CN110616191B - 共刺激配体联合的car t疗法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及通过使用共刺激配体来增强CAR T疗法的组合物和方法。一些实施方案涉及编码嵌合抗原受体(CAR)和与共刺激分子相关的试剂的分离的核酸序列，所述CAR包含共刺激分子的细胞内结构域。

Description

共刺激配体联合的CAR T疗法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月31日提交的美国临时申请62,725,967的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用于扩增和维持修饰的细胞的组合物和方法，及其在治疗包括癌症在内的疾病中的用途，所述修饰的细胞包括遗传修饰的细胞。

背景技术

遗传上针对某些恶性肿瘤的T细胞疗法已经证明了巨大的临床效果。然而，直到最近，CAR T细胞疗法的使用仅限于小型临床试验，主要是晚期血癌患者。CAR和基于CAR的疗法的常规设计似乎不能激活CAR T细胞和/或杀死实体瘤。虽然可以组合多个共刺激结构域，但是T细胞的激活和T细胞的杀伤功能对于治疗实体瘤仍然不是理想的。

发明内容

本文的实施方案涉及用于使用CAR细胞治疗癌症的组合物和方法。一些实施方案涉及分离的核酸序列，其编码嵌合抗原受体(CAR)和与第一共刺激分子相关的试剂，所述CAR包含第二共刺激分子的细胞内结构域。一些实施方案涉及分离的细胞，其包含CAR和与第一共刺激分子相关的试剂，所述CAR包含第二共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，试剂位于细胞的表面上。

本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

参考附图进行详细说明。在不同图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。

图1是示出CAR和共刺激分子的配体或激动剂抗体的实例的示意图；

图2是示出包含CAR的细胞的一部分的实例的示意图；

图3是示出分离的核酸序列的结构的实例的示意图；

图4和5是流式细胞术测定的结果，显示了CAR在各种CAR T细胞中的表达强度和表达水平；

图6和7是流式细胞术测定的结果，显示了各种CAR T细胞中配体的表达强度和表达水平；

图8是显示各种CAR T细胞的杀伤功能测定的结果；

图9是显示各种CAR T细胞中激活标记物表达的细胞计数测定结果；

图10是细胞计数测定的其他结果，显示了各种CAR T细胞中的激活标记物表达；

图11是各种CAR T细胞中记忆分子标记物表达的结果。

详细说明

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

冠词“一个/一种(a/an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即，至少一个)冠词语法对象。举例来说，“一种要素”意指一种要素或多于一种要素。

“约”意指数量、水平、数值、数、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的参考数量、水平、数值、数、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

如本文所用，术语“激活”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指经历细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。本公开中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂、以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999，In：UsingAntibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等人，1989，In：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883；Bird等人，1988，Science242：423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠产生六个高变环(从H链和L链中各自产生3个环)，其为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含特异于抗原的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

如本文所用，“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种。如本文所用，“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。使用本领域可获得且众所周知的技术获得合成DNA。

术语“抗原”是指引发免疫应答的分子，其可涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞的激活、或两者。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质或肽，或衍生自重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码本文使用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。可以从包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物体液的生物样品中产生、合成或衍生得到抗原。

本文所用的术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数减少、转移数减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加或与癌性病状相关的各种生理症状的改善相关的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来证明。

术语“自身抗原”是指被免疫系统错误地识别为外来的抗原。自身抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体的”用于描述衍生自受试者的材料，其随后被重新引入同一受试者。

术语“同种异体的”用于描述衍生自相同物种的不同受试者的移植物。例如，供体受试者可以是相关或不相关或受体受试者，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标志物。

术语“异种的”用于描述衍生自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，并且供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(includ)”和“包括(including)”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。

短语“由...组成”意味着包括并且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列要素是必需的或强制性的，并且不可以存在其他要素。

短语“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或有助于本公开中针对所列要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。

术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可存在“完整的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。

术语“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或部分基本上相同或互补的核苷酸序列或编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的原始信号之外的信号，还介导T细胞应答，包括增殖、激活、分化和其他细胞应答中的至少一种。共刺激配体可包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体尤其还包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指与原始信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

术语“疾病”和“病状”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定的疾病或病状可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认识到作为一种疾病，但仅作为一种不良病状或综合征，其中临床医生已经确定了一组或多或少特定的症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果不治疗，病症不一定会导致动物的健康状态进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或意图的结果。例如，治疗背景中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，其具有定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链和非编码链可被称为编码基因或cDNA的蛋白质或其他产物，所述编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同(除了“T”被“U”代替)并且通常在序列表中提供，并且所述非编码链用作该基因或cDNA的转录的模板。

术语“外源的”是指在野生型细胞或生物体中不天然存在但通常通过分子生物学技术引入细胞的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。此外，通过分子生物学技术从第一生物体分离并转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体的实施方案中，多核苷酸序列可以通过分子生物学技术“引入”已经包含这种多核苷酸序列的微生物，例如，以产生天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，从而促进编码的多肽的过表达。

术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“同源的”是指两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则分子在该位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以相比的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。当两个序列比对以产生最大同源性时进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是不具有已知抗体功能，但可以用作抗原受体的免疫球蛋白。IgE是在暴露于过敏原时通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质而介导即时超敏反应的免疫球蛋白。

术语“分离的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，例如蛋白质或核酸。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已经从其天然存在状态下在其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如，已从通常与片段相邻的序列中移除的DNA片段。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境中和从与细胞的其他组分缔合中体外分离和/或纯化。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与其缔合的组分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其天然存在或天然状态下通常与其缔合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下与其天然缔合的细胞分离的细胞。在一些实施方案中，细胞在体外培养。在其他实施方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包含内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可包含内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。此外，慢病毒的使用使得遗传信息能够整合到宿主染色体中，从而产生稳定转导的遗传信息。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的情况下受试者中的反应水平相比，和/或与另外相同但未经治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反应水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或反应，从而介导受试者(优选人)中有益的治疗反应。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便有利于翻译，则其与编码序列可操作地连接。

术语“在转录控制下”是指与多核苷酸可操作地连接并且在与多核苷酸相关的正确位置和方向上的启动子，控制由RNA聚合酶进行的转录起始和多核苷酸表达。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示相对于来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自疾病区域(例如患者特定组织或器官内的实体瘤)的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者可通过本领域已知的标准测定来确定。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤，癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如脑胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(又称多形性胶质母细胞瘤))、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。表1中提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。

表1实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤

术语组合物的“肠胃外施用”包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法的任何人、动物或活生物体。在一些实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在一些实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

有需要治疗或有需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病状或病症的受试者。有需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病状或病症的受试者。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的表现出与参考多核苷酸序列或多核苷酸具有大部分序列同一性的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中已添加或缺失一个或多个核苷酸或用不同核苷酸替换一个或多个核苷酸的多核苷酸。在这方面，本领域充分理解，可以对参考多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性或者具有与参考多核苷酸相关的增加的活性(即，优化的)。多核苷酸变体包括，例如，本文描述的与参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％以及其间的所有整数百分比，例如，90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如对应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可包括酶多肽或“酶”，其通常催化(即，提高)各种化学反应的速率。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而区别于参考多肽序列的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一种或多种取代而区别于参考多肽，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言，本领域充分理解一些氨基酸可以在不改变多肽活性的性质的情况下改变为具有广泛相似性质的其他氨基酸。多肽变体还包括其中已添加或缺失一个或多个氨基酸或用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸的多肽。

术语“启动子”是指由启动多核苷酸序列的特定转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器(synthetic machinery)识别的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合(bind)”、“结合(binds)”或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的特定第二分子但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计上显著的”意味着结果不可能偶然发生。统计学显著性可通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p值，如果零假设为真，则p值是观察事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝原假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更小。“减少”或“降低”或“更少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括本文描述的量或水平减少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括其间大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8倍等)。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合诱导的初次应答，从而介导信号转导事件，例如通过TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。

术语“刺激分子”是指T细胞上的分子，其特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体。例如，衍生自刺激分子的功能信号传导结构域是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。刺激分子包括负责信号转导的结构域。

术语“刺激配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时可以与细胞上的同源结合配偶体(本文称为“刺激分子”)特异性结合的配体，例如T细胞，从而介导T细胞的初次应答，包括激活、启动免疫应答、增殖和类似过程。刺激配体是本领域熟知的，尤其包括载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体。

术语“治疗性的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态的症状来获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在一定程度上缓解的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重性和待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，删除基因env、vif、vpr、vpu和nef，使得载体在生物学上是安全的。

范围：贯穿本公开，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本公开范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为具有特定公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

“嵌合抗原受体”(CAR)分子是重组多肽，其至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR的结构域位于相同的多肽链上，例如嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，结构域位于不同的多肽链上，例如结构域不是连续的。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰的细胞，例如CAR T细胞，或用于杀死肿瘤细胞，例如实体瘤。在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰的细胞的抗原结合结构域结合WBC表面上的抗原，例如细胞表面分子或标志物。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞和/或淋巴细胞。在实施方案中，WBC是淋巴细胞，例如B细胞。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138、或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。

在实施方案中，用于杀死肿瘤的抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如肿瘤相关MUC1(tMUC1)、神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、muthsp70-2、M-CSF、前列腺素酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF))-I、IGF-II、IGF-I受体、CD19和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可以称为CD19CAR，其是包含结合CD19的抗原结合结构域的CAR分子。

在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括至少一个scFv或至少一个单结构域抗体。例如，CAR上可以有两个scFv。scFv包括轻链可变区(VL)和通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的重链可变区(VH)。单链可变区片段可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备(Bird等人，Science 242：423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO:31)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计并使用了其他序列的接头(Bird等人，1988，同上)。通常，接头可以是短的、柔性的多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成产生，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞、真核细胞(如酵母)、植物、昆虫或哺乳动物细胞、或原核细胞(如大肠杆菌)。编码感兴趣scFv的多核苷酸可以通过常规操作制备，例如连接多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号结构域衍生自原始信号传导结构域，例如CD3ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7的细胞内结构域、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括衍生自T细胞受体的CD3ζ结构域。

本文描述的CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中并入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域和/或细胞质结构域的任何寡聚体或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。

本公开涉及修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸和编码与第一共刺激分子相关的试剂的第二核酸，其中CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原，细胞内结构域包含第二共刺激分子的细胞内结构域。在实施方案中，修饰的细胞是T细胞、NK细胞或树突细胞。

在实施方案中，试剂位于细胞的表面上。在实施方案中，所述试剂是第一共刺激分子的共刺激配体或激动剂抗体。如本文所用，“激动剂抗体”是激活其结合的抗原的生物活性的抗体。在实施方案中，激动剂抗体激活，抗体的部分解离允许单个抗体的抗原结合片段(Fab)臂以动态方式与多于两个受体相互作用，导致多个受体单体募集到受体寡聚体中，其中信号传导可以触发激活。在实施方案中，抗原呈递细胞(APC)充当支架以交联与受体(例如，共刺激受体)结合的激动剂抗体，导致受体超簇群形成和增加的激动剂信号传导。一些蛋白质(例如CD28家族和TNF受体家族)具有用于肿瘤治疗的激动剂抗体。关于激动剂抗体和共刺激分子的更多信息可以在Nature Reviews Drug Discovery第17卷，第509-527页(2018)中找到，其引入本文作为参考。

在实施方案中，所述试剂包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L的配体、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、TNFR相关蛋白(GITR)、或与B7-H3特异性结合的配体。

在实施方案中，所述试剂包括与共刺激分子特异性结合的激动剂抗体，所述共刺激分子是CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或包括与CD83特异性结合的配体。

在实施方案中，第二共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、GITR及其任何组合。

在实施方案中，第一共刺激分子是ICOS，第二共刺激分子是4-1BB，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、5、4和10的氨基酸序列。第一共刺激分子是GITR，第二共刺激分子是4-1BB，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、5、4和8的氨基酸序列。第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是GITR，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、7、4和6的氨基酸序列。第一共刺激分子是ICOS，第二共刺激分子是GITR，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、7、4和10的氨基酸序列。第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是ICOS，或分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、9、4和6的氨基酸序列。或者，第一共刺激分子是GITR，第二共刺激分子是ICOS，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NO s:1、2、9、4和8的氨基酸序列。

在实施方案中，第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是4-1BB、CD86、GITR或CD137。在实施方案中，CAR还包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域。在实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、D19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。

一些实施方案涉及修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸和编码与第一共刺激分子相关的试剂的第二核酸，其中CAR包含第二共刺激分子的细胞内结构域。在实施方案中，第一和第二共刺激分子是相同或不同的。在实施方案中，试剂位于细胞表面上，和/或试剂是第一共刺激分子的共刺激配体或激动剂抗体。在实施方案中，修饰的细胞包含编码SEQ ID NOs:21-30中的至少一种的核酸。

一些实施方案涉及包含修饰的细胞群的组合物。一些实施方案涉及增强受试者中T细胞应答或治疗受试者肿瘤的方法，该方法包括：施用有效量的组合物。

通过参考以下示例性实施方案和实施例进一步描述本发明。提供这些示例性实施方案和实施例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不旨在限制本发明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下示例性实施方案和实施例，而是应该被解释为包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。

具体实施方式

以下是示例性实施方案：

1、一种分离的核酸序列，其编码嵌合抗原受体(CAR)和与第一共刺激分子相关的试剂，所述CAR包含第二共刺激分子的细胞内结构域。

2、一种分离的细胞，其包含CAR和与第一共刺激分子相关的试剂，所述CAR包含第二共刺激分子的细胞内结构域。

3、实施方案2的分离的细胞，其中所述试剂位于细胞的表面上。

4、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中所述试剂是第一共刺激分子的共刺激配体。

5、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中所述试剂包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L的配体、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、TNFR相关蛋白(GITR)、或与B7-H3特异性结合的配体。

6、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中所述试剂包括与共刺激分子特异性结合的抗体，所述共刺激分子是CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或包括与CD83特异性结合的配体。

7、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第二共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、GITR及其任何组合。

8、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第一共刺激分子是ICOS，第二共刺激分子是4-1BB。

9、实施方案8的分离的核酸序列或细胞，其中分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、5、4和10的氨基酸序列。

10、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第一共刺激分子是GITR，第二共刺激分子是4-1BB。

11、实施方案10的分离的核酸序列或细胞，其中分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、5、4和8的氨基酸序列。

12、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是GITR。

13、实施方案12的分离的核酸序列或细胞，其中分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、7、4和6的氨基酸序列。

14、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第一共刺激分子是ICOS，第二共刺激分子是GITR。

15、实施方案14的分离的核酸序列或细胞，其中分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、7、4和10的氨基酸序列。

16、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是ICOS。

17、实施方案16的分离的核酸序列或细胞，其中分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、9、4和6的氨基酸序列。

18、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中第一共刺激分子是GITR，第二共刺激分子是ICOS。

19、实施方案18的分离的核酸序列或细胞，其中分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、9、4和8的氨基酸序列。

20、实施方案1-3中任一项的分离的核酸序列或细胞，其中CAR还包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域。

21、实施方案20的分离的核酸序列或细胞，其中肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。

22、实施方案20的分离的核酸序列或细胞，其中所述抗原结合结构域包含SEQ IDNOs:2和11-20之一的氨基酸序列。

23、一种载体，其包含实施方案1的分离的核酸序列。

24、一种分离的细胞，其包含实施方案1的分离的核酸序列。

25、实施方案2、3和16中任一项的分离的细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或树突细胞。

26、一种组合物，其包含实施方案17的分离的细胞群。

27、一种增强受试者中T细胞应答或治疗受试者肿瘤的方法，所述方法包括：施用有效量的实施方案26的组合物。

28、实施方案26的组合物，其中分离的细胞是T细胞。

29、一种修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸和编码与第一共刺激分子相关的试剂的第二核酸，其中所述CAR包含第二共刺激分子的细胞内结构域。

30、实施方案29的修饰的细胞，其中所述第一共刺激分子和第二共刺激分子相同或不同。

31、实施方案29的修饰的细胞，其中所述试剂位于细胞表面上，和/或所述试剂是第一共刺激分子的共刺激配体或激动剂抗体。

32、实施方案29-31之一的修饰的细胞，其中所述试剂包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L的配体、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、TNFR相关蛋白(GITR)、或与B7-H3特异性结合的配体。

33、实施方案29-31之一的修饰的细胞，其中所述试剂包括与共刺激分子特异性结合的激动剂抗体，所述共刺激分子是CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或包括与CD83特异性结合的配体。

34、实施方案29-33之一的修饰的细胞，其中第二共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、GITR及其任何组合。

35、实施方案29-34之一的修饰的细胞，其中：第一共刺激分子是ICOS，第二共刺激分子是4-1BB，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、5、4和10的氨基酸序列；

第一共刺激分子是GITR，第二共刺激分子是4-1BB，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、5、4和8的氨基酸序列；

第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是GITR，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、3、7、4和6的氨基酸序列；

第一共刺激分子是ICOS，第二共刺激分子是GITR，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含中SEQ ID NOs:1、2、3、7、4和10的氨基酸序列；

第一共刺激分子是4-1BB，第二共刺激分子是ICOS，或分离的核酸序列以5'至3'的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、9、4和6的氨基酸序列；或者，

第一共刺激分子是GITR，第二共刺激分子是ICOS，或分离的核酸序列以5’至3’的顺序包含SEQ ID NOs:1、2、9、4和8的氨基酸序列。

36、实施方案29-35之一的修饰的细胞，其中第一共刺激分子是4-1-BB，第二共刺激分子是4-1BB、CD86、GITR或CD137。

37、实施方案29-36之一的修饰的细胞，其中CAR还包含结合肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域。

38、实施方案37的修饰的细胞，其中肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。

39、实施方案29-38之一的修饰的细胞，其中修饰的细胞是T细胞、NK细胞或树突细胞。

40、一种组合物，其包含实施方案39的修饰的细胞群。

41、一种增强受试者中T细胞应答或治疗受试者肿瘤的方法，所述方法包括：施用有效量的实施方案40的组合物。

42、编码CAR和实施方案29-39之一的试剂的多核苷酸。

实施例1

从志愿者获得CD3+细胞。用分别编码hCD19CAR、hCD19CAR-CD80、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-41BBL和hCD19CAR-GITRL的各种载体(如图1-3所示)转移细胞(hCD19CAR MOI＝5:1；其他载体MOI＝10:1)。更换培养基，从第2天至第5天将细胞扩增。将CAR T细胞与底物细胞共培养以检测表型和细胞因子释放。收集上清液，测量CAR的拷贝数。在第8天，收集培养的细胞并分成组，每组包括200×10⁵个细胞。裂解细胞，提取细胞的基因组DNA。使用41bb引物和探针检测细胞的拷贝数。如表2所示，细胞拷贝数hCD19CAR为1.044，hCD19CAR-CD80为0.718，hCD19CAR-CD86为1.033，hCD19CAR-41BBL为1.089，hCD19CAR-GITRL为0.723。数据显示每组的拷贝数/细胞没有显著差异。

表2细胞中CAR拷贝数

实施例2

图4和5是流式细胞术测定的结果，显示了CAR在各种CAR T细胞中的表达强度和表达水平。在第0天，取健康志愿者的外周血，分选CD3+T细胞，并以1:1的比例加入CD3/CD28Dynabeads。在第2天，使用包含各种下列载体的慢病毒转染T细胞。根据MOI＝10:1的感染率感染19CAR，而hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL/hCD19CAR-41BBL、hCD19CAR-CD80感染细胞的感染率为MOI＝60:1。在第3天，更换细胞培养基，除去慢病毒，并将细胞重悬于新鲜培养基中。在第7天，使用流式细胞术测定来检测CAR表达。19CAR是人源化抗体，因此用人CAR抗体检测。结果如图4和5所示，hCD19CAR CAR的表达率为33.6％，hCD19CAR-CD86 CAR的表达率为11.96％，hCD19CAR-GITRL CAR的表达率为11.34％，hCD19CAR-41BBL CAR的表达率为15.87％，hCD19CAR-CD80 CAR的表达率为5.91％。使用人CAR抗体进行流式细胞术检测以检测CAR的表达强度和表达水平。

实施例3

图6和7是流式细胞术测定的结果，显示了各种CAR T细胞中配体的表达强度和表达水平。在第0天，取健康志愿者的外周血，分选CD3+T细胞，并以1:1的比例加入CD3/CD28Dynabeads。在第2天，使用包含各种下列载体的慢病毒转染T细胞。根据MOI＝10:1的感染率感染19CAR，而hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL/hCD19CAR-41BBL、hCD19CAR-CD80感染细胞的感染率为MOI＝60:1。在第3天，更换培养基，除去慢病毒，并将细胞重悬于新鲜培养基中。在第7天，使用流式细胞术测定来检测CAR和配体表达。结果如下：hCD19CAR CAR的CD80表达率为0.21％，CD86为0.48％，41BBL为0.49％，GITRL为4.82％。hCD19CAR-CD80的CD80表达率为81.47％，h19CAR-CD86的CD86表达率为44.78％，h19CAR-41BBL的41BBL表达率为10.63％，19CAR-GITRL的GITRL表达率为25.05％。数据显示每种配体都被表达和检测。使用人CD80/86/41BBL/GITRL抗体进行流式细胞术检测以检测配体的表达强度和表达水平。

实施例4

图8显示各种CAR T细胞的杀伤功能测定的结果。向培养至第8天CAR T细胞中加入NT细胞，使CAR+比例一致。将3x10⁵ CAR+细胞分别与10⁵ Nalm-6细胞和9x10⁵ Nalm-6细胞共培养。在两次补充肿瘤后24小时测量nalm6细胞的残留(24和48小时)。在hCD19CAR后，分别将hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL、hCD19CAR-CD80与nalm6细胞共培养。在加入nalm6/T细胞达到E:T比例为1:3的情况下，肿瘤杀伤没有显著差异，而在E:T比例为1:1的情况下，在加入肿瘤后24小时hCD19CAR-GITRL会更好地杀死肿瘤。在CAR-T细胞被肿瘤抗原激活后，T细胞发挥杀伤作用并作用于靶细胞以使靶细胞死亡。

实施例5

图9是显示各种CAR T细胞中激活标记物表达的细胞计数测定结果。将细胞培养至第8天，然后使用NT细胞使hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL和hCD19CAR-CD80CAR的CAR比例一致。将3x10⁵ CAR+细胞分别与10⁵ Nalm-6细胞和9x10⁵Nalm-6细胞共培养。在24小时内测量CAR-T细胞的激活。图9显示了与nalm6细胞共培养的hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL细胞中CD137的表达。如图9所示，hCD19CAR的表达率为12.63％，hCD19CAR-CD86的表达率为18.55％，h19CAR-GITRL的表达率为26.38％，h19CAR-41BBL的表达率为14.31％。可以看出，h19CAR-GITRL中CD137的表达率显著高于其他组。这表明激活程度显著高于其他组，表明GITRL帮助CAR T细胞提高了它们在杀伤过程中的激活能力。当CAR-T细胞被肿瘤抗原激活时，T细胞上调激活蛋白标记物的表达。表达的强度越高，CAR T的激活越高。

实施例6

图10是细胞计数测定的其他结果，显示了各种CAR T细胞中的激活标记物表达。将细胞培养至第8天，然后使用NT细胞使hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL和hCD19CAR-CD80CAR的CAR比例一致。将3x10⁵ CAR+细胞分别与10⁵ Nalm-6细胞和9x10⁵ Nalm-6细胞共培养。在CAR-T细胞中表达CD25以确定24小时后CAR T细胞的激活。图10显示了分别与nalm6细胞共培养的hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL细胞中CD25的表达水平。如图10所示，hCD19CAR的表达率为14.28％，hCD19CAR-CD86的表达率为21.26％，h19CAR-GITRL的表达率为25.72％，h19CAR-41BBL的表达率为25.23％。可以看出，h19CAR-GITRL的CD25表达显著高于其他组。这表明激活程度显著高于其他组，表明GITRL帮助CAR T细胞提高了它们在杀伤过程中的激活能力。当CAR-T细胞被肿瘤抗原激活时，T细胞上调激活蛋白标记物的表达。表达的强度越高，CAR T的激活越高。

实施例7

图11是各种CAR T细胞中记忆分子标记物表达的结果。将细胞培养至第8天，然后使用NT细胞使hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL的CAR比例一致。将3x10⁵ CAR+细胞分别与10⁵ Nalm-6细胞和9x10⁵ Nalm-6细胞共培养。在24小时内在CAR-T细胞中测量CD45RO和CD62L的表达以判断记忆的状况。图11显示了分别与nalm6细胞共培养的hCD19CAR、hCD19CAR-CD86、hCD19CAR-GITRL、hCD19CAR-41BBL、hCD19CAR-CD80细胞中CD45RO和CD62L的表达水平。如图11所示，hCD19CAR Tn为54.18％，Teff为25.66％，h19CAR-GITRL Tn为22.12％，Teff为58.01％。可以看出，h19CAR-GITRL的Tn表达显著高于其他组。这表明激活程度显著高于其他组，表明GITRL帮助CAR T细胞提高了它们在杀伤过程中的激活能力。它可以快速激活，CAR T细胞迅速分化为Teff细胞，形成效应细胞的杀伤功能。当CAR-T细胞被肿瘤抗原激活时，T细胞上调激活蛋白标记物的表达。表达的强度越高，CAR T的激活越高。CAR-T的序列如表3所示。

表3 CAR-T序列表

本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。尽管已经根据各种实施例描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，在不脱离其精神的情况下，可以进行各种修改，替换，省略和改变。

序列表

<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司

<120> 共刺激配体联合的CAR T疗法

<130> SDS1.0055US

<150> US62/725,967

<151> 2018-08-31

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

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65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

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100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

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180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

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210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

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Ser Ser

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<212> PRT

<213> synthesized

<400> 3

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1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

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65

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

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1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 6

<211> 254

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

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100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

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Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

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<210> 7

<211> 58

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro

1 5 10 15

Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala

20 25 30

Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu

35 40 45

Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val

50 55

<210> 8

<211> 199

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro

20 25 30

Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu

35 40 45

Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser

50 55 60

Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys

65 70 75 80

Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser

85 90 95

Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu

100 105 110

Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

115 120 125

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

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Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

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Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

165 170 175

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

180 185 190

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

195

<210> 9

<211> 104

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

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1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Leu

35 40 45

Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile

50 55 60

Leu Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp

65 70 75 80

Pro Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys

85 90 95

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100

<210> 10

<211> 302

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu

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Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp

20 25 30

Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn

35 40 45

Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr

50 55 60

Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr

65 70 75 80

Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe

85 90 95

Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His

100 105 110

Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val

115 120 125

Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser

130 135 140

Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser

145 150 155 160

Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp

165 170 175

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210 215 220

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275 280 285

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<210> 11

<211> 237

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

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Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala

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195 200 205

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210 215 220

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<211> 244

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

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1 5 10 15

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50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu

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Gly Ile Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

115 120 125

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165 170 175

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Asp Trp Asn Tyr Asn Pro Leu Arg Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

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Thr Val Ser Ser

<210> 13

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Gly Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly

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Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

165 170 175

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180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

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<210> 14

<211> 243

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Tyr

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100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln

115 120 125

Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys

130 135 140

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys

145 150 155 160

Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr

165 170 175

Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr

210 215 220

Gly Thr Asn Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 15

<211> 241

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln

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130 135 140

Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg

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Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg

165 170 175

Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

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Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 16

<211> 246

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Arg Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gln Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly

130 135 140

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp

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180 185 190

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala

195 200 205

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

210 215 220

Cys Ala Thr Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ala

245

<210> 17

<211> 199

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg

1 5 10 15

Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu

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Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg

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Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala

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Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr

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Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu

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Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn

130 135 140

Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp

145 150 155 160

Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg

165 170 175

Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg

180 185 190

Ile Ile His Asn Asn Asn Cys

195

<210> 18

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

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Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

260 265 270

Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

275 280

Claims (4)

1.一种修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体CAR和与第一共刺激分子相关的位于细胞表面的试剂的核酸序列，其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞外结构域结合抗原，所述细胞内结构域包含第二共刺激分子的细胞内结构域；

其中，所述第一共刺激分子是GITR，所述第二共刺激分子是4-1BB；所述核酸序列为编码SEQ ID NO:23的序列。

2.根据权利要求1所述的一种修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是T细胞或NK细胞。

3.一种组合物，其包含根据权利要求2所述的修饰的细胞。

4.根据权利要求3所述的一种组合物在制备增强受试者中T细胞应答或治疗受试者肿瘤药物中的应用。

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