CN105859891A

CN105859891A - Gfp-cd19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用

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Publication number: CN105859891A
Application number: CN201610354642.0A
Authority: CN
Inventors: 季少平; 房娜; 王凤玲; 赵伟; 郭向前; 肖曼; 王树真; 王豪杰
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2036-05-26
Also published as: CN105859891B

Abstract

本发明属于细胞标记技术领域，具体涉及一种GFP‑CD19融合蛋白、制备方法及其在细胞标记方面应用的专利申请。所述GFP‑CD19融合蛋白包括776个氨基酸，分子量约为85KD；该融合蛋白用于标记细胞表面表达有抗CD19抗体的细胞。本申请利用抗原‑抗体或受体‑配体的特异结合原理，有针对性地制备了GFP‑CD19融合蛋白，该蛋白可特异结合嵌合抗原受体并对其进行荧光标记，由于只有有效转染并表达了嵌合抗原受体的T淋巴细胞才能与该蛋白结合，因而通过检测荧光细胞数量即可对有效转染的T细胞数量进行统计，而依据该数据即可准确控制回输病人体内的有效T‑淋巴细胞数量，从而为应用CAR‑T技术对肿瘤的治疗提供保障。

Description

GFP-CD19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用

技术领域

本发明属于细胞标记技术领域，具体涉及一种GFP-CD19融合蛋白制备方法及其在细胞标记方面的应用的专利申请。

背景技术

随着分子免疫学的发展，人们对T细胞介导的肿瘤免疫过程认识日益深入；与此同时，T细胞在肿瘤细胞免疫耐受以及肿瘤细胞的免疫逃逸中的机制，引起研究人员广泛的兴趣与重视。众所周知，在肿瘤的免疫监控与杀灭过程中，T淋巴细胞起着十分主要的作用。但由于各种基因突变或异常表达现象的存在，肿瘤细胞会表达一些正常组织细胞所不具有的分子，即常说的肿瘤分子标记（marker）/肿瘤特异性抗原。T淋巴细胞攻击肿瘤细胞过程中，需要接受由抗原递呈细胞（DC）加工后的抗原，才能被激活发挥免疫作用；但是T淋巴细胞在获得这些加工后抗原以及激活过程中还要受到MHC (major histocompatibilitycomplex）的限制，从而导致T细胞的抗原接受作用以及被激活能力受到不同程度的抑制。此外，T淋巴细胞在接受 DC 细胞的抗原与激活过程还会受到其它调节性信号的抑制（如CTLA-4 及其配体 CD80/CD86； PD-1及其配体PD-L1等）。正常情况下，这些抑制因素或调节信号在免疫系统中保持平衡，并不会阻碍正常的T细胞激活（或者说对激活的T细胞的数量不造成实际影响）；但在肿瘤病人体内，这些抑制因素及调节信号会导致T淋巴细胞在受到抗原刺激时，不能被有效激活，从而产生免疫耐受。更为糟糕的是，一些肿瘤细胞也会表达这些受体或配体，从而使得肿瘤细胞在受到T淋巴细胞攻击时抑制T淋巴细胞的活性，使T淋巴细胞处于“麻痹”或“昏睡”状态，而无法发挥免疫作用。

为摆脱 MHC 限制的抑制作用，一种人工嵌合抗原受体（Chimeric AntigenReceptor，CAR）-T细胞技术得到了较快发展。由于它采用了嵌合分子技术，将几种分子的功能结构域（domains）重组成一个类似抗原受体的大分子，并表达于T淋巴细胞表面；通过这个类似的抗原受体，使得T细胞一方面能有效地利用抗原-抗体或受体-配体的特异性找到表达有特定标记物（marker）的肿瘤细胞，同时又能有效的将抗原刺激信号传递到T细胞，使得T淋巴细胞在不依赖于MHC的情况下，得到有效的激活并增殖，因而可有效地杀灭肿瘤细胞。

理论而言，CAR-T技术可用于各种肿瘤的治疗，包括实体瘤与血液系统肿瘤、无法切除的原位肿瘤与转移远处的肿瘤。除了特异抗原的鉴定与开发外，这一技术应用的关键之一在于在治疗肿瘤时，能够有效控制回输给病人的CAR-T细胞的数量，因为回输的有效T淋巴细胞数量与治疗效果间是具有明显相关性的，回输时如果有效T淋巴细胞数量过少，显然无法达到预期的治疗作用；而如果回输的有效T淋巴细胞数量过多，则容易引起严重的不良反应，如细胞因子风暴等。因而对于回输时有效T淋巴细胞数量的精确控制对于提高治疗效果是十分重要的。

现有的CAR-T细胞治疗技术中，要想较为准确控制回输给病人时有效T淋巴细胞数量，可进行流式分选操作，获得嵌合抗原受体表达的细胞，但由于该方法的成本太高（为避免交叉感染，每个病人要更换一套管道系统），因而并不适合普遍推广应用。另外一种确定有效T淋巴细胞数量的方法是对细胞进行适当标记（即转染带有荧光蛋白共表达的载体），通过荧光蛋白识别有效转染的细胞。但是外源蛋白可能会引起细胞毒性或增加免疫原性，而增加治疗时的风险。对治疗用CAR-T细胞进行这样的标记时需要谨慎考虑，而这已经严重制约了CAR-T细胞在实际治疗中的应用，因而建立一套有效地、快速且安全的检测CAR-T细胞转染效率（即表达嵌合抗原受体细胞的比例）的方法已经成为当务之急。

发明内容

本发明目的在于提供一种GFP-CD19融合蛋白，用来标记CD19蛋白分子，利用该蛋白可对细胞表面是否表达有效抗CD19抗体（嵌合抗原受体）进行快速检测，从而便于统计和区分有效转染（即表达嵌合抗原受体）细胞数量。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一种GFP-CD19融合蛋白，包括776个氨基酸，分子量为85KD，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

所述GFP-CD19融合蛋白，通过以下步骤制备获得：

（1）以带有CD19 cDNA序列的质粒和带有GFP cDNA序列的质粒pET-28b-EGFP为模板，设计引物，进行PCR扩增，分别获得CD19分子的编码序列与GFP分子的编码序列；

PCR扩增CD19分子的基因序列时所采用引物序列如下：

上游引物：5’- AGGATCCgaggaacctctagtggtgaagg-3’，

下游引物：5’- CAAGCTTtcacctggtgctccaggtgccc-3’；

PCR扩增GFP分子的基因序列时所采用引物序列如下：

上游引物：5’- GCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3’，

下游引物：5’- AGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’；

（2）将CD19基因序列和GFP基因序列分别与pGEM T-EASY载体连接，转化并筛选鉴定，获得正确的含有目的基因的pGEM-CD19质粒和pGEM-GFP质粒，进行测序验证；

（3）将pGEM-CD19质粒与原核表达载体pCold TF分别利用BamHI和HindIII进行双酶切，将CD19编码区连接进pCold TF，构建pCold-CD19载体；

（4）将所构建pCold-CD19载体与pGEM-GFP质粒分别利用NdeI和BamHI进行双酶切，将GFP编码区连接进pCold-CD19，构建重组表达载体pCold TF-GFP-CD19；

（5）将重组表达载体pCold TF-GFP-CD19转化BL21感受态细胞，IPTG诱导表达重组蛋白GFP-CD19；

（6）诱导表达结束后，裂解菌体，采用Ni-NTA亲和色谱法纯化获得GFP-CD19融合蛋白。所述GFP-CD19融合蛋白应用时，用于标记细胞表面表达有CD19抗体的转染后T细胞，具体而言：

使用时，取一定量的慢病毒转染后T淋巴细胞，加入GFP-CD19融合蛋白至0.2~2.0 μg/mL；在同样细胞培养条件下孵育2-4小时后，更换至正常培养基，在荧光显微镜下，有绿色荧光的细胞即为有效转染的细胞，也就是有抗CD19抗体（即嵌合抗原受体）表达于细胞表面的细胞；经计数定量，根据绿色荧光细胞的数量就可以确定样品中有效T淋巴细胞数量，从而便于控制回输给病人时有效T淋巴细胞数量，为获得较好治疗效果奠定基础。

现有技术中，应用CAR-T技术的主要流程是：首先采集病人外周血，分离T淋巴细胞并扩大培养；然后利用包装的嵌合受体病毒颗粒感染所培养的病人T-淋巴细胞，经进一步培养及细胞因子等刺激的作用后，T淋巴细胞增殖迅速加快，当达到一定细胞数量时，收集这些T淋巴细胞经质控与检测后回输到病人体内进行肿瘤的治疗。但是需要注意的是，由于病毒感染细胞的效率会随不同的病人或其它因素而改变，因此，适当控制回输到病人体内的有效转染细胞的数量是十分重要的一步。过少的有效细胞可能无效，而过多的有效细胞可能会导致诸如细胞因子风暴等严重的副作用。

需要解释和说明的是，现有技术中，CAR-T技术可用作嵌合抗原受体的分子多达200多种，但就现有临床前及临床实验结果而言，以抗CD19的抗体介导的CAR-T技术是现有技术中最有疗效的方法，因而针对这一嵌合抗原受体（抗体）进行适当标记并以此为基础对有效转染细胞进行区分与定量是最具有应用前景的方法。

总体而言，本申请利用抗原-抗体或受体-配体的特异结合原理，有针对性地制备了GFP-CD19融合蛋白，该蛋白可特异结合嵌合抗原受体并对其进行荧光标记，由于只有有效转染并表达了嵌合抗原受体的T淋巴细胞才能与该蛋白结合，因而通过检测荧光细胞数量即可对有效转染的T细胞数量进行统计，而依据该数据即可准确控制回输病人体内的有效T-淋巴细胞数量，从而为肿瘤的预防和治疗提供保障。

附图说明

图1为CD19和GFP基因的PCR扩增产物电泳图，其中左侧为CD19的扩增产物，M：DL5000；右侧为GFP扩增产物，M：DL2000；

图2为pGEM-CD19质粒和pGEM-GFP质粒双酶切鉴定电泳图；其中左侧为pGEM-CD19质粒（pGEM对应图中T载体），M：MarkerⅣ；右侧为pGEM-GFP质粒（pGEM对应图中T载体），M：MarkerⅢ；

图3为pCold-CD19质粒载体的双酶切鉴定电泳图，图中M：MarkerⅤ；

图4为pCold TF-GFP-CD19重组质粒的双酶切鉴定电泳图；图中M：DL5000；

图5为GFP-CD19融合蛋白诱导纯化电泳图；

图6为加入融合蛋白后HEK 293细胞绿色荧光表达情况（100×），其中A：未感染病毒的293细胞，B：感染病毒的293细胞；A1（上图左侧）：明场，A2（上图右侧）：绿色荧光，B1（下图左侧）：明场，B2（下图右侧）：绿色荧光；

图7为加入融合蛋白后Daudi细胞绿色荧光表达情况（100×），其中A：未感染病毒的Daudi细胞，B：感染病毒的Daudi细胞；A1（上图左侧）：明场，A2（上图右侧）：绿色荧光，B1（下图左侧）：明场，B2（下图右侧）：绿色荧光；

图8为加入融合蛋白后的Jacket细胞绿色荧光表达情况（100×），其中A：未感染病毒的Jacket细胞，B：感染病毒的Jacket细胞；A1（上图左侧）：明场，A2（上图右侧）：绿色荧光，B1（下图左侧）：明场，B2（下图右侧）：绿色荧光。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前对本发明中所涉及部分生物材料、主要试剂、主要设备等情况简要介绍如下，其他未述及试剂及仪器设备以本领域中常用为准，不再重复介绍。

生物材料：

带有CD19标记的cDNA质粒（RefSeq ID：NM_001770；CDS size：1671；Description：Homosapiens CD19 molecule (CD19)，transcript variant 2，mRNA），购买于上海吉凯基因化学技术有限公司；

带有GFP蛋白的质粒pET-28b-EGFP，购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；需要解释的是，质粒pET-28b(+)是一种原核生物表达载体，抗性是Kanr（卡那霉素抗性），载体宿主是E.coil；其多克隆位点的上下游各有一个His-tag，且在多克隆位点内部有一个T7-Tag的基因；在将EGFP(绿色荧光蛋白)序列插入时，插入位点为NdeI-BamHI，EGFP表达后，与His-Tag融合表达的蛋白可以采用Ni-NTA柱纯化方式纯化目的蛋白；

用于表达CD19抗体的慢病毒颗粒，由上海吉凯基因化学技术有限公司包装，病毒滴度为5×10⁸TU/mL；该病毒感染细胞后无绿色和红色荧光表达；

原核表达载体pCold TF，该载体含有T7启动子和氨苄青霉素抗性基因，购自大连宝生物工程有限公司；

TOP10感受态细胞、BL21细胞，均购自大连宝生物工程有限公司；

感染HEK 293细胞、Daudi和Jacket细胞等细胞样品，购自中国科学院细胞库；

相关引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成提供。

主要试剂：

PCR合成过程中相关试剂，Takara公司；

DNA Marker，上海Lifefeng生物科技有限公司；

质粒提取试剂盒、微量DNA快速回收试剂盒，上海Lifefeng公司；

T-EASY试剂盒，promega公司；

预染蛋白Maker，美国Thermo Fisher scientific；

Ni-NTA resin填料，北京全式金生物技术有限公司；

RPMI-1640培养基、DMEM培养基相关物料，Gibco Life Techonolyge公司；

主要设备：

PCR扩增仪，Thermo Fisher scientific；

水平电泳仪（DYY-6C）、WD-9413B紫外凝胶成像分析仪，北京市六一仪器厂；

TI-E荧光显微镜，日本尼康；

Alpha化学发光成像系统，美国ProteinSimple。

实施例

GFP-CD19融合蛋白（绿色荧光蛋白），包括776个氨基酸，分子量为85KD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。由于该蛋白的获得是本发明实施的关键部分，因而本实施例就该蛋白的制备过程简要介绍如下。

一、设计引物，进行PCR扩增，分别获得CD19分子的基因序列与GFP分子的基因序列；

PCR扩增CD19分子的基因序列时所采用引物序列如下：

上游引物：5’- AGGATCCgaggaacctctagtggtgaagg-3’，

下游引物：5’- CAAGCTTtcacctggtgctccaggtgccc-3’；

PCR扩增GFP分子的基因序列时所采用引物序列如下：

上游引物：5’- GCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3’，

下游引物：5’- AGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’；

分别以带有CD19标记的cDNA质粒和带有GFP蛋白的质粒pET-28b-EGFP为模板，进行PCR扩增，50μL扩增体系设计如下：

质粒模板，200 ng/μL、1 μL；

10×PCR 缓冲液，5 μL；

dNTP 混合物（2.5 mM/ each），2μL；

Taq 聚合酶，5U/μL、0.5μL；

上游引物，10 uM、5 μL；

下游引物，10 uM、5 μL；

ddH₂O，31.5 μL；

PCR扩增程序：变性，退火和延伸，参数分别是：94℃、5 min；94℃、30 sec，55℃、30sec，72℃、45 sec，30个循环；72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图中可以看出，在1600bp和700bp处均有清晰的预期条带。

参考微量DNA快速回收试剂盒说明书，对含有目的基因的琼脂糖凝胶条带进行切胶回收，获得目的基因，具体步骤为：

用干净的手术刀在紫外灯下小心切下PCR扩增后含有目的基因条带的胶块（尽可能切得更小），放入干净的EP管；

称取重量，以质量体积比为1：3的比例加入溶胶液，50℃水浴直至胶块完全溶化；

吸取EP管内的液体加入吸附柱内离心，12000 rpm、30s，弃掉流出废液；加 700 µL漂洗液，12000 rpm、30s，弃掉流出废液；加500µL漂洗液离心，12000 rpm、30s，弃废液，再离心，12000 rpm、1min；

取出吸附柱转移到一干净的EP管，室温晾干5 min，加20 µL洗脱液，12000 rpm、1 min；

EP管内即为回收得到的纯化的目的DNA。

二、将步骤（1）中扩增得到的CD19序列和GFP序列与原核表达载体pCold TF进行连接，具体为：首先将步骤（1）中扩增得到的目的基因（CD19序列和GFP序列）与pGEM T-EASY载体连接，转化并筛选鉴定获得正确的含有目的基因的pGEM T质粒后，再进行酶切，并与原核表达载体pCold TF进行连接，筛选、鉴定获得正确的重组质粒表达载体；详细过程介绍如下。

1、与pGEM T-EASY载体的连接，构建含有目的基因的重组质粒

参考pGEM T-EASY VECTOR载体T-EASY试剂盒（promega公司）说明书，将步骤（1）中所获得的纯化后的目的基因（CD19序列和GFP序列）分别与pGEM T-EASY载体进行连接，连接时，10μL连接体系设计如下：

步骤（1）中胶回收产物（目的基因），2 μg/μL 、4 μL；

T-载体（pGEM T-EASY载体），1 μL；

连接buffer，1 μL；

T4 DNA 连接酶，1 μL（100U/μL）；

ddH₂O，3 μL；

12℃连接过夜。

将上述连接产物转化TOP10感受态细胞，具体步骤为：

取上述连接产物5μL加入到50μL TOP10感受态细胞中，混匀后，冰浴45 min；42℃水浴90秒热休克，立即冰浴2min；加入400μL SOC培养基，37℃、200r/min振荡摇床培养60min；

培养结束后，4000 rpm离心3min，移去150μL上清；剩余部分均匀涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）抗生素的LB平板中，同时平板中含有X-gal（20μg/mL）、IPTG（100μg /mL）；干燥后倒置平皿37℃培养过夜。

培养结束后，挑取阳性白色克隆，于5mL、LB培养基中（含有氨苄青霉素100μg/mL）37℃振荡培养过夜。

培养结束后，离心收集细菌沉淀，参考质粒提取试剂盒（OMEGA）说明书，提取质粒。

对所提取的质粒进行酶切鉴定，对含有CD19序列的pGEM-CD19质粒采用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定，对含有GFP序列的pGEM-GFP质粒采用NdeI 和BamHI进行双酶切鉴定；10μL酶切体系设计如下：

质粒，3 μL；

CutSmart buffer，1 μL；

Bam HI和Hind Ⅲ（或Nde I和Bam HI），各0.5 μL（15U/μL）；

ddH₂O，5 μL；

37℃酶切1小时。

酶切产物进行电泳分析（电泳图如图2所示），电泳检测表明对pGEM-CD19质粒可切出约1600 bP大小的片段，对pGEM-GFP质粒可切出约740 bP大小的片段；此结果表明重组质粒pGEM-CD19和pGEM-GFP构建成功。

回收相应片段并送上海生工生物技术公司测序鉴定；对双酶切鉴定和测序正确的质粒保存备用。

2、将步骤1中扩增所得的CD19序列和GFP序列与载体pCold TF连接，构建重组表达载体pCold TF-GFP-CD19，具体为：首先对步骤1中含有CD19序列的pGEM-CD19质粒和pColdTF载体利用BamHI和Hind Ⅲ分别进行双酶切，然后将酶切产物进行连接，构建含有CD19序列的pCold-CD19载体，然后再对步骤1中含有GFP序列的pGEM-GFP质粒和pCold-CD19载体利用NdeI和BamHI进行双酶切，再对酶切产物进行连接，从而构建重组表达载体pCold TF-GFP-CD19，构建过程详述如下。

构建pCold-CD19 TF载体

将步骤1中双酶切鉴定并测序正确的含有CD19序列的pGEM-CD19质粒利用BamHI和HindⅢ进行双酶切，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，参考微量DNA快速回收试剂盒（上海Lifefeng公司）说明书，回收、纯化获得1600bp大小片段；

同时对原核表达载体pCold TF利用BamHI和Hind Ⅲ进行双酶切，酶切产物同样进行凝胶电泳，并利用微量DNA快速回收试剂盒回收纯化；

将所回收的酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化（转化前对连接产物中的连接酶进行70℃、5min的灭活处理，以提高转化效率）感受态细胞TOP10，并进行氨苄青霉素抗性筛选，对阳性菌株提取质粒后进行BamHI和Hind Ⅲ双酶切鉴定（鉴定结果如图3所示，从图中可以看出，在1600 bP和5700 bp处均有清晰片段存在，表明重组质粒构建成功），获得构建正确的含有CD19序列的pCold-CD19载体。

构建重组表达载体pCold TF-GFP-CD19 TF

将步骤1中双酶切鉴定并测序正确的含有GFP序列的pGEM-GFP质粒利用NdeI和BamHI进行双酶切，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收、纯化获得740bp大小片段；

对上述所构建的pCold-CD19载体利用NdeI和BamHI进行双酶切，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收、纯化酶切产物；

将所回收酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，并进行氨苄青霉素抗性筛选，对阳性菌株提取质粒后进行NdeI和Hind Ⅲ双酶切鉴定（电泳图如图4所示，从图中可以看出，在2300bp左右有清晰片段存在，此片段就是GFP和CD19基因的融合片段，此结果表明pCold TF-GFP-CD19重组质粒构建成功），获得构建正确的重组表达载体pCold TF-GFP-CD19。

三、诱导表达重组蛋白

将步骤二中构建的重组表达载体pCold TF-GFP-CD19转化BL21感受态细胞，IPTG诱导表达，获得重组蛋白GFP-CD19，详细过程如下所述。

将步骤二中筛选鉴定正确的重组表达载体pCold TF-GFP-CD19的1μL加入到50μLBL21感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴45 min；42℃ 水浴90 秒完成热休克，立即冰浴2min；

加入400μL SOC培养基，37℃、200r/min摇床振荡培养60min；

4000 rpm离心3min，移去150μL上清，剩余部分涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）抗生素的LB平板中，干燥后倒置平皿37℃培养过夜。

挑取单个阳性克隆加入到含有氨苄青霉素（100μg/mL）的5mL LB液体培养基中，37℃恒温摇床中通气培养过夜。

将过夜菌按1:200体积比转接到200mL含有氨苄青霉素（100μg/mL）的新鲜LB培养基中，继续培养约2小时；测定培养液OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值达到0.5时，取出培养基放置室温下，待温度降至15℃时，加入IPTG至终浓度0.5 mM，于恒温摇床中15℃条件下通气培养4小时。

培养结束后，常温下4000g离心10min，收集细菌沉淀，此时沉淀为绿色，可冻存于-80℃冰箱中备用。

四、蛋白纯化与浓缩，将步骤三中菌体进行裂解后，采用Ni-NTA亲和色谱法纯化获得GFP-CD19融合蛋白，并进一步浓缩后即可用于后续实验标记，详细制备过程介绍如下。

1、菌体裂解

取步骤三中的菌体沉淀（100 mL菌液收集的沉淀），重悬于25 mL PBS溶液（pH 7.0），加入PMSF至终浓度1 mM，放置冰上；加入 Triton X-100 (solarbio) 至终浓度 0.5%，混匀；-80℃冷冻30分钟；

解冻后，进行超声裂解细胞，85W，超声6s，间隔7s，重复5~7次至溶液透亮；

将溶液4℃、12000 g离心10 分钟，取上清20μL留样，以备SDS-PAGE分析可溶性（检测结果表明，裂解上清中有该融合蛋白的表达，表明该蛋白是可溶的），将剩余上清置于冰上或-20℃保存备用。

2、Ni-NTA亲和色谱法纯化获得GFP-CD19融合蛋白

首先，进行Ni-NTA装柱和进行柱平衡，具体为：取10 mL层析柱，连接好管子后固定柱子，用去离子水冲洗层析柱3~5次；取出Ni-NTA resin填料(购自北京全式金生物技术有限公司)，静置至室温后，用移液器吸取4 mL的填料进行装柱，用灭过菌的去离子水冲洗填料5个柱体积；用PBS溶液（pH 7.0）缓慢平衡Ni柱5个柱体积；

其次，上样和蛋白分离，具体为：用注射器取上述菌体裂解离心后的上清液25mL，过滤后缓慢上样，使蛋白与Ni-NTA resin充分结合（流出液取20μL 4℃保存，以便进行SDS-PAGE检测）；

最后，进行蛋白洗杂和蛋白洗脱，具体为：用PBS溶液（pH 7.0）过柱进行洗杂，缓慢清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，缓慢流洗Ni柱5个柱体积（流出液取20μL 4℃保存，以便进行SDS-PAGE检测）；先用含20mM咪唑的PBS溶液（pH 7.0）过柱，缓慢流洗Ni柱3个柱体积（流出液取20μL 4℃保存，以便进行SDS-PAGE检测），再用含250 mM咪唑的PBS溶液（pH 7.0）过柱，洗脱目的蛋白，缓慢流洗Ni柱2个柱体积，回收流出的蛋白上清液约10mL，4℃保存备用（另取20μL 4℃保存，以便进行SDS-PAGE检测），最后用含800mM咪唑的PBS溶液（pH 7.0）过柱，缓慢流洗Ni柱3个柱体积（流出液取20μL 4℃保存，以便进行SDS-PAGE检测）；

蛋白洗脱后进行层析柱的清洗，以便下次使用，具体为：先用10 mL PBS溶液（pH 7.0）冲洗层析柱5-8次，再用灭菌去离子水冲洗层析柱3~5次，最后用20%乙醇冲洗20mL后，于20%乙醇中4℃保存。

3、蛋白浓缩

将步骤2中所洗脱的含有GFP-CD19融合蛋白的洗脱液采用50KDa Millipore 超滤管(MILLIPORE)进行浓缩，便于进一步使用，具体为：首先对超滤管加入MilliQ水润湿，4℃预冷；然后加入步骤2中所收集的洗脱液，4℃、4500 rpm平衡离心20 min，最后浓缩到1000μL。

取10μL样品，4℃进行SDS-PAGE检测，并进行考马斯亮蓝染色（结果如图5所示，从图中可以看出：IPTG诱导后，GFP-CD19融合蛋白大量表达；将菌体裂解后，沉淀与上清中均可见该融合蛋白，上清中表达量较多，表明该蛋白可溶性较好；用Ni-NTA亲和色谱法纯化可得到纯化的融合蛋白，纯化效果较好，无杂蛋白），以对目标蛋白含量进行定量分析。

测定结果表明，浓缩后GFP-CD19蛋白浓度为2.0 ug/mL；为便于使用，可将浓缩后蛋白样品分装保存于-80℃备用。

实施例2

利用实施例1中所制备的GFP-CD19蛋白，将其用于标记表达有CD19分子的细胞，从而便于相关细胞的识别和区分。为此，发明人对慢病毒感染的不同类型的细胞进行了测定和实验，相关实验过程简要介绍如下。

慢病毒分别感染HEK 293细胞、Daudi和Jacket细胞

实验前一天，以5×10⁴个/mL HEK 293细胞接种于24孔板中的6个孔，分别为对照组3孔和实验组3孔，接种体积为500 µL；

用Enhanced Infection Solution（ENi.S）稀释polybrene，至终浓度50 µg/mL；用ENi.S稀释表达CD19抗体的慢病毒颗粒，至终浓度为1×10⁷ TU/mL；

细胞接种12小时后，更换培养基，对照组每孔加入完全培养基500 µL，实验组每孔加入400 µL，然后加入稀释后的病毒液50 µL，加入稀释后的polybrene溶液50 µL，37℃、 5 %CO₂培养箱中培养；12h后，更换培养基；

细胞培养72h后，实验组与对照组分别加入实施例1所制备的GFP-CD19融合蛋白溶液5µL；继续37℃、5 % CO₂培养箱中培养6h，然后在荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况。

慢病毒感染HEK 293细胞的实验结果如图6所示。

慢病毒感染Daudi细胞的实验结果如图7所示。

慢病毒感染Jacket细胞的实验结果如图8所示。

从图6~8的结果可以看出，GFP-CD19融合蛋白可特异性的有效的结合细胞表面表达有CD19抗体的转染后的细胞，而未转染的细胞则无特异性结合。这一结果表明根据绿色荧光细胞的数量就可以确定有效感染细胞数。

进一步经细胞计数板在荧光显微镜下计数后，Daudi细胞的感染效率为3.2%，Jacket细胞的感染效率为2.6%。需要解释的是，由于Daudi和Jacket细胞病毒感染效率低，抗CD19抗体表达于细胞表面的细胞很少，所以加入GFP-CD19融合蛋白后，荧光显微镜下观察到带有绿色荧光的细胞较少。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> GFP-CD19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 776

<212> PRT

<213> 人工制备

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Leu Met Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Gly Ser

225 230 235 240

Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu

245 250 255

Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp

260 265 270

Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu

275 280 285

Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile

290 295 300

Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly

305 310 315 320

Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu

325 330 335

Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu

340 345 350

Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser

355 360 365

Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro

370 375 380

Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser Leu

385 390 395 400

Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu

405 410 415

Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu

420 425 430

Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu

435 440 445

Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr

450 455 460

Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr

465 470 475 480

Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala

485 490 495

Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val

500 505 510

Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val

515 520 525

Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg Lys

530 535 540

Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val Thr Pro Pro Pro

545 550 555 560

Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu Ser Leu Pro Thr

565 570 575

Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala Ala Gly Leu Gly

580 585 590

Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp Val Gln Ala Asp

595 600 605

Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu

610 615 620

Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu Asp Ser Glu Phe

625 630 635 640

Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu Ser Gln Asp Gly

645 650 655

Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly Pro Glu Asp Glu

660 665 670

Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu Asp Glu Glu Leu

675 680 685

Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser Pro His Gly Ser

690 695 700

Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly Ser Gln Ser Tyr

705 710 715 720

Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Arg Ser Ile

725 730 735

Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Glu

740 745 750

Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp Gly Gly Gly Gly

755 760 765

Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

770 775

Claims

1.一种GFP-CD19融合蛋白，其特征在于，该蛋白包括776个氨基酸，分子量为85KD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述GFP-CD19融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

PCR扩增CD19分子的基因序列时所采用引物序列如下：

上游引物：5’- AGGATCCgaggaacctctagtggtgaagg-3’，

下游引物：5’- CAAGCTTtcacctggtgctccaggtgccc-3’；

PCR扩增GFP分子的基因序列时所采用引物序列如下：

上游引物：5’- GCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3’，

下游引物：5’- AGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’；

（6）诱导表达结束后，裂解菌体，采用Ni-NTA亲和色谱法纯化获得GFP-CD19融合蛋白。

3.权利要求1所述GFP-CD19融合蛋白在细胞标记中的应用，其特征在于，用于标记细胞表面表达有CD19抗体的转染后T淋巴细胞。