CN111944063A - 特异性识别人cd19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其应用 - Google Patents

特异性识别人cd19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其应用 Download PDF

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区家裕
马意朋
林通
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Abstract

本发明公开了特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其应用，涉及嵌合抗原受体技术领域。所述的融合蛋白包含人CD19的胞外段氨基酸序列、绿色荧光蛋白(GFP)的氨基酸序列和6×组氨酸标记。所述融合蛋白可用于通过流式细胞术检测表达抗人CD19‑CAR的阳性细胞水平，并同时验证抗人CD19‑CAR的生物学功能。本发明还提供包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及表达所述融合蛋白的细胞，以及包含所述融合蛋白、核酸分子、载体或细胞作为活性成分或生产原辅料的蛋白组合物，以及所述融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或蛋白组合物的用途。

Description

特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其 应用
技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)技术领域，尤其涉及CAR的检测技术，尤其涉及抗人CD19-CAR的检测技术，以及包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及表达所述融合蛋白的细胞，以及包含所述融合蛋白、核酸分子、载体或细胞作为活性成分或生产原辅料的蛋白组合物，以及所述融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或蛋白组合物的用途。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)是一类人工合成的膜表面受体。一个典型的CAR蛋白由三个结构域串联组成：胞外的靶点结合区，将CAR蛋白锚定在细胞膜的跨膜区，以及胞内的信号转导区。其中，CAR的胞外靶点结合区通常来源靶点特异性抗体的单链抗体高变片段(single-chain variable fragment,scFv)。近年来，靶向各种靶点的CAR相继出现并推向临床试验，基于CAR的肿瘤细胞免疫疗法已展现出极强的应用潜力和发展前景。例如，以抗人CD19-CAR为核心的免疫细胞疗法在治疗急性B细胞白血病和难治复发弥漫性大B细胞淋巴癌上已取得令人惊叹的临床成果。在美国，两种基于抗人CD19-CAR的疗法已成功上市。而在中国，靶向不同靶点的CAR疗法临床试验同样层出不穷。
目前基于CAR的肿瘤细胞免疫疗法以CAR-T细胞为主，患者自身的T细胞被采集到体外并转导CAR表达序列，然后再回输到患者体内。CAR-T细胞的制备流程中的关键步骤是检测CAR的表达，一方面必须保证有相当数量的T细胞表达CAR，另一方面还要保证表达的CAR具有相应的生物学功能。目前检测CAR的方法主要使用荧光标记的蛋白或抗体与CAR胞外段scFv结合，然后应用流式细胞术检测。可分为以下几种：
1.检测CAR胞外段的scFv结构，该检测方法以生物素偶联的L蛋白或抗(Fab)’2抗体为代表，L蛋白或抗(Fab)’2抗体均能特异性结合scFv结构，辅以抗生物素的荧光二抗，即可通过流式细胞术检测CAR的表达。但是，L蛋白或抗(Fab)’2抗体并不适用于同时检测不同的CAR，同时，该方法不能直接反映CAR的生物学功能。
2.靶向特定scFv的抗体，这类抗体将特定CAR的scFv作为抗原制备出相应的抗体，具有极好的特异性。例如，带有FMC63 scFv的抗人CD19-CAR已有相应的抗FMC63抗体。但是，制备这样的靶向特定scFv的抗体需要经历抗体研发的一般流程，研发需时较长，成本较高。
3.荧光基团偶联的抗原蛋白，此类方法将CAR识别的靶点蛋白作为检测手段，可同时得到CAR的表达水平及进行功能性验证。但由于加入了额外的荧光基团修饰步骤而极大增加了制备成本。
因此，一种制备更加快速、生产更加经济、检测灵敏度高的CAR检测方法尚待实现，并且新方法也需要满足日益发展的多CAR疗法的检测需求。
发明内容
本发明目的在于提供一种能特异性结合抗人CD19-CAR的融合蛋白人CD19-GFP-6×His，应用该蛋白可通过流式细胞术检测表达抗人CD19-CAR的阳性细胞水平，并同时验证抗人CD19-CAR的生物学功能，以及包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及表达所述融合蛋白的细胞，以及包含所述融合蛋白、核酸分子、载体或细胞作为活性成分或生产原辅料的蛋白组合物，以及所述融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或蛋白组合物的用途。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白，所述融合蛋白具有特异性结合抗人CD19-CAR的特性，所述融合蛋白包含人CD19的胞外段氨基酸序列、绿色荧光蛋白(GFP)的氨基酸序列和6×组氨酸标记。所述融合蛋白也称为融合蛋白CD19-GFP-6×His。
所述融合蛋白的完整氨基酸序列为：SEQ ID NO:1。
优选的，所述融合蛋白的氨基端含有人CD19的前导肽，所述前导肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2(MPPPRLLFFLLFLTPMEVRP)。
本发明的另一方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。
所述核酸分子的完整核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。
本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体含有以上所述的核酸分子。
优选的，所述载体为病毒载体。
更优选的，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞转导以上任一方面所述核酸分子或以上任一方面所述载体，该细胞可表达所述的融合蛋白CD19-GFP-6×His。
优选的，所述细胞为293T细胞。
更优选的，所述细胞可将融合蛋白释放到细胞上清液。
本发明的另一方面，提供一种蛋白组合物，所述蛋白组合物包含以上所述的融合蛋白CD19-GFP-6×His、核酸分子、载体或细胞作为活性成分或生产原辅料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了能特异性结合抗人CD19-CAR的融合蛋白CD19-GFP-6×His，该蛋白仅需经历常规重组蛋白制备流程即可用于抗人CD19-CAR的流式细胞术检测，无须额外的荧光基团修饰流程，极大简化了蛋白制备步骤和节省蛋白制备成本，可同时满足抗人CD19-CAR表达率的检测及生物学功能验证，具有特异性强、检测灵敏度高的优点。本发明还提供了能特异性结合抗人CD19-CAR的包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及表达所述融合蛋白的细胞,以及包含所述融合蛋白、核酸分子、载体或细胞作为活性成分或生产原辅料的蛋白组合物，以及所述融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或蛋白组合物的用途。
附图说明
图1为编码融合蛋白CD19-GFP-6×His的核苷酸序列元件示意图；
图2为流式检测293T细胞对融合蛋白CD19-GFP-6×His的表达水平结果；
图3为293T细胞和293T-anti-CD19-CAR细胞的特异性验证结果；
图4为293T-anti-CD19-CAR细胞的特异性验证结果；
图5为融合蛋白CD19-GFP-6×His的浓度梯度结果；
图6为融合蛋白CD19-GFP-6×His的灵敏度验证结果；
图7为融合蛋白CD19-GFP-6×His的孵育时长验证结果。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。以下实施例的主要目的是用于进一步介绍本发明方法的具体实施过程，不代表本发明方法仅能按以下实施例实现。
实施例1：带有编码融合蛋白CD19-GFP-6×His的核苷酸序列的核酸分子及载体的制备
参见图1，编码融合蛋白CD19-GFP-6×His的核苷酸序列分为两部分，第一部分为编码包含人CD19前导肽的人CD19胞外段的核苷酸序列，第二部分为编码绿色荧光蛋白和6×组氨酸标记的核苷酸序列。
第一部分核苷酸序列的核酸分子通过如下方法获得。
使用RNA提取试剂盒(QIAGEN)获得健康人外周血单个核细胞的RNA，通过逆转录试剂盒(TaKaRa)获得cDNA。使用特异性引物通过聚合酶链式反应(PCR)获得包含编码含前导肽的人CD19胞外段的核苷酸序列的核酸分子。
第二部分核苷酸序列的核酸分子通过如下方法获得。
使用序列设计软件将编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列与编码6×组氨酸标记的核苷酸序列串联获得完整的核苷酸序列，将核苷酸序列送上海生工生物工程股份有限公司进行全基因合成，获得带有该核苷酸序列的载体。使用特异性引物通过PCR获得包含编码绿色荧光蛋白和6×组氨酸标记串联核苷酸序列的核酸分子。
获得上述两部分的核酸分子后，通过特异性引物往两部分核酸分子的5’端和3’端引入重组区域，通过重叠PCR(overlap PCR)将两部分核酸分子拼合为一个完整的核酸分子，该核酸分子包含编码融合蛋白的完整核苷酸序列，该核苷酸序列元件如图1所示。
融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
融合蛋白的氨基端含有人CD19的前导肽，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
编码融合蛋白的核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
将包含编码融合蛋白的核苷序列的核酸分子插入逆转录病毒载体pMSCV中，并对载体元件进行了改造，使其可以更好表达融合蛋白。
实施例2：制备表达融合蛋白的293T细胞
转染病毒包装细胞系293GP细胞pMSCV-CD19-GFP-6×His-WPRE及pVSV-G质粒，制备逆转录病毒并采用病毒上清转导293T细胞。
转染操作如下：第0天将293GP细胞接种至6孔板(8×105/孔)；第1天，pMSCV-CD19-GFP-6×His-WPRE及pVSV-G质粒转染293GP细胞(2μg pMSCV-CD19-GFP-6×His-WPRE及560ng pVSV-G/孔)；第2天，将293T细胞接种至6孔板(3×105/孔)；第3天，收集含病毒上清的培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的DMEM)至293GP细胞中；用收集的病毒上清转染293T细胞；第4天采用同样的方法第二次转染同一孔293T细胞；第5天将转染后的293T细胞收集至T25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清和1×GlutMAX的DMEM)。第7天流式检测融合蛋白的表达水平，如图2所示，融合蛋白的表达水平为96.7％。
进一步参见图2，使用BD FACSAria II仪器应用流式细胞分选术将高表达率的293T-CD19-GFP-6×His细胞(约59.6％)分选出来并进一步培养。
实施例3：融合蛋白的制备流程
融合蛋白的制备分为获取、提取和浓缩三个步骤。
获取操作如下：将分选获得的293T-CD19-GFP-6×His细胞按1×107/瓶接种到T175细胞培养瓶中，待细胞密度超过90％后，将细胞培养液更换为50mLDMEM培养基(含1×GlutMAX，不含血清)，继续培养24小时后，收集细胞上清液并补充新的DMEM培养基，如此往复收集100mL以上的细胞上清液。4℃，500xg离心10分钟后取上清液。
提取操作如下：将第一步获得的上清液使用镍柱亲和层析法进行提取。对于100mL的上清液，使用1mL的镍柱(QIAGEN)。先用2mL DMEM培养基平衡镍柱，然后将上清液反复过镍柱3次。然后依次使用2mL 20mM咪唑溶液、2mL 40mM咪唑溶液洗涤镍柱。最后用250mM咪唑溶液洗脱2次,每次1mL，获得融合蛋白的提取液。
浓缩操作如下：使用30kDa的蛋白截留柱(Millipore)进行浓缩及缓冲液置换的操作。提前准备足量的0.1％BSA-PBS。将4mL 0.1％BSA-PBS与2mL的融合蛋白提取液混合，装填到带有30kDa蛋白截留柱的Amicon Pro Purification系统中，4℃，3000xg离心20分钟～30分钟，使溶液全部过柱。然后装填10mL0.1％BSA-PBS，4℃，3000xg离心30分钟以上，使溶液全部过柱，然后重复此步骤一次。仔细取出截留柱内的蛋白浓缩液，进行蛋白定量，使用0.1％BSA-PBS稀释至合适浓度后分装冻存。
实施例4：融合蛋白的特异性验证
依照实验例3准备CD19-GFP-6×His融合蛋白及GFP-6×His融合蛋白，蛋白浓度均为50μg/mL。
准备293T-anti-CD19-CAR细胞，该抗人CD19-CAR的scFv来自于克隆号为FMC63的人CD19抗体，通过流式细胞分选术获得阳性率稳定在90％以上的细胞。
流式细胞术实验：使用CD19-GFP-6×His融合蛋白和GFP-6×His融合蛋白分别对293T细胞和293T-anti-CD19-CAR细胞进行抗人CD19-CAR染色，仅有CD19-GFP-6×His融合蛋白可检测293T-anti-CD19-CAR细胞表面的抗人CD19-CAR蛋白，表达率＞90％，如图3所示。
流式细胞术实验：使用CD19-GFP-6×His融合蛋白对293T-anti-CD19-CAR细胞进行抗人CD19-CAR染色，表达率＞90％。使用克隆号为FMC63的人CD19抗体(Sigma)与CD19-GFP-6×His融合蛋白混合孵育30分钟后，使用该混合液对293T-anti-CD19-CAR细胞进行抗人CD19-CAR染色，表达率＜1％。这说明抗人CD19抗体(FMC63)封闭了CD19-GFP-6×His融合蛋白与抗人CD19-CAR蛋白的结合位点，如图4所示。
流式细胞术实验：使用CD19-GFP-6×His融合蛋白对293T-anti-CD19-CAR细胞进行抗人CD19-CAR染色，表达率＞90％。使用重组人CD19蛋白(abcam)与293T-anti-CD19-CAR混合孵育30分钟后，再加入CD19-GFP-6×His融合蛋白进行抗人CD19-CAR染色，表达率＜1％。这说明重组人CD19蛋白(abcam)封闭了抗人CD19-CAR蛋白与CD19-GFP-6×His的结合位点，如图4所示。
综上所述，CD19-GFP-6×His融合蛋白与抗人CD19-CAR利用了FMC63scFv抗人CD19的特性而实现特异性结合，通过流式细胞术获得绿色荧光蛋白的阳性细胞水平指示了表达抗人CD19-CAR的阳性细胞水平，同时指示了细胞表面的抗人CD19-CAR具有其特定生物学功能。
实施例5：融合蛋白的浓度梯度曲线验证
流式细胞术实验：依照实验例3准备CD19-GFP-6×His融合蛋白，蛋白浓度为50μg/mL。使用不同浓度的CD19-GFP-6×His融合蛋白对293T-anti-CD19-CAR进行抗人CD19-CAR染色，稀释梯度为1/5、1/10、1/20、1/100、1/500、1/1000、1/2000、1/10000，染色结果呈现抗人CD19-CAR阳性细胞率随浓度变化而变化，如图5所示。该结果说明对于抗人CD19-CAR阳性率大于90％的细胞群体，使用2.5μg/mL的CD19-GFP-6×His融合蛋白即可充分检出所有表达抗人CD19-CAR的细胞。
实验例6：融合蛋白的灵敏度验证及孵育时长验证
依照实验例3准备CD19-GFP-6×His融合蛋白，蛋白浓度为50μg/mL。
流式细胞术实验：将293T细胞与293T-anti-CD19-CAR细胞按如下比例混合：99:1、9:1、1:1、0:100，分别对应1％、10％、50％和100％的抗人CD19-CAR阳性细胞。用等浓度的CD19-GFP-6×His融合蛋白对不同比例的混合细胞进行抗人CD19-CAR染色，如图6所示，该结果说明CD19-GFP-6×His融合蛋白对细胞群体种含有1％～100％的抗人CD19-CAR阳性细胞均有极好的检出率，灵敏度满足实际要求。
流式细胞术实验：用等浓度的CD19-GFP-6×His融合蛋白对4组293T-anti-CD19-CAR细胞染色，孵育时长分别为15分钟、30分钟、45分钟和60分钟，如图7所示，该结果说明CD19-GFP-6×His融合蛋白仅需与抗人CD19-CAR细胞共孵育15分钟即可获得接近100％的检出率。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 深圳市因诺转化医学研究院；深圳因诺免疫有限公司
王，明军
区，家裕
马，意朋
林，通
<120> 特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其应用
<141> 2020-08-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 531
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
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Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
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Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
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<400> 3
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtaggc 840
ggatcaggcg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 900
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 960
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 1020
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 1080
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 1140
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 1200
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 1260
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 1320
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 1380
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 1440
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 1500
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 1560
aagggagggt ctggacacca ccaccaccac cactaa 1596

Claims (10)

1.一种特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含人CD19的胞外段氨基酸序列、绿色荧光蛋白(GFP)的氨基酸序列和6×组氨酸标记；
所述融合蛋白可用于通过流式细胞术检测表达抗人CD19-CAR的阳性细胞水平，并同时验证抗人CD19-CAR的生物学功能。
2.如权利要求1所述的特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求2所述的特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基端含有人CD19的前导肽，所述前导肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1-3任一项所述的特异性识别人CD19嵌合抗原受体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，和/或所述融合蛋白的氨基端氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码如权利要求1-4任一项所述融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。
6.如权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求5-6任一项所述的核酸分子。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞转导权利要求5-6任一项所述核酸分子或权利要求7所述载体，该细胞可表达融合蛋白CD19-GFP-6×His。
9.一种蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物包含权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5-6任一项所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞作为活性成分或生产原辅料。
10.如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5-6任一项所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的细胞或权利要求9所述的蛋白组合物用于制备检测表达抗人CD19-CAR的阳性细胞水平的活性成分或生产原辅料。
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