CN102839145A - 一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌、其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效表达重组蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其是通过反转录克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，构建原核重组表达质粒pET30a/蛇毒激肽原酶基因(pET30a/VK)，转入到大肠杆菌中，从中筛选出高效分泌表达的菌株。该表达系统所表达的外源蛋白的N端具有His蛋白标签，通过Ni柱洗脱的方法进行纯化，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，获得的重组蛋白纯度高达90％以上，且纯化效率高、成本低，适合目的蛋白的大规模制备。

Description

一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌、其构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达人源蛇毒激肽原酶的基因工程菌、其构建方法及应用。

背景技术

激肽原酶是动物体内的一种蛋白水解酶，存在于许多器官的组织中。人们认识最早、研究最为清楚的是蛇毒中的胰激肽原酶。胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又称为胰激肽释放酶(PancreaticKallikrein)是一类内切型蛋白水解酶，存在于哺乳动物体内的多种组织，尤以蛇毒中含量最为丰富。在体内作用于激肽原，使其释放出激肽，从而发挥出一系列的药理作用：使微血管扩张，改善外周血液循环；促进前列腺素分泌，扩张小动脉，增加肾血管流量；激活纤溶酶系统，使纤维蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。临床上主要用于微循环障碍引起的肾病变及眼底供血障碍、高血压症、脑动脉硬化和脑动脉血栓、冠心病及其它闭塞性周围血管性疾病的治疗。

目前国内临床上所使用的激肽原酶均为从哺乳动物的胰腺中提取，纯度不高，具有一定的抗原性，进入人体后，可能诱发一系列的抗原抗体反应，已有报道注射胰激肽原酶导致固定性药疹及重症多形红斑药疹，且不能实现静脉注射给药，使药物不能最大限度发挥作用。经过多年的临床实践，发现江浙蝮蛇蛇毒类激肽原酶有最好的疗效。然而蛇毒资源是非常有限的，如果通过基因工程来获得产品，则是一个很有前途的途径。

为此，本发明利用基因工程技术，通过反转录克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，利用大肠杆菌表达系统对其进行表达，使大规模生产安全的蛇毒激肽原酶成为可能，同时为蛇毒激肽原酶的结构和性质研究提供了实验材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效表达重组蛇毒激肽原酶的基因工程菌。

本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明的进一步目的是提供上述基因工程菌在生产重组蛇毒激肽原酶中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其出发菌株为大肠杆菌。优选地，其出发菌株为大肠杆菌BL21。

上述基因工程菌的构建方法，其包括步骤：1)从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到VK基因；2)将步骤1)中得到的VK基因插入到表达载体中；3)将步骤2)中构建的表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌。

前述的方法，其中所述表达载体的出发载体为pET30a。

前述的方法，其中所述VK基因具有Seq ID No：1所示的核苷酸序列。

为了获得原核表达载体质粒，本发明通过反转录江浙蝮蛇组织得到VK基因，用PCR方法在5’端加上CCATGG以构成NcoI酶切位点，3’端加上GCGGCCGC以构成Not I酶切位点，然后经NcoI及Not I两种酶消化后，即可直接克隆至pET30a质粒，得到pET30a/VK质粒。

本发明以pET30a作为表达载体，是由于pET系统是有史以来在大肠杆菌(E.coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导表达。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。此外pET30a表达系统能在所表达的外源蛋白的N端加上His蛋白标签，可以用Ni柱洗脱的方法进行纯化，从而极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，非常适合大规模目的蛋白的制备。

将上述pET30a/VK原核表达载体转入大肠杆菌BL21，然后进行重组克隆的筛选，从而获得大肠杆菌工程菌。所述工程菌的诱导培养方法包括：待工程菌于37℃培养至对数生长期后，按3～5v/v％的接种量将菌液接种于LB液体培养基中，当OD₆₀₀达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，在温度37℃，200rpm的条件下诱导培养4h。

本发明的诱导培养条件中，在IPTG浓度为1mmol/L的诱导条件下，目的蛋白可以大量表达；随着IPTG浓度的增加，蛋白表达量增加不明显；诱导温度对目的蛋白的诱导表达量也有一定影响，本发明研究了在较高温度(30℃、37℃)下目的蛋白在菌体裂解液上清的表达情况，当诱导温度为30℃或37℃时，目的蛋白几乎均以可溶形式表达形式存在；从蛋白表达的总量上看，37℃时得到的目的蛋白是最多的；目的蛋白的诱导表达量随着诱导时间的增加而增加，当诱导时间达到4h后目的蛋白的表达量趋于稳定。

为了分离纯化蛇毒激肽原酶蛋白，本发明还提供了由上述工程菌所表达的蛇毒激肽原酶蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，破碎菌体，提取并溶解含有VK蛋白的上清液；

2)用His TrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；

3)通过梯度脱盐。

具体地说，本发明中蛇毒激肽原酶蛋白的纯化方法包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，向菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取含有VK蛋白的上清液；

所述裂解液含有50mmol/L Tris-Cl、10mmol/L EDTA、100mmol/LNaCl、pH值为8.0；

2)将步骤1)中得到的上清液与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；

所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；

本发明的纯化方法，通过使用洗涤缓冲液洗涤细胞碎片杂质，能使VK重组蛋白纯度达到90％。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明通过RT-PCR方法反转录蛇毒激肽原酶基因，从而将蛇毒激肽原酶基因连接到原核表达载体上，转入大肠杆菌中高效表达，VK蛋白表达量占总蛋白的50％。

(2)使用pET30a作为表达载体，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制，由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导表达。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白表达量通常可以占到细胞总蛋白的50％以上，能够实现蛇毒激肽原酶基因的高效表达。

(3)本发明利用所表达的外源蛋白的N端具有His蛋白标签，可以用Ni柱洗脱的方法进行纯化，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，纯度高达90％以上，且纯化效率高、成本低，适合目的蛋白的大规模制备。

附图说明

图1为本发明通过PCR方法扩增得到的长度约为713bp的不含信号肽的蛇毒激肽原酶VK基因，其中，M为DL2000Marker；1，2为不含信号肽的蛇毒激肽原酶VK基因片段。

图2为本发明的重组表达质粒pET30a/VK的酶切鉴定电泳图，其中，M为DL2000Marker；7为双酶切产物。

图3为本发明VK重组蛋白纯化层析图。

图4为本发明VK重组蛋白表达纯化前后的SDS-PAGE分析图，其中，M为低分子量蛋白Marker；1、3为纯化前的蛋白；2为层析纯化后的蛋白条带。

图5为蛇毒激肽原酶VK基因表达蛋白的活性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蛇毒激肽原酶基因的扩增

从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到VK基因。用1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带后通过T4DNA连接酶于4℃连接过夜至pGEM-T载体，然后转化至大肠杆菌DH5α；转化株先经过蓝白斑筛选，再用PCR扩增(扩增的程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s，60℃复性15s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，结束反应)并进行测序鉴定。(图1)

实施例2表达载体的构建及大肠杆菌的转化

设计上游引物5’-CCATGGTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA-3’(下划线部分为Nco I酶切位点)和下游引物5’-GCGGCCGCTCACGGGGGGCATGTCA-3’(下划线部分为NotI酶切位点)，用PCR方法扩增得到不含信号肽的VK基因。PCR产物经Nco I和NotI消化后插入表达载体pET30a的Nco I和NotI位点，将此质粒转入大肠杆菌DH5α，提取转化株质粒经Nco I和NotI酶切，测序鉴定后(图2)，转入大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例3重组大肠杆菌的诱导表达

(1)挑取含有质粒pET30a/VK的重组大肠杆菌的阳性单克隆加入含卡纳抗生素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养，使其OD₆₀₀值达到0.5～0.6；

(2)取0.5mL菌液，10000rpm离心沉淀菌体。向菌体中加入100μL 1×SDS凝胶加样缓冲液，沸水浴10min后自然冷却备用，此为未诱导的阴性对照；

(3)向剩余的4.5mL菌液中加入IPTG使其终浓度达到1mM，继续诱导培养4h，每隔1h取菌液0.5mL，10000rpm离心沉淀菌体。实施例4破碎细胞提取上清液

取3g菌体加入20mL裂解液(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，pH8.0)中，加入溶菌酶至1mg/mL，在37℃孵育30min，每隔10min搅动一次；然后在冰浴条件下超声破碎，功率200～300W，每次超声10s，间隔10s，共超声30次；然后在4℃温度下，在12000r/min离心20～30min取上清；-20℃保存。

实施例5蛋白的纯化

His TrapTM FF凝胶柱用10mL双蒸水洗涤后用10mL结合缓冲液平衡，上样使目的蛋白与凝胶柱结合，没有结合的蛋白用洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，pH8.0)除去，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，pH8.0)洗脱，得到目的蛋白，纯度达90％。

实施例6重组蛋白的鉴定

对实施例5中得到纯化的目的蛋白蛋白进行SDS-PAGE电泳。(如图4所示)。对其活性进行测定(如图5所示)，可以看出标准品1U吸光值0.288；重组蛋白吸光值0.072，即重组蛋白活性为0.403U，具有激肽原酶活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌含有蛇毒激肽原酶(VK)基因的表达载体，所述蛇毒激肽原酶基因具有Seq ID No：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，表达载体的出发载体为pET30a。

3.如权利要求1所述的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，表达载体的工程菌为大肠杆菌工程菌。

4.如权利要求3所述的一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其特征在于，出发菌株为大肠杆菌BL21。

5.一种构建表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到蛇毒激肽原酶(VK)基因；

2)将步骤1)中得到的VK基因插入到表达载体中；

3)将步骤2)中构建的表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌，并对工程菌进行诱导培养产生目的蛋白。

6.如权利要求5所述的一种构建表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述的诱导培养方法包括：待工程菌于37℃培养至对数生长期后，按3～5v/v％的接种量将菌液接种于LB液体培养基中，当OD₆₀₀达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，在温度37℃，200rpm的条件下诱导培养4h。

7.如权利要求5所述的一种构建表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌的方法，其特征在于，工程菌表达的目的蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)离心并收集工程菌，向菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有VK蛋白的上清液；所述裂解液含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、pH值为8.0；所述洗涤液含有50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5v/v％Triton及10mmol/L β-巯基乙醇，pH值为8.0；

2)将步骤1)中得到的上清液与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8.0。

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