CN100429228C - 重组人a20蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因工程重组蛋白，即重组人A20蛋白(recombinanthuman A20，rhA20)。属于基因工程产品及其用途领域。它是将HIV-1 Tat的穿膜结构域和人A20的抗炎功能域融合而成的重组蛋白。本发明还提供了该重组蛋白的氨基酸序列。该重组蛋白具有主动进入哺乳动物细胞、抑制核转录因子NF-κB活性、下调促炎细胞因子表达的功能，适用于治疗临床各种炎症性疾病，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。

Description

重组人A20蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及一种基因工程重组蛋白：重组人A20蛋白，及其用于临床各种炎症相关性疾病的治疗，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。

技术背景

炎症可发生于机体的任何部位和任何组织，适度的炎症反应是机体的一种正常免疫防御机制；过度的炎症反应则会引起组织器官损伤，导致临床炎性疾病的发生。研究发现，体内过度的炎症反应与一种被称为NF-κB的核转录因子过度活化有关。促炎细胞因子、病原微生物感染、组织缺血缺氧、化学毒物损伤、电离辐射损伤等刺激，都可以激活细胞内的NF-κB，活化的NF-κB进入到细胞核内与其相应的DNA序列结合，使促炎细胞因子(TNFα、IL-1、IL-2、IL-6等)、产炎症介质酶类(如NO合成酶、环氧化酶等)、黏附分子(如E选择素、ICAM-1、VCAM-1等)等的表达上调。促炎细胞因子中的TNFα、IL-1等反过来又进一步刺激细胞，通过与他们各自相应的膜受体的结合，引起NF-κB更进一步活化，以至于生成更多的促炎细胞因子……形成炎症的级联放大环，最终引起炎症反应过度，甚至发生失控。此时，体内促炎细胞因子和抑炎细胞因子之间的平衡被破坏，同时伴有免疫机能紊乱发生。因此，抑制过高的NF-κB活性、恢复促炎细胞因子和抑炎细胞因子平衡对于临床炎性疾病的治疗十分重要。

回顾人们曾经使用过的抗炎治疗药物，其中的糖皮质激素虽然是NF-κB活性的有效抑制物，但是副作用大；抗氧化剂类，如乙酰半胱氨酸，对NF-κB活性的抑制作用较弱且效果不确定；阿司匹林和水杨酸钠虽然也可以抑制NF-κB活化，但是发挥作用必须使用异常高的浓度；天然抑制物如曲霉来源的glyotoxin对人的毒性太大。人们曾经用抗TNFα抗体、IL-1受体拮抗剂等生物工程产品进行治疗，都未能得到明显的治疗效果。美国礼来公司近期推出的重组人活化蛋白C虽然具有明显的抗炎特性，但是同时也是一种强效抗凝物质，可以引起严重的出血并发症如颅内出血等，因此其临床应用受到很大的局限。总之，开发新型抗炎药物仍然是人们面对的挑战之一。

1990年人们发现了A20蛋白，近年的研究结果证实：A20是一种体内组织细胞NF-κB活化后合成的一种C2/C2型锌指蛋白。各种炎症诱发因素刺激细胞，细胞都可以表达A20。A20表达后存在于细胞浆中，通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方式抑制NF-κB活性，导致体内促炎细胞因子TNFα、IL-1、IL-6等表达的下调、以及介导细胞炎症反应的关键性膜受体TLR4表达的下调。由于A20表达后及时下调了TNFα水平，对过高TNFα引起的组织细胞凋亡呈现出保护性效果。目前已经证实，A20的表达见于临床脓毒血症、类风湿性关节炎、炎性肠病、慢性肝炎、糖尿病、动脉粥样硬化等多种炎症性疾病，在这些疾病中，A20的表达与炎症抑制和炎症时的组织细胞内源性保护有关。因此，开发基于人A20蛋白氨基酸序列的炎症治疗性基因工程药物，具有特异、高效的特点。

遗憾的是，A20蛋白为胞浆蛋白，无论是从动物组织中直接分离得到的A20蛋白，还是采用原核表达和/或真核表达获得的人A20蛋白，都不能进入细胞，也就无法实现其抗炎作用。为了克服天然人A20的上述缺点，我们设想通过对天然人A20蛋白的改造，赋予其能够进入细胞并发挥抗炎作用的能力。

HIV-1 Tat蛋白是HIV-1的转录活化因子，含86～102个氨基酸残基，将Tat蛋白作为爱滋病预防和治疗性接种疫苗的研究已有报道(用于预防和治疗接种的HIV-1 TAT或其衍生物，申请号98812496.3)。研究发现，HIV-1Tat蛋白有一个碱性区域，是介导HIV-1进入细胞的关键，其中第49位～57位氨基酸是介导HIV-1进入细胞的最小单元——称HIV-1 Tat的穿膜结构域。因此，我们设想：将HIV-1 Tat蛋白穿膜结构域与人A20抗炎功能域，通过基因工程操作进行融合，希望得到一个能够主动进入细胞同时兼有人A20蛋白抗炎功能的重组人A20蛋白，用于临床炎症性疾病的治疗，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够进入细胞、抑制细胞NF-κB活性、下调促炎细胞因子表达的重组人A20蛋白，单独或作为一种组分用于治疗临床炎症性疾病，尤其是全身性失控性炎症的治疗。

本发明的另一个目的是提供该重组蛋白的氨基酸序列。

本发明的再一个目的是提供了该重组蛋白单独或作为一种组分在临床炎症性疾病治疗，尤其是在全身性失控性炎症治疗中的用途。

本发明提供的重组人A20蛋白，HIV Tat蛋白穿膜结构域位于其氨末端，人A20抗炎功能域位于其羧末端，两者之间由一个连接肽将它们连接起来，以确保两者翻译后的正确折叠。该重组蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，分子量为93kD。

SEQ ID NO：1

1     Y    V    R    K    K    R    R    Q    R    R    R    S    G    G    S    15

16    G    S    G    G    G    G    E    F    V    L    P    Q    A    L    Y    30

31    L    S    N    M    R    K    A    V    K    I    R    E    R    T    P    45

46    E    D    I    F    K    P    T    N    G    I    I    H    H    F    K    60

61    T    M    H    R    Y    T    L    E    M    F    R    T    C    Q    F    75

76    C    P    Q    F    R    E    I    I    H    K    A    L    I    D    R    90

91    N    I    Q    A    T    L    E    S    Q    K    K    L    N    W    C    105

106   R    E    V    R    K    L    V    A    L    K    T    N    G    D    G    120

121   N    C    L    M    H    A    T    S    Q    Y    M    W    G    V    Q    135

136   D    T    D    L    V    L    R    K    A    L    F    S    T    L    K    150

151   E    T    D    T    R    N    F    K    F    R    W    Q    L    E    S    165

166   L    K    S    Q    E    F    V    E    T    G    L    C    Y    D    T    180

181   R    N    W    N    D    E    W    D    N    L    I    K    M    A    S    195

196   T    D    T    P    M    A    R    S    G    L    Q    Y    N    S    L    210

211   E    E    I    H    I    F    V    L    C    N    I    L    R    R    P    225

226   I    I    V    I    S    D    K    M    L    R    S    L    E    S    G    240

241   S    N    F    A    P    L    K    V    G    G    I    Y    L    P    L    255

256   H    W    P    A    Q    E    C    Y    R    Y    P    I    V    L    G    270

271   Y    D    S    H    H    F    V    P    L    V    T    L    K    D    S    285

286   G    P    E    I    R    A    V    P    L    V    N    R    D    R    G    300

301   R    F    E    D    L    K    V    H    F    L    T    D    P    E    N    315

316   E    M    K    E    K    L    L    K    E    Y    L    M    V    I    E    330

331   I    P    V    Q    G    W    D    H    G    T    T    H    L    I    N    345

346   A    A    K    L    D    E    A    N    L    P    K    E    I    N    L    360

361   V    D    D    Y    F    E    L    V    Q    H    E    Y    K    K    W    375

376   Q    E    N    S    E    Q    G    R    R    E    G    H    A    Q    N    390

391   P    M    E    P    S    V    P    Q    L    S    L    M    D    V    K    405

406   C    E    T    P    N    C    P    F    F    M    S    V    N    T    Q    420

421   P    L    C    H    E    C    S    E    R    R    Q    K    N    Q    N    435

436   K    L    P    K    L    N    S    K    P    G    P    E    G    L    P    450

451   G    M    A    L    G    A    S    R    G    E    A    Y    E    P    L    465

466   A    W    N    P    E    E    S    T    G    G    P    H    S    A    P    480

481   P    T    A    P    S    P    F    L    F    S    E    T    T    A    M    495

496   K    C    R    S    P    G    C    P    F    T    L    N    V    Q    H    510

511   N    G    F    C    E    R    C    H    N    A    R    Q    L    H    A    525

526   S    H    A    P    D    H    T    R    H    L    D    P    G    K    C    540

541   Q    A    C    L    Q    D    V    T    R    T    F    N    G    I    C    555

556   S    T    C    F    K    R    T    T    A    E    A    S    S    S    L    570

571   S    T    S    L    P    P    S    C    H    Q    R    S    K    S    D    585

586   P    S    R    L    V    R    S    P    S    P    H    S    C    H    R    600

601   A    G    N    D    A    P    A    G    C    L    S    Q    A    A    R    615

616    T    P    G    D    R    T    G    T    S    K    C    R    K    A    G    630

631    C    V    Y    F    G    T    P    E    N    K    G    F    C    T    L    645

646    C    F    I    E    Y    R    E    N    K    H    F    A    A    A    S    660

661    G    K    V    S    P    T    A    S    R    F    Q    N    T    I    P    675

676    C    L    G    R    E    C    G    T    L    G    S    T    M    F    E    690

691    G    Y    C    Q    K    C    F    I    E    A    Q    N    Q    R    F    705

706    H    E    A    K    R    T    E    E    Q    L    R    S    S    Q    R    720

721    R    D    V    P    R    T    T    Q    S    T    S    R    P    K    C    735

736    A    R    A    S    C    K    N    I    L    A    C    R    S    E    E    750

751    L    C    M    E    C    Q    H    P    N    Q    R    M    G    P    G    765

766    A    H    R    G    E    P    A    P    E    D    P    P    K    Q    R    780

781    C    R    A    P    A    C    D    H    F    G    N    A    K    C    N    795

796    G    Y    C    N    E    C    F    Q    F    K    Q    M    Y    G         809

本发明提供的重组蛋白也可以是至少具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其分子量可以小到只有28kD。

SEQ ID NO：2

1      Y     V    R    K    K    R    R    Q    R    R    R    S    G    G    S    15

16     G     S    G    G    G    G    E    F    V    R    S    P    S    P    H    30

31     S     C    H    R    A    G    N    D    A    P    A    G    C    L    S    45

46     Q     A    A    R    T    P    G    D    R    T    G    T    S    K    C    60

61     R     K    A    G    C    V    Y    F    G    T    P    E    N    K    G    75

76     F     C    T    L    C    F    I    E    Y    R    E    N    K    H    F    90

91     A     A    A    S    G    K    V    S    P    T    A    S    R    F    Q    105

106    N     T    I    P    C    L    G    R    E    C    G    T    L    G    S    120

121    T     M    F    E    G    Y    C    Q    K    C    F    I    E    A    Q    135

136    N     Q    R    F    H    E    A    K    R    T    E    E    Q    L    R    150

151    S     S    Q    R    R    D    V    P    R    T    T    Q    S    T    S    165

166    R     P    K    C    A    R    A    S    C    K    N    I    L    A    C    180

181    R     S    E    E    L    C    M    E    C    Q    H    P    N    Q    R    195

196    M     G    P    G    A    H    R    G    E    P    A    P    E    D    P    210

211    P     K    Q    R    C    R    A    P    A    C    D    H    F    G    N    225

226    A     K    C    N    G    Y    C    N    E    C    F    Q    F    K    Q    240

241    M     Y    G                                                                243

该重组蛋白加入到细胞培养瓶后，可以自动进入到哺乳动物细胞内，明显抑制核转录因子NF-κB的活性，下调促炎细胞因子(如TNFα、IL-1β)的表达，关闭细胞的炎症反应应答；该重组蛋白注射入炎症动物模型体内后，可以下调实验动物血液中的TNFα、IL-1β、IL-6水平，达到对实验动物过度炎症反应应答的干预目的，可以单独或作为一种组分用于各种炎症性疾病的治疗，尤其是全身性失控性炎症反应的治疗。

发明的用途

单独或作为一种组分用于临床各种炎症性疾病的治疗，尤其是全身性失控性炎症的治疗。

发明的特点

本发明是将HIV-1 Tat的穿膜结构域与人A20蛋白的抗炎功能域进行融合得到的一种重组人A20蛋白，为了确保HIV-1 Tat穿膜结构域的穿膜功能和人A20抗炎功能域的抗炎功能，不因为基因的串联造成翻译后蛋白质空间折叠上的改变而丧失它们各自天然空间折叠所赋予的生物学活性，我们在HIV-1 Tat穿膜结构域和人A20抗炎功能域之间设计了一个连接肽，该连接肽使重组人A20蛋白的穿膜结构域和A20抗炎功能域分别具有正确的空间折叠形式，从而同时兼有了进入哺乳动物细胞的功能和抑制NF-κB活性的功能，成为可单独或做为一种组分用于临床炎性疾病，尤其是全身性失控性炎症反应救治的治疗性药物。

附图说明

本发明通过实施例进一步说明，实施例包括如下附图：

附图1HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体阳性克隆的菌落PCR快速筛选电泳图

附图2HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体插入序列测序结果

附图3TOPO-hA20质粒EcoRI酶切物0.8％琼脂糖凝胶电泳图

附图4重组人A20毕赤酵母表达载体阳性克隆的菌落PCR快速筛选电泳图

附图5重组人A20毕赤酵母表达载体hA20基因正向插入载体筛选的1％琼脂糖凝胶电泳结果

附图6重组人A20毕赤酵母表达载体基因测序结果

附图7YPD-G418梯度平板筛选GS115重组人A20基因高整合菌株

附图8重组人A20基因在毕赤酵母GS115基因组中整合的PCR快速鉴定

附图9重组人A20蛋白毕赤酵母诱导表达上清液SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果

附图10重组人A20蛋白毕赤酵母诱导表达上清液Western Blot结果

附图11毕赤酵母GS115表达重组人A20蛋白的时间-产量关系

附图12超滤纯化重组人A20蛋白的SDS-PAEG电泳凝胶之考马斯亮兰染色结果

附图13超滤纯化重组人A20蛋白的Western Blot结果

附图14重组人A20蛋白穿膜活性鉴定结果

附图15重组人A20蛋白对细胞LPS应答时NF-κB活性的调节

附图16重组人A20蛋白对细胞LPS应答时TNFα和IL-1β表达的调节

附图17重组人A20蛋白对脓毒症大鼠血液TNFα、IL-1β、IL-6水平的调节

参见图1，该图反映HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体阳性克隆的菌落PCR快速筛选电泳结果。其中M是DNA Marker DL2000；1到5是LB平板上生出来的不同菌落。

参见图2，该图反映HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体插入序列测序结果。

参见图3，该图反映TOPO-hA20 EcoR I酶切物0.8％琼脂糖凝胶电泳结果。图中：1为TOPO-hA20；2为TOPO-hA20之EcoR I酶切物；3为DNA Marker DL15000/2000。

参见图4，该图反映重组人A20毕赤酵母表达载体阳性克隆的菌落PCR快速筛选结果(1.2％琼脂糖凝胶电泳)。图中：M为DNA Marker DL1 5000/DL 2000；1到12为LB平板上生出的不同菌落；其中1、7、8、9为阳性克隆。

参见附图5，该图反映重组人A20毕赤酵母表达载体hA20基因正向插入载体筛选的1％琼脂糖凝胶电泳结果。图中：M为λ-EcoT14 I消化的DNAMarker；C1到C6为不同阳性克隆来源的质粒。其中C3和C5为hA20基因正向插入的重组人A20毕赤酵母表达载体。

参见附图7，附图反映是YPD-G418梯度平板筛选GS115重组人A20基因高整合菌株。图中：从1到7依次是含0、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0mg/ml G418的YPD平板。

参见附图8，附图反映重组人A20基因在毕赤酵母GS115基因组中整合的PCR快速鉴定。图中1到13为不同的YPD-G418筛选菌株；14为阴性对照；M为DNA markerλ-EcoT14 I片段。

附图9反映重组人A20蛋白毕赤酵母诱导表达上清液SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。图中：M是蛋白质分子量标准品；1是GS 115诱导培养液；2是HIV-1 Tat-连接肽基因整合GS115诱导培养液；3～7是重组人A20基因整合GS115诱导第1天～诱导第7天的培养液。

附图10反映重组人A20蛋白毕赤酵母诱导表达上清液Western Blot结果。图中：M是蛋白质分子量标准品；1是GS115诱导培养液；2是HIV-1Tat-连接肽基因整合GS115诱导培养液；3～7是重组人A20基因整合GS115诱导第1天～诱导第7天的培养液。

图11反映毕赤酵母GS115表达重组人A20蛋白的时间-产量关系。图中：1为GS115诱导培养液；2是HIV-1 Tat-连接肽基因整合GS115诱导培养液；3～7是重组人A20基因整合GS115诱导第1天～诱导第7天的培养液。

图12反映超滤纯化重组人A20蛋白的SDS-PAEG电泳凝胶之考马斯亮兰染色结果。图中：M为蛋白质分子量标准品；1为GS115诱导培养液；2是HIV-1 Tat-连接肽基因整合GS115诱导培养液；3是超滤纯化的重组人A20。

图13反映超滤纯化重组人A20蛋白的Western Blot结果。图中：M为蛋白质分子量标准品；1为GS115诱导培养液；2是HIV-1 Tat-连接肽基因整合GS115诱导培养液；3是超滤纯化的重组人A20。

图14反映重组人A20蛋白穿膜活性鉴定结果。图中：A为加入对照液孵育的THP1细胞，B为加入FITC标记rhA20液孵育的THP1细胞。

图15反映重组人A20蛋白对细胞LPS应答时NF-κB活性的调节。图中：1：阴性对照组；2：LPS处理对照组；3：1ng/ml重组入A20治疗组；4：10ng/ml重组人A20治疗组；5：100ng/ml重组人A20治疗组；6：1μg/m重组人A20治疗组；7：10μg/ml.重组人A20治疗组。

图16反映重组人A20蛋白对细胞LPS应答时TNFα和IL-1β表达的调节。图中：1：阴性对照组；2：LPS处理对照组；3：1ng/ml重组人A20治疗组；4：10ng/ml重组人A20治疗组；5：100ng/ml重组人A20治疗组；6：1μg/m重组人A20治疗组；7：10μg/ml.重组人A20治疗组。

图17反映重组人A20蛋白对脓毒症大鼠血液TNFα、IL-1β和IL-6水平的调节。

具体实施方式

实施例1

HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体的构建

EcoRI/SnaBI消化HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽DNA片段的准备：

人工合成HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽基因的正义链DNA(5′cgacgTACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAAGCGGAGGATCGGGTAGCGGAGGAGGAGGAGAATTCGTCCGGagc3′，83bp)和反义链DNA(5′gctCCGGACGAATTCTCCTCCTCCTCCGCTACCCGATCCTCCGCTTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTTACGTAcgtcg3′，83bp)，用灭菌纯水将它们配制成200μmol/L，1∶1混合后，95℃变性10分钟，立即插入冰浴冷却10分钟，取出投入55℃退火15分钟。取经过变性退火的反应液170μl，加入15u/μl的EcoRI 10.0μl，加入10×H Buffer 20μl，混均匀，37℃水浴4小时，65℃20分钟。用Omega PCR产物纯化试剂盒回收DNA，并将回收DNA溶于85μl灭菌纯水中。继续加入5u/μl的SnaBI 5.0μl，10×SEB Buffer B 10μl，混均匀，继续37℃水浴4小时，65℃20分钟，并用Omega PCR产物纯化试剂盒回收DNA于30μl灭菌纯水中，为准备好的试剂A。

EcoRI/SnaBI开环pPIC9K质粒的准备：

取pPIC9K质粒(购于Invitrogen Co.)20μg，加入5u/μl的SnaBI 4.0μl，10×SEB Buffer B 10μl，以灭菌纯水补足100μl体积，混均匀，37℃水浴4小时，65℃20分钟，用OmegaPCR产物纯化试剂盒回收DNA于86μl灭菌纯水中。继续加入15u/μl的EcoRI 4.0μl，加入10×H Buffer 10μl，混均匀，37℃水浴4小时，65℃20分钟，用Omega PCR产物纯化试剂盒回收DNA于50μl灭菌纯水中，为准备好的试剂B。

EcoRI/SnaBI开环pPIC9K质粒和EcoRI/SnaBI消化HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽DNA片段的连接反应和阳性克隆的快速筛选：

取试剂A4.5μl，试剂B0.5μl，加入Solution I(购于TaKaRa Co.)5.0μl，混均匀，16℃4小时。加入50μl的大肠杆菌JM109(ATCC购置)的感受态细胞，混均匀，冰浴30分钟，42℃90秒，立即加入37℃预热的LB液体培养基500μl，在37℃摇床上轻轻震荡培养1小时，接种含氨苄青霉素mg/ml的LB平板，37℃培养过夜。次日，平板上生出一些菌落，挑菌落少许于10μl灭菌纯水中，煮沸15分钟，10000rpm离心5分钟。取上清液1.0μl，加入合成的PCR引物P1(5′tat tat tgc cag cat tgc tgc3′，21bp)0.5μl，加入合成的PCR引物P2(5′gca aat ggc att ctg aca tcc3′，21bp)0.5μl，再按照试剂盒说明书加入通用的PCR试剂(购于TaKaRa Co.)。94℃5分钟，进入94℃45秒→55℃45秒→72℃45秒的热循环，共循环30次，最后72℃4分钟。吸取2μl进行3.5％的琼脂糖凝胶电泳，扫描结果见附图1，提示Lane3是我们希望得到的253bp的扩增片段。

挑取少许Lane3对应的菌落于25ml的LB液体培养基中，37℃摇床上震荡培养过夜，取0.5ml菌液送上海申能博彩生物技术公司测序，其余菌液用Omega Co.质粒提取试剂盒提取质粒DNA备用。测序结果见附图2，证实插入序列与设计序列完全一致。

实施例2

重组人A20蛋白毕赤酵母表达载体的构建

EcoRI开环HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体的准备：

取HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体15μg，加入15u/μl的EcoRI 4.0μl，加入10×H Buffer 10μl，用灭菌纯水补足100μl，混均匀，37℃水浴4小时，65℃20分钟。用Omega PCR产物纯化试剂盒回收DNA，并将回收DNA溶于88μl灭菌纯水中。继续加入10×碱性磷酸酶缓冲液10μl，10～30u/μl的碱性磷酸酶(购于TaKaRa Co.)2μl，37℃水浴30分钟，再补加碱性磷酸酶1μl，继续37℃水浴30分钟。加入灭菌纯水200μl，加入Tris饱和酚150μl，24∶1的氯仿/异戊醇150μl，充分混均匀，室温1000rpm离心2分钟。转移水相，再重复抽提一次。转移水相，乙醇沉淀法将DNA浓缩到10μl灭菌纯水中，为试剂C。

EcoRI修饰hA20抗炎功能域DNA片段的准备：

取TOPO-hA20质粒30μg(TOPO-hA20质粒的构建方法见文献：吴丽娟等.人锌指蛋白A20 ORF的克隆.第三军医大学学报，2004；26(8)：658-662)，加入15u/μl的EcoRI 9.0μl，加入10×H Buffer 20μl，用灭菌纯水补足200μl，混均匀，37℃水浴4小时，65℃20分钟。将全部反应液做0.8％琼脂糖凝胶电泳(电泳结果的见附图3)，用TakaRa琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收2.4kb的目的片段，并将回收DNA溶于30μl灭菌纯水中，为试剂D。

EcoRI开环HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体和EcoRI修饰hA20抗炎功能域DNA片段的连接与阳性克隆的快速筛选：

取试剂C 0.5μl，试剂D 4.5μl，加入Solution I(购于TaKaRa Co.)5.0μl，混均匀，16℃4小时。转化大肠杆菌JM109感受态细胞及阳性克隆的菌落PCR快速筛选方法同“HIV-1 Tat穿膜结构域-连接肽毕赤酵母表达载体的构建”的相应部分。重组人A20毕赤酵母表达载体阳性克隆的菌落PCR快速筛选结果见附图4。其中的第1、第7、第8、第9泳道对应的克隆为阳性目标克隆。

重组人A20毕赤酵母表达载体hA20基因正向插入载体的筛选：

取菌落PCR鉴定得到的阳性克隆少许，放大培养后，用TaKaRa质粒提取试剂盒提取质粒。取质粒各500ng，加入10u/μl SacI 0.5μl，10×SEBBuffre G 1μl，以灭菌纯水补足10μl。37℃2小时，做1％琼脂糖凝胶电泳，结果见附图5。其中的C3和C5为hA20基因正向插入的目标重组人A20毕赤酵母表达载体。选择C3进行测序，结果见附图6-1～附图6-5，测序结果证实重组人A20基因序列与我们的设计完全一致。

实施例3

重组人A20基因在毕赤酵母GS115菌株基因组中的整合

线性化重组人A20毕赤酵母表达载体基因的准备：

取C3质粒5μg，用SalI或BglII进行消化，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次，转移水相，乙醇沉淀法浓缩DNA于5μl灭菌纯水中。

毕赤酵母GS115感受态细胞的制备：

采用山梨醇法，具体方法参见Invitrogen Co.试剂盒说明书进行。

电转化与阳性克隆的筛选：

取50μl GS115感受态细胞，加入线性化重组人A20毕赤酵母表达载体3μg，混均匀后转入冰提前冷却的电转化杯中，使用Bio-Rad Gene Pulser(购于美国BioRad公司)，用1500V 25μF 200Ω条件进行转化，立即接种His-营养缺陷平板(制作方法参见Invitrogen Co.试剂盒说明书)，30℃培养5～6天。加入1ml的YPD液体培养基(配制方法参见Invitrogen Co.试剂盒说明书)，以推杆碾下菌细胞，将碾下的菌细胞吸入1.5ml离心管中，彻底震荡，打散菌细胞，用分光光度计测OD₆₀₀，将其调至约10⁶个/ml的密度，按每个平板接种100μl菌液依次接种YPD-G418梯度平板(G418梯度包括0，1，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0mg/ml，制作方法参见Invitrogen Co.试剂盒说明书)，28～30℃孵箱培养3～5天，菌落生长情况见附图7。如附图7所示，在无G418的YPD平板和含1mg/mlG418的YPD平板上细菌生长旺盛，铺满了整个平板。在含2.0mg/ml及以上G418的YPD平板上长出单个高拷贝菌落。

实施例4

重组人A20基因在毕赤酵母GS115基因组中整合的PCR鉴定

模板DNA的制备：

分别挑取适量的毕赤酵母阳性转化子单个菌落于5ml YPD中，28～30℃250rpm培养2～3天，将OD₆₀₀调至0.5，取1.5ml菌液用酵母基因组提取试剂盒(购于上海申能博彩生物科技公司)提取全基因组DNA，具体方法见试剂盒说明书。

PCR：

按50μl总体积预混PCR反应体系：5u/l TaKaRa Taq 0.25μl，10×PCRBuffer(Mg²⁺ Free)5.0μl，25mmol/L MgCl₂ 3.0μl，dNTPs Mixture(each2.5mmol/L)4.0μl，20μmol/L引物P1(同前)1.0μl，20μmol/L引物P2(同前)1.0μl，灭菌纯水30.75μl。混匀，9μl/支进行分装，插于冰浴中。在每支中分别加入相应酵母基因组模板DNA各1.0μl。热启动94℃2min；进入变性94℃1分钟、退火55℃1分钟，延伸72℃1分钟的热循环，共重复扩增30次；最后72℃继续延伸4min。取1μlPCR产物做0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果见附图8，其中第1～第3、第6～第7、第11～第13号菌株证实整合了重组人A20基因。

实施例5

重组人A20的甲醇诱导表达

将阳性菌株单克隆接种于盛有10ml BMGY培养基(成分为1％ YeastExtract/2％ Peptone/100mmol/L pH6.0磷酸盐缓冲液/1.34％YNB/4×10^-5Biotin/1％ Glycerol，配制方法参见Invitrogen Co.试剂盒说明书)的100ml三角烧瓶中，30℃，250～300rpm振摇培养16～18小时。将菌液转入盛有10ml BMGY培养基(成分为1％ Yeast Extract/2％ Peptone/100mmol/L pH6.0磷酸盐缓冲液/1.34％YNB/4×10^-5 Biotin/0.5％ Methanol，配制方法参见Invitrogen Co.试剂盒说明书)的100ml三角烧瓶中，继续30℃ 250～300rpm振摇培养6～8小时，使菌体数呈指数上升，室温2000×g离心5分钟收集菌体，重悬菌细胞于盛有10ml BMMY培养基的100ml三角烧瓶中，继续30℃振摇培养24小时。加入终浓度为0.5％的甲醇，继续诱导培养6天。每天补充甲醇1次，每次10μl。室温2000×g离心10分钟，收集酵母培养液。

实施例6

毕赤酵母表达重组人A20的鉴定

9％SDS-PAGE电泳：

具体方法及试剂配制参见金冬雁、黎孟枫译《分子克隆实验指南》(第二版)第888页897页，选择5％的积层胶/9％的分离胶。将样品(酵母诱导培养液)与上样缓冲液按照4∶1的比例进行混合，沸水浴中加热10分钟，立即插入冰浴冷却。点样时，每孔加入的总体积20～30μl。电泳时积层胶电压50v，时间约1h，待染料前沿进入分离胶后，电压改为80v，电泳约3h，直至溴酚蓝到达分离胶底部后关闭电源。电泳结束后，取下电泳玻璃板和凝胶，用三蒸水洗涤凝胶表面，将一块凝胶用于考马斯亮蓝染色，另一块用于Western Bot。

考马斯亮蓝染色：

用5倍体积的考马斯亮蓝R250染色染浸泡SDS-PAGE胶，放于摇床上RT缓慢旋转染色1～2h。换掉染色液，用甲醇/醋酸脱色溶液浸泡凝胶，缓慢摇动24h进行脱色，期间需换脱色液2～3次，直到条带满意为止。将脱色后的凝胶扫描，结果见附图9，全长重组蛋白的百分含量从第1天～第7天分别达到0.1％、0.3％、0.5％、0.9％、1.1％、0.8％和0.6％。

蛋白质的Westerb Blot：

具体方法及试剂配制参见金冬雁、黎孟枫译《分子克隆实验指南》(第二版)第888页897页。电压15V，过夜转膜。先用丽春红S染色以标出蛋白质分子量标准品的参照位置，再进行封闭。一抗为小鼠抗人A20IgG1单克隆抗体(购于美国Active Motif公司)，稀释比例1∶2000。二抗为生物素化山羊抗小鼠IgG(Genex产品，北京鼎国生物科技公司分装)，稀释比例1∶2000。三抗为链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(Genex产品，北京鼎国生物科技公司分装)，稀释比例1∶1000。显色反应使用AP-NBT/BCIP显色系统，用凝胶成像系统扫描NC膜，结果见附图10，在93kD附近有目标全长重组人A20蛋白条带。

全长重组人A20蛋白表达量测算：

全长重组人A20蛋白表达量＝用全长重组人A20蛋白表达的百分含量×相应上清液的总蛋白含量。上清液的总蛋白含量用BCA蛋白质定量法进行测定。(BCA蛋白质定量试剂盒购于上海申能博彩生物科技公司，详细方法参见试剂盒说明书。)结果诱导的第一天、第二天、第三天、第四天、第五天、第六天和第七天全长rhA20的分泌量分别达到1.74±0.06、5.40±0.19、9.08±0.30、16.95±0.36、22.84±0.17、15.79±0.65和13.22±1.13μg/ml，统计图见附图11。

实施例7

重组人A20蛋白的超滤纯化及鉴定

超滤纯化：

超滤时，先用300K规格的超滤杯(美国Pall-Gelman产品，购于北方同正公司重庆分公司)过滤离心以去除100kD及以上大小的蛋白质，收集滤过液，重复过滤5次，每次使用新的过滤杯。换用30K规格的超滤杯继续过滤离心，收集未滤过液体，加入灭菌的去离子水进行一定稀释，再换新超滤杯离心，共离心5次。之后，换用60K规格的超滤杯继续过滤离心，仍然收集未滤过液体，加入灭菌的去离子水进行一定稀释，再同法离心1次。经过上述30K和60K规格超滤杯离心过滤后，收集的未滤过液体中90kD以下大小的蛋白质及盐类被除去，样品杯中的残流液即为纯化产物。上述处理的详细操作步骤参见Pall-Gelman超滤杯使用说明书。

9％SDS-PAGE：

方法同前述，结果见附图12。如附图12所示，超率物电泳后仅剩下约93kD大小的单一目标蛋白条带。

Western Blot：

电转方法同前述，抗原抗体反应时二抗为辣根过氧(化)物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Genex产品，北京鼎国生物科技公司分装)，稀释比例1∶20000，使用化学发光显色系统(购于PIERCE)，凝胶成像系统采集发光信号，结果见附图13。附图13表明：超率物电泳所示约93kD大小的蛋白条带是重组人A20蛋白。

实施例8

重组人A20穿膜活性鉴定

重组人A20的FITC标记：

用pH9.5的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液对纯化的重组人A20进行透析，加入DMSO溶解的FITC(即异硫氰酸荧光素，为Sigma产品)，4℃反应16小时，用Sephadex G50纯化FITC偶联物。详细方法参见Masseyeff RF，etal.Methods of Immunological Analysis Volumes.Germarry：VCHVerlagagesellschatt MBH Weinheim(Federal Republic)，1993；237-238。

黏附剂处理玻片的准备：

玻片按常规洗净，烘干。用丙酮将APES(Sigma产品)稀释50倍，将玻浸入稀释APES中并停留30秒。取出玻片，将之放入蒸馏水中洗去表面上没有结合的游离APES，放通风处凉干即可。

穿膜实验：

将人单核细胞株THP1悬浮于含10％FCS的RPMI1640培养基中，37℃5％CO₂条件下培养，2～3天换液传代一次。实验前一天，将稳定培养的THP1细胞换液，37℃ 5％ CO₂培养过夜。800rpm离心5分钟收集细胞，用含10％FCS的RPMI-1640培养液(Hyclone产品)重悬细胞，调细胞浓度至1×10⁸/ml。取2只洗净灭菌的青霉素小瓶，各加入1ml的细胞悬浮液，向其中的1只中加入FITC标记的重组人A20蛋白100μl(100ng)，另1只加入GS115诱导培养第5天上清液经过超滤纯化和FITC标记同法处理收集液(即对照)100μl，立即放回CO₂培养箱，37℃ 5％ CO₂培养40分钟。加入8ml生理盐水，800rpmin离心5min洗涤细胞，重复洗涤2次，重悬细胞于1ml RPMI1640培养基中，取1滴细胞悬液滴加在APES处理玻片上，轻轻赶开，凉干后用在德国Leica激光共聚焦扫描仪上进行检查。结果见附图14(其中A为阴性对照)，在附图14A中无荧光信号，无法显示出细胞的轮廓；而附图14B中有明亮的黄绿色荧光信号，细胞形态清晰，在细胞核部分荧光信号有明显的减弱。上述结果提示：重组人A20能够进入到细胞内，主要分布在细胞质中。

实施例9

重组人A20对炎性细胞炎症应答的干预作用

细胞实验：

实验前一天对稳定培养的人单核细胞株THP1细胞进行一次换液传代，次日离心收集细胞并用生理盐水洗涤2次，用RPMI1640培养液重悬细胞并测定细胞浓度。实验分阴性对照组、LPS处理对照组和rhA20治疗组进行，rhA20治疗组分1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml五个不同的浓度点。向各组各浓度点培养瓶中加入3ml的10％FCS-RPMI1640培养基，4.5×10⁶的THP1细胞。向LPS处理对照组和rhA20治疗组各培养瓶中加入终浓度为10ng/ml的LPS。37℃ 5％ CO₂条件培养30分钟后，  向rhA20治疗组各培养瓶加入规定终浓度的纯化rhA20。继续37℃ 5％ CO₂培养6小时，离心分别收集细胞和上清液。

核蛋白的提取：

采用核蛋白提取试剂盒(PIERCE公司产品)提取细胞样品中的核蛋白，详细方法参见试剂盒说明书。

NF-κB活性测定：

采用NF-κB活性检测试剂盒(Active motif公司产品)测定核蛋白中的NF-κB活性，详细方法参见试剂盒说明书，实验结果见附图15。阴性对照组、LPS处理对照组、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml和10μg/ml重组人A20治疗组，反映THP1细胞NF-κ B活性水平的OD_450/660值分别为0.09±0.02、0.48±0.05、0.44±0.02、0.41±0.05、0.30±0.06、0.10±0.01和0.09±0.03，可见加入不同浓度的重组人A20后，THP1细胞NF-κB活性在不同程度上都有所降低。将阴性对照组、各重组人A20治疗组依次与LPS处理对照组进行比较，t检验结果显示：在阴性对照组与LPS处理对照组之间NF-κB活性存在极显著性差别，P＜0.01，说明细胞功能状态满意；加入1ng/ml、10ng/ml重组人A20后，THP1细胞NF-κB活性都有所下降，但下降程度与LPS处理对照组之间无显著性差别，P值分别为0.3713和0.3276，即全部P＞0.05；加入100ng/ml重组人A20后，THP1细胞NF-κB活性下降程度与LPS处理对照组之间存在显著性差别，P＝0.0116，即P＜0.05。加入1μg/ml和10μg/ml重组人A20后，THP1细胞NF-κB活性下降程度与LPS处理对照组之间存在极显著性差别，P值分别为0.0066和0.0018，P＜0.01。上述结果表明：1ng/ml～10μg/ml的重组人A20对LPS激活THP1细胞NF-κB有不同程度的抑制效果且存在剂量依赖性特点，其中以加入微克级重组人A20效果更明显。

TNFα水平的ELISA分析：

采用TNFαELISA试剂盒(JINGMEI BIOTECH产品)测定上清液中的TNFα水平，具体方法按说明书进行，实验结果见附图16。阴性对照组、LPS处理对照组、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的重组人A20治疗组，THP1细胞合成并分泌到培养液中的TNFα分别为28.15±10.77、541.37±75.50、508.20±81.03、418.72±49.39、212.13±38.86、103.05±33.53和99.78±30.22pg/ml，提示加入不同浓度的重组人A20后，THP1细胞合成和分泌的TNFα在不同程度上都有所降低。将阴性对照组、各重组人A20治疗组依次与LPS处理对照组进行比较，t检验结果显示：在阴性对照组与LPS处理对照组之间TNFα水平存在极显著性差别，P＜0.01，说明细胞功能状态满意；1ng/ml、10ng/ml重组人A20治疗组与LPS处理对照组之间TNFα水平没有显著性差别，P值分别为0.3419和0.2306，全部P＞0.05；100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml重组人A20干预组与LPS处理对照组之间TNFα水平存在极显著性差别，P值分别为0.0062、0.0105和0.0043，即P＜0.01。上述结果表明：重组人A20对THP1细胞合成并分泌TNFα有干预作用，且存在剂量依赖性特点，其中以加入100ng/ml以上的重组人A20效果最为显著。

IL-1β水平的ELISA分析：

采用IL-1βELISA试剂盒(JINGMEI BIOTECH产品)测定上清液中的IL-1β水平，具体方法按说明书进行，实验结果见附图16。阴性对照组、LPS处理对照组、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的重组人A20治疗组，THP1细胞合成并分泌到培养液中的IL-1β分别为27.49±5.67、807.56±85.57、721.21±75.26、699.03±59.97、431.79±40.49、153.66±32.20和121.37±20.75pg/ml，提示加入不同浓度的重组人A20后，THP1细胞合成和分泌的IL-1β在不同程度上都有所降低。将阴性对照组、各重组人A20治疗组依次与LPS处理对照组进行比较，t检验结果显示：在阴性对照组与LPS处理对照组之间IL-1β水平存在极显著性差别，P＝0.0035，说明细胞功能状态佳；1ng/ml、10ng/ml、重组人A20治疗组与LPS处理对照组之间IL-1β水平没有显著性差别，P值分别为0.4441和0.3169，即全部P＞0.05；100ng/ml重组人A20治疗组与LPS处理对照组之间IL-1β水平存在显著性差别，P＝0.0282；1μg/ml、10μg/ml重组人A20治疗组与LPS处理对照组之间IL-1β水平存在极显著性差别，P值分别为0.0028和0.0033，即P＜0.01。上述结果表明：重组人A20对THP1细胞合成并分泌IL-1β有干预作用，且存在剂量依赖性特点，其中以加入微克级重组人A20效果最显著。

因此，可以认为重组人A20具有抑制THPI细胞NF-κB活化、下调细胞生成TNFα、IL-1β的能力，对实验细胞的炎症应答具有明显的调节作用。

实施例10

重组人A20对脓毒症大鼠全身性失控性炎症反应的治疗作用

动物实验：

清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～300克，适应喂养1周。rhA20治疗组大鼠6只，腹腔注射10mg/kg的LPS，分别于1小时后尾静脉注射30μg/kg/d的rhA20。LPS处理组大鼠6只，腹腔注射10mg/kg的LPS，分别于1小时后尾静脉注射与rhA20等体积的生理盐水。对照组大鼠6只，腹腔注射与LPS等体积的生理盐水，分别于1小时后尾静脉注射与rhA20等体积的生理盐水。上述各组动物于尾静脉注射24小时后收集血液样品，离心分离血清。

血清TNFα水平的测定：

试剂及方法同细胞实验TNFα测定，结果见附图17。对照组、LPS处理组、rhA20治疗组血清中TNFα分别为45.55±13.67、268.76±65.34和112.00±31.05pg/ml，将LPS处理组、rhA20治疗组与对照组进行比较，t检验结果显示：LPS处理组、rhA20治疗组与对照组血清中TNFα水平存在极显著性差异，P值分别为0.0003和0.0103；将rhA20治疗组与LPS处理组进行比较，t检验结果显示：rhA20治疗组与LPS处理血清中的TNFα水平存在极显著性差异，P＝0.0060。上述结果表明，rhA20对LPS所致实验性脓毒症大鼠血液中TNF α水平具有明显的调节作用。

血清IL-1β水平的测定：

试剂及方法同细胞实验IL-1β测定，结果见附图17。对照组、LPS处理组、rhA20治疗组血清中IL-1β分别为38.98±17.11、321.44±66.51和121.49±56.26pg/ml，将LPS处理组、rhA20治疗组与对照组进行比较，t检验结果显示：LPS处理组、rhA20治疗组与对照组血清中IL-1β水平存在极显著性差异，P值分别为0.0002和0.0140；将rhA20治疗组与LPS处理组进行比较，t检验结果显示：rhA20治疗组与LPS处理血清中的IL-1β水平存在极显著性差异，P＝0.0052。上述结果表明，rhA20对LPS所致实验性脓毒症大鼠血液中IL-1β水平具有明显的调节作用。

血清IL-6水平的测定：

采用IL-6 ELISA试剂盒(JINGMEI BIOTECH产品)测定血清中的IL-6水平，具体方法按说明书进行，结果见附图17。对照组、LPS处理组、rhA20治疗组血清中IL-6分别为19.32±4.22、113.51±32.23和56.50±25.31pg/ml，将LPS处理组、rhA20治疗组与对照组进行比较，t检验结果显示：LPS处理组与对照组血清中IL-6水平存在极显著性差异，P＝0.0007。rhA20治疗组与对照组血清中IL-6水平存在显著性差异，P＝0.0151；将rhA20治疗组与LPS处理组进行比较，t检验结果显示：rhA20治疗组与LPS处理血清中的IL-6水平存在显著性差异，P＝0.0182。上述结果表明，rhA20对LPS所致实验性脓毒症大鼠血液中IL-6水平具有一定的调节作用。

上述结果表明，重组人A20能够明显下调实验动物血液TNFα、IL-1和IL-6水平，对实验动物体内炎症应答具有明显的调节能力，可以用于临床炎症性疾病的治疗，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。

Claims (2)

1、一种重组人A20蛋白，其特征在于是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2、权利要求1所述的重组人A20蛋白在制备治疗临床因核转录因子NF-κB过度活化引起的各种炎症相关疾病的药物中的用途。

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