CN112322646A - 植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法 - Google Patents

植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，包括如下步骤，步骤1：设计引物构建原核表达载体；步骤2：原核系统中蛋白的表达；步骤3：蛋白纯化。本发明在传统原核表达纯化的基础上，根据膜结合蛋白的蛋白结构与性质，优化了其纯化方法，并筛选了相应的诱导表达条件与纯化缓冲液配置方法，实现了对膜结合蛋白的原核高浓度纯化表达。

Description

植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法
技术领域
本发明涉及一种表达纯化的方法，特别涉及一种植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法。
背景技术
拟南芥(Arabidopsis thaliana)又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科植物，拟南芥基因组大约为12500万碱基对和5对染色体。拟南芥是一年生细弱草本，高20-35厘米，被单毛与分枝毛。花序为疏松的总状花序，结果时可伸长达20厘米；萼片长圆卵形，长约1.5毫米，顶端钝、外轮的基部成囊状，外面无毛或有少数单毛；花瓣白色，长圆条形，长2-3毫米，先端钝圆，基部线形。角果长10-14毫米，宽不到1毫米，果瓣两端钝或钝圆，有1中脉与稀疏的网状脉，多为桔黄色或淡紫色；果梗伸展，长3-6毫米。种子每室1行，种子卵形、小、红褐色。花期4-6月。由于这些优点，拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
膜结合转录因子(membrane-bound transcription factors，MTFs)是转录因子家族中一类特殊的转录因子，在正常生长条件下通常锚定在细胞质膜或者内膜上并以静息状态存在。当植物体处于逆境条件或处在特殊发育阶段时，这些转录因子由内部或外部刺激激活从膜上分离，并迁移进入细胞核到真核生物基因的DNA启动子元件附近，与基因的启动子区域结合并同其他顺式作用元件如增强子、沉默子一起对转录进行调控，并在启动子区域招募RNA 聚合酶，组装成转录起始复合物，从而实现对RNA合成过程的调控(Allen andTaatjes,2015)。使得植物体可以在短时间内对胞内和胞外的多种信号实现快速的生理响应。
蛋白原核表达纯化是通过大肠杆菌在体外表达重组蛋白，目前以成为应用最为成熟的外源蛋白生产方式(Lee and Li et al.,2011)。但外源基因在大肠杆菌中的表达效率通常受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌液浓度等因素的影响(Busuttil andTurney et al.,2001)。膜结合转录因子，作为细胞内不可缺少的调控因子，在植物的生长发育与胁迫响应的生理过程中发挥着重要的作用，因此其外源表达系统的方法优化，有助于快速高效开展膜结合转录因子的体外生化研究，从而揭示此类转录调控因子的作用机制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，本发明在传统原核表达纯化的基础上，根据膜结合蛋白的蛋白结构与性质，优化了其纯化方法，并筛选了相应的诱导表达条件与纯化缓冲液配置方法，实现了对膜结合蛋白的原核高浓度纯化表达，可以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，包括如下步骤：
步骤1：设计引物构建原核表达载体
1)设计包含相应酶切位点的无缝克隆引物，随后扩增目的基因，在微量 PCR离心管中配制10μL PCR反应液，反应体系为：pfu DNAPolymerase 1μL， Buffer(10×)1μL，Mg2+1μL，dNTP 1μL，Primer-forward和Primer-reverse 两种扩增引物各0.5μL，cDNA 1μL，余量用双蒸水补齐至10μL；
2)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR 反应，反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s 36个循环，72℃延伸10min，得到PCR产物；
3)利用NEB公司酶切试剂盒中的限制性内切酶对PET 30a原核表达载体进行双酶切：20μL的酶切反应液成分为：浓度为50ng/μL质粒DNA 5～10μL，NEB Buffer(10×)2μL，BSA(100×)0.2μL，酶10.5μL，酶20.5μL，余量为双蒸水补齐；
4)利用无缝克隆技术将扩增的目的基因连接进入PET 30a原核表达载体中，配置10μL的反应液，反应体系为：目的基因扩增片段XμL，线性化载体YμL，SmeaLess CLoningMix(2×)5μL，其余为双蒸水补齐，其中线性化载体与目的基因扩增片段的摩尔比应介于1:1-1:3之间；
5)PCR连接反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，反应程序为：50℃保温45min，16℃持续30min等待回收；
6)将PET 30a原核表达载体与目的基因的重组质粒通过电转法转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株；
7)在终浓度为50ng/mL的卡那霉素LB固体培养基上涂布活化后的菌液，筛选成功转入重组质粒的阳性菌株；
8)选取单菌落，在卡那霉素终浓度为50ng/mL的LB液体培养基中充分活化扩增菌体；
9)利用目的基因的检测引物检测活化菌液是否为阳性菌株，配置10μL 的反应液，反应体系为：Taq酶(2×)5μL，Primer-forward-check和 Primer-reverse-check两种目的基因检测引物各0.5μL，不同活化菌株的菌液模板1μL，余量为双蒸水补齐；
步骤2：原核系统中蛋白的表达
1)在500mL卡那霉素终浓度为50ng/mL的LB液体培养基中加入OD600在0.8的BL21(DE3)大肠杆菌1-2mL；
2)在37℃180rpm的摇床中，扩增菌体6-8小时，菌体扩增前摇床紫外灭菌20min；
3)检测菌液OD600在0.8时，向菌液中加入终浓度为0.3-0.4mM的IPTG。
4)18℃160rpm的摇床中诱导12-14h；
5)离心机4℃8000rpm离心收集菌体；
步骤3：蛋白纯化；
1)离心机4℃8000rpm离心收集菌体，重悬于pH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer，所述pH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)， ImidazoLe(终浓度：25mM)，PMSF(终浓度：1mM)，其余为水，其中 PMSF需要在使用前加入到溶液中，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；
2)将细菌悬浮液置于冰上，超声破碎细菌获得破碎的细菌悬浮液，超声波粉碎仪的参数设置为：在28℃60％的超声强度下，超声粉碎菌体10min，该过程分别由5s的超声时间和5s的间隔时间循环交替组成；
3)离心机4℃12000rpm离心破碎的细菌悬浮液90min，取上清蛋白溶液于新的离心管中，全程应维持蛋白溶液处在4℃的低温环境下；
4)用10倍体积的ddH2O清洗gLutathione-sepHarose 4B填料，随后用10 倍体积的pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗填料，所述pH：7.4的 His标签融合蛋白重悬buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：25mM)，其余为双蒸水，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；
5)将蛋白溶液与gLutathione-sepHarose 4B填料混匀，放在静音混合器上 4℃混合2h；
6)将结合后的混合液预装柱，待上述蛋白液全部流出后，用4℃预冷pH： 7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗柱填料；
7)清洗过程中多次检测杂蛋白的含量，清洗至完全洗去杂蛋白即可；
8)杂蛋白去除干净后封闭柱子，加入4℃预冷的pH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer与填料多次混匀，静置10min，所述pH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)， NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：250mM)，其余为双蒸水，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；
9)收集洗脱液，即可用于后续实验和结果分析。
进一步地，所述电转法大肠杆菌转化方法为：
Ⅰ.取3-5μL上述重组反应液，加入到冰浴融化的大肠杆菌(BL21(DE3)) 感受态细胞中，轻轻吸打混匀；
Ⅱ.将混合的菌液注入到宽度为0.2cm的电极杯中，在2.5kV的电压下电击一次；
Ⅲ.将电击后的菌液注入到500μL的LB液体培养基中，37℃180rpm活化40min。
进一步地，所述引物的设计方法为：去除膜结合转录因子序列中的膜定位信号肽后，进行引物设计。
进一步地，选择BamH I和Sal I为酶切位点用于与PET 30a连接的目的基因PCR扩增引物为： Amplification-F:CAAGGCCATGGCTGATATCGGATCC(目的基因正向引物)Amplification-R:CGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGAC(目的基因反向引物)
进一步地，步骤1的第3)步具体步骤为：
Ⅰ.内切酶从冰箱内取出放置冰上；
Ⅱ.先将DNA、NEB Buffer、BSA和双蒸水按量混匀，4度放置30min；
Ⅲ.按量加入内切酶，混匀，瞬时离心；
Ⅳ.37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离成功酶切质粒组分。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过设计无缝克隆引物构建PET 30a与目的基因的融合表达载体，经过抗性筛选获得阳性菌株，进行目的蛋白的诱导表达和纯化，与其他植物蛋白纯化方法相比，本原核表达纯化系统可以更有效的纯化膜相关蛋白增加纯化效率，更具有高效性和实用性，对膜结合转录子的蛋白生化研究与体外生化实验的开展意义重大，在本发明中融合表达载体构建系统得到了优化，而且还改进(测试)了BL21表达菌株诱导蛋白表达的诱导条件，优化了诱导温度，IPTG浓度以及诱导时间等方法，同时改进了蛋白纯化过程中缓冲液的配置以及操作流程，既节省时间，又节约成本，进一步提高了原核蛋白纯化系统在纯化膜结合蛋白过程中应用的效率。
附图说明
图1为本发明的实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
拟南芥膜结合转录因子AtCLB的原核表达及纯化
步骤一、设计引物构建原核表达载体ProT7:AtCLB-GFP
1)设计包含BamHI和Sal I酶切位点的无缝克隆引物
2)PCR扩增引物为：
AtCLB-F:GACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCCGTATGATGACTC ACCGATC
AtCLB-R:GTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCTGTTTTGCA CCATCGT
3)随后扩增AtCLB，在微量PCR离心管中配制10μl PCR反应液，反应体系为：pfuDNAPolymerase 1μl，Buffer(10×)1μl，Mg2+1μl，dNTP 1μl， AtCLB-F和AtCLB-R两种扩增引物各0.5μl，cDNA 1μl，余量4μl用双蒸水补齐至10μl。
4)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR 反应，反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s 36个循环，72℃延伸10min，得到PCR产物。
5)利用NEB公司酶切试剂盒中的BamHI和Sal I限制性内切酶对PET 30a 原核表达载体进行酶切：20μl的酶切反应液成分为：浓度为100ng/μl质粒DNA 5μl，NEB Buffer(10×)2μl，BSA(100×)0.2μl，BamHI酶0.5μl，Sal I酶 0.5μl，余量11.8μl双蒸水补齐。具体步骤为：
Ⅰ.内切酶从冰箱内取出放置冰上
Ⅱ.先将DNA、NEB Buffer、BSA和双蒸水按量混匀，4度放置30min
Ⅲ.按量加入内切酶，混匀，瞬时离心
Ⅳ.37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离成功酶切质粒组分
6)利用无缝克隆技术将AtCLB连接进入PET 30a原核表达载体中，获得 ProT7:AtCLB-GFP融合表达载体，配置10μl的反应液，反应体系为：目的基因扩增片段2μl，线性化载体3μl，Smealess Cloning Mix(2×)5μl。
7)PCR连接反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，反应程序为：50℃保温45min，16℃持续30min等待回收。
8)将ProT7:AtCLB-GFP重组质粒通过电转法转入大肠杆菌BL21表达菌株，具体操作步骤为：
Ⅰ.取3-5μl上述重组质粒，加入到冰浴融化的大肠杆菌(BL21)感受态细胞中，轻轻吸打混匀
Ⅱ.将混合的菌液注入到宽度为0.2cm的电极杯中，在2.5kV的电压下电击一次
Ⅲ.将电击后的菌液注入到500μl的LB液体培养基中，37℃180rpm活化 40min
9)在卡那霉素终浓度为50ng/ml的LB固体培养基上涂布活化后的菌液，筛选成功转入重组质粒的阳性菌株。
10)选取单菌落，在卡那霉素终浓度为50ng/ml的LB液体培养基中充分活化扩增菌体。
11)利用目的基因的检测引物检测活化菌液是否为阳性菌株，配置10μl 的反应液，反应体系为：Taq酶(2×)5μl，Check-F和Check-R两种目的基因检测引物各0.5μl，不同活化菌株的菌液模板1μl，余量3μl用双蒸水补齐。
12)检测引物为：
Check-F:CGTATGATGACTCACCGATC
Check-R:CTGCTGTTTTGCACCATCGT
步骤二、原核系统中蛋白的表达
1)在500ml卡那霉素终浓度为50ng/ml的LB液体培养基中加入OD600在0.8的BL21大肠杆菌1-2mL。
2)在37℃180rpm的摇床中，扩增菌体7小时，菌体扩增前摇床紫外灭菌20min。
3)检测菌液OD600在0.8时，向菌液中加入终浓度为0.3-0.4mM的IPTG。
4)18℃160rpm的摇床中诱导12h。
5)离心机4℃8000rpm离心收集菌体。
第三步、蛋白纯化
1)离心机4℃8000rpm离心收集菌体，重悬于PH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer。
2)将细菌悬浮液置于冰上，超声破碎细菌获得破碎的细菌悬浮液，超声波粉碎仪的参数设置为：在28℃60％的超声强度下，超声粉碎菌体10min，该过程分别由5s的超声时间和5s的间隔时间循环交替组成。
3)离心机4℃12000rpm离心破碎的细菌悬浮液90min，取上清蛋白溶液于新的离心管中，全程维持蛋白溶液处在4℃的低温环境下。
4)用10倍体积的ddH2O清洗glutathione-sepharose 4B填料，随后用10 倍体积的PH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗填料。
5)将蛋白溶液与glutathione-sepharose 4B填料混匀，放在静音混合器上 4℃混合2h。
6)将结合后的混合液预装柱，待上述蛋白液全部流出后，用4℃预冷PH： 7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗柱填料。
7)清洗过程中多次检测杂蛋白的含量，清洗至完全洗去杂蛋白即可。
8)杂蛋白去除干净后封闭柱子，加入4℃预冷的PH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer与填料多次混匀，静置10min。
9)收集洗脱液，即可用于后续实验和结果分析，结果如图1。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：设计引物构建原核表达载体
1)设计包含相应酶切位点的无缝克隆引物，随后扩增目的基因，在微量PCR离心管中配制10μL PCR反应液，反应体系为：pfu DNAPolymerase 1μL，Buffer(10×)1μL，Mg2+1μL，dNTP1μL，Primer-forward和Primer-reverse两种扩增引物各0.5μL，cDNA 1μL，余量用双蒸水补齐至10μL；
2)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s 36个循环，72℃延伸10min，得到PCR产物；
3)利用NEB公司酶切试剂盒中的限制性内切酶对PET 30a原核表达载体进行双酶切：20μL的酶切反应液成分为：浓度为50ng/μL质粒DNA 5～10μL，NEB Buffer(10×)2μL，BSA(100×)0.2μL，酶10.5μL，酶20.5μL，余量为双蒸水补齐；
4)利用无缝克隆技术将扩增的目的基因连接进入PET 30a原核表达载体中，配置10μL的反应液，反应体系为：目的基因扩增片段XμL，线性化载体YμL，SmeaLess CLoning Mix(2×)5μL，其余为双蒸水补齐，其中线性化载体与目的基因扩增片段的摩尔比应介于1:1-1:3之间；
5)PCR连接反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，反应程序为：50℃保温45min，16℃持续30min等待回收；
6)将PET 30a原核表达载体与目的基因的重组质粒通过电转法转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株；
7)在终浓度为50ng/mL的卡那霉素LB固体培养基上均匀涂布活化后的菌液，筛选成功转入重组质粒的阳性菌株；
8)选取单菌落，在卡那霉素终浓度为50ng/mL的LB液体培养基中充分活化扩增菌体；
9)利用目的基因的检测引物检测活化菌液是否为阳性菌株，配置10μL的反应液，反应体系为：Taq酶(2×)5μL，Primer-forward-check和Primer-reverse-check两种目的基因检测引物各0.5μL，不同活化菌株的菌液为模板1μL，余量为双蒸水补齐；
步骤2：原核系统中蛋白的表达
1)在500mL卡那霉素终浓度为50ng/mL的LB液体培养基中加入OD600在0.8的BL21(DE3)大肠杆菌1-2mL；
2)在37℃180rpm的摇床中，扩增菌体6-8小时，菌体扩增前摇床紫外灭菌20min；
3)检测菌液OD600在0.8时，向菌液中加入终浓度为0.3-0.4mM的IPTG。
4)18℃160rpm的摇床中诱导12-14h；
5)离心机4℃8000rpm离心收集菌体；
步骤3：蛋白纯化
1)离心机4℃8000rpm离心收集菌体，重悬于pH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer，所述pH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：25mM)，PMSF(终浓度：1mM)，其余为水，其中PMSF需要在使用前加入到溶液中，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；
2)将细菌悬浮液置于冰上，超声破碎细菌获得破碎的细菌悬浮液，超声波粉碎仪的参数设置为：在28℃60％的超声强度下，超声粉碎菌体10min，该过程分别由5s的超声时间和5s的间隔时间循环交替组成；
3)离心机4℃12000rpm离心破碎的细菌悬浮液90min，取上清蛋白溶液于新的离心管中，全程应维持蛋白溶液处在4℃的低温环境下；
4)用10倍体积的ddH2O清洗gLutathione-sepHarose 4B填料，随后用10倍体积的pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗填料，所述pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：25mM)，其余为双蒸水，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；
5)将蛋白溶液与gLutathione-sepHarose 4B填料混匀，放在静音混合器上4℃混合2h；
6)将结合后的混合液预装柱，待上述蛋白液全部流出后，用4℃预冷pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗柱填料；
7)清洗过程中多次检测杂蛋白的含量，清洗至完全洗去杂蛋白即可；
8)杂蛋白去除干净后封闭柱子，加入4℃预冷的pH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer与填料多次混匀，静置10min，所述pH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：250mM)，其余为双蒸水，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；
9)收集洗脱液，即可用于后续实验和结果分析。
2.如权利要求1所述的植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，其特征在于，所述电转法大肠杆菌转化方法为：
Ⅰ.取3-5μL上述重组反应液，加入到冰浴融化的大肠杆菌(BL21(DE3))感受态细胞中，轻轻吸打混匀；
Ⅱ.将混合的菌液注入到宽度为0.2cm的电极杯中，在2.5kV的电压下电击一次；
Ⅲ.将电击后的菌液注入到500μL的LB液体培养基中，37℃180rpm活化40min。
3.如权利要求1所述的植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，其特征在于，所述引物的设计方法为：去除膜结合转录因子序列中的膜定位信号肽后，进行引物设计。
4.如权利要求1所述的植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，其特征在于，选择BamHI和SalI为酶切位点用于与PET 30a连接的目的基因PCR扩增引物为：
Amplification-F:CAAGGCCATGGCTGATATCGGATCC(目的基因正向引物)
Amplification-R:CGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGAC(目的基因反向引物)。
5.如权利要求1所述的植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，其特征在于，步骤1的第3)步具体步骤为：
Ⅰ.内切酶从冰箱内取出放置冰上；
Ⅱ.先将DNA、NEB Buffer、BSA和双蒸水按量混匀，4度放置30min；
Ⅲ.按量加入内切酶，混匀，瞬时离心；
Ⅳ.37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离成功酶切质粒组分。
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