CN118477171A - 脂质纳米颗粒 (lnp) 及其在细胞治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含与结合T细胞的细胞表面抗原的试剂缀合的脂质颗粒的组合物，所述脂质颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合血液抗原的第一结合分子的第一多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的第二结合分子的第二多核苷酸，和/或编码一种或多种药剂的第三多核苷酸。

Description

脂质纳米颗粒(LNP)及其在细胞治疗中的用途

序列表信息

与本申请相关的序列表以XML和PDF格式提供，并特此通过引用并入说明书中。

技术领域

本公开涉及用于扩增和维持修饰细胞(包括基因修饰细胞)的组合物和方法，及其在治疗疾病(包括癌症)中的用途。

背景技术

最近的科学研究表明，mRNA可用于制造CAR T细胞，脂质纳米颗粒(LNP)可改善编码工程化CAR分子的mRNA的递送。此外，LNP mRNA和CAR T技术的组合已被提议用于治疗实体瘤。这些新技术有可能提高CAR T细胞治疗癌症的疗效和安全性。

概要

本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

本公开涉及用于在体内和/或体外增强T细胞反应和/或CAR细胞扩增和/或维持的组合物和方法。例如，增强受试者中T细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：向患有与抗原相关或表达抗原的癌症形式的受试者施用有效量的包含修饰细胞的组合物，例如作为实体瘤抗原；施用一种或多种编码抗原或其变体的核酸，或施用有效量的包含额外修饰细胞的组合物，所述额外修饰细胞包含编码抗原或其变体的一种或多种核酸。

本公开描述了一种增强淋巴细胞扩增和/或克服肿瘤异质性的方法，该方法包括：获得包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸的多核苷酸的脂质颗粒；使抗原呈递细胞(APC)群体和淋巴细胞群体与脂质颗粒接触，所述淋巴细胞群体包含第一淋巴细胞群体，所述第一群体包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含SEQ ID NO:5的氨基酸或6和第二个淋巴细胞群包含T细胞受体(TCR)，第二个淋巴细胞群不包含CAR；并允许扩增第二个淋巴细胞群。在实施例中，第一淋巴细胞群还包含编码IL-12的多核苷酸，并且淋巴细胞群的扩增水平大于包含编码CAR的多核苷酸而不包含编码IL-12的多核苷酸的淋巴细胞群的扩增水平。这里，肿瘤异质性是指肿瘤细胞之间的分子变异。这些细胞的实例包括表达不同或不同水平的肿瘤抗原或表位的混合肿瘤细胞，表达不同或不同水平的检查点抑制剂的混合肿瘤细胞，以及包含肿瘤细胞和与肿瘤细胞相关的淋巴细胞(M2巨噬细胞)的混合细胞和/或促进例如肿瘤血管生成、转移和免疫抑制。在实施方案中，将抗原递送至DC不仅增强了结合抗原的相应CAR T细胞的扩增，而且增强了不包含CAR的T细胞(旁观者T细胞)的扩增，这是一个令人惊讶的发现。这些旁观者T细胞的T细胞反应可能有助于CAR T细胞克服肿瘤异质性。

本公开描述了包含与结合T细胞的细胞表面抗原的试剂缀合的脂质颗粒的组合物，所述脂质颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合血液抗原的第一结合分子的第一多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的第二结合分子的第二多核苷酸和/或编码一种或多种药剂的第三种多核苷酸。

传统的CAR T细胞疗法已成为治疗癌症，尤其是实体瘤的一种很有前途的方法。然而，在治疗癌症，尤其是实体瘤时，需要考虑这种方法的某些局限性。CAR T细胞疗法旨在通过重新编程T细胞攻击肿瘤抗原来消除癌细胞。这种方法基于完全或部分消除癌细胞的原则，这可能比治疗其他疾病要困难得多。称为的新一代CAR T技术在克服传统CAR T疗法的某些局限性方面显示出治疗实体瘤的希望。这种新一代CAR T技术已显示CAR T细胞在体外和体内的抗原非依赖性扩增。如示例中所示，技术的一个独特方面是它根据它们表达的载体提供了几种不同类型的细胞。在实施例中，产品可以包括16种不同类型的细胞。实施例表明，在对产品有反应的患者中，一种特定类型的细胞在患者血液中显着富集，这意味着这种特定类型细胞在将产品注入患者体内时患者血液中的百分比明显高于未注入产品情况下患者血液中的百分比。这表明这种特定类型的细胞可以在产品的有效性中发挥关键作用。另一方面，在对产品没有任何反应的患者中，这种特定类型的细胞在患者血液中没有富集或没有显着富集，这表明这种特定类型的细胞缺乏富集可能与此有关产品缺乏反应。

一种特定类型的细胞在对CoupledCAR产品有反应的患者的血液中显着富集的发现是实体瘤CAR T细胞疗法领域的一个令人惊讶和重要的发现。这种现象凸显了实体瘤治疗过程中的复杂动力学，以及了解单个细胞在CAR T产品中的作用的重要性。此外，这一现象挑战了对CAR T细胞疗法有效性的传统理解，对患者的选择具有重要意义，并凸显了需要新的策略来增强产品的有效性。

实施方案涉及增强CAR T疗法、治疗患有癌症形式的受试者、引起、诱导或引发受试者中的T细胞反应和/或增强其治疗的方法，该方法包括：给予药物组合物，该药物组合物包含包含多核苷酸的T细胞群，所述多核苷酸包括编码结合CD19或BCMA的CAR的多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的CAR的多核苷酸和编码IL-12的多核苷酸。

实施方案涉及增强CAR T疗法、治疗患有癌症形式的受试者、引起、诱导或引发受试者中的T细胞反应和/或增强其治疗的方法，该方法包括：施用药物组合物包含多核苷酸的T细胞群，所述多核苷酸包含编码结合血液抗原的第一结合分子的第一多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的第二结合分子的第二多核苷酸和/或编码药剂的第三多核苷酸。在实施方案中，第一、第二和第三多核苷酸在一个多核苷酸或多个多核苷酸中。

在实施方案中，血液抗原是白细胞(WBC)的细胞表面分子。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在实施例中，WBC是B细胞。在实施方案中，细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。在一些实施方案中，细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，细胞表面分子是CD19或BCMA。

在实施方案中，实体瘤抗原是肿瘤相关MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

在实施方案中，药剂是细胞因子。在实施方案中，药剂是IFNγ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23或其组合。在实施方案中，药剂是IL-12。

在实施方案中，第三多核苷酸包含启动子，所述启动子包含用于调节IL-12的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。

在实施例中，转录调节剂包含HIF-1α、NFAT、FOXP3或NFkB。

在实施例中，结合分子是嵌合抗原受体(CAR)或TCR。在实施例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3zeta结构域。

在实施例中，共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或结合CD83的配体。

在实施方案中，与施用不包含所有三种多核苷酸的T细胞群的受试者相比，受试者中的T细胞反应和/或癌症治疗得到增强。

在实施方案中，该方法进一步包括使T细胞群与一个或多个包含第一、第二和第三多核苷酸的载体接触。在实施例中，第一、第二和第三多核苷酸在同一载体上。

在实施方案中，包含第一、第二和第三多核苷酸的载体为脂质纳米颗粒(LNP)。

在实施方案中，涉及一种组合物，其包含与结合CD2、CD3、CD5、CD7或CD28的抗体缀合的脂质颗粒，所述脂质颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合CD19或BCMA的CAR的多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的CAR的多核苷酸，和编码IL-12的多核苷酸。

在实施方案中，脂质颗粒是脂质体、脂质纳米颗粒或胶束。

在实施方案中，脂质颗粒是脂质纳米颗粒。

在实施方案中，脂质纳米颗粒包含缀合至所述靶向结构域的PEG-脂质。

在实施方案中，实体瘤抗原是肿瘤相关MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8,CFC1,SLC12A3,SSTR1,GPR27,FZD10,TSHR,SIGLEC15,SLC6A3,KISS1R,CLDN18.2,QRFPR,GPR119,CLDN6,UPK2,ADAM12,SLC45A3,ACPP,MUC21,MUC16,MS4A12,ALPP,CEA,EphA2,FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

在实施方案中，编码IL-12的多核苷酸包含启动子，启动子包含用于调节IL-12的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。

在实施方案中，所述转录调节剂包含HIF-1α、NFAT、FOXP3或NFkB。

在实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3zeta结构域。

在实施方案中，共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的细胞内结构域、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或结合CD83的配体。

在实施方案中，涉及组合物在制备药物中的用途。在实施方案中，药物为治疗实体瘤的药物。

具体实施方式参照附图进行描述。在不同的图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。

附图说明

图1是用于治疗癌症的疫苗和细胞疗法的示例性组合的示意图。

图2是用于治疗癌症的疫苗和细胞疗法的示例性组合的示意图。

图3是用于治疗癌症的疫苗和细胞疗法的示例性组合的示意图。

图4是用于治疗癌症的疫苗和细胞疗法的示例性组合的示意图。

图5是用于治疗癌症的疫苗和细胞疗法的示例性组合的示意图。

图6是用于治疗癌症的疫苗和细胞疗法的示例性组合的示意图。

图7显示各种成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合分子(FAPBM)。

图8显示实施针对实体瘤的纳米颗粒以治疗癌症患者的实施例。

图9显示实施针对实体瘤的纳米颗粒以治疗癌症患者的实施例。

图10显示实施针对实体瘤的纳米颗粒以治疗癌症患者的实施例。

图11显示了制备含有多核苷酸的LNP和使用LNP转染DC的示意图。

图12A和12B显示了GCC-LNP和GFP-LNP的平均粒径。

图13显示了GCC-LNP和GFP-LNP的封装效率和封装的RNA浓度。

图14A、14B和14C显示流式细胞术分析的结果，证实获得了CAR T细胞和DC。

图15显示流式细胞术分析的结果，证实分化的DC细胞被GFP-LNP或GCC-LNP转染。

图16A、16B、16C和16D显示用GCC-LNP转染的DC增强了GCC CAR T细胞和未转导的T细胞的扩增。

图17A、17B和17C显示混合的CD19 CAR T和GCC CAR T细胞在与用GCC-LNP转染的DC混合后的扩增。

图18A、18B和18C显示了混合CAR19 CAR T和GCC CAR T细胞在与用GCC-LNP转染的DC混合后的激活。

图19显示了对患者01进行CAR T疗法的总结。

图20A、20B和20C显示在患者01中输注CAR T细胞后，特定类型的T细胞单独被富集。

图21显示了对患者02进行CAR T疗法的总结。

图22A、22B和22显示在患者02中输注CAR T细胞后，特定类型的T细胞单独富集。

图23显示了患者02在CAR T治疗前后的PET-CT扫描图像对比。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

所谓“约”是指数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度变化多达20,15,10,9,8,7,6，4,3,2或1％至参考数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度。

如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广义使用，是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。或功能。本公开内容中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体；多克隆抗体；和/或多克隆抗体。单克隆抗体；Fv，Fab，Fab'和F(ab')2片段；以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999，在：《使用抗体：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow等，1989，在：《抗体：实验室手册》，冷纽约州斯普林港；休斯顿等人，1988，美国国家科学院院刊85：5879-5883；伯德等人，1988，科学242：423-426。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如，抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双体线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成，呈紧密的非共价结合。这两个结构域的折叠产生六个高变环(重链和轻链各有3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包括抗原特异的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点(二聚体).

如本文所用，“抗体重链”是指以天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用，“抗体轻链”是指以天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括已经通过编码抗体的DNA分子的合成和DNA分子的表达以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。使用本领域可用的和公知的技术获得合成DNA。

术语“抗原”是指激发免疫反应的分子，这可能涉及抗体产生、特定免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质、肽或源自重组或基因组DNA的分子。例如，DNA包括编码引发免疫反应的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此，编码本文所用术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体的生物样品中产生、合成或衍生。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移灶数量减少、肿瘤细胞增殖减少、减少在肿瘤细胞存活方面，具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来体现。

术语“自身抗原”是指被免疫系统错误识别为外源的内源性抗原。自身抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述来自同一受试者的材料，稍后将其重新引入受试者。

术语“同种异体”用于描述源自同种不同受试者的移植物。例如，供体受试者可能与受体受试者相关或无关，但供体受试对象具有与受体受受试者相似的免疫系统标记。

术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾癌，肝癌，脑癌，淋巴瘤，白血病，肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”，“包括”和“包括”将被理解为暗示包括陈述的步骤或元件或步骤或元件的组，但不排除其他任何元件。步骤或元素或一组步骤或元素。

短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何事物。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素可以存在。

短语“基本上由……组成”意在包括在该短语之后列出的任何元素，并且可以包括不干扰或有助于在公开中为列出的元素指定的活动或行动的其他元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但那些其他要素是可选的，可能存在也可能不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活动或行动。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配，或者可能是“完整的”“或”核酸之间的“总”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显着影响。

术语“对应于”或“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸在肽或蛋白质中；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供一种信号，除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外，还介导T细胞反应，包括增殖、激活、分化和其他反应中的至少一种细胞反应。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体,以及与B7-H3显式结合的配体。共刺激配体还尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子，BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指与主要信号(如TCR/CD3连接)结合，导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。

术语“共刺激信号区域”、“共刺激结构域”和“共刺激结构域”可互换使用，指除刺激或信号结构域(例如CD3 zeta)之外的一个或多个附加刺激结构域。术语“刺激”或“信号”结构域(或区域)也可以互换使用，例如，当提到CD3 zeta时，主要信号结构域。在实施例中，共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域可以在相同分子或相同细胞中的不同分子上。

“疾病”和“病症”这两个词可以互换使用，也可以有所不同，因为特定的疾病或病症可能没有已知的病原体(因此病因尚未确定)，因此尚未得到认可作为一种疾病，但仅作为一种不良状况或综合症，临床医生已经确定了一组或多或少特定的症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持稳态并且其中如果疾病没有改善，则受试者的健康继续恶化。相反，受试者的“病症”是动物可以维持稳态但动物的健康状态不如没有病症时的健康状态的健康状态。如果不加以治疗，疾病不一定会导致动物健康状况进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，以用作模板，用于在生物学过程中合成具有特定结构的其他聚合物和大分子。核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同的编码链(除了用“U”代替“T”以外)通常都在序列表中提供，非编码链均用作模板用于基因或cDNA转录的“蛋白质”可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源”是指在野生型细胞或生物体中不天然存在但通常通过分子生物学技术引入细胞的分子。外源多核苷酸的实例包括载体、质粒和/或编码所需蛋白质的人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。此外，从第一种生物体分离并通过分子生物学技术转移到第二种生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二种生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在特定的实施方案中，多核苷酸序列可以通过分子生物学技术“引入”到已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生一个或多个额外的拷贝，否则自然发生的多核苷酸序列，从而促进过度表达编码的多肽。

术语“表达或过表达”是指特定核苷酸序列转录和/或翻译成前体或成熟蛋白质，例如，由其启动子驱动。“过表达”是指转基因生物体或细胞中基因产物的产量超过正常或非转化生物体或细胞的产量水平。如本文所定义，“表达”是指表达或过表达。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制(调控)序列。表达载体包括足够的顺式作用元件用于表达。其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如粘粒，质粒(例如裸露或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)。

病毒可以在体外和体内(受试者体内)将核酸递送到细胞中。可用于将核酸递送到细胞中的病毒的实例包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和腺相关病毒。

还存在用于将核酸递送到细胞中的非病毒方法，例如电穿孔，基因枪，声穿孔，磁转染，以及使用寡核苷酸，脂复合物，树状聚合物和无机纳米颗粒。

术语“同源”是指当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个中的每一个中的一个位置DNA分子被腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配或同源，则这两个序列具有60％的同源性。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当对齐两个序列以给出最大同源性时进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类具有抗体功能的蛋白质。属于此类蛋白质的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的主要抗体，例如唾液、泪液、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者初次免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，在抵御细菌和病毒方面很重要。IgD是一种免疫球蛋白，没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体。最后，IgE是一种免疫球蛋白，它通过在暴露于过敏原时引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应。

术语“分离的”是指基本上或基本不含通常在其天然状态下伴随它的成分的材料。该材料可以是细胞或大分子，例如蛋白质或核酸。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已从其侧翼的天然存在状态的序列中纯化的多核苷酸，例如，已从正常存在的序列中去除的DNA片段。与片段相邻。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境中与细胞的其他组分结合而体外分离和/或纯化。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与之相关的成分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指已经从其他细胞类型中分离出来的细胞，其他细胞类型在其天然存在或天然状态下通常与之相关。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在其他情况下，该术语仅指已与在其自然状态下与它们自然相关的细胞分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有相互为简并形式且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的核苷酸序列短语也可以包括内含子，其程度是编码蛋白质的核苷酸序列可以包含某种形式的内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。在感染非分裂细胞方面，慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的；它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体最有效的方法之一。此外，慢病毒能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而产生稳定转导的遗传信息。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显着水平基因转移的方法。

术语“调节”是指与没有治疗或化合物的情况下受试者的应答水平相比和/或与应答水平相比，在受试者中应答水平可检测地增加或减少。在其他相同但未经治疗的受试者中该术语包括干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者，优选人中介导有益的治疗反应。

当与另一个核酸序列建立功能关系时，核酸是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA 被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接到多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至编码序列，或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其可操作地连接至编码序列。

术语“在转录控制下”是指与多核苷酸可操作地连接并且在与多核苷酸相关的正确位置和方向上的启动子，以控制(调节)RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

术语“过表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意在表示来自患者特定组织或器官内的诸如实体瘤的疾病区域的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。达到该组织或器官在正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有以肿瘤抗原的过表达为特征的实体瘤或血液系统恶性肿瘤的患者。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤，癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如脑胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)，胶质母细胞瘤(又称多形性胶质母细胞瘤)，星形细胞瘤，中枢神经系统淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤opharyogioma，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，menangioma，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。表1中提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。

表1

组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)，静脉内(iv)，肌内(im)，胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且指任何动物，例如哺乳动物，例如人类或服从本文描述的方法的任何活生物体。在实施例中，患者、受试者或个体是人或哺乳动物。在实施例中，术语“受试者”旨在包括可在其中引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的例子包括人和动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠，以及它们的转基因物种。

需要治疗或需要治疗的受试者包括患有需要治疗的疾病、病症或病症的受试者。有此需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病症或病症的受试者。因此，受试者也可能需要预防疾病状况或病症。在实施例中，疾病是癌症。

“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、删除或取代至少一个核苷酸而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加、删除或被不同核苷酸替换的多核苷酸。在这方面，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性或具有增加的活性与参考多核苷酸的关系(即优化)。多核苷酸变体包括，例如，与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％和其间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸此处描述。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基及其变体和合成类似物的聚合物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可包括酶促多肽或“酶”，其通常催化(即，增加速率)各种化学反应。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开来的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个可以是保守的或非保守的取代来区别于参考多肽。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代。在这方面，本领域众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似特性的其他氨基酸而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括这样的多肽，其中一个或多个氨基酸已被添加、删除或替换为不同的氨基酸残基。

术语“启动子”是指被细胞的合成机器识别的或引入的启动多核苷酸序列的特异性转录所需的合成机器的DNA序列。术语“表达控制(调节)序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。此外，真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合”、“结合”或“相互作用”是指一种分子识别并粘附于样品或生物体中的第二分子，但基本上不识别或粘附于样品中其他结构上不相关的分子。如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性不会改变抗体的特异性分类。在另一个例子中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应不会改变抗体的特异性分类。在某些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于抗体、蛋白质或肽与第二种化学物质的相互作用，表示相互作用取决于特定物质的存在化学物种的结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量.

“具有统计显着性”是指结果不太可能是偶然发生的。统计显着性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显着性度量包括p值，它是原假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显着性水平，则拒绝零假设。在简单情况下，显着性水平定义为p值等于或小于0.05。“减少的”或“减少的”或“较少的”量通常是“统计上显着的”或生理上显着的量。它可能包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15的减少,20,30,40,or 50 or more times(eg,100,500,1000times)(包括1之间和大于1的所有整数和小数点，eg,1.5,1.6,1.7.1.8,etc.)一个量或此处描述的级别。

术语“刺激”是指通过将刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级反应，从而介导信号转导事件，例如通过TCR/CD3复合物的信号转导。此外，刺激可以介导某些分子表达的改变，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。

术语“刺激分子”是指T细胞上的分子，其特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体。例如，衍生自刺激分子的功能信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的zeta链。刺激分子包括负责信号转导的结构域。

术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC，树突状细胞，B细胞等)上时可以与同源结合伴侣(称为“配体”)特异性结合的配体。在本文中称为“刺激性分子”)在细胞例如T细胞上，从而介导T细胞的初级应答，包括激活，免疫应答的起始，增殖和类似过程。刺激性配体在本领域中是众所周知的，并且尤其包括装载有肽，抗CD3抗体，超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制，减轻或消除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指将引起研究者、兽医、医生或其他临床医生寻求的组织、系统或受试者的生物学或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括化合物的量，当施用时，该化合物足以防止发展或在某种程度上减轻所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状。治疗有效量将根据待治疗受试者的化合物、疾病、严重程度、年龄、体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。

术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞已被外源核酸转染、转化或转导。细胞包括原代受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。许多载体在本领域是已知的，包括线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些例子包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体已经通过多重弱化HIV毒力基因产生，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使载体在生物学上是安全的。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围和各个数值。例如，对诸如1到6的范围的描述应该被认为具有具体公开的子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

“嵌合抗原受体”(CAR)分子是重组多肽，其至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质或细胞内结构域。在实施例中，CAR的结构域在相同的多肽链上，例如，嵌合融合蛋白。然而，在实施例中，结构域位于不同的多肽链上，例如，结构域不连续。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰的细胞，例如CAR T细胞，或杀死肿瘤细胞，例如实体瘤。在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域结合WBC表面上的抗原，例如细胞表面分子或标志物。在实施方案中，WBC是GMP(粒细胞巨噬细胞前体)、MDP(单核细胞-巨噬细胞/树突细胞前体)、cMoP(普通单核细胞前体)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、SatM(含分离核的非典型单核细胞)中的至少一种)、巨噬细胞、单核细胞、CDP(常见树突状细胞前体)、cDC(常规DC)、pDC(浆细胞样DC)、CLP(常见淋巴细胞前体)、B细胞、ILC(先天性淋巴细胞)、NK细胞、巨核细胞、成髓细胞、pro-髓细胞、髓细胞、间髓细胞、带状细胞、淋巴母细胞、幼淋巴细胞、单核细胞、巨核细胞、前巨核细胞、巨核细胞、血小板或MSDC(髓源性抑制细胞)。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞和/或淋巴细胞。在实施方案中，WBC是淋巴细胞，例如B细胞。在实施例中，WBC是B细胞。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138、或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。

本文所述的细胞，包括修饰的细胞，例如CAR和T细胞，可以源自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞，更特别是非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。修饰的细胞也可以是树突细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。在实施方案中，修饰的细胞可来源于由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在本发明的细胞扩增和遗传修饰之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞来源。T细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤.在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员可用和已知的任何T细胞系。在实施例中，经修饰的细胞可源自健康供体、诊断患有癌症的患者或诊断患有感染的患者。在实施方案中，修饰的细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

细胞群体是指两个或多个细胞组成的组。种群的细胞可以是相同的，从而种群是同质的细胞种群。群体的细胞可以是不同的，以使得该群体是细胞的混合群体或异质群体。例如，混合的细胞群可以包括包含第一CAR的修饰细胞和包含第二CAR的细胞，其中第一CAR和第二CAR结合不同的抗原。

术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化成其他种类细胞的能力的某些类型的细胞。例如，一个干细胞要么产生两个子代干细胞(如体外培养的胚胎干细胞)，要么产生一个干细胞和一个经历分化的细胞(如造血干细胞，升至血细胞)。不同类别的干细胞可以根据它们的来源和/或它们分化成其他类型细胞的能力的程度来区分。例如，干细胞可包括胚胎干(ES)细胞(即多能干细胞)、成体干细胞、诱导多能干细胞和其他类型的干细胞。

多能胚胎干细胞存在于囊胚的内细胞团中，并具有先天的分化能力。例如，多能胚胎干细胞可以在体内形成任何类型的细胞。当在体外长期生长时，ES细胞保持多能性，因为子代细胞保留了多向分化的潜力。

成体干细胞可包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成体干细胞(存在于各种组织中，例如骨髓)。这些细胞被认为具有低于多能ES细胞的分化能力——胎儿干细胞的能力高于成体干细胞。成体干细胞显然仅分化为有限数量的细胞类型，并被描述为多能的。“组织特异性”干细胞通常只产生一种细胞类型。例如，胚胎干细胞可以分化成造血干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，其可以进一步分化成各种血细胞(例如，红细胞、血小板、白细胞等)。

诱导的多能干细胞(即，iPS细胞或iPSC)可以包括通过诱导特定基因的表达而人工衍生自非多能细胞(例如，成年体细胞)的一种多能干细胞。诱导的多能干细胞在许多方面类似于天然多能干细胞，例如胚胎干(ES)细胞，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达，染色质甲基化模式，倍增时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，可行的嵌合体形成以及效价和可分化性。诱导的多能细胞可以从成年的胃，肝，皮肤和血细胞中获得。

在实施方案中，CAR细胞、修饰细胞或细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞、修饰细胞或细胞是T细胞。

T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的一种白细胞。有多种类型的T细胞，包括T辅助(TH)细胞、细胞毒性T(TC)细胞(T杀伤细胞、杀伤T细胞)、自然杀伤T(NKT)细胞、记忆T(Tm)细胞、调节性T(Treg))细胞和gamma delta T(γδT)细胞。

T辅助(TH)细胞协助其他淋巴细胞，例如，激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞以及B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞。这些T辅助细胞在其表面表达CD4糖蛋白，也称为CD4+T细胞。一旦被激活，这些T细胞就会迅速分裂并分泌细胞因子。

细胞毒性T(TC)细胞会破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。它们在其表面表达CD8蛋白。细胞毒性T细胞释放细胞因子。

自然杀伤T(NKT)细胞不同于自然杀伤细胞。NKT细胞识别由CD1d呈递的糖脂抗原。一旦被激活，NKT细胞就会产生细胞因子并释放细胞杀伤分子。

记忆T(Tm)细胞寿命长，并且在再次暴露于其同源抗原后可以扩展为大量效应T细胞。Tm细胞为免疫系统提供针对先前遇到的病原体的记忆。Tm细胞有多种亚型，包括中央记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、组织驻留记忆T(TRM)细胞和虚拟记忆T细胞。Tm细胞要么是CD4+要么是CD8+，通常是CD45RO。

调节性T(Treg)细胞在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺负选择过程的自身反应性T细胞。Treg细胞亚群包括胸腺Treg和外周衍生的Treg。Treg的两个子集都需要转录因子FOXP3的表达。

Gamma delta T(γδT)细胞是T细胞的一个子集，在细胞表面具有γδT细胞受体(TCR)，因为大多数T细胞表达αβTCR链。γδT细胞在人和小鼠中不太常见，主要存在于肠道黏膜、皮肤、肺和子宫中。它们参与免疫反应的启动和传播。

在实施方案中，用于杀死肿瘤的抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，可引发免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。肿瘤抗原是本领域熟知的并且包括例如肿瘤相关MUC1(tMUC1)、神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白,RAGE-1,MN-CAIX,人端粒酶逆转录酶,RU1,RU2(AS),肠羧基酯酶,muthsp70-2,M-CSF,前列腺酶,前列腺特异性抗原(PSA),PAP,NY-ESO-1,LAGE-1a,p53,prostein,PSMA,Her2/neu,surviving,端粒酶,前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1),MAGE,ELF2M,中性粒细胞弹性蛋白酶,ephrinB2,CD22,胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、CD19和间皮素。例如，当肿瘤抗原为CD19时，其CAR可称为CD19 CAR或19CAR，即包括与CD19结合的抗原结合结构域的CAR分子。

在实施例中，CAR的细胞外抗原结合域包括至少一个scFv或至少一个单域抗体。例如，一个CAR上可以有两个scFv。scFv包括目标抗原特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，通过柔性接头连接。可通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段(Bird等人，Science 242:423-426,1988)。连接肽的一个例子是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：24)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。其他序列的接头已被设计和使用(Bird等人，1988，同上)。通常，接头可以是短的、柔性的多肽并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以通过重组或合成方式产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组生产，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞，该宿主细胞可以是真核细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，也可以是原核细胞，例如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操作例如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

本文所述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号结构域。共刺激和信号域传递信号并激活分子，例如T细胞，以响应抗原结合。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号结构域衍生自初级信号结构域，例如CD3zeta结构域。在实施方案中，信号域还包括一个或多个源自共刺激分子的功能性信号域。在实施方案中，共刺激分子是激活细胞对抗原的反应所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。

在实施例中，共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括源自T细胞受体的CD3 zeta结构域。

本文描述的CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在细胞外结构域和CAR的跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域和/或细胞质结构域的任何寡聚体或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。

本公开进一步描述了使用源自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞治疗癌症的方法或组合物。在实施方案中，可以分离表达对靶抗原具有高亲和力的TCR的T细胞克隆。例如，TIL或外周血单核细胞(PBMC)可以在抗原呈递细胞(APC)存在的情况下进行培养等位基因。可以根据MHC-肽四聚体染色和/或识别和裂解用低滴定浓度的同源肽抗原脉冲的靶细胞的能力来选择高亲和力克隆。选择克隆后，通过分子克隆鉴定和分离TCRα和TCRβ链或TCRγ和TCRδ链。例如，对于TCRα和TCRβ链，然后使用TCRα和TCRβ基因序列生成表达构建体，理想地促进人T细胞中两条TCR链的稳定、高水平表达。例如，然后可以生成转导载体(伽马逆转录病毒或慢病毒)并测试其功能(抗原特异性和功能亲和力)，并用于生产临床批次的载体。然后可以使用等分的最终产品来转导目标T细胞群(通常从患者PBMC中纯化)，在输注到患者体内之前将其扩增。

可以实施多种方法来获得编码肿瘤反应性TCR的基因。更多信息在Kershaw等人的Clin Transl Immunology中提供。2014年5月；3(5)：e16。在实施方案中，特异性TCR可源自患者体内自发产生的肿瘤特异性T细胞。此类别中的抗原包括黑素细胞分化抗原MART-1和gp100以及MAGE抗原和NY-ESO-1，在更广泛的癌症中表达。此外，还可以分离出对病毒相关恶性肿瘤具有特异性的TCR，只要病毒蛋白由转化细胞表达即可。此类别中的恶性肿瘤包括肝癌和宫颈癌、肝炎和乳头状瘤病毒，以及Epstein-Barr病毒相关的恶性肿瘤。在实施方案中，TCR的靶抗原包括CEA(例如，对于结直肠癌)、gp100、MART-1、p53(例如，对于黑色素瘤)、MAGE-A3(例如，黑色素瘤、食管和滑膜肉瘤)和NY-ESO-1(例如，黑色素瘤和肉瘤以及多发性骨髓瘤)。

在实施例中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的制备和输注可以以下方式实施。例如，可以在无菌条件下从手术或活检标本中获取肿瘤组织，并将其运送到冰盒中的细胞培养室。可以去除坏死组织和脂肪组织。可将肿瘤组织切成约1-3立方毫米的小块。可加入胶原酶、透明质酸酶、DNA酶，4℃消化过夜。用0.2um滤膜过滤，用淋巴细胞分离液在1500rpm下分离收集细胞5min。在含有PHA、2-巯基乙醇和CD3单克隆抗体的培养基中扩增细胞，可以加入小剂量的IL-2(10-20IU/ml)诱导活化和增殖。仔细测量细胞密度，并在37℃、5％ CO2的条件下将细胞密度保持在0.5-2x10⁶/ml的范围内7-14天。

TIL阳性细胞可以通过共培养筛选出同源癌细胞。可以在含有高剂量IL-2(5000-6000IU/ml)的无血清培养基中扩增TIL阳性细胞，直到可以获得大于1x1011 TIL。为了管理TIL，首先使用连续流离心将它们收集在盐水中，然后通过血小板管理装置过滤到200-300mL体积中，其中包含5％白蛋白和450000IU IL-2。TIL可在30-60分钟内通过中心静脉导管注入患者体内。在实施例中，TILs可以输注在两个到四个单独的袋子中，并且单独的输注可以间隔几个小时。

本公开进一步描述了使用递送对应于这些疗法的抗原来增强由基于CAR T/TILs/TCR的疗法引起的T细胞应答的方法。例如，GUCY2C或至少GUCY2C的细胞外结构域可以被输送到患者体内以增强GUCY2C CAR T细胞的抗肿瘤活性，增加T细胞反应。在实施例中，T细胞反应的增加基于CAR的拷贝数和/或释放的细胞因子(例如，IL-6和IFN-γ)的量。在实施例中，T细胞反应包括细胞因子释放，细胞扩增，和/或活化水平。在实施方案中，第一载体进一步包含编码IL-6或IFNγ或其组合的多核苷酸。在实施方案中，第一载体进一步包含编码IL-12的多核苷酸。在实施方案中，多核苷酸包含编码NFAT和/或VHL的多核苷酸。在实施方案中，修饰细胞群包含表达第一结合分子和IL-6或IFNγ或其组合的细胞，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子的细胞在实施方案中，修饰细胞群包含表达第二结合分子和IL-6或IFNγ或其组合的细胞，表达第二结合分子的细胞，表达第一和第二分子的细胞，和/或表达第一结合分子和IL-12的细胞。在实施方案中，修饰细胞群包含表达第二结合分子和IL-6或IFNγ或其组合的细胞、表达第二结合分子的细胞、表达第一和第二分子的细胞、和/或表达第二结合分子的细胞分子和IL-12。在实施方案中，修饰细胞群包含表达PD-1显性失活形式的细胞。抗原可以配制成疫苗的形式。疫苗的实例包括DC，包括抗原、amph-配体和纳米颗粒RNA疫苗。有关疫苗示例的更多信息，请参阅E Snook,A。“用于CAR T细胞疗法的伴随疫苗：应用基础免疫学来增强治疗效果”，Future Medicinal Chemistry，V.12，第15期，2020年，第12页。1359–62.，它被整体合并。

在实施例中，本文所述的CAR分子的胞质结构域包含共刺激结构域和CD3zeta结构域。在实施例中，本文所述的CAR分子可以包括没有相应的CD3 zeta结构域组分的共刺激结构域。在实施例中，本文所述的CAR分子可以包括没有共刺激结构域的CD3zeta结构域。

在实施例中，经修饰的细胞包含程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白的显性失活变体粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)或CD 160。在实施方案中，修饰的细胞还包含编码自杀基因的核酸序列，和/或自杀基因包含HSV-TK自杀基因系统。在实施方案中，与相应的宽型T细胞相比，分离的T细胞包含减少量的TCR。

显性失活突变具有改变的基因产物，可对抗野生型等位基因。这些突变通常导致分子功能改变(通常不活跃)，并以显性或半显性表型为特征。在实施方案中，本文所述的修饰细胞包含PD-1受体的显性失活(DN)形式。在实施方案中，DN PD-1受体在本文所述的修饰细胞中的表达受诱导基因表达系统的调节。在实施例中，诱导型基因表达系统是lac系统、四环素系统或半乳糖系统。

本公开描述了药物组合物。药物组合物包括以下的一种或多种：CAR分子、TCR分子、修饰的CAR T细胞、包含CAR或TCR的修饰细胞、修饰细胞的混合群体、核酸和本文所述的载体。将药物组合物适当地施用至待治疗(或预防)的疾病。这些因素将决定给药的数量和频率，如患者的状况和患者疾病的类型和严重程度，尽管临床试验可以确定合适的剂量。

术语“药学上可接受的”是指由美国联邦或州政府的监管机构或EMA(欧洲药品管理局)批准或列在《美国药典》(美国药典-33/国家处方-28重新发行，(美国药典公约，罗克维尔，出版日期：2010年4月)或其他公认的药典用于动物，尤其是人类。

术语“载体”是指稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或与治疗剂一起施用的载体。药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水葡萄糖和甘油也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

本公开还描述了包含本文所述的第一和第二细胞群的药物组合物。包含包含第一抗原结合分子的第一细胞群和包含第二抗原结合结构域的第二细胞群的本文描述的药物组合物适用于癌症治疗。例如，第一抗原结合分子与抗原的结合增强了适用于癌症治疗的细胞的扩增。

本公开还描述了一种使用本文所述的适用于癌症治疗的细胞增强癌症治疗的方法。该方法包括向患有表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的第一组合物，该第一组合物包含细胞群(例如，T细胞)，其包含抗原结合分子(例如，CAR)结合抗原；向受试者施用有效量的第二组合物，第二组合物包含疫苗形式的抗原(例如，DC-抗原和纳米颗粒-mRNA)。第一组合物和第二组合物可以同时或分别进行，例如顺序进行。有关适用于癌症治疗的细胞的更多信息，请参见Eyileten,C.、Majchrzak,K.、Pilch,Z.等人。“癌症治疗和药物输送中的免疫细胞”，炎症介质，V.2016，2016，第1-13页和Reinhard,K.、Rengstl,B.、Oehm,P.等。“RNA疫苗驱动密蛋白CAR-T细胞的扩增和功效以对抗实体瘤，”Science，V.367，No.6476，2020年，第446-53页，将其纳入本文以供参考。

当指出“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗有效量”时，本公开的组合物的精确施用量可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定。可以说包含本文所述修饰细胞的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量给药，包括那些范围内的所有整数值。也可以这些剂量多次施用修饰的细胞组合物。可以使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病征兆并相应地调整治疗来容易地确定用于特定患者的最佳剂量和治疗方案。在某些实施方案中，可能需要将活化的T细胞给予受试者，然后重新抽血(或进行单采术)，收集活化和扩增的T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞重新输注患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在某些实施方案中，T细胞可以在抽血中从10cc到400cc被激活。在某些实施方案中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中激活。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可以选择出某些T细胞群。

本文所述的药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(iv)注射或腹膜内施用给患者。在实施方案中，本文所述的修饰细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于受试者。在实施例中，本公开的T细胞组合物通过静脉内注射施用。修饰细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在实施例中，使用本文描述的方法或本领域已知的其他方法激活和扩增的细胞被扩增至治疗水平，与任何数量的相关的(例如，之前、同时或之后)一起施用于患者。治疗方式，例如作为联合疗法，包括但不限于用抗病毒药物西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)进行治疗；或MS患者的那他珠单抗治疗；或efalizumab治疗牛皮癣患者或其他治疗PML患者。在进一步的实施方案中，本文所述的T细胞可以与化疗、放疗、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消融剂(例如CAM PATH、抗CD3抗体)组合使用或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达里滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号转导(雷帕霉素)很重要的p70S6激酶。(Liu等人，Cell 66:807-815,1991；Henderson等人，Immun 73:316-321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5:763-773,1993；Isoniemi(同上)).在实施方案中，将本文所述的细胞组合物与(例如，之前、同时或之后)骨髓移植、使用诸如氟达拉滨的化疗剂的T细胞消融疗法、外照射放射疗法(XRT)一起施用于受试者、环磷酰胺或OKT3或CAMPATH等抗体。在实施方案中，本文所述的细胞组合物在B细胞消融疗法后施用。例如，可对患者施用与CD20反应的药剂，例如Rituxan。在实施例中，受试者可以接受标准治疗，即高剂量化疗，然后是外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。给予有需要的受试者的上述治疗的剂量将随着所治疗病症和治疗接受者的确切性质而变化。取决于各种因素，医生可以根据本领域公认的实践来调整用于人类给药的剂量。关于使用修饰细胞的癌症治疗方法的更多信息，请参阅美国专利US8,906,682，通过引用整体并入。

在实施方案中，该方法可进一步包括施用包含靶向WBC抗原(例如，CD19和BCMA)的CAR T细胞的额外组合物。

本公开涉及增强以治疗癌症患者。在实施方案中，该方法包括以免疫学有效量施用混合细胞，所述混合细胞包含含有靶向实体瘤抗原的第一结合分子的第一修饰细胞群和含有靶向WBC或血液的第二结合分子的第二修饰细胞群在药学上可接受的载体中的抗原和施用一种或多种编码在药学上可接受的载体中的实体瘤抗原或其变体的核酸，该核酸是体外转录的RNA。在实施例中，转录的RNA被封装在脂质体中。在实施方案中，该方法包括施用包含靶向药学可接受载体中的实体瘤抗原的第一结合分子的第一修饰细胞群，施用包含靶向WBC或血液抗原的第二结合分子的修饰细胞第二群。药学上可接受的载体，并且施用一种或多种编码药学上可接受的载体中的实体瘤抗原或其变体的核酸，所述核酸是体外转录的RNA。在实施例中，转录的RNA被封装在脂质体中。有关的更多信息，请参阅PCT公开号：WO2020106843和WO2020146743。

脂质颗粒包括脂质纳米颗粒(LNP)，其是包含脂质的球形囊泡。它们可用于将核酸递送至目标位点。脂质包括阳离子脂质、中性脂质和阴离子脂质。阳离子脂质的例子包括DOTMA(2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane)、DOTAP(12-dioleoyloxy-3-[trimethylammonium]-propane)、DOSPA(2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido))乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐)和DC-Chol(3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)。中性脂质的例子包括胆固醇、DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和DOPE(12-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。

一些脂质是两亲性的，例如磷脂磷脂的例子包括DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)。当在水溶液中水合时，磷脂有形成脂质体的倾向。脂质体是由一个或多个包围离散水空间的同心脂质双层组成的球形囊泡。如本文所用，LNP包括脂质体。也可以使用阳离子脂质或诸如阳离子、中性、阴离子和/或磷脂的脂质组合形成脂质体。

在实施例中，第一组合物可包含经修饰的细胞。修饰的细胞可以包含抗原结合分子，并且修饰的T细胞中一种或多种蛋白质的表达和/或功能已经增加或增强，并且一种或多种蛋白质包含细胞因子(例如，IL-6或IFNγ，或其组合)。在实施方案中，修饰的T细胞响应于修饰的T细胞的活化、缺氧或其组合而表达和分泌一种或多种蛋白质。在实施方案中，IL-6是人IL-6，IFNγ是人IFNγ。在实施方案中，修饰的T细胞包含编码一种或多种蛋白质的外源多核苷酸。在实施方案中，外源多核苷酸存在于重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中的修饰的T细胞中。在实施方案中，外源多核苷酸包含启动子，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节修饰细胞中IL-6、IFNγ或其组合的表达和/或分泌。在实施例中，转录调节剂包含HIF-1α、NFAT、FOXP3或NFkB。细胞因子的实例包括IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、IFN-y、MIP-ln、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM-CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L和铁蛋白。在实施例中，可将细胞因子直接施用于受试者。例如，增强修饰细胞抗肿瘤活性的方法，该方法包括：将有效量的修饰细胞给予患有实体瘤的对象；向受试者施用有效量的药剂，该药剂包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；其中修饰的细胞抑制对象中实体瘤的生长，并且其中对象中的抗肿瘤活性大于施用有效量的修饰细胞但未施用药剂的对象中的抗肿瘤活性。在实施例中，向受试者施用有效量的试剂包括使用长效G-CSF以每名受试者约1-60mg或10-1000μg/人的剂量向受试者施用有效量的G-CSF公斤体重。在实施方案中，向受试者施用有效量的药剂包括使用长效G-CSF以每受试者约6mg或100μg/kg体重的剂量向受试者施用有效量的G-CSF.在实施方案中，向受试者施用有效量的试剂包括在受试者已经施用有效量的G-CSF后不到1、2、3、4或5天内向受试者施用有效量的G-CSF。修饰细胞。在实施方案中，向受试者施用有效量的试剂包括在受试者已经被施用有效量的修饰细胞后少于14天内向受试者施用有效量的G-CSF。

实施方案涉及使用或使用编码抗原结合分子和/或治疗剂的多核苷酸来增强修饰细胞的扩增或增强受试者中的T细胞反应。该方法或用途包括：提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，该载体基因组包含多核苷酸，其中多核苷酸可操作地连接至赋予多核苷酸转录的表达控制元件；向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达。在实施例中，AAV制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。有关病毒颗粒给药和制备的更多信息，请参见美国专利号：9840719和Milani M、Annoni A、Moalli F等人。吞噬作用屏蔽的慢病毒载体改善了非人灵长类动物的肝脏基因治疗。科学翻译医学。2019；11(493):eaav7325。doi:10.1126/scitranslmed.aav7325，其通过引用并入本文。

在实施方案中，多核苷酸可以整合到修饰细胞的基因组中，并且修饰细胞的后代也将表达多核苷酸，从而产生稳定转染的修饰细胞。在实施例中，经修饰的细胞表达编码CAR的多核苷酸。然而，多核苷酸不整合到修饰细胞的基因组中，使得修饰细胞表达瞬时转染的多核苷酸一段有限的时间(例如，几天)，之后多核苷酸通过细胞分裂或其他因素丢失。例如，多核苷酸存在于修饰细胞中的重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中，和/或多核苷酸是未整合到修饰细胞基因组中的mRNA。

本公开内容描述了增强疫苗和CAR T疗法的组合。虽然联合疗法显示出体外扩展，但疫苗已设计为靶向APC(例如，DC)。疫苗的例子包括针对pMHC定向CAR-T细胞的肽-DC疫苗接种、体内向APC递送替代抗原以及体内向APC递送天然抗原。已知DC上的免疫检查点分子(例如，PD-1)在限制T细胞反应中起着关键作用。例如，虽然DC是将肿瘤抗原交叉呈递给T细胞的主要抗原呈递细胞，但随后的PD-L1上调可保护它们免受细胞毒性T淋巴细胞的杀伤，从而抑制抗肿瘤反应。此外，在已建立的肿瘤中阻断PD-L1可促进肿瘤浸润性T细胞的重新激活以控制肿瘤。

在实施方案中，刺激对表达抗原的肿瘤细胞的免疫反应的方法包括向受试者施用靶向抗原的CAR T细胞；施用一种或多种编码抗原或其变体的核酸，其中所述核酸是体外转录的RNA，其被包封在脂质体中、药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲液、防腐剂或赋形剂中，其中CAR T细胞包含改良的免疫检查点分子(例如PD-1)。免疫检查点分子是指与T细胞相关并调节T细胞反应的分子。在实施方案中，免疫检查点分子选自PD-1、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)，以及CD160。

在实施例中，修饰的PD-1是PD-1的显性阴性形式。在实施例中，修饰的PD-1包含PD-1的胞外结构域和PD-1多肽的胞质结构域被截短，或者修饰的细胞具有部分或完全缺失的PD-1基因和减少量的PD-1多肽。PD-1与相应的野生型细胞或无功能的PD-1基因相比。在实施方案中，修饰的PD-1包含酪氨酸残基223的突变和/或酪氨酸残基248的突变。

在实施方案中，修饰的CTLA-4是截短的CTLA-4，其干扰T细胞的CTLA-4和靶细胞的CTLA4配体之间的通路。例如，截短的CTLA4包含CTLA4胞外结构域或CTLA4跨膜结构域，或其组合。截短的CTLA4的例子可以在PCT公开号：WO2020/086989中找到，该专利以其整体并入本文。

实施方案涉及脂质颗粒，其包含：阳离子和/或pH响应性脂质、水溶性治疗有效化合物和编码抗原和一种或多种免疫细胞活化剂的多核苷酸。在实施方案中，一种或多种免疫细胞激活剂是一种或多种T细胞激活剂，例如CD80、CD86蛋白、41BBL蛋白和其他共刺激结构受体的配体；CD28抗体、41BB抗体等共刺激结构受体激活抗体。实施例采用纳米脂质体颗粒载体mRNA疫苗(LNP mRNA疫苗)联合CoupledCAR-T进行细胞体外共培养实验、流式细胞仪检测细胞因子表达和CAR-T表达。预期实验结果：增强CAR-T的扩增，减少衰竭，提高CoupledCAR-T杀伤肿瘤细胞的能力。实施例使用LNP mRNA疫苗来呈递和表达不同的信号(包括配体、抗体、靶标、因子等)，例如使用LNP mRNA疫苗来呈递第二信号(例如CD80、CD86蛋白、41BBL蛋白和其他辅助信号)。刺激结构受体)配体，以及CD28抗体、41BB抗体等共刺激结构受体激活抗体)，呈递第三信号(如细胞因子IL2/7/15/21/23/12/18、CCL5、CCL22、etc.)等进行细胞体外共培养实验，流式细胞仪检测细胞因子表达，CAR-T表达。预期实验结果：增强CAR-T的扩增，减少衰竭，提高CoupledCAR-T杀伤肿瘤细胞的能力。使用纳米脂质体颗粒载体mRNA疫苗(LNP mRNA疫苗)联合CoupledCAR-T，我们是传递第二信号(如CD80、CD86蛋白、41BBL蛋白等共刺激结构受体配体，以及CD28抗体、41BB抗体等共刺激结构受体激活抗体)和第三信号(如细胞因子IL2/7/15/21/23/12/18、CCL5、CCL22等)实现CAR-T细胞在A在实体瘤微环境中大量扩张，激活不引起衰竭。它可以更好地执行T细胞的功能。有关LNP及其在细胞疗法中的用途的更多信息，请参见PCT公开号：WO2020206231、WO2005120469、WO2021021634、WO2019014623和WO2016155809以及Reinhard等人，A nanoparticle RNAvaccine strategy targets chimeric antigen receptor(CAR)–T cells to solidtumors in difficult-to-treat mouse models,SCIENCE24 JAN 2020:446-453，其全部内容并入本文。表2提供了LNP示例的参数。

表2

粒子	AA序列	核苷酸序列序列	电荷比	尺寸
					GCC-LNP	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:2	5:1	100nm
GFP-LNP	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:4	6:1	100nm

图8和9显示实施针对实体瘤的纳米颗粒以治疗癌症患者的实施例。例如，FAP在各种肿瘤环境中高表达，已广泛应用于肿瘤成像和免疫治疗。因此，FAPBM可以偶联到纳米颗粒的表面以将纳米颗粒引导至肿瘤环境。此外，如图所示。如图8所示，所包含的RNA可以包括调节元件(例如，缺氧元件和/或NFAT)以提高安全性。治疗及其相关序列的例子可以在申请人的PCT专利申请号：PCT/US21/31258和PCT/US2021/028429中找到，它们的全部内容并入本文。

本公开描述了一种增强淋巴细胞或T细胞反应(例如，淋巴细胞的扩增)和/或克服肿瘤异质性的方法，该方法包括：获得包含编码抗原的多核苷酸和编码IL-12的多核苷酸的脂质颗粒；使抗原呈递细胞(APC)群体和淋巴细胞群体与脂质颗粒接触，淋巴细胞群体包含结合抗原的抗原结合分子；并允许淋巴细胞群的淋巴细胞或T细胞反应。在实施方案中，淋巴细胞或T细胞反应包括淋巴细胞的扩增，并且淋巴细胞群的扩增水平大于与没有编码抗原的多核苷酸和编码IL-12的多核苷酸的脂质颗粒接触的淋巴细胞群的扩增水平。

本公开描述了一种增强淋巴细胞扩增和/或克服肿瘤异质性的方法，该方法包括：获得包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸的多核苷酸的脂质颗粒；使抗原呈递细胞(APC)群体和淋巴细胞群体与脂质颗粒接触，所述淋巴细胞群体包含第一淋巴细胞群体，所述第一群体包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含SEQ ID NO:5的氨基酸或6和第二个淋巴细胞群包含T细胞受体(TCR)，第二个淋巴细胞群不包含CAR；并允许扩增第二个淋巴细胞群。在实施例中，第一淋巴细胞群还包含编码IL-12的多核苷酸，并且淋巴细胞群的扩增水平大于包含编码CAR的多核苷酸而不包含编码IL-12的多核苷酸的淋巴细胞群的扩增水平。这里，肿瘤异质性是指肿瘤细胞之间的分子变异。这些细胞的实例包括表达不同或不同水平的肿瘤抗原或表位的混合肿瘤细胞，表达不同或不同水平的检查点抑制剂的混合肿瘤细胞，以及包含肿瘤细胞和与肿瘤细胞相关的淋巴细胞(M2巨噬细胞)的混合细胞和/或促进例如肿瘤血管生成、转移和免疫抑制。在实施方案中，将抗原递送至DC不仅增强了结合抗原的相应CAR T细胞的扩增，而且增强了不包含CAR的T细胞(旁观者T细胞)的扩增，这是一个令人惊讶的发现。这些旁观者T细胞的T细胞反应可能有助于CAR T细胞克服肿瘤异质性。在实施方案中，细胞增殖或扩增是指导致细胞总数增加的过程，这可以通过多种方法测量，例如通过代谢活性测定、细胞增殖标记物测定、ATP浓度测定和DNA合成化验。细胞增殖也可以使用Invitrogen^TMCellTrace^TMViolet细胞增殖试剂盒进行测量，该试剂盒通过流式细胞术使用染料稀释来标记细胞以追踪多代细胞。在实施例中，可以基于T细胞基因组DNA中CAR分子拷贝数的增加来测量T细胞扩增。在实施方案中，T细胞扩增可以基于对在T细胞上表达的分子的流式细胞术分析来测量。

在实施方案中，淋巴细胞包括T细胞或NK细胞，或其组合。

在实施方案中，APC包括树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞和B细胞或T细胞。

在实施方案中，抗原结合分子包含嵌合抗原受体(CAR)。在实施例中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且细胞外结构域结合肿瘤抗原。在实施例中，细胞内结构域包含CD3 zeta信号结构域。在实施例中，包含共刺激结构域的细胞内结构域包含选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或其组合。

在实施方案中，脂质颗粒是脂质纳米颗粒(LNP)，并且抗原包含SEQ ID NO：1。在实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：5。

在实施方案中，使APC群体和淋巴细胞群体与脂质颗粒接触包括使APC群体和淋巴细胞群体与脂质颗粒接触以允许APC群体表达抗原并表达和分泌IL-12。

在实施方案中，结合分子包含T细胞受体(TCR)。在实施方案中，结合分子包含修饰的TCR。在实施方案中，TCR源自患者体内自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。在实施例中，TCR包含TCRγ和TCRδ链、TCRα和TCRβ链，或其组合。

在实施方案中，脂质颗粒包含包含编码抗原的多核苷酸的第一脂质颗粒、包含编码IL-12的多核苷酸的第二脂质颗粒和包含编码共刺激信号相关分子的多核苷酸的第三脂质颗粒。在实施方案中，共刺激信号相关分子包含抗-CD28、CD40L和抗-41-BB或激动剂。

在实施例中，经修饰的细胞包含免疫检查点分子的显性失活形式。在实施例中，免疫检查点分子包含PD-1、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD 160。

受试者中的淋巴细胞或T细胞反应是指与辅助、杀伤、调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞反应可能包括在免疫过程中协助其他WBC以及识别和破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞等活动。受试者中的T细胞反应可以通过各种指标来测量，例如T细胞杀死的病毒感染细胞和/或肿瘤细胞的数量、T细胞释放的细胞因子(例如，IL-6和IFN-γ)的量在体内和/或在与病毒感染的细胞和/或肿瘤细胞共培养中，指示受试者中T细胞的增殖水平、T细胞的表型变化(例如记忆T细胞的变化)和水平受试者中T细胞的寿命或寿命。

在实施例中，本文所述的增强T细胞反应的方法可以有效地治疗有需要的受试者，例如被诊断患有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指肿块、液体的集合，例如血液，或固体肿块。肿瘤可以是恶性的(癌性的)或良性的。血癌的例子包括慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。

实体瘤通常不包含囊肿或液体区域。恶性实体瘤的主要类型包括肉瘤和癌。肉瘤是在称为间充质细胞的软组织细胞中发展的肿瘤，可以在血管、骨骼、脂肪组织、韧带淋巴管、神经、软骨、肌肉、韧带或肌腱中发现，而癌是在上皮细胞中形成的肿瘤,存在于皮肤和粘膜中。最常见的肉瘤类型包括未分化多形性肉瘤，累及软组织和骨细胞；平滑肌肉瘤，涉及排列在血管、胃肠道和子宫内的平滑肌细胞；涉及骨细胞的骨肉瘤和涉及脂肪细胞的脂肪肉瘤。肉瘤的实例包括尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、软骨肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、纤维肉瘤和神经胶质瘤。

五种最常见的癌症包括肾上腺癌，它涉及产生液体或粘液的器官，例如乳房和前列腺；基底细胞癌，涉及皮肤最外层的细胞，例如皮肤癌；鳞状细胞癌，涉及皮肤基底细胞；移行细胞癌会影响包括膀胱、肾脏和输尿管在内的泌尿道中的移行细胞。癌的例子包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌和胆管癌。

本公开还涉及mRNA疫苗技术和的组合，以在患有某种形式的癌症的受试者中扩增淋巴细胞。的更多信息可在PCT公开号：WO2020106843和WO2020146743以及美国专利公开号：US20210100841和US20210137983中找到，它们通过引用整体并入。例如，本公开描述了一种增强淋巴细胞(例如T细胞)反应的扩增和/或激活的方法，该方法包括：获得包含编码抗原的多核苷酸的脂质颗粒；使APC群体和淋巴细胞群体与脂质颗粒接触，所述淋巴细胞群体包含包含结合血细胞抗原的CAR的第一淋巴细胞群体和包含结合实体瘤抗原的抗原结合分子的第二淋巴细胞群体；允许第一和第二淋巴细胞群的扩增，其中第一和第二淋巴细胞群的扩增水平大于与APC群接触但是没有脂质颗粒的相应第一和第二淋巴细胞群的扩增水平。在实施方案中，第一淋巴细胞群和/或第二淋巴细胞群可以用多特异性结合分子例如CD3-CD19和CD3-GCC替代。关于多特异性结合分子的更多信息可以在PCT专利公开号：WO2021216731中找到，其通过引用整体并入。

在实施例中，APC包含DC和B细胞。在实施方案中，实体瘤抗原包含MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR，SIGLEC15、SLC6A3、CLDN 18.2、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、MAGE A4、EGFR或其组合。在实施方案中，淋巴细胞包括NK细胞和/或T细胞。在实施例中，抗原结合分子包含CAR或TCR。

最近发现了一种通过在T细胞靶向脂质纳米颗粒(LNP)中递送修饰的信使RNA(mRNA)在体内产生瞬时抗纤维化嵌合抗原受体(CAR)T细胞的治疗方法，这为实体瘤的治疗带来了巨大希望。这种方法利用LNP封装的mRNA的靶向递送来重新编程T细胞以表达对肿瘤抗原具有特异性的CAR，然后将这些CAR T细胞扩增并输注到患者体内。关于使用靶向T细胞的脂质纳米颗粒(LNP)在体内递送修饰的信使RNA(mRNA)的更多技术可以在PCT专利公开号：WO2022/081694、WO2022/081699和WO2022/081702中找到，这些专利特此并入整体参考。

脂质纳米颗粒(LNP)mRNA与传统CAR T细胞疗法的结合已成为治疗癌症，尤其是实体瘤的一种有前途的方法。然而，在治疗癌症，尤其是实体瘤癌症时，需要考虑这种方法的某些局限性。例如，纤维化疾病的特征是纤维组织过度积累，导致器官功能障碍。在这些情况下，主要靶细胞是活化的成纤维细胞，而不是癌细胞。在这种情况下，治疗的目标不是消除所有病理细胞，而是减轻总体疾病负担。这可以通过减少活化的成纤维细胞的数量或通过抑制它们的活化和增殖来实现。

相比之下，CAR T细胞疗法旨在通过重新编程T细胞攻击肿瘤抗原来消除癌细胞。这种方法基于完全或部分消除癌细胞的原则，这可能比治疗纤维化疾病要困难得多。例如，靶向递送LNP封装的mRNA技术和传统的CAR T细胞疗法可能无法绕过实体瘤使用的免疫逃避机制。例如，实体瘤通常会产生一种微环境，阻止其抗原暴露于免疫系统，从而使CAR T细胞难以到达并消灭癌细胞。

称为的新一代CAR T技术在克服传统CAR T疗法的某些局限性方面显示出治疗实体瘤的希望。这种新一代CAR T技术已显示CAR T细胞在体外和体内的抗原非依赖性扩增。如实施例所示，技术的一个独特方面是它包含几种不同类型的细胞，这些细胞基于它们表达的载体。在实施例中，产品可以包括16种不同类型的细胞。然而，LNP介导的mRNA递送依赖于LNP进入细胞并在细胞内释放mRNA有效载荷的能力。因此，LNP介导的递送过程取决于LNP的大小和mRNA分子的大小。较大的LNP可以携带较大的mRNA分子，但由于体积较大，它们也更难进入细胞。因此，将多个LNP递送至T细胞以获得患者体内所有16种类型的T细胞可能存在挑战。

如实施例所示，一种特定类型的细胞在对产品有反应的患者的血液中显着富集。这意味着这种特定类型细胞在患者血液中的百分比明显高于注入患者体内的产品，这表明这种特定类型的细胞可以在产品的有效性中发挥关键作用。另一方面，在对产品没有任何反应的患者中，这种特定类型的细胞在患者血液中没有富集或没有显着富集，这表明缺乏这种特定类型的细胞富集可以与对产品缺乏反应有关。

一种特定类型的细胞在对CoupledCAR产品有反应的患者的血液中显着富集的发现是实体瘤CAR T细胞疗法领域的一个令人惊讶和重要的发现。这种现象凸显了实体瘤治疗过程中的复杂动力学，以及了解单个细胞在CAR T产品中的作用的重要性。此外，这一现象挑战了对CAR T细胞疗法有效性的传统理解，对患者的选择具有重要意义，并凸显了需要新的策略来增强产品的有效性。

基于这一令人惊讶的发现，设计了脂质纳米颗粒(LNP)mRNA和CAR T细胞疗法的新组合。实施方案涉及包含与结合CD2、CD3、CD5或CD7的抗体缀合的脂质颗粒的组合物，脂质颗粒包含编码CAR结合CD19或BCMA的多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的CAR的多核苷酸，和/或编码IL12的多核苷酸。

实施方案涉及包含与结合T细胞的细胞表面抗原的试剂缀合的脂质颗粒的组合物，所述脂质颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合血液抗原的第一结合分子的第一多核苷酸、编码结合血液抗原的第二结合分子的第二多核苷酸实体瘤抗原，和/或编码药剂的第三多核苷酸。在实施方案中，第一、第二和第三多核苷酸在一个多核苷酸或多个多核苷酸中。在实施方案中，脂质颗粒包含作为单个多核苷酸或作为三个单独的多核苷酸的所有三种多核苷酸。在实施方案中，每个多核苷酸在单独的脂质颗粒中。在实施方案中，两个多核苷酸在脂质颗粒中作为单个多核苷酸或作为两个单独的多核苷酸并且第三个多核苷酸在单独的脂质颗粒中。

实施方案涉及包含与结合T细胞的细胞表面抗原的试剂缀合的第一脂质颗粒的组合物，第一脂质颗粒包含编码结合血液抗原的第一结合分子的第一多核苷酸；第二脂质颗粒缀合至结合T细胞的细胞表面抗原的试剂，第二脂质颗粒包含编码结合实体瘤抗原的第二结合分子的第二多核苷酸；第三脂质颗粒缀合至结合T细胞的细胞表面抗原的试剂，第三脂质颗粒包含编码药剂的第三多核苷酸。

实施方案涉及在有此需要的受试者中治疗实体瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的组合物。

在实施方案中，第一、第二和第三多核苷酸包含单个RNA分子、三个独立的RNA分子或两个独立的RNA分子。

在实施方案中，T细胞的细胞表面抗原是泛T抗原。在实施方案中，泛T抗原CD2、CD3、CD5或CD7。

在实施方案中，脂质颗粒是脂质体、脂质纳米颗粒或胶束。

在实施方案中，脂质颗粒是脂质纳米颗粒。在实施方案中，脂质纳米颗粒包含缀合至靶向结构域的PEG-脂质。

在实施方案中，试剂包含核酸分子、肽、抗体和小分子。在实施例中，药剂是抗体。在实施例中，药剂是抗CD5抗体。

在实施方案中，血液抗原细胞是白细胞(WBC)的表面分子。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在实施例中，WBC是B细胞。

在实施方案中，细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。在实施方案中，细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。

在实施方案中，细胞表面分子是CD19或BCMA。

在实施方案中，实体瘤抗原是肿瘤相关MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

在实施方案中，药剂是细胞因子。

在实施方案中，药剂是IFNγ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23或其组合。在实施方案中，药剂是IL-12。

在实施方案中，第三多核苷酸包含启动子，所述启动子包含用于调节IL-12的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。在实施例中，转录调节剂包含HIF-1α、NFAT、FOXP3或NFkB。

在实施方案中，结合分子是嵌合抗原受体(CAR)或TCR。

在实施例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3zeta结构域。在实施例中，共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或结合CD83的配体。

通过参考以下示例性实施例和示例来进一步描述本公开。这些示例性实施例和示例仅出于说明的目的而提供并且不旨在限制，除非另有说明。因此，本公开决不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

例子

生成了编码单个CAR分子的慢病毒载体并用T细胞转染，如下所述。与细胞培养和细胞毒性T淋巴细胞检测相关的技术可以在“Control of large,established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 andCD137 domains,”PNAS,March 3,2009,vol.106，No.9,3360–3365和“含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活率和增强的体内抗白血病功效”，分子疗法，2009年8月，第17卷，第8期,1453–1464，其全部内容通过引用并入本文。

用慢病毒转导底物细胞(例如，K562细胞)，包括编码各种抗原的核酸序列以建立靶肿瘤细胞系。慢病毒包括IRES-mCherry结构，它编码红色荧光以确认抗原表达。观察到这些底物细胞的红色荧光信号，表明目标实体瘤细胞系已成功建立。构建细胞系的技术可以在“含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活和增强的体内分子治疗抗白血病功效，分子疗法，2009年8月，第17卷，第8期,1453–1464”，其通过引用并入本文。K562细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

用慢病毒载体(见下表)转导原代T细胞以生成混合CAR T细胞。原代T细胞获自健康人类供体。慢病毒包括编码CAR分子和一种或多种治疗剂的核酸序列，并且可以进一步包括IRES-mCherry构建体，其编码红色荧光以确认CAR表达。与细胞培养、慢病毒载体的构建和流式细胞术相关的技术可以在“Treatment of Advanced Leukemia in Mice withmRNA-Engineered T Cells,HUMAN GENE THERAPY 22:1575–1586(December 2011)”中找到，其并入本文引用。转导后，分析混合的T细胞以确定单个细胞类型和百分比。

表3

图11显示了制备含有多核苷酸的LNP和使用LNP转染DC的示意图。通过将阴离子GCC mRNA与阳离子脂质体混合产生GCC-LNP转染的DC。图12显示了GCC-LNP和GFP-LNP的平均粒径。图13显示了GCC-LNP和GFP-LNP的封装效率和封装的RNA浓度。Ignite^TMSystem仪器、LNP kitIgnite^TMTraining Kit和GenVoy-ILM^TM用于GCC mRNA 包裹。有关LNP及其在细胞疗法中的用途的更多信息，请参见PCT公开号：WO2020206231、WO2005120469、WO2021021634、WO2019014623和WO2016155809以及Reinhard等人，Ananoparticle RNAvaccine strategy targets chimeric antigen receptor(CAR)-T cells to solid tumors in difficult-to-treat mouse models,SCIENCE24JAN2020:446-453，其全部内容并入本文。

图14A、14B和14C显示流式细胞术分析的结果，证实获得了CAR T细胞和DC。T细胞和单核细胞取自健康志愿者的外周血。用编码CAR的慢病毒转染T细胞以获得CAR T细胞(例如，GCC CAR T细胞)。单核细胞分化为DC细胞(即CD14阴性和CD86阴性)。

图15显示流式细胞术分析的结果，证实分化的DC细胞被GFP-LNP或GCC-LNP转染。将DC与10ug或100ug LNP混合，并确定GFP或GCC的表达。与100ug LNP混合的DC表现出更高的转染率。

图16显示用GCC-LNP转染的DC增强了GCC CAR T细胞和未转导的T细胞的扩增。分化的DC细胞转染GCC-LNP后，与包括GCC CAR T细胞和非转导T细胞在内的混合细胞共培养(E:T＝1:1)。使用Celltrace^TM进行T细胞的扩增分析。结果发现，与DC-GCC共培养后，GCCCAR T细胞出现扩增，非转导T细胞也出现扩增。

图17显示混合的CD19 CAR T和GCC CAR T细胞在与转染有GCC-LNP的DC混合后的扩增。在用GCC-LNP转染分化的DC细胞24小时后，将它们与CAR T细胞混合，包括CD19 CAR T细胞和GCC CAR T细胞，有或没有B细胞。进行了扩展分析。结果发现，GCC CAR T细胞显示出明显的增殖，尤其是CD4+T细胞。这表明GCC-LNP增强了系统中实体瘤CAR T细胞(例如，CD19 CAR T细胞和GCC CAR T细胞)的扩增。

图18显示混合的CAR19 CAR T和GCC CAR T细胞在与用GCC-LNP转染的DC混合后的激活。结果发现，GCC CAR T细胞显示出显着的活化。这表明GCC-LNP增强了系统中实体瘤CAR T细胞(例如，CD19 CAR T细胞和GCC CAR T细胞)的活化。

可以使用本文所述的CAR T疗法生成的16种不同类型的CAR T细胞(见US17/592,601，Table 3和Table 4)。为了进一步研究这16种CAR T细胞在CAR T疗法中的命运，选择了6名患者，并收集了他们的血液样本进行单细胞测序分析。在这6名患者中，有3名是反应者，另外3名是无反应者。对于3位反应者，他们的最佳总体反应(BOR)是结肠直肠癌的部分缓解(PR)或前列腺癌的PSA水平降低。图19显示了对患者01的CAR T疗法的总结。图20A-20C显示在将CAR T细胞输注到患者01中之后特定类型的T细胞单独被富集。图21显示了对患者02的CAR T疗法的总结。图22A-22C显示了在将CAR T细胞输注到患者02中之后特定类型的T细胞单独被富集。图23显示了患者02在CAR T治疗前后的PET-CT扫描图像对比。这些结果表明，在对CoupledCAR产品有反应的患者中，一种特定类型的CAR T细胞在患者血液中显着富集，这种CAR T细胞包是含编码CD19 CAR、PAP或GCC CAR和IL-12的多核苷酸的CAR T细胞。然而，这种特定类型的T细胞并没有在无反应者中富集。这些结果表明，这种特定类型的细胞百分比在患者血液中明显高于产品注入患者体内时的百分比。这表明这种特定类型的细胞可能在CoupledCAR产品的有效性中可能发挥关键作用。另一方面，在对产品没有任何反应的患者中，这种特定类型的细胞在患者血液中没有富集或没有显着富集。这表明缺乏这种特定类型细胞的富集可能与缺乏对产品的反应有关。

和本申请中相关的序列、组合物和方法相关的序列可以在PCT专利公开号：WO2016138846、WO2018126369、WO2017167217、WO2019140100、WO2020146743、WO2021216731、WO2020106843、WO2020047306和WO2022150831以及美国专利公开NOS：US20210060069和US20210100841中发现，他们的全文通过引用并入本说明书。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请都具体且单独地指明通过引用并入。虽然已经根据各种实施例描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改、替换、省略和改变。

Claims (10)

1.一种组合物，其包含与结合CD2、CD3、CD5、CD7或CD28的抗体缀合的脂质颗粒，所述脂质颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合CD19或BCMA的CAR的多核苷酸、编码结合实体瘤抗原的CAR的多核苷酸，和编码IL-12的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质颗粒是脂质体、脂质纳米颗粒或胶束。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述脂质颗粒是脂质纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含缀合至所述靶向结构域的PEG-脂质。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的组合物，其中所述实体瘤抗原是肿瘤相关MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8,CFC1,SLC12A3,SSTR1,GPR27,FZD10,TSHR,SIGLEC15,SLC6A3,KISS1R,CLDN18.2,QRFPR,GPR119,CLDN6,UPK2,ADAM12,SLC45A3,ACPP,MUC21,MUC16,MS4A12,ALPP,CEA,EphA2,FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码IL-12的多核苷酸包含启动子，所述启动子包含用于调节IL-12的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述转录调节剂包含HIF-1α、NFAT、FOXP3或NFkB。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3zeta结构域。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的细胞内结构域、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或结合CD83的配体。

10.权利要求1～9中任意一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物优选为治疗实体瘤的药物。