CN101298611B - 衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段及其表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段。本发明所公开的衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段，是下述多肽之一：1)是将由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失10至40个氨基酸残基得到的31个多肽之一；2)是将由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失10至40个氨基酸残基，并且自氨基末端的第609位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失10个氨基酸残基得到的31个多肽之一。本发明所提供的8种CPAF活性片段具有酶原表达量高、活化后的多肽活性高的特点。因此，本发明的8种CPAF活性片段及其表达方法对生产疫苗具有重要的意义。

Description

衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段及其表达方法

技术领域

本发明涉及衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段及其表达方法。

背景技术

衣原体是自然界中传播很广泛的病原体。它是既不同于细菌也不同于病毒的一种微生物，专营寄生在真核细胞内。衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及禽类。根据衣原体的抗原结构和DNA同源性的特点，将衣原体属(Chlamydiae)分为四个种，包括沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)和兽类衣原体(Chlamydiapecorum)。与人类疾病有关的衣原体有三种，分别是鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体和肺炎衣原体。目前由衣原体感染所致的性传播疾病增加很快，生殖道感染的发病率已超过淋病奈瑟菌感染，成为最常见的性传播疾病。这三种衣原体均可引起肺部感染。

衣原体对宿主细胞的毒性作用一般认为是通过CPAF(chlamydialprotease/proteasome-like activity factor)蛋白来实现的：

衣原体为了能在受感染宿主细胞生存，进化出了逃避、以及应付宿主免疫识别的能力。其中一个策略就是衣原体通过抑制宿主主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类抗原的表达从而逃脱T淋巴细胞的免疫识别(Zhong et al.，1999，2000)。现在已经找到分泌到宿主细胞质中的衣原体蛋白酶或蛋白酶体样活性因子CPAF(chlamydial protease/proteasome-like activity factor)，CPAF对降解宿主主要组织相容性复合物(MHC)的转录因子rfx5和上游刺激因子1(USF-1)不仅是足够的，而且是必须的(Zhong et al.，2001)。

抑制宿主受感染细胞凋亡是衣原体成功生存和繁殖所采用的另一个策略(Byrne and Ojcius，2004；Fan et al.，1998；Fischer et al.，2004；Greene etal.，2004；Miyairi and Byrne，2006)：已经证明衣原体通过降解BH3-only凋亡蛋白来抑制受感染宿主细胞的凋亡，最近研究表明CPAF也在此过程中发挥重要作用，研究发现CPAF能降解广谱的BH3-only前凋亡蛋白，例如Puma等(Pirbhai et al.，2006)。

除了降解rfx5、USF-1、BH3-only蛋白，CPAF还能降解细胞骨架中间纤维蛋白keratin 8，对衣原体蛋白CPAF此行为的解释是通过降解细胞骨架中间纤维蛋白keratin 8使得宿主细胞具有更好的流动性，有利于含有不断增殖衣原体的液泡的扩张；同时有利于受感染细胞的裂解从而衣原体得以继续感染新的细胞，吸收养分(Dong et al.，2004)。

CPAF是一类功能高度保守的基因，在不同种的衣原体中都有表达(Dong et al.，2005；Shaw et al.，2002)，而且都显示出相似的蛋白酶活性(Dong et al.，2005)，但和其他基因并没有很高的同源性。在未感染宿主细胞的衣原体内并没检测到CPAF的存在，只有当衣原体感染宿主细胞后复制时才表达、分泌(Jyotika Sharma etal.，2005)，刚翻译出来的CPAF是没有活性的70kDa酶原。有趣的是，尽管CPAF由衣原体中一个阅读框编码，但纯化出的CPAF主要是以29-kDa的N-末端(CPAFn)和35-kDa的C-末端片段(CPAFc)出现，实验显示对其中的一个片段特异识别的抗体总是免疫共沉淀出CPAF这两段，而且沉淀是有活性的(Zhong et al.，2001)，说明CPAF N-末端(CPAFn)和C-末端(CPAFc)是结合在一起的，而且这两段形成的分子内二聚体是它的催化活性所必需的，实验证明无论是单独的CPAFn还是CPAFc，或不形成分子内二聚体的CPAFn和CPAFc的混合物都没有对rfx5的降解活性(Dong et al.，2004)，这也就意味着在CPAF内部进行蛋白酶剪切形成的分子内二聚体对它的激活很重要。事实上，将全长CPAF剪切为CPAFc/n是它由酶原形式转变为有活性状态的充分必要条件(Dong et al.，2004；Fan et al.，2002)。尽管在衣原体种间有些CPAF仅有48％的序列一致性，但CPAF的激活机制在衣原体种间是非常保守的(Dong et al.，2005)，尤为重要的是，CPAF的激活机制可能是一个生物学相关的过程，因为从临床沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)分离的CPAF同样被剪切为CPAFc和CPAFn，这正好与它产生降解RFX5的活性过程一致(Dong et al.，2004)。

基于CPAF在衣原体致病过程中的重要作用，高效率提纯具有生物活性的CPAF，对于生产疫苗、临床诊断都具有重大意义。但是现有CPAF的分离、纯化方法只能得到非常少量的蛋白质(只有通过非常敏感的检测方法，如Western，才能检测到)。

发明内容

本发明的一个目的是提供衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段。

本发明所提供的衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段，是下述多肽之一：

1)是将由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失10至40个氨基酸残基得到的31个多肽之一；或是将所述31个多肽的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有降解主要组织相容性复合物的转录因子RFX5的活性的多肽之一；

2)是将由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失10至40个氨基酸残基，并且自氨基末端的第609位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失10个氨基酸残基得到的31个多肽之一。

所述衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段，具体可以是下述多肽之一：

1)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第11-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

2)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第21-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

3)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第25-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

4)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第31-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

5)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第41-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

6)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第11-599位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

7)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第21-599位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

8)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第31-599位氨基酸残基所示的氨基酸序列。

上述任一种活性片段的编码基因也属于本发明的保护范围。

含有上述任一所述编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可以是在pET系列载体的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述任一所述活性片段的方法。

本发明所提供的表达上述任一所述活性片段的方法，包括如下步骤：将上述pET系列重组载体导入大肠杆菌BL21细胞，然后将其在37℃条件下培养至所述大肠杆菌BL21细胞的溶液的OD₆₀₀值达到0.6-1.0，进行IPTG诱导，表达得到所述活性片段。

其中，所述IPTG诱导的条件具体可以为：在25℃条件进行诱导、所述IPTG的终浓度可以为0.1mM。

所述诱导的时间可以为10-12小时。

所述大肠杆菌BL21可以为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL21(DE3plus)和大肠杆菌BL21(Rosseta)中的至少一种。

本发明通过利用DNA重组技术，在大肠杆菌中高效表达8种CPAF活性片段的酶原，这些酶原多肽在体外能够自我活化。本发明所提供的8种CPAF活性片段表达量高、降解主要组织相容性复合物的转录因子RFX5的能力强，即活性高。本发明的表达8种CPAF活性片段的方法具有酶原表达量高、活化后的多肽活性高的特点。因此，本发明的8种CPAF活性片段及其表达方法对生产疫苗具有重要的意义。

附图说明

图1为基因克隆流程图。

图2为活性片段(1-609)和(1-599)的表达量与可溶性。

图3为活性片段(11-599)、(21-599)和(31-599)的表达量与可溶性。

图4为活性片段(11-609)和(41-609)的表达量与可溶性。

图5为活性片段(21-609)、(25-609)和(31-609)的表达量与可溶性。

图6为活性片段各多肽酶原在离子交换柱上的洗脱峰(A)和收集洗脱峰附近的样品的电泳图(B)。

图7为活性片段各多肽在体外活化过程中不同时间点取样电泳图。

图8为活化后的活性片段在凝胶过滤层析柱上的洗脱峰(A)和收集洗脱峰附近的样品的电泳图(B)。

图9为活化后活性片段的体外酶活性分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、10种衣原体蛋白酶体样活性因子(CPAF)的活性片段的表达及活性分析

一、表达条件的优化

蛋白表达条件的优化目的是获得高产量的正确折叠的目的蛋白。筛选表达温度(15-37℃)并调节诱导剂量来优化CPAF的表达，并结合更换表达宿主细胞株类型和选择诱导时机来进一步优化表达条件。

(1)表达温度的优化

用于蛋白表达的宿主大肠杆菌细胞一般在摄氏37℃时生长代谢最好，但在此温度下处于强启动子下的外源蛋白基因表达过快，可能造成折叠错误。因此，常常进行低温表达。但低温下宿主大肠杆菌细胞新陈代谢降低，影响蛋白的表达量水平。所以，平衡好降低温度提高正确折叠的蛋白比率和低温下影响蛋白表达量水平的问题是能否获得尽可能多的正确折叠的目的蛋白的关键。

试验表明，当表达温度为37℃时，CPAF活性片段表达量很高但有相当一部分不溶；而当表达温度为15℃时，虽然CPAF活性片段可溶性提高，但总目的蛋白表达量水平下降很多。最终经亲和纯化检测了在1L表达体系下的可溶性目的蛋白产率，确定在25℃(室温)时诱导表达最优。

(2)诱导剂浓度的调节

许多类型的大肠杆菌表达系统是诱导剂剂量-表达水平相关型。调节诱导剂浓度可以控制目的蛋白表达的速率，提高蛋白表达量，减少错误折叠水平。

经试验最终确定诱导剂(IPTG)终浓度为0.1mM左右时，表达达到最优水平。

(3)诱导表达时机

根据经验在大肠杆菌浓度在OD₆₀₀测定量为0.6～1时蛋白表达最优，部分不溶性蛋白在低浓度(OD₆₀₀约0.3)下可提高其溶解性。而CPAF活性片段在不同的大肠杆菌浓度下诱导后的溶解性基本不变，因此为提高蛋白表达水平，确定在OD₆₀₀达到1.0时进行诱导。

(4)诱导时间

根据降低温度提高诱导时间的经验原则，确定在25℃(室温)表达时过夜表达。

(5)不同菌株

测试了如下几种大肠杆菌表达菌株：BL21(DE3)、BL21(DE3plus)和BL21(Rosseta)，未发现对CPAF的表达产生明显影响。

二、10种多肽的表达

(一)10种多肽的编码基因的扩增

本实施例表达了10个多肽：CPAF全长蛋白CPAF(1-609)及以下9个活性片段CPAF(11-609)、CPAF(21-609)、CPAF(25-609)、CPAF(31-609)、CPAF(41-609)、CPAF(1-599)、CPAF(11-599)、CPAF(21-599)和CPAF(31-599)。具体的实验方法和实验结果如下：

以人工合成的沙眼衣原体基因组中GeneID为884659的核苷酸序列为模板，用设计的10对引物分别进行PCR扩增：反应体积为50ul，其中含有0.5ul CPAF模板、1.0ul Pfu酶。94℃变性4分钟后，开始30个循环，每次循环94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸3分钟。循环结束后，72℃最后延伸10分钟。

扩增10种多肽的引物序列如下：

1.CPAF_1_nde1_5：5’-gaa att cat atg GGTTTTTGGAGAACA-3’

2.CPAF_11_nde1_5：5’-gaa att cat atg AATAGGATTTGGCTATTA-3’

3.CPAF_21_nde1_5：5’-gaa att cat atg TTTTCTTCTGCCATACAT-3’

4.CPAF_25_nde1_5：5’-gaa att cat atg ATACATTCTCCTGTACAA-3’

5.CPAF_31_nde1_5：5’-gaa att cat atg GGAGAAAGCTTGGTTTGC-3’

6.CPAF_41_nde1_5：5’-gaa att cat atg CAAGATTTGAGTTTTTTA-3’

7.CPAF_609_xho1_3：5’-gaa att ctc gag AAAACTACCATCTTCCGC-3’

8.CPAF_599_xho1_3：5’-gaa att ctc gag ACCGTCGTTATTGATCAG-3’

其中，多肽(1-609)的编码基因是由上述引物1和引物7扩增得到的，该编码基因所编码的氨基酸序列如序列表中序列1所示，共609个氨基酸，自其N-端起第1-18个氨基酸可能为信号肽序列；多肽(1-599)的编码基因是由上述引物1和引物8扩增得到的，多肽(11-609)的编码基因是由上述引物2和引物7扩增得到的，多肽(21-609)的编码基因是由上述引物3和引物7扩增得到的，多肽(25-609)的编码基因是由上述引物4和引物7扩增得到的，多肽(31-609)的编码基因是由上述引物5和引物7扩增得到的，多肽(41-609)的编码基因是由上述引物6和引物7扩增得到的，多肽(11-599)的编码基因是由上述引物2和引物8扩增得到的，多肽(21-599)的编码基因是由上述引物3和引物8扩增得到的，多肽(31-599)的编码基因是由上述引物5和引物8扩增得到的。

所有PCR产物均用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，GoldView染色。用DNA纯化试剂盒回收PCR产物。回收的PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切后，分别连接到用同样双酶切的pET-30a表达载体(Novagen)上。构建好的重组表达质粒转化到感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，37℃在含有卡那霉素(终浓度为50微克/毫升)的LB培养基中培养10-15个小时。其中LB培养基的组成为：每升培养基中含有10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克NaCl，15克琼脂粉，其余为水。

阳性的克隆鉴定：双筛选法鉴定阳性克隆

步骤如下：

挑选单克隆至1mL含有卡那霉素(终浓度为50微克/毫升)的LB培养基中，37℃、200RPM振荡培养1至3小时至菌液明显浑浊。吸取各个单克隆对应的菌液1μl作为PCR鉴定的模板进行菌液PCR鉴定。

同时于各管菌液中加入1μl浓度为0.6mol/L的IPTG后，在37℃、200rpm振荡环境中继续培养并进行目的蛋白的诱导表达；表达1-2小时后，以13,000rpm离心1分钟收取上述菌液的菌体，加入40μl 1X SDS上样缓冲液重悬菌体并经过100℃变性5分钟，高速离心1分钟，收集上清液即为总蛋白样品；对此蛋白样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定对应单克隆的蛋白表达情况。

对照PCR鉴定和表达鉴定的结果选取并保存双阳性结果的单克隆。

实验过程如图1所示。

(二)10种多肽的表达及表达量分析

1、采用1.0L表达体系：将步骤(一)挑选的CPAF阳性克隆接种于含有卡那霉素的11LB培养基中，在37℃条件下振荡培养。当菌体浓度的OD₆₀₀值大约0.6时，温度降至25℃，继续振荡培养1小时；然后加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在25℃条件下，震荡诱导10个小时。

2、10种多肽的表达量、可溶性分析

蛋白的各种体外表达体系在表达外源基因时，表达的蛋白常常由于不正确折叠而形成不溶的包涵体(inclusion body)；或因此缺失其功能、造成蛋白性质的不均一。前者是全蛋白不正确折叠造成，后者是局部不正确折叠造成。形成这种不正确折叠的原因有：表达过程过快，表达量过大造成蛋白未能完全折叠；蛋白在过量表达状态下对表达宿主产生毒性促使宿主干预其正确表达；缺乏帮助其正确折叠的分子伴侣等等。因此，需对目的蛋白进行表达量与可溶性分析并作为表达条件优化的依据。

一般可溶性的分析的步骤是：

(1)将步骤1得到的1L菌液在4℃下、以4,000RPM的速度离心15分钟，收集菌体；加入30ml重悬缓冲液(25mM Tris，100mM NaCl，pH8.0)，震荡使菌体均匀混悬，加入蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲基磺酰氟)后超声裂解细胞，留存裂解的细胞悬液样品作为总蛋白样品，标记为CX。用同样的方法获得转入空载体pET-30a的细菌的总蛋白样品，以作为阴性对照。

(2)将已破碎的菌体混悬液高速离心(15000g)1小时，沉淀菌体碎片及其它不溶性物质，保留上清液以待进一步的纯化，并留存此上清液样品作为可溶性总蛋白样品，标记为SU。用同样的方法获得转入空载体pET-30a的细菌的可溶性总蛋白样品，以作为阴性对照。

(3)亲和纯化：

a、将步骤(1)中得到的总蛋白样品，缓慢通过亲和层析介质Ni-NTA，留取通过后的样品，此样品为未结合亲和层析介质的可溶性蛋白，标记为FT。

b、用10个柱体积洗涤缓冲液(25mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；15mM咪唑)冲洗亲和层析介质，洗去非特异性附着于介质上的蛋白；用洗脱缓冲液(5～10ml，25mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；250mM咪唑)将目标蛋白洗脱。此样品代表结合于亲和层析介质的可溶性蛋白，标记为EL。

分别将10种多肽的总蛋白样品(CX)、可溶性总蛋白样品(SU)、未结合亲和层析介质的可溶性蛋白(FL)、结合于亲和层析介质的可溶性蛋白(EL)并排进行SDS-PAGE凝胶电泳，上样量均是4ul。

10种多肽的电泳结果分别如图2-5所示。

结果表明：

①活性片段(1-609)和(1-599)的表达量和可溶性低，即含有前导序列的多肽在大肠杆菌中的表达量和可溶性降低(图2)；

②活性片段(11-599)(图3)和(11-609)(图4)的表达量和可溶性高。

③活性片段(21-609)(图5)和(21-599)(图3)的表达量和可溶性高。

④活性片段(25-609)的表达量和可溶性最高(图5)。

⑤活性片段(31-609)(图5)和(31-599)(图3)的表达量和可溶性高。

⑥活性片段(41-609)的表达量和可溶性高(图4)。

图2中，CX：细胞粗提物总蛋白；SU：破碎细胞经离心后上清液蛋白；FL：上清液蛋白通过Ni-NTA介质后的蛋白；EL：洗脱样品；MW为标准蛋白分子量。

图3中，CX：细胞粗提物总蛋白；SU：破碎细胞经离心后上清液蛋白；EL：洗脱样品；MW为标准蛋白分子量。

图4中，CX：细胞粗提物总蛋白；SU：破碎细胞经离心后上清液蛋白；EL1表示用溶液(5～10ml：25mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；30mM咪唑)洗脱下来的蛋白；EL2表示用溶液(5～10ml：25mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；250mM咪唑)洗脱下来的蛋白；MW为标准蛋白分子量。

图5中，CX：细胞粗提物总蛋白；SU：破碎细胞经离心后上清液蛋白；EL：洗脱样品；MW为标准蛋白分子量。

综上结果表明，删除多肽的N端的10-40个氨基酸的多肽的表达量及溶解性高；多肽C端的10个氨基酸不影响其表达量和溶解度。

(4)离子交换柱纯化酶原形式的10种多肽

将步骤(3)得到的从亲和层析介质Ni-NTA洗脱下来的蛋白质(EL)，用溶液A(25mM Tris，pH8.0；5mM DTT)稀释3倍，上样到已经用溶液A平衡过的离子交换层析柱上，以溶液A为起始液、以溶液B(25mM Tris pH8.0；1.0M NaCl；5mMDTT)为终止液进行梯度洗脱，流速为4毫升/分钟，氯化钠的浓度的变化速度为20mM/L/min，温度为4℃。收集各洗脱峰并进行SDS-PAGE电泳检测蛋白质。

实验设3次重复。

3次重复下10种多肽的峰面积的平均值分别为：(1-609)：0mAU*ml；(1-599)：0mAU*ml；(11-599)：596.5mAU*ml；(11-609)：596.5mAU*ml；(21-609)：2982.5mAU*ml；(21-599)：2982.5mAU*ml；(25-609)：4772mAU*ml；(31-609)：2982.5mAU*ml；(31-599)：2982.5mAU*ml；(41-609)：2386mAU*ml。收集的洗脱峰的电泳图表明均为单一的目的条带(图6，其中，A为多肽在离子交换柱上的洗脱峰；B为洗脱峰附近的样品的电泳图)。

(三)10种多肽的活化及纯化

(1)10种多肽的活化：

将步骤(二)从离子交换柱洗脱下来的、有洗脱峰的收集管中的蛋白质进行合并，使其终浓度为5毫克/毫升，将其放置室温(25℃)3-12小时；其间在不同时间点取样进行SDS-PAGE电泳分析。

活化结果表明，在活化过程中，CPAF酶原蛋白经过中间体逐渐活化成为有活性的两个亚基，其中多肽(25-609)共需3个小时即可完全活化为有活性的两个亚基(图7，其中，CPAF为活化前的酶原蛋白；CPAFn和CPAFc为活化后CPAF的两个亚基，而CPAFc1和CPAFc2为CPAFc的两个中间体。)

(2)活化后多肽的纯化：

将经过活化的10种多肽分别浓缩至10毫克/毫升，上样到已经经过溶液C(10mMTris pH8.0；100mM NaCl；5mM DTT)平衡过的凝胶过滤层析柱Superdex-200上，流速0.5毫升/分钟，0.5毫升/管。收集各峰并进行SDS-PAGE电泳检测。

实验设3次重复。

活化后的10种多肽的3次重复的峰面积的平均值分别为：(1-609)：0mAU*ml；(1-599)：0mAU*ml；(11-599)：477.2mAU*ml；(11-609)：477.2mAU*ml；(21-609)：2386mAU*ml；(21-599)：2386mAU*ml；(25-609)：3817.6mAU*ml；(31-609)：2386mAU*ml；(31-599)：2386mAU*ml；(41-609)：1908.8mAU*ml。收集的洗脱峰的电泳图表明均为29KD和35KD的两个亚基(CPAFn和CPAFc)(图8，其中，A为经过活化后的多肽在凝胶过滤层析柱上的洗脱峰；B为收集洗脱峰附近的电泳图)。

实验设3次重复。经活化纯化后，10种多肽的量的平均值分别为(1-609)：0mg/L菌液；(1-599)：0mg/L菌液；(11-599)：2mg/L菌液；(11-609)：2mg/L菌液；(21-609)：10mg/L菌液；(21-599)：10mg/L菌液；(25-609)：16mg/L菌液；(31-609)：10mg/L菌液；(31-599)：10mg/L菌液；(41-609)：8mg/L菌液。

(四)10种活化及纯化后多肽的活性分析

衣原体蛋白酶体样活性因子(CPAF)的活性片段可以降解宿主细胞内的多种蛋白。本实验中以纯化的RFX5(氨基酸181-616)作为底物，来检测经过凝胶过滤层析纯化活化的10种多肽的活性。

多肽的活性定义为：1微克多肽每分钟降解的RFX5的量。

具体方法如下：分别将1微克步骤(三)得到的10种活化纯化后的多肽，与100微克RFX5混合，并用溶液D(25mM Tris，pH8.0；150mM NaCl；5mM DTT)稀释至100微升；将其置于4℃条件下一段时间，其间，在不同时间点取样进行SDS-PAGE电泳分析反应后的产物。

结果表明，在以上条件下，10种多肽在2分钟内即可将RFX5完全降解(图9，图中CPAFn和CPAFc分别为活化CPAF的两个亚基)。8种多肽的活性分别为(11-599)：12ug RFX5/1ug多肽·min；(11-609)：12ug RFX5/1ug多肽·min；(21-609)：54ug RFX5/1ug多肽·min；(21-599)：54ug RFX5/1ug多肽·min；(25-609)：90ug RFX5/1ug多肽·min；(31-609)：54ug RFX5/1ug多肽·min；(31-599)：54ug RFX5/1ug多肽·min；(41-609)：44ug RFX5/1ug多肽·min。

序列表

<160>1

<210>1

<211>609

<212>Pro

<213>衣原体属沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis)

<400>1

Met Gly Phe Trp Arg Thr Ser Ile Met Lys Met Asn Arg Ile Trp Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Thr Phe Ser Ser Ala Ile His Ser Pro Val Gln Gly Glu

            20                  25                  30

Ser Leu Val Cys Lys Asn Ala Leu Gln Asp Leu Ser Phe Leu Glu His

        35                  40                  45

Leu Leu Gln Val Lys Tyr Ala Pro Lys Thr Trp Lys Glu Gln Tyr Leu

    50                  55                  60

Gly Trp Asp Leu Val Gln Ser Ser Val Ser Ala Gln Gln Lys Leu Arg

65                  70                  75                  80

Thr Gln Glu Asn Pro Ser Thr Ser Phe Cys Gln Gln Val Leu Ala Asp

                85                  90                  95

Phe Ile Gly Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly Val Thr Phe Phe Ala

            100                  105                  110

Ile Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Tyr Thr Val Gln Lys Ser Ser Asp Gly

        115                 120                 125

Arg Phe Tyr Phe Val Asp Ile Met Thr Phe Ser Ser Glu Ile Arg Val

    130                 135                 140

Gly Asp Glu Leu Leu Glu Val Asp Gly Ala Pro Val Gln Asp Val Leu

145                 150                 155                 160

Ala Thr Leu Tyr Gly Ser Asn His Lys Gly Thr Ala Ala Glu Glu Ser

                165                 170                 175

Ala Ala Leu Arg Thr Leu Phe Ser Arg Met Ala Ser Leu Gly His Lys

            180                 185                 190

Val Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys Ile Arg Arg Pro Phe Gly Thr

        195                 200                 205

Thr Arg Glu Val Arg Val Lys Trp Arg Tyr Val Pro Glu Gly Val Gly

    210                 215                 220

Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro Ser Ile Arg Ala Pro Gln Leu Gln Lys

225                 230                 235                 240

Ser Met Arg Ser Phe Phe Pro Lys Lys Asp Asp Ala Phe His Arg Ser

                245                 250                 255

Ser Ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met Val Pro His Phe Trp Ala Glu Leu

            260                 265                 270

Arg Asn His Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Lys Ser Gly Tyr Asn Ile Gly

        275                 280                 285

Ser Thr Asp Gly Phe Leu Pro Val Ile Gly Pro Val Ile Trp Glu Ser

    290                 295                 300

Glu Gly Leu Phe Arg Ala Tyr Ile Ser Ser Val Thr Asp Gly Asp Gly

305                 310                 315                 320

Lys Ser His Lys Val Gly Phe Leu Arg Ile Pro Thr Tyr Ser Trp Gln

                325                 330                 335

Asp Met Glu Asp Phe Asp Pro Ser Gly Pro Pro Pro Trp Glu Glu Phe

            340                 345                 350

Ala Lys Ile Ile Gln Val Phe Ser Ser Asn Thr Glu Ala Leu Ile Ile

        355                 360                 365

Asp Gln Thr Asn Asn Pro Gly Gly Ser Val Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu

    370                 375                 380

Leu Ser Met Leu Thr Asp Arg Pro Leu Glu Leu Pro Lys His Arg Met

385                 390                 395                 400

Ile Leu Thr Gln Asp Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Trp Leu Thr Leu

                405                 410                 415

Leu Glu Asn Val Asp Thr Asn Val Glu Ser Arg Leu Ala Leu Gly Asp

            420                 425                 430

Asn Met Glu Gly Tyr Thr Val Asp Leu Gln Val Ala Glu Tyr Leu Lys

        435                 440                 445

Ser Phe Gly Arg Gln Val Leu Asn Cys Trp Ser Lys Gly Asp Ile Glu

    450                 455                 460

Leu Ser Thr Pro Ile Pro Leu Phe Gly Phe Glu Lys Ile His Pro His

465                 470                 475                 480

Pro Arg Val Gln Tyr Ser Lys Pro Ile Cys Val Leu Ile Asn Glu Gln

                485                 490                 495

Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val Val Leu Lys Asp Asn Asp

            500                 505                 510

Arg Ala Leu Ile Val Gly Thr Arg Thr Ala Gly Ala Gly Gly Phe Val

        515                 520                 525

Phe Asn Val Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly Ile Lys Thr Cys Ser Leu

    530                 535                 540

Thr Gly Ser Leu Ala Val Arg Glu His Gly Ala Phe Ile Glu Asn Ile

545                 550                 555                 560

Gly Val Glu Pro His Ile Asp Leu Pro Phe Thr Ala Asn Asp Ile Arg

                565                 570                 575

Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Val Lys Lys Leu Val Cys

            580                 585                 590

Gln Leu Ile Asn Asn Asp Gly Thr Ile Ile Leu Ala Glu Asp Gly Ser

        595                 600                 605

Phe

Claims (11)

1.衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段，是下述多肽之一：

1)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第11-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

2)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第21-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

3)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第25-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

4)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第31-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

5)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第41-609位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

6)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第11-599位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

7)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第21-599位氨基酸残基所示的氨基酸序列；

8)其氨基酸序列为序列表中序列1自氨基末端起第31-599位氨基酸残基所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述活性片段的编码基因。

3.含有权利要求2所述编码基因的表达盒。

4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体。

5.含有权利要求2所述编码基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2所述编码基因的重组菌。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在pET系列载体的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

8.表达权利要求1所述活性片段的方法，包括如下步骤：将权利要求7所述重组载体导入大肠杆菌BL21细胞，然后将其在37℃条件下培养至所述大肠杆菌BL21细胞的溶液的OD₆₀₀值达到0.6-1.0，进行IPTG诱导，表达得到所述活性片段。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述IPTG诱导的条件为：在25℃条件进行诱导、所述IPTG的终浓度为0.1mM。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述诱导的时间为10-12小时。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌BL21为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL21(DE3plus)和大肠杆菌BL21(Rosseta)中的至少一种。

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