノ酸配列は、１型PTP-BASのアミノ酸残基と比較するとアミノ酸1279-1883を含む。この４型PTP-BASのアミノ酸配列は、GLGF2、GLGF3および GLGF4を含む。さらに、４型PTP-BASは、５つのアミノ酸VLFDKインサートをGLGF2 中に含む。 HFAP20は、約1500のヌクレオチドインサート(この約600のヌクレオチドが、さらに決定されなければならない)を含む(図15；配列番号４)。HFAP20のヌクレオチド配列は、92個のアミノ酸のポリペプチドをコードしていた。HFPA20によりコードされたこのポリペプチドのN-末端68アミノ酸は、PTP-BASに対して相同であり、このため、ポリペプチドを５ａ型PTP-BASと命名した(図14；配列番号３)。図11に示されるように、５ａ型PTP-BASのアミノ酸配列は、PTP-BAS１型のアミノ酸残基と比較すると、アミノ酸1377-1445を含み、そしてGLGF2(４型PTP-BASと同様にGLGF2中に５つのアミノ酸VLFDKインサートを含む。５ａ型PTP-BASポリペプチド中の残りの24個のC-末端アミノ酸は、タンパク質のPTP-BASファミリー(４型 PTP-BASを含む)の他のメンバーに対して相同ではない(図11参照)。重要なことに、アミノ酸配列は、終止コドン、TGA、(図15中のヌクレオチド4408-4410)により終止する。結果として、５ａ型PTP-BASは、触媒性ホスファターゼドメイン(図11 参照)を含まない。以下に記載するように、ヒト５ａ型PTP-BASは、触媒性ホスファターゼドメインを含まない５型PTP-BASタンパク質のサブファミリーのメンバーである。実施例IV マウス５ｂ型PTP-BASの同定および特徴付けこの実施例は、マウス５ｂ型PTP-BASの同定および特徴付けを記載する。これは、酵母のツーハイブリッドシステムを使用するPTP-BAS型タンパク質のサブファミリーのメンバーである。プラスミドpVP16-31およびpVP16-43からのcDNAインサートを用いて、λ gtll( Clontech)にクローン化したマウス肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングした。マウスFAP、MFAP23(図11)をコードするインサートを含むcDNAクローンを得た。M FAP23の部分ヌクレオチド配列を図17(配列番号６)に、そして推定アミノ酸配列を図16(配列番号５)に示す。図11に示されるように、MFAP23にコードされたアミノ酸配列のN-末端は、ヒト１型PTP-BASタンパク質中のアミノ酸残基1180から始まるPTP-BASのアミノ酸配列と相同である。マウスPTP-BASは、GFLG2、GLGF3、GLGF4およびGLGF5反復を含む。しかし、ヒト５ａ型PTP-BASと同様に、マウス５ｂ型PTP-BASタンパク質は、そのC-末端で分岐し、そして終止コドンにより終止する(図11、16および17を参照のこと)。結果として、マウス５ｂ型PTP-BASは、触媒性ホスファターゼドメインを含まない。従って、マウスPTP-BASは、触媒性ホスファターゼドメインを含まないPTP-BAS5型タンパク質のサブファミリーの他のメンバーの例である。実施例V PTP-BAS 発現はアポトーシスを還元する。この実施例は、アポトーシスのレベルが細胞中のFAP発現と関連することを実証する。A. 抗-Fas抗体−誘発アポトーシスに対する感受性が細胞における内因性PTP-BA S発現に関連する。種々の腫瘍細胞株(SNG-M細胞、Jurket細胞、HepG2細胞、Raji細胞、RS11846細胞、380細胞およびCos7細胞をPTP-BAS発現について試験し、そして抗-Fas抗体に細胞を暴露させて誘発されたアポトーシスに対する細胞株の感受性を測定した。細胞株の全て(Cos7細胞を除く)はFas抗原を発現したが、これは、抗-Fas抗体を用いるフローサイトメトリック免疫蛍光アッセイにより、およびノーザンブロット分析により決定した(図18を参照のこと)。Cos7細胞をFas cDNAを用いてトランスフェクトし、Cos7-Fas細胞を得た。これは、Fas抗原(Oehmら、J ．Biol．Chem. 267:10709-10715(1992)(本明細書中に参考として援用される)を発現した。腫瘍細胞株におけるPTP-BAS mRNAの存在または不存在を、ノーザンブロット分析により測定した。簡潔に記載すると、20μgの全RNAを各細胞株から単離し、電気泳動により分離し、ナイロンフィルターへ移し、そして³²P-標識HFAP10プローブ(実施例IIIを参照のこと)とハイブリダイズさせた。試験した腫瘍細胞株のうちSNG-M、Jurkat、HepG2およびRaji細胞は、検出可能なPTP-BAS mRNAを有さなかったが、これに対してRS11846、380およびCos7細胞は、PTP-BAS mRNAを発現した (図18)。 2×10⁵細胞/mlを１μg／mlの抗-Fas抗体(CH11;MedicalおよびBiological labo ratories:Nagoya Japan)の存在下(+)または不存在下(-)、24時間培養し、そして生存細胞数をトリパンブルー排除法により測定した。図18に示されるように、RS 11846細胞、380細胞およびCos7-Fas細胞(PTP-BAS mRNAを発現する)は抗-Fas抗体により誘発されるアポトーシスに対して完全に抵抗性であった。対照的に、PTP- BAS mRNAを有さない細胞は抗-Fas抗体誘発アポトーシスに対して種々の程度で感受性であった。これらの結果は、細胞中でPTP-BASを発現することにより、Fas- 誘発アポトーシスに対して細胞を相対的に抵抗性にすることを実証する。 B．細胞での外因性ヒト４型PTP-BASの発現がアポトーシスに対する抵抗性を与える完全長ヒト４型PTP-BASタンパク質をコードするcDNAは、λ gtllの胎児脳cDNA ライブラリー(実施例IIIを参照のこと)から得られたDNAを用いた一連の４つの重複するPCR反応により構築した。5'-および3'-隣接プライマーは、Not I部位を含んでおり、これはG418耐性遺伝子(Invitrogen;San Diego CA)を含むpRc/CMV中のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの下流のサブクローン化のために用いられた。内因性PTP-BASの検出可能なレベルを発現しないJurkat細胞(図18を参照のこと)を、25μｇのpRc/CMVまたはpRc/CMV-PTP-BAS4を用いてエレクトロボレーションし、安定なトランスフェクタントがG418選択(0.8mg/ml)により得られ、そして個々のクローンを制限希釈により単離した。クローン化細胞の４型PTP-BASの相対レベルをノーザンブロット分析により測定した(図19参照)。クローン化細胞を50ng/mlの抗-Fas抗体の存在下、または不存在下において４時間、インキュベートし、次いで、TUNELアッセイを用いて分析した。これは、アポトーシスの指標となるDNAフラグメンテーションを測定する(Gorczycaら、Canc.Res.53:1945(1993)、これは本明細書に参考として援用される)。図19に示されるように、抗-Fas抗体−誘発アポトーシスに対する相対的な抵抗性は、クローン化細胞株において発現する４型PTP-BASの量に相関する。さらに、より高いレベルの４型PTP-BASを発現するクローンは、コントロール細胞と比較してより高い抗体の濃度に耐性であり、そしてより長期間、生存した( 示されず)。 C-末端短縮型４型PTP-BASタンパク質をコードするcDNAを、2225位の後に終止コドンを導入することにより生成した。完全鎖または短縮型４型PTP-BASをコードするcDNAをpREP-9(インビトロゲン)にクローン化し、そしてJurkat細胞において発現させ、次いでトランスフェクト細胞を抗-Fas抗体誘発アポトーシスに対する感受性について試験した。短縮型４型PTP-BASタンパク質(触媒性ドメインを有さない)を発現するクローン化細胞はFas-誘発DNA分解から保護されなかった(示されず)。これらの結果は、細胞中のFas-誘発アポトーシスのレベルが、細胞中のPTP-BASの発現により調節され得、かつPTP-BASホスホターゼ活性がこの調節に必要とされることを実証する。本発明は、上記実施例を参照して記載されるが、本発明の精神から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者サトー，タカアキアメリカ合衆国カリフォルニア 92122, サンディエゴ，フローレテラスナンバー211 5240

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に精製された哺乳動物４型ＰＴＰ−ＢＡＳ。２．前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の哺乳動物４型ＰＴＰ−ＢＡＳ。３．図１２のアミノ酸配列（配列番号１）を実質的に含む、請求項２に記載のヒト４型ＰＴＰ−ＢＡＳ。４．抗４型ＰＴＰ−ＢＡＳ抗体。５．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体。６．請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。７．哺乳動物４型ＰＴＰ−ＢＡＳをコードする、実質的に精製された核酸分子。８．前記哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の核酸分子。９．図１３のヌクレオチド配列（配列番号２）を実質的に含む、請求項８に記載の核酸分子。１０．請求項７に記載の核酸分子を含むベクター。１１．請求項１０に記載のベクターを含有する宿主細胞。１２．比較的ストリンジェントな条件下で、請求項７に記載の核酸分子とハイブリダイズする、少なくとも１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列。１３．実質的に精製された哺乳動物５型ＰＴＰ−ＢＡＳ。１４．前記哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の哺乳動物５型ＰＴＰ− ＢＡＳ。１５．図１４に示されるヒト５ａ型ＰＴＰ−ＢＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）を実質的に含む、請求項１４に記載のヒト５型ＰＴＰ−ＢＡＳ。１６．前記哺乳動物がマウスである、請求項１３に記載の哺乳動物５型ＰＴＰ −ＢＡＳ。１７．図１６に示されるマウス５ｂ型ＰＴＰ−ＢＡＳのアミノ酸配列（配列番号５）を実質的に含む、請求項１６に記載の哺乳動物５型ＰＴＰ−ＢＡＳ。１８．抗５型ＰＴＰ−ＢＡＳ抗体。１９．ヒト５ａ型ＰＴＰ−ＢＡＳを結合し得る、請求項１８に記載の抗体。２０．マウス５ｂ型ＰＴＰ−ＢＡＳを結合し得る、請求項１８に記載の抗体。２１．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。２２．請求項２１に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。２３．哺乳動物５型ＰＴＰ−ＢＡＳをコードする、実質的に精製された核酸分子。２４．前記哺乳動物がヒトである、請求項２３に記載の核酸分子。２５．図１５に示される、ヒト５ａ型ＰＴＰ−ＢＡＳをコードするヌクレオチド配列（配列番号４）を実質的に含む、請求項２４に記載の核酸分子。２６．前記哺乳動物がマウスである、請求項２３に記載の核酸分子。２７．図１７に示される、マウス５ｂ型ＰＴＰ−ＢＡＳをコードするヌクレオチド配列（配列番号６）を実質的に含む、請求項２６に記載の核酸分子。２８．請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。２９．請求項２４に記載のベクターを含有する宿主細胞。３０．比較的ストリンジェントな条件下で、請求項２３に記載の核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列。３１．Ｆａｓ会合タンパク質（ＦＡＰ）とＦａｓとの会合を変化させるに有効な薬剤を同定する方法であって、ａ．該ＦＡＰおよび該Ｆａｓを、該ＦＡＰと該Ｆａｓとの会合を可能にする条件下で、該ＦＡＰと該Ｆａｓとの会合を変化させ得ることが推測される薬剤と接触させる工程；およびｂ．該ＦＡＰと該Ｆａｓとの変化した会合を検出する工程であって、該変化した会合が有効な薬剤を同定する、工程、を包含する、方法。３２．前記変化した会合が、レポーター遺伝子の転写活性を測定することによって検出される、請求項３１に記載の方法。３３．前記接触工程がインビトロで行われる、請求項３１に記載の方法。３４．前記接触工程がインビボで行われる、請求項３１に記載の方法。３５．前記接触工程が哺乳動物細胞において行われる、請求項３４に記載の方法。３６．前記接触工程が酵母細胞において行われる、請求項３４に記載の方法。３７．前記ＦＡＰがタンパク質チロシンホスファターゼ−ＢＡＳ（ＰＴＰ−ＢＡＳ）である、請求項３１に記載の方法。３８．前記ＦＡＰが７８,０００ダルトンのグルコースに調節されるタンパク質（ＧＲＰ７８）である、請求項３１に記載の方法。３９．前記有効な薬剤が薬物である、請求項３１に記載の方法。４０．前記有効な薬剤がタンパク質である、請求項３１に記載の方法。４１．前記タンパク質が、触媒活性を欠くＰＴＰ−ＢＡＳである、請求項４０に記載の方法。４２．細胞におけるアポトーシスのレベルを調整する方法であって、ａ．ＰＴＰ−ＢＡＳをコードする核酸分子を、該細胞に導入する工程；およびｂ．該ＰＴＰ−ＢＡＳを該細胞において発現させる工程であって、該ＰＴＰ− ＢＡＳの発現が該細胞におけるアポトーシスを調整する、工程、を包含する、方法。４３．前記ＰＴＰ−ＢＡＳが触媒活性を欠く、請求項４２に記載の方法。４４．細胞におけるアポトーシスのレベルを調整する方法であって、アンチセンスヌクレオチド配列を該細胞に導入する工程を包含し、ここで、該アンチセンスヌクレオチド配列がＰＴＰ−ＢＡＳをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーションが該細胞における該ＰＴＰ−ＢＡＳの発現を減少させるかまたは阻害する、方法。４５．前記核酸がＤＮＡである、請求項４４に記載の方法。４６．前記核酸がＲＮＡである、請求項４４に記載の方法。４７．被験体におけるＦＡＰのレベルの増加または減少によって特徴づけられる病状を診断する方法であって、ａ．該被験体から試験サンプルを得る工程；ｂ．該試験サンプルを、該ＦＡＰを結合し得る試薬と、該試薬と該ＦＡＰとの特異的な結合を可能にする適切な条件下で接触させる工程；およびｃ．該試験サンプルにおける該特異的な結合の量を、コントロールサンプルにおける特異的な結合の量と比較する工程であって、該コントロールサンプルと比較して該試験サンプルにおける該特異的結合の量の増加または減少を病状と診断する、工程を包含する、方法。４８．前記ＦＡＰがＰＴＰ−ＢＡＳである、請求項４７に記載の方法。４９．前記ＦＡＰがＧＲＰ７８である、請求項４７に記載の方法。５０．前記試薬が抗ＦＡＰ抗体である、請求項４７に記載の方法。５１．前記試薬がＦａｓである、請求項４７に記載の方法。５２．細胞におけるアポトーシスのレベルを調整する方法であって、該細胞を、該細胞におけるＦＡＰとＦａｓとの会合を有効に変化させる薬剤と接触させる工程を包含する、方法。５３．細胞におけるアポトーシスのレベルを調整する方法であって、該細胞を、該細胞におけるＦＡＰの活性を有効に変化させる薬剤と接触させる工程を包含する、方法。５４．前記ＦＡＰの活性がＰＴＰ−ＢＡＳの触媒活性である、請求項５３に記載の方法。