CN108138148A - T细胞的激活和扩增 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于选择性地激活和/或扩增用于治疗的T细胞群的组合物、方法和系统。例如，该方法可以包括使T细胞群与能够结合在T细胞群表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)的胞外结构域的试剂接触。

Description

T细胞的激活和扩增

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月8日提交的标题为“T细胞的激活和扩增”的美国临时申请No.62/238,894的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及基因工程和医学，具体涉及用于T细胞激活和扩增的组合物、方法和系统。

背景技术

嵌合抗原受体T淋巴细胞(即CAR-T细胞)鉴定肿瘤特异性标记物并在杀死肿瘤细胞中起直接作用。由于构建了第一代CAR分子，因此表达各种CAR分子的T细胞已被广泛用于治疗疾病(例如癌症)。基于CAR-T治疗的挑战之一是开发高效技术和具有成本效益的临床制造平台，以实现安全有效的治疗用途。

发明内容

本文的实施例涉及用于选择性地激活和/或扩增用于治疗的T细胞群的组合物、方法和系统。

一些实施例涉及一种选择性地激活用于治疗的T细胞群的方法。该方法可以包括使T细胞群与能够结合在T细胞群表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)胞外结构域的试剂接触。

一些实施例涉及一种选择性地激活用于治疗的T细胞群的方法。该方法可以包括使T细胞群与试剂接触以激活表达CAR的T细胞群以释放IFNγ。例如，所述试剂可以包括人CD19的胞外结构域，及CAR可以包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

一些实施例涉及一种选择性地激活用于治疗的T细胞群的方法。在一些实施例中，该方法可以包括使T细胞群与固定于固体表面上的抗体接触。该抗体能够激活待转移的T细胞。在某些实施例中，然后可将编码CAR的核酸序列转移至T细胞群。CAR在T细胞群的表面表达之后，可以在转移之后从T细胞群中移除该固体表面，然后可以使T细胞群与试剂接触以提供表达CAR的T细胞群的持续激活，并将T细胞群扩增至适合治疗用途的一定数量。例如，所述试剂可以包括人CD19的胞外结构域，及CAR可以包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

在一些实施例中，该方法可进一步包含，在T细胞群与试剂接触之前，使T细胞群与固定于固体表面一段时间的抗CD3抗体接触。然后，可以将编码CAR的核酸序列转移到接触的T细胞群中，然后可以从T细胞群中移除固体表面。

在一些实施例中，固体表面进一步附着有抗CD28抗体。

在一些实施例中，该方法可以进一步包括从受试者收集外周血单核细胞(PBMC)，并从PBMC中选择CD3⁺细胞。在某些实施方案中，PBMC可以与抗体组混合以允许该抗体组结合靶细胞。在这些情况下，该抗体组不包括CD3抗体。可从PBMC中移除靶细胞以获得含有CD3⁺细胞的溶液。例如，该抗体组可以包含CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123或CD235a中的至少一个。

在一些实施例中，CAR可包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号结构域；并且该试剂可以包括与CAR的抗原结合结构域结合的抗原的胞外结构域。

在一些实施方案中，CAR的胞外结构域是CD19抗原结合结构域。例如，该试剂是CD19抗原，其可以包括CD19抗原，可以包括人CD19的胞外结构域。在某些实施例中，CD19抗原可以包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，CAR可包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

在一些实施方案中，试剂附着于表面。在某些实施方案中，该表面是生物相容的、生物可降解的、不可生物降解的、天然的或合成的中的至少一种。例如，该表面是磁珠。在某些实施例中，微珠能够激活表达CAR的T细胞群以释放IFNγ。在某些实施例中，表面进一步附着有4-1BB抗体或其4-1BB结合片段。

在一些实施例中，T细胞群离体消耗足够数量用于治疗。在某些实施例中，T细胞群扩增至原始T细胞群的约100倍。在某些实施例中，T细胞群扩增至原始T细胞群的约100,000倍。

一些实施例涉及包含与包含人CD19胞外结构域的CD19抗原缀合的磁性粒子的组合物。例如，磁性粒子能够选择性地离体激活表达CAR用于治疗的T细胞。在一些实施例中，CAR可包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

在一些实施例中，T细胞已经从PBMC中收集，并且使用抗CD3抗体或其CD3结合片段预先激活。

在一些实施例中，粒子能够激活表达CAR的T细胞群以释放IFNγ。

提供本发明内容是为了以简化的形式介绍将在以下详细描述中进一步描述的一些概念。本发明内容并非旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也并非旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

参考附图给出详细描述。在不同的图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。

图1是示出用于激活和扩增T细胞的示例性过程的示意图。

图2是示出根据本公开的实施例的微珠的示例性结构的示意图。

图3是指示缀合有CD19抗原或CD22抗原的微珠的制备的流式细胞仪分析图。

图4是指示制备抗CD19 CAR-T细胞的流式细胞分析图。

图5是示出缀合有CD19抗原的微珠激活表达CAR的T细胞的流式细胞分析图。

图6是示出由CD19微珠刺激的T细胞增殖的图。

图7包括显示响应于暴露于缀合有CD19抗原的微珠的T细胞相关参数的图。

图8包括示出了图7中所示的一些参数的测量的示例性流式细胞分析图。

图9包括显示与缀合有CD19抗原微珠接触的T细胞的功能的图像。

图10是显示根据本公开的实施例的T细胞的选择的流式细胞分析图。

图11包括显示不同选择方法下的T细胞生长率的示意图。

图12是显示不同选择方法下的T细胞转导率的示意图。

具体实施方式

综述

原代T细胞的体外扩增需要连续或持续激活以维持用于治疗用途的良好状态。例如，缀合有抗CD3和抗CD28抗体的微珠广泛用于T细胞激活。在常规技术下，分离的T细胞与这些微珠接触，直到T细胞群达到适合治疗用途的一定数量。然而，长期的抗CD28 T细胞刺激可能导致T细胞耗竭，这是T细胞功能障碍的状态。T细胞耗竭阻止对感染和肿瘤的最佳控制。

本文的实施例利用与CD19抗原缀合的微珠来选择性激活和/或扩增表达抗CD19CAR的T细胞。CD19抗原可以通过例如4-1BB和/或CD3-ζ介导的信号激活T细胞。因此，通过避免抗-CD28的延长刺激，实施例可以减少或延迟与治疗用途相关的T细胞耗竭。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

冠词“一”和“一个”指的是本文语法对象的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。

所谓“约”是指量、水平、数值、量数、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％至参考量、水平、数值、量数、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。

如本文所用，术语“激活”是指已充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。激活还可以与诱导细胞因子产生和可检测的效应因子功能相关联。术语“激活的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且只要它们表现出期望的生物学活性或功能，具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(比如双特异性抗体)和抗体片段。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999，In:Using Antibodies:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等，1989，In:Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等，1988，Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988，Science 242:423-426)。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个片段由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发出六个高变环(每个均来自H和L链的3个环)，其贡献氨基酸残基用于抗原结合并赋予抗体结合抗原的特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。如本文所用，“抗体重链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较大的一个。如本文所用，“抗体轻链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较小的一个。κ和λ轻链是指两种主要抗体轻链同种型。

如本文所用，术语“合成抗体”是指利用重组DNA技术产生的抗体，例如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应该解释为已经通过合成编码抗体的DNA分子产生的抗体，该DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列通过使用本领域已知的合成DNA或氨基酸序列的技术获得。

如本文所用的术语“抗原”定义为引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的激活或两者。抗原可以包括任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。此外，可以从包括组织样本、肿瘤样本、细胞或生物流的生物样本产生、合成或衍生出抗原。

如本文所用，术语“抗肿瘤效应”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、具有肿瘤细胞的受试者预期寿命增加相关的生物学效应、或与癌症相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过本公开的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。

术语“自体抗原”是指被免疫系统错误地认为是外来的抗原。自体抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“同种自体”用于描述从同一个体获得的材料，其稍后重新引入该个体。

“同种异体”用于描述来自同一物种的不同动物的移植物。

“异种异体”用于描述来自同一物种的不同动物的移植物。

如本文所用的术语“癌症”定义为以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血液和淋巴系统传播到身体的其他部位。各种癌症的例子包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、和肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”，“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或元素或步骤组或元素组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤组或元素组。

“由......组成”意味着包括并限于在短语“由...组成”之后的任何事物。因此，短语“由......组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。

所谓“基本上由...组成”是指包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于所公开的所列元素的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由......组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的并且可能存在或可能不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。

术语“互补”和“互补性”是指由碱基配对规则相关的多聚核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则只有一些核酸碱基匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“全部”的互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显着影响。

所谓“对应于”或“相对于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或部分基本上相同或互补的核苷酸序列，或编码与参考多核苷酸中氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸一种肽或蛋白质；或(b)具有与参照肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，由此提供信号，除了通过例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合提供的主要信号之外，还介导包括增殖、激活、分化在内的T细胞应答等。共刺激分子配体可以包括CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激分子配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还包括，除此之外，特异性结合存在于T细胞上的共刺激分子的抗体，如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合搭档，其与共刺激分子配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

“共刺激信号”是指第一信号，其与例如TCR/CD3连接结合，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。

如本文所使用的，术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定疾病或病症可能不具有已知的病原体(因此病因尚未解决)，因此它是尚未被认为是疾病，但仅作为不良的病症或综合征，其中临床医师已经确定了或多或少的一组特定症状。如本文所用，“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则受试者的健康持续恶化。相反，受试者中的“紊乱”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但是其中动物的健康状况不如在没有紊乱时那样有利。如果不进行治疗，紊乱不一定会导致动物健康状况的进一步恶化。

如本文所用，术语“有效”意指足以实现期望的、预期的或预期的结果。例如，“有效量”可以是足以产生治疗或预防效果化合物的量。

“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有性质，用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，其或具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或具有确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果mRNA的转录和翻译对应于该基因在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提供，用作基因或cDNA转录模板的非编码链可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。

对于多核苷酸，术语“外源的”是指不天然存在于野生型细胞或生物体中但通常通过分子生物学技术引入细胞的多核苷酸序列。外源多核苷酸的例子包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。富裕多核苷酸，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸序列。而且，从第一生物体分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸。在具体的实施例中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如以创建另外天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的副本，并且由此有助于过表达编码的多肽。

如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用因子；用于表达的其他因子可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

“同源的”是指两条多肽之间或两条核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是由两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配或同源，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的一级抗体，如唾液、眼泪、母乳、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面很重要。IgD是没有已知抗体功能但可以用作抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在暴露于过敏原时引起肥大细胞和嗜碱细胞释放介质而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。

“分离的”是指基本上或本质上不含通常伴随其天然状态的组分的材料。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态下的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如，从通常与该片段相邻的序列中除去的DNA片段。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境以及从与该细胞的其他组分的联系中的体外分离和/或纯化。

在本公开的上下文中，使用通常存在的核酸碱基的以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。

除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，以至于编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可以含有内含子。

如本文所用，“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息输送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HI、SIV和FIV都是慢病毒的例子。来自慢病毒的载体提供了实现显着水平的体内基因转移的手段。

如本文所用，术语“调节”是指，与不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/或与其他方面相同但未经处理的受试者的应答水平相比较，介导受试者的应答水平的可检测增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者，优选人的有益治疗反应。

当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果将前序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况下是连续的并处于阅读阶段。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

术语“过度表达”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在指示相对于来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自患者的特定组织或器官内的实体肿瘤等疾病区域的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。

“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(iv.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”，“受试者”，“个体”等在本文中可互换使用，并且指的是任何动物或其细胞，无论是体外还是原位，均适用于本文所述的方法。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人类。在一些实施例中，术语“受试者”旨在包括可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

如本文所使用的表述“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常指至少10个碱基长度的聚合形式的核苷酸、核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA和RNA。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性，或相对于参考多核苷酸具有增加的活性(即，优化的)。多核苷酸变体包括，例如与参考本文描述的多核苷酸序列，具有至少50％(以及至少51％至至少99％和全部整数百分比之间，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括编码这些酶的天然存在的等位基因变体和直向同源物。

“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化各种化学反应(即，提高速率)的酶促多肽或“酶”。

引用多肽“变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分的多肽。在某些实施例中，通过一个或多个取代将多肽变体与参考多肽区分开来，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施例中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言，本领域中熟知可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基置换的多肽。

如本文所用的术语“启动子”被定义为DNA序列，其被细胞的合成机器识别、或引进合成机器、需要启动多核苷酸序列的特异性转录。表述“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合”、“结合了”或“与......相互作用”是指一个分子识别并粘附于样品或生物体中的特定第二分子，但基本不识别或粘附于样品中的其他结构不相关分子。如本文相对于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位形式。但是，这种交叉反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意指相互作用取决于存在于化学物种上的特定结构(例如抗原决定簇或表位)；例如，抗体通常识别并结合特定蛋白质结构而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中含有表位A的分子(或游离的未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。

“可溶性受体”是不与细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体是最常见的缺乏跨膜和胞质结构域的配体结合受体多肽。可溶性受体可以包括另外的氨基酸残基，例如提供纯化多肽或提供将多肽连接至底物的位点的亲和标签，或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有天然存在的、通过蛋白水解产生的可溶性对应物。据说可溶性受体多肽基本上不含跨膜和胞内多肽片段，因为它们分别缺乏这些片段的足够部分以提供膜锚定或信号转导。

“具有统计显著性”意味着结果不可能偶然发生。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。如果零假设为真，常用的显著性度量指标包括p值，即观测事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。“减少的”或“降低的”或“较少的”量通常是“统计学显着的”或生理学上显着的量，并且可以包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍的低于或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)于本文所述的量或水平。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，例如经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。

“刺激分子”是指T细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的分子。

“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时可以与同源结合配偶体特异性结合的配体(在本文中称为“刺激分子”)，从而介导T细胞的初级应答，包括激活、启动免疫应答、增殖等。刺激性配体在本领域中是公知的，并且尤其包括装载有肽、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已与其天然存在状态下通常与其相关的其他细胞类型分开的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是同质的细胞群。在其他情况下，这个术语简单地指的是与它们天然状态下与它们天然相关的细胞分开的细胞。在一些实施例中，细胞在体外培养。在其他实施例中，细胞在体外培养。

这里使用的术语“治疗性”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的引出组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在某种程度上缓解所述病症或疾病的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物、疾病及其严重程度和年龄、体重等而变化。

本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括主要受试细胞及其后代。

如本文所用，短语“在转录控制下”或“有效连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向以控制RNA聚合酶的转录启动和多核苷酸的表达。

“载体”是包含分离的核酸且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应该解释为包括促进核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其他具有调控或结构功能的基因。慢病毒载体在本领域中是众所周知的。慢病毒的一些例子包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过多重减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef使得载体生物安全。

范围：贯穿本公开，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应该理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本公开的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，从1到6的范围的描述应该被认为具有特定公开的子范围，例如从1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

本公开涉及分离的核酸序列，包括分离的核酸序列的载体，包括分离的核酸序列的细胞以及使用这些细胞治疗癌症的方法。

组合物、及其治疗应用和制备方法

本文的实施例涉及用于选择性地激活和/或扩增用于治疗的T细胞群的组合物、方法和系统。

一些实施例涉及一种选择性地激活用于治疗的T细胞群的方法。该方法可以包括使T细胞群与能够结合在T细胞群表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)胞外结构域的试剂接触。

一些实施例涉及一种选择性地离体激活用于治疗的T细胞群的方法。该方法可以包括使T细胞群与试剂接触以激活表达CAR的T细胞群以释放IFNγ。例如，所述试剂可以包括人分化簇19(CD19)胞外结构域，及CAR可以包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

一些实施例涉及一种选择性地离体激活用于治疗的T细胞群的方法。在一些实施例中，该方法可以包括使T细胞群与固定于表面上的抗体接触。该抗体能够激活待转移的T细胞。在某些实施例中，然后可将编码CAR的核酸序列转移至T细胞群。CAR在T细胞群的表面表达之后，可以在转移之后从T细胞群中移除该固体表面，然后可以使T细胞群与试剂接触以提供表达CAR的T细胞群的持续激活，并将T细胞群扩增至适合治疗用途的一定数量。在一些情况下，所述试剂可以包括人CD19的胞外结构域，和/或CAR可以包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

例如，通过HD237或B4抗体(Kiesel等，Leukemia Research II，12：1119(1987))确定CD19约90kDa。在从干细胞阶段到末端分化为浆细胞的B系细胞分化过程中，包括但不限于前B细胞、B细胞(包括幼稚B细胞、抗原刺激的B细胞、记忆细B细胞、浆细胞和B淋巴细胞)和滤泡树突细胞，在细胞中发现CD19。在人胎儿组织中的B细胞上也发现CD19。在一些实施例中，本公开的抗体所靶向的CD19抗原是人CD19的抗原。

在一些实施例中，CD19抗原可包含人CD19的部分或全部胞外结构域。在一些实施例中，CD19抗原可包含人CD19的信号肽和/人CD19的胞外结构域。例如，CD19抗原可以包括约283个氨基酸(包含人CD19的信号肽和胞外结构域)，预测分子量为31.6kDa；在还原条件下的SDS-PAGE中，由于糖基化，该CD19抗原以约47kDa的条带迁移。在某些实施例中，CD19抗原包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，CAR可包括抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。并且该试剂可以包括与CAR的抗原结合结构域结合的抗原胞外结构域。

在一些实施方案中，CAR的胞外结构域是CD19抗原结合结构域。例如，该试剂是CD19抗原，其可以包括CD19抗原，可以包括人CD19的胞外结构域。在某些实施例中，CD19抗原可以包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，CAR可包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

在一些实施方案中，试剂附着于表面。在某些实施方案中，该表面是生物相容的、生物可降解的、不可生物降解的、天然的或合成的中的至少一种。例如，该表面是磁珠。在某些实施例中，该磁珠能够激活表达CAR的T细胞群以释放IFNγ。在某些实施例中，表面进一步附着有4-1BB抗体或其4-1BB结合片段。

在一些实施例中，T细胞群离体消耗足够数量用于治疗。在某些实施例中，T细胞群扩增至原始T细胞群的约100倍。在某些实施例中，T细胞群扩增至原始T细胞群的约100,000倍。

一些实施例涉及包含与CD19抗原缀合的磁性颗粒的组合物，所述CD19抗原包含人类CD19的部分或全部胞外结构域(CD19微珠)。例如，磁性粒子和CD19抗原融合在一起，使得缀合的磁性粒子能够选择性地离体激活表达CAR用于治疗的T细胞。CAR包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域(比如4-1BB和/或CD28)。在其他实施例中，CD19抗原可以与载体例如微珠或细胞以外的固体表面缀合，然后载体能够选择性离体激活表达抗CD19 CAR的T细胞。

在一些实施例中，T细胞已经从PBMC中收集，并且使用抗CD3抗体或其CD3结合片段预先激活。例如，T细胞的初级激活可以通过共培养从PBMC分离的原代T细胞与缀合有抗CD3微珠的微珠来实现。激活的T细胞可以与含有CAR的病毒一起转移。在T细胞表面表达CAR(比如转导后两天)后，可以从含有T细胞的培养物中除去抗CD3抗体或其CD3结合片段。例如，抗CD3抗体或其CD3结合片段可以与微珠缀合，并且可以从培养物中移除微珠。为了扩增T细胞，可以通过将T细胞与缀合有CD19抗原的微珠共培养来实施持续激活。在一些实施例中，微珠与CD19抗原缀合，因此能够激活表达CAR的T细胞以释放IFNγ。

在一些实施方案中，所述方法可以通过从PBMC去除CD3阴性细胞而采用阴性选择并因此获得包括T细胞的CD3阳性细胞。令人惊奇的是，与如下所述的传统技术相比，这些实施例具有较高的转导效率。

目前，制备CAR-T细胞的技术可以分为三种方法。对于第一种方法，直接从PBMC获得CAR-T细胞。例如，进行单采血液成分密度梯度离心以获得PBMC，然后用IL2和CD3激动剂孵育以制备转导的CAR-T细胞。然而，由于转导的细胞不仅包括T细胞，而且还包括单核细胞以及其他细胞，因此该方法的转导效率较低。

对于第二种方法，进行单采血液成分密度梯度离心以获得PBMC，然后除去单核细胞。将剩余的细胞转导以获得CAR-T细胞。第二种方法的转导效率仍然很低，因为除T细胞外，转导的细胞还包括各种其他细胞。

对于第三种方法，进行单采血液成分密度梯度离心以获得PBMC，然后将其和用CD3/CD28抗体包被的微珠孵育以获得用于转导的T细胞。在使用CD3/CD28富集T细胞的同时，在第三种方法下产生的细胞仍然包含各种其他细胞。因此，转导效率仍然很低，并且使用这种方法获得的T细胞的功能是不稳定的。

在一些实施例中，该方法可进一步包含，在T细胞群与试剂接触之前，使T细胞群与固定于固体表面一段时间的抗CD3抗体接触。然后，可以将编码CAR的核酸序列转移到接触的T细胞群中，然后可以从T细胞群中移除固体表面。在一些实施例中，固体表面进一步附着有抗CD28抗体。

例如，可以从受试者收集外周血单核细胞(PBMC)，可以获得来自PBMC的CD3⁺细胞，并且可以通过第一信号途径(例如，结合TCR/CD3复合物)将CD3⁺细胞激活以获得激活的T细胞。编码CAR的核酸序列可以转移至激活的T细胞以获得CAR-T细胞。在某些实施例中，该方法可包括将PBMC与抗体组混合以允许该抗体组结合靶细胞并从PBMC移除靶细胞以获得含有CD3⁺细胞的溶液。在这些情况下，该抗体组不包括CD3抗体。例如，该抗体组可以包含CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123或CD235a中的至少一个。在一些情况下，在转移后第5、6或7天测量的转移激活T细胞的转导率至少为50％。

可以使用包括本公开的某些实施例的各种方法来激活T细胞。在一些实施例中，可以通过将T细胞与抗体(例如CD3和/或CD28)共培养来激活T细胞。在一些实施例中，可以通过将T细胞与缀合有抗体(例如CD3和/或CD28)的微珠(例如磁性微珠)共培养来激活T细胞。在一些实施例中，各种细胞因子(例如IL2、IL7、IL15)可用于激活T细胞。在某些实施例中，细胞因子和抗体的组合可用于激活T细胞。在某些实施例中，细胞因子和微珠的组合可用于激活T细胞。

CAR是通常包括细胞外和细胞内结构域的分子。细胞外结构域包括靶特异性结合元件。细胞内结构域(例如细胞质结构域)包括共刺激信号区域和ζ链部分。共刺激信号区域是指CAR的一部分，包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所需的。

CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间可以掺入间隔区。如本文所用，术语“间隔区”通常意指用于将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔区可包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。

在一些实施例中，本公开内容中CAR的靶特异性结合元件可识别肿瘤抗原。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原在本领域众所周知，包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)，β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺素、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺特异性蛋白、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-I受体和间皮素。

在一些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、Kappa或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8或病毒相关的由肿瘤表达的抗原。

编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法，采用标准技术获得，例如通过筛选来自表达该基因的细胞的文库，通过从已知包含该基因的载体衍生该基因，或通过直接从含有该基因的细胞和组织中分离。或者，目的基因可以通过合成产生，而不是克隆。

本公开的实施例还涉及其中插入本公开的DNA的载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定整合并在子细胞中增殖。慢病毒载体相对于源自癌症-逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。

实施例还涉及治疗患者疾病的方法，包括向患者施用有效量的本公开的工程化细胞。根据本发明的方法可以治疗各种疾病，包括癌症、如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、前列腺癌和白血病。在一些实施例中，该方法包括向人患者施用包含抗肿瘤有效量的人T细胞群的药物组合物，其中该人T细胞群包括人T细胞，该人T细胞包含如本公开的核酸序列。

可能治疗的癌症包括没有血管化或尚未实质血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可能包括非实体肿瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可能包括实体瘤。用本公开内容的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。

血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性粒细胞性(细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常肿块组织。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤(诸如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移瘤)。

通常，如本文所述激活和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。具体而言，本公开的工程化细胞用于治疗癌症。具体而言，本公开的细胞用于治疗处于患癌症风险的患者。因此，本公开提供了治疗或预防癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的工程化T细胞。

本公开内容的工程化T细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合施用。简而言之，本公开的药物组合物可包含如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包括缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本公开的组合物优选配制用于静脉内施用。

本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管通过临床试验可以确定合适的剂量，但施用的数量和频率将由诸如患者的状况、患者的疾病的类型和严重程度等因素决定。

当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生通过考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者(受试者)的状况的个体差异来确定要给予的本公开的组合物的精确量。通常可以说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以104至109细胞/kg体重，优选105至106细胞/kg体重的剂量给予，包括在这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以在这些剂量下多次给药。细胞可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可容易由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征兆并相应地调整治疗来确定。

在某些实施方案中，可能希望将激活的T细胞给予受试者，然后根据本公开内容重新抽取血液(或进行单采血液成分术)，从其激活T细胞，并用这些激活的和扩增的T细胞再为患者注射。这个过程可以每隔几周进行多次。在某些实施例中，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中激活。在某些实施例中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案，可以选择某些T细胞群。

主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内，静脉(i.v)注射或腹膜内注射给予患者。在一个实施例中，本公开内容的T细胞组合物通过皮内或皮下注射给予患者。在另一个实施例中，本公开的T细胞组合物优选通过静脉注射。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。

在本公开的某些实施例中，使用本文所述的方法或本领域已知的将T细胞扩展至治疗水平的其他方法激活和/或扩增的细胞与任何数量的相关治疗方式联合(比如之前、同时或之后)给予患者，所述方式包括但不限于用诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)的试剂治疗或MS患者的那他珠单抗治疗或牛皮癣患者的依法珠单抗治疗或PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案例中，本公开的T细胞可以与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体或其他免疫清除剂例如CAM PATH、CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉宾、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70S6激酶。(Liu等，Cell 66：807-815，1991；Henderson等，Immun 73：316-321，1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun 5：763-773，1993；Isoniemi(同上))。在另一个实施例中，将本公开的细胞组合物与骨髓移植联合(例如，之前、同时或之后)施用于患者，使用化疗药物如氟达拉滨、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH进行T细胞消融治疗。在另一个实施例中，本公开的细胞组合物在B细胞消融治疗后施用，诸如与CD20反应的试剂，例如Rituxan。例如，在一个实施例中，受试者可以接受高剂量化疗然后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施例中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施例中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。

待给予患者的上述治疗剂量将随着被治疗病症和治疗接受者的确切性质而变化。可以根据本领域接受的实践进行人用试剂量的缩放。例如，对于成人患者，CAMPATH的剂量通常在1至约100mg的范围内，通常每天给药持续1至30天之间。优选的每日剂量为每天1至10mg，尽管在一些情况下可以使用每天最多40mg的较大剂量(在美国专利号6,120,766中描述，其全部内容通过引用并入)。

在美国专利号8，906，682中提供了关于利用工程T细胞的治疗癌症的方法的其他信息，其全部内容通过引用并入本文。

用于免疫治疗的可接受的体外或动物模型包括：白血病小鼠模型、体外细胞杀伤实验、药物剂量和施用途径，包括相关的动物模型和人。根据剂量105-107/kg体重，对选定的细胞进行修饰以获得CAR-T细胞，其可用于静脉输血。

实施例

通过参考以下实施例进一步描述本公开。提供这些实施例仅用于说明的目的，并非意在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下实施例，而是应解释为包含由于本文提供的启示而变得明显的任何和所有变体。

实施例1：制备缀合有CD19胞外结构域和CD22胞外结构域的微珠

CD19抗原是包括信号肽和胞外结构域的人CD19。6His标签(例如6-组氨酸)附接到CD19抗原的C末端。CD19抗原在HEK293E细胞中表达，然后纯化。重新悬浮CD19抗原之后使用结合缓冲液，其进一步与磁珠缀合以获得CD19微珠。

磁珠获得自Life(目录号：10103D)。磁珠是表面与Co2⁺离子结合的琼脂糖珠。磁珠表面上的Co2⁺离子能够与His标签结合，从而相应地制备CD19微珠。

包括CD19和CD22胞外结构域(ECD)的肽与Co2⁺磁珠混合。CD19和CD22ECD的C末端含有His标签，使得微珠与CD19和CD22ECD缀合。分析不同梯度(例如，肽的量和微珠体积之间的比率)以测试微珠和肽的缀合。然后进行流式细胞仪分析以测量结合效率，如图3所示。

含有编码抗CD19 CAR的核酸序列(SEQ ID NO:2)的慢病毒病毒转移到原代T细胞中，分离出原代T细胞用于流式细胞仪分析(见Chimeric Receptors ContainingCD137Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells andIncreased Antileukemic Efficacy in vivo Molecular Therapy，第17卷，第8号，1453-1464，2009年8月，通过引用并入本文)。抗CD19 CAR含有4-1BB信号转导结构域和CD3-ζ结构域。

实施例2：由CD19微珠刺激的抗CD19 CAR-T细胞的激活

将K562细胞、K562-CD19细胞(表达CD19的K562细胞)、CD19珠和CD22珠与等量NT(未转导的T细胞)或CAR-T细胞共培养24小时，并进行流式细胞仪分析以检测IFNγ释放。

在引起IFNγ释放的能力方面，K562-wt和K562-CD19分别代表阴性和阳性对照。如图5所示，CD22微珠不能导致IFNγ释放，并且CD19微珠引起IFNγ释放，如由两个峰所指示的(图5中的方框)。在图5的流式细胞术图中，横轴表示IFNγ释放的强度。

实施例3：由CD19微珠刺激的T细胞的扩增

分离原代T细胞并在第1天与缀合有抗CD3和抗CD28的微珠接触。在第2天，将T细胞与含有编码抗CD19 CAR的核酸序列(SEQ ID NO:2)的慢病毒转移。在第4天，从培养物中移除缀合有抗CD3和抗CD28的微珠，并将CD19微珠与T细胞共培养。从第6天开始测量T细胞增殖并示于图6，其示出CD19微珠成功刺激T细胞以扩增。

实施例4：由CD19珠子介导的T细胞的持续激活

如表1所示，分离几组原代T细胞并在第1天与缀合有抗CD3和抗CD28的微珠接触。在第2天，将T细胞与含有编码抗CD19 CAR的核酸序列(SEQ ID NO:2)的慢病毒转移。在第4天，从培养物中移除缀合有抗CD3和抗CD28的微珠，并将CD19微珠与T细胞(C组和D组)共培养至少3天。对于A组和B组，T细胞和与抗CD3和抗CD28缀合的微珠连续培养。如图7-图9所示，第5天后，利用流式细胞仪分析，测量各种参数以确定T细胞是否保持健康和功能性。对于C组和D组，还使用与抗CD3缀合的微珠(不含抗CD28)，并且获得了类似的结果。

将来自A、B、C和D各组的细胞与K562-CD19 mCherry细胞一起培养。如图9所示，来自组A和C的细胞能够杀死CD19阳性细胞。这些结果表明T细胞的持续激活可以由CD19微珠介导，并且T细胞群保持健康和功能性。

实施例5：分离方法(10ml)

利用DPBS稀释来自受试者的血液样品。单采血液成分密度梯度离心进行以获得含有淋巴细胞的PBMC。MACS缓冲液用于冲洗PBMC。将Pan T细胞-Ab混合物与PBMC混合并孵育5分钟。加入Pan T细胞微珠混合物并在2-8度孵育10分钟。LS柱用于收集CD3⁺细胞。

实施例6：使用本公开的方案针对常规T细胞分离方案评估分离T细胞的潜在优点

两种常用的T细胞分离方案和两种Dyna微珠刺激比例评估如下。1、本公开的方案：使用histopaque从全血中分离免疫细胞，然后通过亲和柱正选择。2、利用histopaque分离全部免疫全细胞。3、利用histopaque分离全部免疫细胞，然后使用3倍数量的磁珠进行刺激。评估参数可以包括转导后的CD3纯度、T细胞增殖率、慢病毒转导率和/或T细胞增殖率。

如图10中所示的流式细胞仪分析，本公开分离的细胞群的方案占CD3⁺细胞的98.48％；而来自另一种方法的样品仅获得48.43％的CD3⁺细胞。在图11中，使用本公开分离T细胞的方案的T细胞增殖率并不优于其他方法。更有活力的细胞群内的细胞间相互作用有可能促进细胞增殖，预计1：3微珠刺激更快地增殖。如图12所示，使用本公开的方案分离的T细胞在感染后第二天表现出优异的纵列感染性，并且表达CAR-T的细胞的百分比保持较高直到第9天。

表2中提供了各种构建体的序列标识符。

Claims (46)

1.一种选择性地激活用于治疗的T细胞群的方法，所述方法包括：

使T细胞群与能够结合在所述T细胞群表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)的胞外结构域的试剂接触。

2.如权利要求1所述的方法，进一步包括：

在使所述T细胞群与所述试剂接触之前，

(a)使所述T细胞群与抗CD3抗体或其上的固定于固体表面一段时间的CD3结合片段接触；

(b)将编码所述CAR的核酸序列转移至所述T细胞群；以及

(c)在转移所述核酸序列后从所述T细胞群中移除所述固体表面。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述固体表面进一步附着有抗CD28抗体。

4.如权利要求1所述的方法，进一步包括：

收集来自受试者的外周血单核细胞(PBMC)；以及

从所述PBMC中选择CD3⁺细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其中从所述PBMC中选择所述CD3⁺细胞包括：

将所述PBMC与抗体组混合以允许所述抗体组结合靶细胞，所述抗体组不包含CD3抗体；以及

从所述PBMC中移除所述靶细胞以获得含有所述CD3⁺细胞的溶液。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体组包括CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ和共刺激信号结构域，并且其中所述试剂包括结合CAR的抗原结合结构域的抗原胞外结构域。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述CAR的所述细胞外结构域是CD19抗原结合结构域。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述试剂包括CD19抗原。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述CD19抗原包括人CD19的胞外结构域。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述CD19抗原包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。

12.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述CAR包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

13.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述试剂附着于表面。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述表面是微珠。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述微珠能够激活表达所述CAR的所述T细胞群以释放IFNγ。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述表面是磁粒子。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述表面进一步附着有4-1BB抗体或其4-1BB结合片段。

18.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述T细胞群离体消耗足够数量用于治疗。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述T细胞群扩增至原始T细胞群的约100倍。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述T细胞群扩增至原始T细胞群的约100,000倍。

21.一种组合物，包括：

与包含人CD19胞外结构域的CD19抗原缀合的磁粒子，所述磁性粒子能够选择性地离体激活表达CAR用于治疗的T细胞，所述CAR包含CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

22.如权利要求21所述的组合物，其中所述T细胞已经从PBMC中收集，并且使用抗CD3抗体或其CD3结合片段预先激活。

23.如权利要求21所述的组合物，其中所述CD19抗原包括所述氨基酸序列SEQ ID NO:1。

24.如权利要求21所述的组合物，其中所述磁粒子能够激活表达所述CAR的所述T细胞群以释放IFNγ。

25.一种选择性地离体激活用于治疗的T细胞群的方法，所述方法包括：

使所述T细胞群与试剂接触以激活表达CAR的T细胞群以释放IFNγ，所述试剂包括人CD19的胞外结构域，所述CAR包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

26.如权利要求25所述的方法，进一步包括：

在使所述T细胞群与所述试剂接触之前，

(a)使所述T细胞群与固定于所述固体表面一段时间的抗CD3抗体接触；

(b)将编码所述CAR的核酸序列转移至所述接触的T细胞群；以及

(c)在转移后从所述T细胞群中移除所述固体表面。

27.如权利要求25所述的方法，进一步包括：

收集来自受试者的外周血单核细胞(PBMC)；以及

从所述PBMC中选择CD3⁺细胞。

28.如权利要求27所述的方法，其中从所述PBMC中选择所述CD3⁺细胞包括：

将所述PBMC与抗体组混合以允许所述抗体组结合靶细胞，所述抗体组不包含CD3抗体；以及

从所述PBMC中移除所述靶细胞以获得含有所述CD3⁺细胞的溶液。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述抗体组包括CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述CD19抗原包括所述氨基酸序列SEQ ID NO:1。

31.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述试剂附着于表面。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述表面是微珠。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述微珠能够激活表达所述CAR的所述T细胞群以释放IFNγ。

34.如权利要求31所述的方法，其中所述表面是磁粒子。

35.如权利要求31所述的方法，其中所述表面进一步附着有4-1BB抗体或其4-1BB结合片段。

36.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述T细胞群离体消耗足够数量用于治疗。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述T细胞群扩增至所述原始T细胞群的约100倍。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述T细胞群扩增至所述原始T细胞群的约100,000倍。

39.一种选择性地离体激活用于治疗的T细胞群的方法，所述方法包括：

(a)使T细胞群与固定于固体表面上的抗体接触，所述抗体能够激活待转移的T细胞；

(b)将编码CAR的核酸序列转移至所述T细胞群；

(c)在所述转移后从所述T细胞群中移除所述固体表面；以及

(d)使所述T细胞群与试剂接触以提供表达所述CAR的所述T细胞群的持续激活并将所述T细胞群扩增至适合治疗用途的一定数量，其中所述试剂包括人CD19的胞外结构域，并且所述CAR包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、CD3-ζ结构域和共刺激信号结构域。

40.如权利要求39所述的方法，进一步包括：

收集来自受试者的外周血单核细胞(PBMC)；以及

从所述PBMC中选择CD3⁺细胞。

41.如权利要求40所述的方法，其中从所述PBMC中选择所述CD3⁺细胞包括：

将所述PBMC与抗体组混合以允许所述抗体组结合靶细胞，所述抗体组不包含CD3抗体；以及

从所述PBMC中移除所述靶细胞以获得含有所述CD3⁺细胞的溶液。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述抗体组包括CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a。

43.如权利要求39所述的方法，其中所述CD19抗原包括所述氨基酸序列SEQ ID NO:1。

44.如权利要求39所述的方法，其中编码所述CAR的所述核酸序列包括核苷酸序列SEQID NO:2。

45.如权利要求39所述的方法，其中所述T细胞群扩增至所述原始T细胞群的约100倍。

46.如权利要求39所述的方法，其中所述T细胞群扩增至所述原始T细胞群的约100,000倍。