CN112501125A - 偶联嵌合抗原受体细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

偶联嵌合抗原受体细胞及其用途。本公开涉及修饰的细胞包含编码抗原结合分子的核酸序列，该序列进一步包括抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞内信号传导结构域至少包含TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TLR10,TLR11,MYD88,TRIF,TRAM,或TIRAP其中任一的信号传导域。

Description

偶联嵌合抗原受体细胞及其用途

技术领域

本公开属于生物医药技术领域，涉及使用偶联嵌合抗原受体细胞疗法治疗包括癌症在内的疾病的细胞、组合物和方法。

背景技术

肿瘤的细胞免疫疗法目前已经取得了很大的成果，但是细胞疗法仍然难以治疗某些恶性肿瘤，并且在某些治疗中还引起了副作用。基因组编辑技术的最新进展使科学家能够编辑细胞中的基因表达，以增强效应子功能或绕过肿瘤免疫抑制和代谢不利的肿瘤微环境。因此，需要调节细胞内信号传导结构域以增强肿瘤的细胞免疫疗法。

发明内容

本公开涉及修饰的细胞包含编码抗原结合分子的核酸序列，该序列近一步包括抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞内信号传导结构域至少包含TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TLR10,TLR11,MYD88,TRIF,TRAM,TIRAP其中任一的信号传导域。

本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。

图1显示了编码抗原结合分子的核酸序列的载体结构。

图2显示了编码抗原结合分子的核酸序列的CAR结构示意图。

图3显示了跨膜结构域包含CD8或CD40的跨膜结构域的示意图。

图4显示了流式表达MyD88和CD40的CAR表达示意图。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

所谓“约”是指数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，相差多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性或功能。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(每个来自H和L链的3个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

如本文所用，“抗体重链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较大的一种。如本文所用，“抗体轻链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。使用本领域可获得且众所周知的技术可获得合成DNA。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引起免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。可以从包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体的生物样品产生，合成或衍生。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症相关的各种生理症状的改善有关的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生方面的能力来表现。

术语“自体抗原”指的是由免疫系统错误识别为外源的抗原。自体抗原包括细胞蛋白质、磷蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述源自受试者的材料，随后将其重新引入相同的受试者。

术语“同种异体”用于描述来源于相同物种的不同受试者的移植物。作为例子，供体受试者可以是与受体受试者相关或不相关的，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标记。

术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所述步骤或元件或步骤或元件的组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的组。

短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。

短语“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何元素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列元素指定的活动或动作的其他元素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的元素是必需的或强制性的，但是其他元素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活动或动作。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配，或者在核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。

术语“对应”或“对应于”是指(a)具有与参考肽或蛋白质中的多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号之外的信号，其介导T细胞应答，包括增殖、活化、分化和其他中的至少一种细胞反应。共刺激配体可包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体尤其还包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指信号，其与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认识到作为一种疾病，但仅作为不良状况或综合征，其中临床医生已经确定了或多或少特定的一组症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果不及时治疗，疾病并不一定会导致动物的健康状况进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，具有任何定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了“T”被“U”代替)并且通常在序列表中提供，并且非编码链用作模板对于基因或cDNA的转录，可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源性”是指在野生型细胞或生物中不天然存在但通常通过分子生物学技术引入细胞的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源性”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。而且，从第一生物体中分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如以产生另外天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，并且由此有助于过表达编码的多肽。

术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。

术语“同源的”是指两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个多肽中的每一个中的位置。DNA分子被腺嘌呤占据，然后分子在该位置同源。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以相比的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对以产生最大同源性时进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是没有已知的抗体功能但可以作为抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在暴露于过敏原时从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质而介导即时超敏反应的免疫球蛋白。

术语“分离的”是指基本上或基本上不含通常伴随其天然状态的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常是正常序列中去除的DNA片段与片段相邻。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境的体外分离和/或纯化，以及与其他组分细胞。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在某些实施方案中，细胞在体外培养。在某些实施方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息输送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。来自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比，调节受试者中反应水平的可检测增加或减少，和/或与在其他方面相同但未经处理的主题中的回应。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者，优选人的有益治疗反应。

当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。

术语“在转录控制下”是指与多核苷酸有效连接并处于正确位置和方向的启动子，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

术语“过度表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示肿瘤抗原在来自疾病区域的细胞中的异常表达水平，所述疾病区域例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤到来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌症、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤))、胶质母细胞瘤(也是称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)、静脉内(iv)、肌内(im)、胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法的任何人、动物或生物体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

需要治疗或有此需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病症或病状的受试者。有此需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病症或病状的受试者。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％以及所有整数百分比之间，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸本文所述的术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直向同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)的酶促多肽或“酶”。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分的多肽。在某些实施方案中，通过一个或多个取代将多肽变体与参考多肽区分开来，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言，本领域中熟知可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基置换的多肽。

术语“启动子”是指由启动多核苷酸序列特异性转录所需的细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合”，或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的第二分子但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体，蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于存在。特定结构(例如，抗原决定簇或表位)对化学物质的影响；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计上显著”意味着结果不可能偶然发生。统计显著性可通过本领域已知的任何方法确定。常用的重要度量包括p值，即如果零假设为真，观察事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.5或更小。“降低”或“减少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括减少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括所有整数和介于1和大于1之间的小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的本文所述的数量或水平。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，例如经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。

术语“刺激分子”是指特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体的T细胞上的分子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的ζ链。

术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与细胞(例如T细胞)上的同源结合配偶体(在本文中称为作为“刺激分子”)特异性结合的配体，从而介导T细胞的主要反应，包括活化、启动免疫应答，增殖和类似过程。刺激性配体在本领域中是公知的，并且尤其包括装载有肽、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

术语“治疗剂”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态症状而获得。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或另一临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种症状或症状的发展或在一定程度上减轻所述病症或疾病的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物、疾病及其严重程度和年龄、体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包括主要受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使得载体在生物学上是安全的。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

“嵌合抗原受体”(CAR)分子是重组多肽，其至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域。在实施方案中，CAR的结构域位于相同的多肽链上，例如嵌合融合蛋白。在实施方案中，结构域位于不同的多肽链上，例如结构域不是连续的。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域结合B细胞表面上的抗原，例如细胞表面分子或标记物。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138、或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在特定的实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。

在实施方案中，抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如肿瘤相关MUC1、胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)，凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺素酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活蛋白、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可以称为CD19CAR。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号传导结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号传导结构域衍生自主要信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7的细胞内结构域、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括衍生自T细胞受体的CD3-ζ结构域。

在实施方案中，CAR的细胞质结构域仅包括一个或多个刺激结构域而没有信号传导结构域。

CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在细胞外结构域和CAR的跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。

受试者中的淋巴细胞或T细胞应答是指与辅助细胞、杀伤细胞、调节细胞和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞应答可以包括诸如在免疫过程中辅助其他WBC以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞应答可以通过各种指标来测量，例如T细胞杀死的许多病毒感染的细胞和/或肿瘤细胞，T细胞在与病毒感染的细胞共培养时释放的细胞因子的量和/或肿瘤细胞，受试者中T细胞的增殖水平，T细胞的表型变化，例如记忆T细胞的变化，以及受试者中T细胞的水平寿命或寿命。

在实施方案中，增强T细胞应答的方法治疗有此需要的受试者，例如，诊断患有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指块状肿瘤，其可以是液体肿瘤的集合，例如血液或固体物质。肿瘤可以是恶性的(癌性的)或良性的。血癌的实例包括慢性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。

本文描述的方法可用于治疗诊断患有癌症的受试者。癌症可以是血癌或可以是实体瘤，例如肉瘤或癌。治疗方法包括向受试者施用包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的有效量的T细胞以提供T细胞应答，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合不同于WBC的细胞表面分子的抗原。在实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括选择性增强体内表达第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的T细胞的增殖。

本文描述的实施方案涉及用于制备修饰细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用编码至少CAR的DNA转染细胞样品，并在选择性增强CAR表达T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。

在实施方案中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，通过单采血液成分术或静脉穿刺术获得细胞样品。在实施方案中，细胞样品是T细胞的亚群。

一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂，所述治疗剂是或包含至少一种IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23的组合物。在一些实施方案中，治疗剂是或包含Eome、TRAF6、IL12、IL2、IL18、IL23、AQP9、Runx3、AMPK或BCL-2。

一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂，所述治疗剂是或包含至少一种TNFRSF超家族成员受体活化抗体或其膜结合形式，TNFRSF超家族成员配体或其膜结合形式，不同的趋化因子或其膜结合形式，趋化因子抗体，或趋化因子或膜受体抗体。TNFRSF超家族成员受体活化抗体或其膜结合形式，TNFRSF超家族成员配体或其膜结合形式，趋化因子或其膜结合形式，趋化因子抗体，或趋化因子受体抗体或膜结合其形式，或D28家族的配体。例如，TNFRSF超家族成员受体可包括肿瘤坏死因子受体1、肿瘤坏死因子受体2、淋巴毒素β受体、淋巴毒素β受体、CD40、Fas受体、诱饵受体3、CD27、CD30、4-1BB、死亡受体4、死亡受体5、诱饵受体1、诱饵受体2、RANK、骨保护素、TWEAK受体、TACI、BAFF受体、疱疹病毒进入介质、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原、糖皮质激素诱导相关的TNFR、TROY、死亡受体6、死亡受体3、Ectodysplasin A2受体等。

在一些实施方案中，治疗剂包括抗体试剂(例如，单链抗体(例如，scFv)、单结构域抗体(例如，骆驼抗体)、或双特异性抗体试剂(例如，双特异性T细胞)。在其他实施方案中，治疗剂包括细胞因子。细胞因子的实例包括IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、MIP-1n、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM-CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L、铁蛋白及其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子可包括促炎细胞因子，例如：IFN-γ、IL-15、IL-4、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。例如，IFN-γ已被FDA批准治疗患有恶性骨质疏松症的患者(例如，Journal of Pediatrics 121(1)：119-24·1992年8月)。

一些实施方案涉及包含核酸序列和另外的核酸序列的CAR细胞群，其中CAR细胞包含淋巴细胞、白细胞或PBMC。在一些实施方案中，CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子。在一些实施方案中，多蛋白包含CAR和治疗剂之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A，和/或CAR和治疗剂各自组成型表达。在一些实施方案中，CAR细胞包含：第三核酸序列，其编码与不同于CAR的抗原结合的另外的CAR，或结合实体肿瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在实施方案中，治疗剂或其变体可以重组或合成产生。对于治疗剂的合成生产，可以使用自动合成仪。为了重组产生治疗剂，可以将含有编码治疗剂的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞、真核细胞如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞、或原核细胞如大肠杆菌。编码目标治疗剂的多核苷酸可以通过常规操作制备，例如连接多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得治疗剂。

一些实施方案涉及包含CAR细胞群的药物组合物。一些实施方案涉及在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物。

一些实施方案涉及包含一种或多种CAR的修饰细胞，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂，所述治疗剂是IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23中的至少一种或包含IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23中的至少一种。在一些实施方案中，将细胞工程化以表达治疗剂，所述治疗剂与修饰细胞的膜结合。

在一些实施方案中，该方法可以进一步包括监测受试者的组织或血液中治疗剂的浓度；如果受试者的浓度和/或其他参数不在期望的条件下，则施用治疗剂或治疗剂的受体拮抗剂(例如，抗体)。例如，参数可以包括体温水平，CRS水平和神经毒性水平等。

在一些实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌可以通过诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统，其增加或激活治疗剂或其组合的表达。例如，四环素控制的转录激活是诱导型基因表达的方法，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素)的存在下可逆地打开或关闭转录。在一些实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌可以通过诱导型表达系统调节，和/或修饰的细胞包含编码诱导型自杀系统的核酸序列。例如，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型caspase-9系统。

在一些实施方案中，T细胞包含结合实体瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在一些实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR，B细胞抗原是CD19、CD20、MEGE A4、CD22或BCMA。

在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。

在一些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。

在一些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、二唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体-α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。

在一些实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含显性失活的PD-1突变体，使得细胞的PD-1/PD1-1信号传导途径受到干扰。

目前治疗癌症最有效的方法是CAR-T疗法，但CAR-T在实体肿瘤治疗中存在几个问题:1.如何迁移到肿瘤细胞中；2.需要DC细胞提供一些特殊的因子(如IL12)；3.自身产生新抗原的能力。如何充分激活DC细胞，在做CAR-DC或CAR-T分子之前，这两种细胞的激活是非常不同的(T细胞主要依赖TCR)，DC细胞的主要信号来源于TOLL样受体。外周血中DC细胞的比例低于T细胞，难以纯化培养。本发明允许DC特异性识别肿瘤，增强DC细胞功能，通过DC细胞招募其他修饰和未修饰的免疫细胞，释放各种细胞因子(IL12等)，增强并促进免疫系统功能和其他免疫细胞，从而增强免疫治疗的效果。本发明基于一种Toll-Like Receptor(TLR)设计，能够充分激活DC细胞并促进DC细胞识别肿瘤。同时，我们也可以在DC细胞中表达适合的CAR结构，从而激活DC细胞，促进DC细胞的功能。也可以结合CAR-DC、CAR-T和其他细胞疗法。信号域包括10个不同的TLR：TLR1-10(使用TLR9或Myd88进行实验)。Myd88:髓系分化因子与TLR分子的细胞内区域具有相同的TIR结构域，是TLR中的关键连接分子，在下游信息的传递中起关键作用。TRIF可以产生IFN-[beta]和一个含有TIR结构域的接头蛋白。

在某些实施例中，跨膜域包括下表中列出的至少一种分子(例如CD8 CD40)的跨膜域。

CD8b	ITLGLLVAGVLVLLVSLGVAI
		CD8a	IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
CD40	ALVVIPIIFGILFAILLVLVFI
		CD4	MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF
CD5	AGLAAGTVASIILALVLLVVLLVVCGPLAY
		CD3zeta	LCYLLDGILFIYGVILTALFL
CD22	VAVGLGSCLAILILAICGL
		CD28	FWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT
CD33	GAIGGAGVTALLALCLCLIFFIV
		CD64	VLFYLAVGIMFLVNTVLWVTI
CD80	LLPSWAITLISVNGIFVICCL
		CD86	WITAVLPTVIICVMVFCLILW
CD134	VAAILGLGLVLGLLGPLAILL
		CD137	IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV
CD154	IFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYL

在某些实施例中，细胞内信号域包括CD40和RAGE中的至少一个。

在一些实施方案中，细胞内信号转导域包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、MYD88、TRIF、TRAM和TIRAP中的至少一个信号转导域。在某些实施方案中，细胞内信号域包括TLR9和MYD88中至少一个的信号域。细胞内信号域包括下表中所列的至少一种分子的信号域。

示例性实施方式

以下是示例性实施例：

1.一种有效用于在患者中扩增和/或维持修饰细胞的修饰细胞，其包含编码抗原结合分子的核酸序列，所述核酸序列包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述跨膜结构域包含CD8或CD40的跨膜结构域。

2.实施方案1的修饰的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，TLR11，MYD88，TRIF，TRAM和TIRAP。

3.实施方案1-2中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含TLR9和MYD88中至少一个的信号传导域，和/或包含CD40和RAGE中的至少一个的信号传导域。

4.实施方案1的修饰的细胞，其中所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)。

5.在实施方案中，修饰的免疫细胞包括修饰的T细胞或DC细胞。

6.实施方案1的修饰的细胞，其中抗原结合结构域结合WBC细胞抗原。

7.实施方案6的修饰的细胞，其中WBC细胞抗原包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13中的任意一种或组合。

8.实施方案1中的细胞，其中抗原结合结构域结合实体瘤抗原。

9.实施方案8中的细胞，其中所述实体肿瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、ILA13、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3、EGFR中所列的任意一种。

9.实施方案8的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域与肿瘤抗原结合，肿瘤抗原选自：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、蛋白酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、脯氨酸、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/Galectin 8、Mela nA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠内羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。

10.实施方案8和9中任一项的修饰的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，或主要信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导结构域包括蛋白质的功能性信号传导结构域，其中蛋白质包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、一种与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM，Ly9(CD229、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLA MF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、和NKG2D中的任意一种或组合。

11.前述合适实施方案中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，所述抗原结合分子是修饰的TCR。

12.实施方案11的修饰细胞，其中所述TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。

13.实施方案12的修饰细胞，其中所述TCR结合肿瘤抗原。

14.实施方案13的修饰细胞，其中所述肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。

15.实施方案14的修饰细胞，其中所述TCR包含TCRγ和TCRδ链，或TCRα和TCRβ链，或其组合，和/或前述任何合适实施方案的方法，其中所述细胞是免疫细胞(例如，免疫效应细胞群)，例如，免疫细胞是T细胞或NK细胞。

16.前述合适实施方案中任一项的修饰的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。

17.实施方案16的修饰细胞，其中所述免疫效应细胞是DC细胞。

18.实施方案16的修饰细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。

19.实施方案18的修饰细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞或其组合。

20.前述合适实施方案中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。

21.一种多核苷酸的方法或用途，所述方法包括

提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或其变体)，该载体基因组包含编码一个以上分子的多核苷酸和编码抗原结合分子的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至赋予转录的表达控制元件多核苷酸；和

向受试者施用一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达，其中一个或多个分子与修饰细胞的代谢相关。

22.实施方案21的方法，其中所述AAV制备物可以包含AAV载体颗粒，空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产物。

23.一种药物组合物，其包含实施方案1-3中任一项的细胞。

24.一种在需要其的受试者中引起或引发T细胞应答和/或治疗该受试者的肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的实施方案23的组合物或分离的编码与修饰细胞的代谢相关的一种或多种分子。

例子

产生了编码单个CAR分子的慢病毒载体，并用T细胞转染，下面将对其进行详细说明。与细胞培养有关的技术，细胞毒性T淋巴细胞论文的构建可在“用遗传重定目标的含有CD28和CD137结构域的人类T细胞控制大型的已建立的肿瘤异种移植物”中找到，PNAS，2009年3月3日，第一卷，106(9)号，3360–3365和“包含CD137信号转导结构域的嵌合受体介导T细胞存活增强和体内抗白血病功效提高”，《分子疗法》，2009年8月，第1卷，17(8)号，1453-1464，通过引用将其全部内容合并在此。

在第0天，从健康志愿者中提取外周血。通过pan T Kit筛选CD3+T细胞，并每1×10⁷T细胞添加100ul TransAct。在第1天，将1×10⁶T细胞用载体1234转染。将1×10⁶T细胞用载体7408转染，而4×10⁶T细胞是未转导的T细胞(NT)。去除慢病毒和TransAct，并将细胞重悬于新鲜培养基中。在第7天，进行流式检测CAR比例和细胞表型。如图4所示，hCAR在载体1234中的表达率为71.51％。hCAR在载体7408中的表达率为61.56％。根据表2和表3进行实验。序列可在下表1中找到。

表1

表2

名称	构造结构
		1234	CAR-h19-bbz
7408	CAR-h19-bbz-MYD88CD40

表3

序列表

<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司

<120> 偶联嵌合抗原受体细胞及其用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 6

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaaaggtgg ccaagaagcc aaccaataag gccccccacc ccaagcagga accccaggag 60

atcaattttc ccgacgatct tcctggctcc aacactgctg ctccagtgca ggagacttta 120

catggatgcc aaccggtcac ccaggaggat ggcaaagaga gtcgcatctc agtgcaggag 180

agacag 186

<210> 7

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Lys Asn Tyr Lys Ala Ile Gly Lys Ile Gly Glu Gly Thr Phe Ser

1 5 10 15

Glu Val Met Lys Met Gln Ser Leu Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Cys

20 25 30

Lys Gln Met Lys Gln Arg Phe Glu Ser Ile Glu Gln Val Asn Asn Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Gln Ala Leu Arg Arg Leu Asn Pro His Pro Asn Ile Leu

50 55 60

Met Leu His Glu Val Val Phe Asp Arg Lys Ser Gly Ser Leu Ala Leu

65 70 75 80

Ile Cys Glu Leu Met Asp Met Asn Ile Tyr Glu Leu Ile Arg Gly Arg

85 90 95

Arg Tyr Pro Leu Ser Glu Lys Lys Ile Met His Tyr Met Tyr Gln Leu

100 105 110

Cys Lys Ser Leu Asp His Ile His Arg Asn Gly Ile Phe His Arg Asp

115 120 125

Val Lys Pro Glu Asn Ile Leu Ile Lys Gln Asp Val Leu Lys Leu Gly

130 135 140

Asp Phe Gly Ser Cys Arg Ser Val Tyr Ser Lys Gln Pro Tyr Thr Glu

145 150 155 160

Tyr Ile Ser Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Cys Leu Leu Thr Asp

165 170 175

Gly Phe Tyr Thr Tyr Lys Met Asp Leu Trp Ser Ala Gly Cys Val Phe

180 185 190

Tyr Glu Ile Ala Ser Leu Gln Pro Leu Phe Pro Gly Val Asn Glu Leu

195 200 205

Asp Gln Ile Ser Lys Ile His Asp Val Ile Gly Thr Pro Ala Gln Lys

210 215 220

Ile Leu Thr Lys Phe Lys Gln Ser Arg Ala Met Asn Phe Asp Phe Pro

225 230 235 240

Phe Lys Lys Gly Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Thr Asn Leu Ser Pro

245 250 255

Gln Cys Leu Ser Leu Leu His Ala Met Val Ala Tyr Asp Pro Asp Glu

260 265 270

Arg Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Gln His Pro Tyr Phe Gln Glu Gln

275 280 285

Arg Lys Thr Glu Lys Arg Ala Leu Gly Ser His Arg Lys Ala Gly Phe

290 295 300

Pro Glu His Pro Val Ala Pro Glu Pro Leu Ser Asn Ser Cys Gln Ile

305 310 315 320

Ser Lys Glu Gly Arg Lys Gln Lys Gln Ser Leu Lys Gln Glu Glu Asp

325 330 335

Arg Pro Lys Arg Arg Gly Pro Ala Tyr Val Met Glu Leu Pro Lys Leu

340 345 350

Lys Leu Ser Gly Val Val Arg Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Pro Thr Leu

355 360 365

Gln Ser Val Leu Gly Ser Gly Thr Asn Gly Arg Val Pro Val Leu Arg

370 375 380

Pro Leu Lys Cys Ile Pro Ala Ser Lys Lys Thr Asp Pro Gln Lys Asp

385 390 395 400

Leu Lys Pro Ala Pro Gln Gln Cys Arg Leu Pro Thr Ile Val Arg Lys

405 410 415

Gly Gly Arg

<210> 8

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser

1 5 10 15

Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr

35 40 45

Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu

50 55 60

Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly

65 70 75 80

Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu

85 90 95

Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp

100 105 110

Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro

115 120 125

Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu

130 135 140

Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg

145 150 155 160

Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile

165 170

Claims (10)

1.一种修饰的细胞，其特征在于：其包含编码抗原结合分子的核酸序列，所述核酸序列包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述跨膜结构域包含CD8或CD40的跨膜结构域。

2.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其特征在于：其中所述细胞内信号传导结构域包含TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，TLR11，MYD88，TRIF，TRAM和TIRAP中的任意一种。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的修饰的细胞，其特征在于：其中所述细胞内信号传导结构域包含TLR9和MYD88中至少一个的信号传导域，和/或包含CD40和RAGE中的至少一个的信号传导域。

4.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其特征在于：其中所述抗原结合分子可以是嵌合抗原受体(CAR)。

5.根据权利要求4所述的修饰的细胞，其特征在于：其中所述细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或包含初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括：CD27，CD28、4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，CD83配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2R beta，IL2Rgamma，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELLPG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46和NKG2D中的任意一种或组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的修饰的细胞，其特征在于：其中与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域选自：TSHR，CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA，Tn Ag，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT，IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-beta，SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，蛋白酶，PAP，ELF2M，Ephrin B2，IGF-1受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，邻乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248，TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，聚唾液酸，PLAC1，GloboH，NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，legumain，HPV E6，E7，MAGE A1，ETV6-AML，精子蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，脯氨酸，存活蛋白和端粒酶，PCTA-1/Galectin 8，MelanA/MART1，Ras突变体，hTERT，肉瘤易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK，AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠羧基酯酶，mut hsp70-2，CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2，LY75，GPC3，FCRL5和IGLL1中的任意一种或组合。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的细胞，其特征在于：其中所述抗原结合分子包含CD3ζ结构域。

8.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其特征在于：其中所述抗原结合分子可以是修饰的TCR，TCR结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原包含CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3或NY-ESO-1中的任意一种或组合。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的修饰的细胞，其特征在于：其是DC细胞和/或T细胞。

10.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-9任一项所述的修饰的细胞。

Images