CN101830975B - 重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白及其制备方法，具体通过生物技术方法提供具有生物活性的重组Galectin-1蛋白，通过构建原核表达载体pET-22b(+)-Gal-1、pET-22b(+)-Gal-1②，分别转染BL21构建工程菌，然后通过IPTG诱导表达，裂菌后的层析分离纯化得到具有生物活性的重组Galectin-1单体蛋白或者重组Galectin-1二串体蛋白。通过红细胞凝集试验证实了这两种重组Galectin-1蛋白均具有明显的生物活性，而且重组Galectin-1二串体蛋白的生物活性要高于重组Galectin-1单体蛋白。

Description

重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及目的蛋白质的重组质粒的构建、原核表达、纯化及鉴定，特别涉及重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白及其制备方法。

背景技术

1、Galectin-1的基本特性

半乳糖凝集素-1(Galectin-1)属于内源凝集素的半乳糖凝集素(Galectins)家族。迄今为止，已发现14个Galectins家族成员，人体至少存在12种，该家族成员均具有结构上包含约130个氨基酸的糖类识别区(Carbohydrate-recognition domains，CRD)和对β-半乳糖苷有特殊亲和力两种特性。根据其分子结构的不同可将Galectins划分为三类：①原型，含有单一的糖类识别结构域CRD，包括Galectin-1、2、5、7、10、13、14；②嵌合型，包含一个糖类识别结构域CRD和一个胶原蛋白样重复结构域，Galectin-3是其唯一成员；③串联重复型，两个CRD串联融合，包括Galectin-4、6、8、9、12。

Galectin-1由位于22q12(第22号染色体长臂1区2带)的LSGALS1基因编码；该基因转录本由4个外显子剪接而成，长0.6kb，编码135个氨基酸，其分子量约为14.5kDa。Galectin-1是典型的胞浆蛋白，但在细胞表面、细胞外基质、胞浆和核内均有表达，通常以单体及非共价键形成的同源二聚体形式存在。Galectin-1表达于多种类型的细胞，如胸腺上皮胞、树突状细胞、内皮细胞、巨噬细胞、骨髓基质细胞和纤维母细胞等，在胸腺、肾脏、骨骼肌、平滑肌、心肌、感觉和运动神经元及胎盘中含量丰富。

2、Galectin-1的生物学功能

2.1Galectin-1在免疫系统中的作用

研究表明Galectin-1可以通过固有免疫和获得性免疫应答来调节机体自身稳态。在胸腺选择时，胸腺上皮细胞、巨噬细胞表达的Galectin-1能诱导未成熟的双阳性胸腺细胞发生凋亡，揭示Galectin-1可能是胸腺选择中的凋亡介导者之一。Galectin-1也可调节外周活化的T细胞，诱导其凋亡。Rabinovich和同事证明Galectin-1与T细胞表面的三种分子即CD45、CD43和CD7特异性结合，其中CD7已被证明是必不可少的，激活AP-1活性并下调Bcl-2的表达，这很可能Galectin-1诱导凋亡的分子机制。而Galectin-1激发线粒体途径的凋亡程序也被发现，Ion及其同事证明Galectin-1通过激起酸性神经磷脂酶调节神经胺酸的释放，降低Bcl-2蛋白的产量，激活Caspas-9和Caspase-3诱导的细胞凋亡。

Galectin-1不仅可以抑制T细胞发挥功效，在体内还有抗炎作用。在自身免疫性疾病中，Galectin-1通过抑制TNF-α、IFN-γ、IL-12等炎症因子的产生，选择性去除自身反应性T细胞，从而抑制炎症的发生，已成功用于小鼠自身免疫性脑脊髓炎、小鼠类风湿性关节炎、ConA诱导的急性肝炎、糖尿病等自身免疫性动物模型的预防和治疗。

此外，Galectin-1还可抑制微生物感染。细菌脂多糖(LPS)可刺激巨噬细胞、中性粒细胞脱颗粒，而Galectin-1可抑制LPS释放花生四烯酸以达到抗菌的目的。低浓度的Galectin-1可以完全阻断克氏锥虫感染的鼠巨噬细胞产生L-12，高浓度的Galectin-1可以触发克氏锥虫感染的巨噬细胞发生凋亡。但Galectin-1可作为HIV-1稳定因子使其稳定粘附到宿主细胞表面。

2.2Galectin-1在神经系统中的作用

Galectin-1主要分布在背根神经节细胞与运动神经元，仅在神经元胞体、轴突和成年啮齿动物的雪旺细胞上具有免疫活性。当轴突损伤时，胞浆内Galectin-1减少，大部分分子从生长的轴突和活化的雪旺细胞中分泌到胞外，并转变成氧化型刺激轴突再生。McGraw等报道低浓度的氧化型半乳凝素-1即可刺激外周与中枢神经轴索再生。

在神经细胞分化方面，Galectin-1能够诱导星形胶质细胞分化，分化的星形胶质细胞分泌大量的脑源性神经营养因子，对神经元的生长、分化以及突触可塑性的形成起重要作用。

当中风和脑缺血时，给予Galectin-1可增强NMDA受体NR1a亚基表达和降低PKC活性，从而抑制谷氨酸神经毒性，保护中枢神经元免受损伤。在肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者体内，发现球状体有大量Galectin-1聚集，提示与神经丝的形成有关。将氧化性Galectin-1注射转基因小鼠ALS模型，可起到保护神经、延长生存期的作用。

2.3Galectin-1在肿瘤发生中的作用

Galectin-1在多种肿瘤中均有表达，如：星形细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、结肠癌、膀胱癌和卵巢癌等。多数情况下，Galectin-1的表达与这些肿瘤的侵袭和转移密切相关。

Galectin-1与癌基因H-Ras相互作用，使其锚定于膜上，增强Ras介导的信号转导过程，从而促进细胞向肿瘤细胞表型转化。Yamaoka等发现抑制Galectin-1在鼠Glioma细胞系中的表达将会限制肿瘤的生长，表明内源Galectin-1有促进肿瘤生长作用。Galectin-1还可通过阻断S/G2细胞周期的运行，抑制细胞复制，并诱导细胞发生凋亡。

研究显示Galectin-1参与了细胞黏附、侵袭力增强、血管生成和免疫逃逸等肿瘤转移的多个步骤。Galectin-1可增加前列腺癌和卵巢癌细胞对细胞外基的黏附。Galectin-1可通过MAC-2BP蛋白调节同型的人黑色素瘤细胞的聚集。在体外，外源性的Galectin-1可以增强胶质母细胞瘤细胞的运动性。淋巴瘤血管壁中Galectin-1的表达与其血管密度的增强有很大关系。而在Galectin-1缺陷的小鼠中由于血管新生受到抑制，肿瘤的生长也受到明显抑制。肿瘤细胞通过分泌Galectin-1抑制活性T细胞功能，进而参与到肿瘤细胞的免疫逃逸。阻断Galectin-1在肿瘤组织中的抑制作用可激活肿瘤特异性T细胞应答，使肿瘤组织减小。因此，Galectin-1可考虑作为肿瘤免疫治疗的靶标。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白及其制备方法，本发明将Galectin-1分别以单串体、二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，并且分离具有生物学活性的Galectin-1重组蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的半乳糖凝集素-1，其连接方式为：Galectin-1-Gly-Ser-Galectin-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种编码所述的重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白的表达载体，包含如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

所述的编码重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白的表达载体，为pET-22b(+)-Gal-1②表达载体，通过Nde I和Sal I酶切位点将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列克隆到pET-22b(+)表达载体中。

一种重组半乳糖凝集素-1蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)通过Nde I和Sal I酶切位点将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列克隆到pET-22b(+)表达载体中，构建pET-22b(+)-Gal-1或pET-22b(+)-Gal-1②表达载体；

2)将pET-22b(+)-Gal-1或pET-22b(+)-Gal-1②表达载体转化感受态细胞BL21，经过筛选获得成功转染的单克隆菌落；然后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜，次日以1∶100的比例转接于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，诱导4h后后离心收集菌体；

3)将收集的菌体裂菌后，离心收集上清；将收集的上清于透析液中4℃充分透析，透析后的上清上样于透析液平衡过的阴离子交换层析柱，然后用透析液充分洗柱，再用洗脱液A线性梯度洗脱5～10个柱体积，收集目的蛋白洗脱峰I；

所述的透析液为：pH 7.4的20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA；所述的洗脱液A为：pH 7.4的20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，1mol/L NaCl；

将收集的目的蛋白洗脱峰I稀释并调pH至4.0，并于平衡液4℃充分透析；将透析过的蛋白洗脱峰I上样于平衡液平衡过的阳离子交换层析柱，然后用洗脱液B线性梯度洗脱5～10个柱体积，收集目的蛋白洗脱峰II，将其透析于50倍体积的PBS后，用滤膜过滤除菌，得到纯化后的目的蛋白；

所述的平衡液为：pH 4.0的20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，1mmol/LEDTA；所述的洗脱液B为：pH 4.0的20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，1mmol/L EDTA，1mol/L NaCl。

所述的菌体裂菌是将收集的菌体按1g菌体加10ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴超声破菌20min；所述的裂菌缓冲液为：pH 8.0的20mmol/LTris-HCl，100mM NaCl，1mmol/L EDTA。

所述的阴离子交换层析柱为Q-Sepharose FF阴离子层析柱，所述的阳离子交换柱为SP-Sepharose FF阳离子层析柱。

所述的线性梯度洗脱为：0％～100％的洗脱液线性洗脱。

所述的上样时的流速为1ml/min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过生物技术方法提供了具有生物活性的重组Galectin-1蛋白的制备方法，所述的重组Galectin-1蛋白包括重组Galectin-1单体蛋白和重组Galectin-1二串体蛋白。通过构建原核表达载体pET-22b(+)-Gal-1、pET-22b(+)-Gal-1②，分别转染BL21构建工程菌，然后通过IPTG诱导表达，裂菌后的层析分离纯化得到具有生物活性的重组Galectin-1单体蛋白或者重组Galectin-1二串体蛋白。通过红细胞凝集试验证实了这两种重组Galectin-1蛋白均具有明显的生物活性，而且重组Galectin-1二串体蛋白的凝集活性要高于重组Galectin-1单体蛋白。

本发明分别将表达载体pET-22b(+)-Gal-1和pET-22b(+)-Gal-1②转染感受态的BL21，构建工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1和BL21/pET-22b(+)-Gal-1②；经IPTG诱导后可高效表达目的蛋白，诱导后菌体的裂菌上清经阴离子和阳离子交换作用层析，可得到纯度大于90％的目的蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。采用免疫印迹法证明重组Galectin-1单体蛋白和重组二串体蛋白均可与鼠抗人Galectin-1单克隆抗体特异性结合；并且具有红细胞凝集的生物活性。

附图说明

图1为PCR扩增的Galectin-1单体基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为表达载体pET-22b(+)-Gal-1的Nde I和Sal I双酶切鉴定结果图；

图3为表达载体pET-22b(+)-Gal-1②的Nde I和Sal I双酶切鉴定结果图；

图4为重组Galectin-1单体蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹检测结果图；

图5为重组Galectin-1二串体蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹检测结果图；

图6为工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1表达纯化阶段的SDS-PAGE检测结果图；

图7为工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1②表达纯化阶段的SDS-PAGE检测结果图；

图8为Galectin-1单体蛋白和Galectin-1二串体蛋白的红细胞凝集试验检测结果。

具体实施方式

本发明通过生物技术方法提供具有生物活性的重组Galectin-1蛋白，通过构建原核表达载体pET-22b(+)-Gal-1、pET-22b(+)-Gal-1②，分别转染BL21构建工程菌，然后通过IPTG诱导表达，裂菌后的层析分离纯化得到具有生物活性的重组Galectin-1单体蛋白或者重组Galectin-1二串体蛋白。通过红细胞凝集试验证实了这两种重组Galectin-1蛋白均具有明显的生物活性，而且重组Galectin-1二串体蛋白的生物活性要高于重组Galectin-1单体蛋白。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、Galectin-1单体基因的克隆及表达载体的构建

1.1Galectin-1单体cDNA的克隆

以包含Galectin-1cDNA的质粒pACT-Gal1为模板扩增Galectin-1的单体cDNA，并将Nde I酶切位点引入5’端引物，Sal I酶切位点引入3’端引物，PCR反应引物设计如下：

3’端引物P1：gggaattcca tatggcttgt ggtctggtcg cc        32；

5’端引物P2：acgcgtcgac tcagtcaaag gccacacatt tgatcttg  38；

PCR扩增体系：pACT-Gal1(模板DNA，100ng/ml)1μl，Primer1(100μM)1μl，Primer2(100μM)1μl，2×MasterMix 12.5μl，ddH₂O 9.5μl，总计25μl。

PCR扩增参数：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，70℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

回收PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，泳道M为Marker，泳道1可见预期大小(408bp)的扩增的Galectin-1单体基因片段。

1.2原核表达载体pET-22b(+)-Gal-1的构建

将质粒pET-22b(+)经Nde I和Sal I双酶切后回收的大片段与经同样双酶切的PCR扩增的Galectin-1单体基因片段建立T4连接酶连接体系，16℃连接2h。连接完成后，将连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养后收菌。对菌体提取质粒后用Nde I和Sal I双酶切并琼脂糖凝胶电泳鉴定。

鉴定结果如图2所示，泳道M为Marker，泳道1为Nde I和Sal I双酶切鉴定，可以清楚看到双酶切得到的408bp的目的基因片段和剪切所得的pET-22b(+)载体大片段；对酶切鉴定正确的提取质粒进行测序，Galectin-1单体基因测序结果如SEQ ID NO.2所示，将测序正确的质粒命名为pET-22b(+)-Gal-1表达载体。

2、Galectin-1单体基因的克隆及表达载体的构建

2.1Galectin-1二串体cDNA的克隆

以质粒pACT-Gal1为模板扩增Galectin-1的单体cDNA，然后将两个单体cDNA片段串连成二串体基因片段；在前有设计P1、P2的基础上，再设计两个引物P3、P4，将BamH I酶切位点分别引入3’端引物P3和5’端引物P4(这样通过BamH I酶切位点将两次扩增的单体片段串连成二串体)：

3’端引物P3：cgcggatccg tcaaaggcca cacatttgat cttgaag  37；

5’端引物P4：cgcggatcca tggcttgtgg tctggtcgcc          30；

以pACT-Gal1为模板，分别以P1、P3为引物对，以P4、P2为引物对进行两次Galectin-1单体基因片段PCR扩增，PCR扩增体系分别为：

pACT-Gal1(模板DNA，100ng/ml)1μl，P1(100μM)1μl，P3(100μM)1μl，2×MasterMix 12.5μl，ddH₂O 9.5μl，总计25μl。

pACT-Gal1(模板DNA，100ng/ml)1μl，P4(100μM)1μl，P2(100μM)1μl，2×MasterMix 12.5μl，ddH₂O 9.5μl，总计25μl。

PCR扩增参数：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，70℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

分别回收以上两次PCR产物并进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，泳道M为Marker，泳道2、3分别为两次扩增的结果，均可见预期大小(408bp)的扩增的Galectin-1单体基因片段。

2.1原核pET-22b(+)-Gal-1②表达载体的构建

将质粒pET-22b(+)经Nde I和Sal I双酶切后回收的大片段、P1和P3引物对PCR扩增所得产物经Nde I和BamH I双酶切后的单体片段、P4和P2引物对PCR扩增所得产物经BamH I和Sal I双酶切后的单体片段，建立T4连接酶连接体系，16℃连接2h。连接完成后，将连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养后收菌。对菌体提取质粒后用NdeI和Sal I双酶切并琼脂糖凝胶电泳鉴定。

鉴定结果如图3所示，泳道M为Marker，泳道1为Nde I和Sal I双酶切鉴定，可以清楚看到双酶切得到的825bp的二串体基因片段和剪切所得的pET-22b(+)载体大片段；对酶切鉴定正确的提取质粒进行测序，Galectin-1二串体基因测序结果如SEQ ID NO.3所示，将测序正确的质粒命名为pET-22b(+)-Gal-1②表达载体。

3、pET-22b(+)-Gal-1和pET-22b(+)-Gal-1②表达载体的转染、表达及鉴定

3.1感受态宿主细胞的制备

取BL21(DE3)甘油菌种按1∶100的比例接种入LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至OD₆₀₀约0.4左右。将菌液冰浴10min(无菌操作)，离心(3000r/min×5min，4℃)后弃去上清，加入1/2体积预冷的100mmol/L CaCl₂，轻轻吹起沉淀，冰浴40min，离心(3000r/min×5min，4℃)，弃上清后加入1/25体积的含25％甘油的100mmol/L CaCl₂，吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，-70℃保存备用。

3.2表达载体的转染、表达

取出-70℃贮存的BL21(DE3)感受态细胞，冰浴10min使其融化，加入表达载体(pET-22b(+)-Gal-1或pET-22b(+)-Gal-1②)2μl，用移液枪轻轻混匀，冰浴30min，然后于水浴锅中42℃热激90s；不要摇动离心管，取出之后冰浴3～5min，涂布于预热的含Amp+的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

挑取转染后培养的单菌落，分别接种于LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，摇床37℃培养过夜，次日以1∶100的比例转接于新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，诱导4h后离心收集菌体。

3.3重组Galectin-1单体蛋白、重组Galectin-1二串体蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹鉴定

将收集的pET-22b(+)-Gal-1转染的BL21工程菌裂菌，分别加入50μl水和50μl 2×上样缓冲液(4％SDS、20％甘油、5％β-巯基乙醇、20％甘油、0.2％溴酚蓝、100mM Tris-HCl，pH 6.8、0.2％溴酚蓝)，充分混匀后，于沸水中煮5-10min，12000rpm离心5min，移液器分别取10μl上清对6％浓缩胶和15％分离胶进行SDS-PAGE，检测重组Galectin-1单体蛋白的表达；

在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20％甲醇)中100V恒压电泳1h，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mMNaCl，0.05％Tween-20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中室温封闭1h，TBST室温洗3次，每次5min。然后加入鼠抗人Galectin-1单克隆抗体(abcam公司，0.5mg/ml)，室温孵育2h，TBST室温洗3次，每次10min；再以HRP-兔抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，按1∶5000稀释)室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，最后用TBS(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl)洗3次，滤纸贴角吸干水分后，浸入辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法的发光混合液中，熄灯至可见淡绿色荧光条带后，置于保鲜膜内固定于片盒中，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光，并显影、定影。

重组Galectin-1单体蛋白的SDS-PAGE检测结果如图4a所示，泳道M为Marker，泳道1为未诱导的工程菌的表达结果，泳道2为IPTG诱导的工程菌表达结果；与之相对应的重组Galectin-1单体蛋白的免疫印迹检测结果如图4b所示，泳道1为未诱导的工程菌的表达结果，泳道2为IPTG诱导的工程菌表达结果。在图4a、图4b中，泳道2与泳道1相比，结果显示经过IPTG诱导之后，工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1表达了相对分子量为14.5kD的重组Galectin-1单体蛋白(泳道1中没有相应的表达)，而且所表达的蛋白能够与Galectin-1单克隆抗体特异性的结合。

将收集的pET-22b(+)-Gal-1②转染的BL21工程菌裂菌，按照同样的方法进行SDS-PAGE和免疫印迹检测重组Galectin-1二串体蛋白的表达，结果分别如图5a、图5b所示，其中，泳道1为未诱导的工程菌的表达结果，泳道2为IPTG诱导的工程菌表达结果。在图5a、图5b中，泳道2与泳道1相比，结果显示经过IPTG诱导之后，工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1②表达了相对分子量为28kD的重组Galectin-1单体蛋白(泳道1中没有相应的表达)，而且所表达的蛋白能够与Galectin-1单克隆抗体特异性的结合。4、重组Galectin-1单体蛋白、重组Galectin-1二串体蛋白的纯化及检测

4.1破菌收集上清

将收集的菌体，按1g菌体加10ml裂菌缓冲液STE(pH 8.0、20mmol/LTris-HCl，100mM NaCl，1mmol/L EDTA)的比例将菌体重悬，冰浴超声破菌20min，离心(12000r/min×20min，4℃)，收集目的蛋白所在的上清，弃去沉淀。收集的上清用于下一步的离子交换层析。

4.2Q-Sepharose FF阴离子交换层析

将收集的裂解上清用透析液(pH 7.4、20mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA)在4℃条件下搅拌透析12h，每6h换液1次，共换液2次。将Q-SepharoseFF阴离子层析柱连接至常压层析系统，并用透析液冲洗平衡，然后将透析后的裂解上清直接上样，上样流速为1ml/min。上样结束后用透析液充分洗柱，再用洗脱液A(pH 7.4、20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，1mol/L NaCl)从0％～100％线性梯度洗脱5～10个柱床体积，收集第一个洗脱峰，该洗脱峰为目的蛋白初次洗脱峰，称为目的蛋白洗脱峰I。

4.3SP-Sepharose FF阳离子交换层析

将收集的目的蛋白洗脱峰I的蛋白浓度稀释至1mg/ml以内，用1mol/LHCl调pH至4.0，然后用平衡液(pH 4.0、20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，1mmol/LEDTA)4℃条件下搅拌透析12h，中间换液2次(每6h换液1次)。用平衡液冲洗平衡SP-Sepharose FF阳离子层析柱，然后将透析后的目的蛋白洗脱峰I上样，上样流速1ml/min。上样结束后用平衡液充分洗柱，再用洗脱液B(pH 4.0、20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，1mmol/L EDTA，1mol/L NaCl)从0％～100％线性梯度洗脱5～10个柱床体积，收集第二个洗脱峰，该洗脱峰为目的蛋白二次洗脱峰，称为目的蛋白洗脱峰II，并将其用50倍体积的PBS透析，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到纯化后的重组Galectin-1单体蛋白或重组Galectin-1二串体蛋白，分装后-20℃保存备用。

4.4纯化的重组蛋白的SDS-PAGE检测

工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1表达纯化阶段的SDS-PAGE检测如图6所示，其中，泳道M为Marker，泳道1为未诱导的全菌蛋白电泳，泳道2为IPTG诱导的全菌蛋白电泳，泳道3为裂菌沉淀，泳道4为裂菌上清，泳道5为Q阴离子交换层析纯化的Galectin-1单体蛋白，泳道6为SP阳离子交换层析纯化的Galectin-1单体蛋白；对比图6的各个泳道，可以看出在经IPTG诱导后，14.5kD的Galectin-1单体蛋白得到表达，而且位于裂菌上清当中，经过两次离子交换层析纯化之后逐渐的减少其他杂蛋白，到最后可以得到纯度相当高的重组Galectin-1单体蛋白。

工程菌BL21/pET-22b(+)-Gal-1②表达纯化阶段的SDS-PAGE检测如图7所示，其中，泳道M为Marker，泳道1为未诱导的全菌蛋白电泳，泳道2为IPTG诱导的全菌蛋白电泳，泳道3为裂菌沉淀，泳道4为裂菌上清，泳道5为Q阴离子交换层析纯化的Galectin-1二串体蛋白，泳道6为SP阳离子交换层析纯化的Galectin-1二串体蛋白；对比图6的各个泳道，可以看出在经IPTG诱导后，28kD的Galectin-1二串体蛋白得到表达，而且位于裂菌上清当中，经过两次离子交换层析纯化之后逐渐的减少其他杂蛋白，到最后可以得到纯度相当高的重组Galectin-1二串体蛋白。按照其编码核苷酸可以得到重组Galectin-1二串体蛋白的氨基酸序列，具体如SEQ IDNO.1所示。

5、红细胞凝集试验

采集小鼠全血收集于肝素化的离心管中，1000rmp×10min离心，弃血清及白细胞后，用pH7.2的0.01mol/L PBS液洗涤，再离心，弃去上清液。同法重复2次，得到洗涤后的红细胞。再用PBS配制成2％红细胞悬液，按1∶10000比例加入叠氮钠，4℃保存备用。

以PBS作为阴性对照，ConA(刀豆素A)作为阳性对照，分别在96孔V型板上用25μl蛋白浓度为200μg/ml的Galectin-1单体蛋白液、Galectin-1二串体蛋白液与等量PBS按1∶1比例系列倍比稀释后，加入2％红细胞悬液50μl，振匀，室温静置2h后，肉眼观察。无凝集现象时，红细胞沉积在V型孔底部成点状；有凝集现象时成网状而不下沉。

红细胞凝集检测结果如图8所示，其中，列1为作为阴性对照的PBS组，列2为作为阳性对照的ConA组，列3为Galectin-1二串体蛋白组，列4为Galectin-1单体蛋白组。列3与列2相比，可以看出Galectin-1二串体蛋白组具有明显的生物活性，能够凝集小鼠的红细胞；其凝集作用基本与ConA相当。列4与列2相比，可以看出Galectin-1单体蛋白在浓度大于25μg/ml时也具有明显的生物活性，能够凝集小鼠的红细胞。而列3与列4相比，可以看出Galectin-1二串体蛋白的生物活性要明显高于Galectin-1单体蛋白的生物活性，其最小凝集浓度3.1μg/ml相当于Galectin-1单体蛋白最小凝集浓度25μg/ml的1/8。

核苷酸和氨基酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白及其制备方法

<160>3

<210>1

<211>272

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Met Ala Cys Gly Leu Val Ala Ser Asn Leu Asn Leu Lys Pro Gly Glu Cys Leu Arg Val

1                5                  10                  15                  20

Arg Gly Glu Val ala Pro Asp Ala Lys Ser Phe Val Leu Asn Leu Gly Lys Asp Ser Asn

                25                  30                  35                  40

Asn Leu Cys Leu His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Ala His Gly Asp Ala Asn Thr Lle Val

                45                  50                  55                  60

Cys Asn Ser Lys Asp Gly Gly Ala Trp Gly Thr Glu Gln Arg Glu Ala Val Phe Pro Phe

                65                  70                  75                  80

Gln Pro Gly Ser Val Ala Glu Val Cys Lle Thr Phe Asp Gln Ala Asn Leu Thr Val Lys

                85                  90                  95                  100

Leu Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Lys Phe Pro Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala Lle Asn Tyr

                105                 110                 115                 120

Met Ala Ala Asp Gly Asp Phe Lys Lle Lys Cys Val Ala Phe Asp Gly Ser Met Ala Cys

                125                 130                 135                 140

Gly Leu Val Ala Ser Asn Leu Asn Leu Lys Pro Gly Glu Cys Leu Arg Val Arg Gly Glu

                145                 150                 155                 160

Val ala Pro Asp Ala Lys Ser Phe Val Leu Asn Leu Gly Lys Asp Ser Asn Asn Leu Cys

                165                 170                 175                 180

Leu His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Ala His Gly Asp Ala Asn Thr Lle Val Cys Asn Ser

                185                 190                 195                 200

Lys Asp Gly Gly Ala Trp Gly Thr Glu Gln Arg Glu Ala Val Phe Pro Phe Gln Pro Gly

                205                 210                 215                 220

Ser Val Ala Glu Val Cys Lle Thr Phe Asp Gln Ala Asn Leu Thr Val Lys Leu Pro Asp

                225                 230                 235                 240

Gly Tyr Glu Phe Lys Phe Pro Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala Lle Asn Tyr Met Ala Ala

                245                 250                 255                 260

Asp Gly Asp Phe Lys Lle Lys Cys Val Ala Phe Asp

                265                 270

<210>2

<211>405

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

atggcttgtg gtctggtcgc cagcaacctg aatctcaaac ctggagagtg ccttcgagtg    60

cgaggcgagg tggctcctga cgctaagagc ttcgtgctga acctgggcaa agacagcaac    120

aacctgtgcc tgcacttcaa ccctcgcttc aacgcccacg gcgacgccaa caccatcgtg    180

tgcaacagca aggacggcgg ggcctggggg accgagcagc gggaggctgt ctttcccttc    240

cagcctggaa gtgttgcaga ggtgtgcatc accttcgacc aggccaacct gaccgtcaag    300

ctgccagatg gatacgaatt caagttcccc aaccgcctca acctggaggc catcaactac    360

atggcagctg acggtgactt caagatcaaa tgtgtggcct ttgac                    405

<210>3

<211>816

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atggcttgtg gtctggtcgc cagcaacctg aatctcaaac ctggagagtg ccttcgagtg    60

cgaggcgagg tggctcctga cgctaagagc ttcgtgctga acctgggcaa agacagcaac    120

aacctgtgcc tgcacttcaa ccctcgcttc aacgcccacg gcgacgccaa caccatcgtg    180

tgcaacagca aggacggcgg ggcctggggg accgagcagc gggaggctgt ctttcccttc    240

cagcctggaa gtgttgcaga ggtgtgcatc accttcgacc aggccaacct gaccgtcaag    300

ctgccagatg gatacgaatt caagttcccc aaccgcctca acctggaggc catcaactac    360

atggcagctg acggtgactt caagatcaaa tgtgtggcct ttgacggatc catggcttgt    420

ggtctggtcg ccagcaacct gaatctcaaa cctggagagt gccttcgagt gcgaggcgag    480

gtggctcctg acgctaagag cttcgtgctg aacctgggca aagacagcaa caacctgtgc    540

ctgcacttca accctcgctt caacgcccac ggcgacgcca acaccatcgt gtgcaacagc    600

aaggacggcg gggcctgggg gaccgagcag cgggaggctg tctttccctt ccagcctgga    660

agtgttgcag aggtgtgcat caccttcgac caggccaacc tgaccgtcaa gctgccagat    720

ggatacgaat tcaagttccc caaccgcctc aacctggagg ccatcaacta catggcagct    780

gacggtgact tcaagatcaa atgtgtggcc tttgac                              816

Claims (3)

1.一种重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白，其特征在于，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的半乳糖凝集素-1，其连接方式为：Galectin-1-Gly-Ser-Galectin-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码所述的重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白的表达载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的编码所述的重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白的表达载体，其特征在于，所述的编码重组半乳糖凝集素-1二串体蛋白的表达载体，为pET-22b(+)-Gal-1②表达载体，通过Nde I和Sal I酶切位点将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列克隆到pET-22b(+)表达载体中。

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