CN117987435A - 氧依赖性嵌合抗原受体表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种氧依赖性嵌合抗原受体表达及其应用，属于生物医药领域。该氧依赖性嵌合抗原受体由包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸、编码氧依赖性降解(ODD)结构域的核酸和一个或多个缺氧反应元件(HRE)的序列的核酸的多核苷酸表达生成。氧依赖性CAR表达可以通过将T细胞活性限制在氧气不充足的区域并允许T细胞在缺氧的肿瘤微环境中生存和发挥更好的功能来提高CAR T细胞疗法的安全性和有效性。

Description

氧依赖性嵌合抗原受体表达及其应用

序列表信息

2023年1月10日左右创建的名为“ST25 Finalized”的计算机可读文本文件，文件大小约为30,821字节，包含本申请的序列表，并通过引用整体并入本文。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)T细胞是一种可以识别和靶向特定癌细胞的工程T细胞。CAR T细胞疗法的主要问题之一是脱靶毒性的可能性，其中T细胞除了攻击癌细胞外还攻击健康细胞。这可能是因为CAR T细胞被设计为靶向存在于癌细胞上的特定抗原，但这些抗原也可能以低水平存在于健康细胞上。因此，CAR T细胞可能会攻击这些健康细胞，从而导致严重的副作用。这可能包括细胞因子释放综合征，这是一种可能危及生命的疾病，其特征是高烧、低血压和呼吸困难，以及神经系统并发症，如意识模糊、癫痫发作和脑病。另一个潜在的脱靶毒性是自身抗体的形成。CAR T细胞可产生针对自身抗原的自身抗体，从而引起器官损伤和自身免疫性疾病，如溶血性贫血、血小板减少症和肾炎等。此外，CAR T细胞还可以靶向表达与癌细胞相似抗原的正常细胞。这可能导致正常细胞和器官功能障碍的毒性作用。总之，脱靶毒性的可能性是CAR T细胞疗法的一个问题，因为它会导致严重的副作用和器官损伤。因此，重要的是继续制定策略以最大限度地降低这种风险。

概要

提高CAR T细胞疗法安全性和有效性的一种方法是使CAR的表达依赖于氧气的存在。这被称为“氧依赖性CAR表达”。氧依赖性CAR表达通过将T细胞的活性限制在没有足够氧气的身体区域(例如肿瘤)来解决这个问题。这使得CAR T细胞能够特异性地靶向癌细胞，同时最大限度地减少伤害健康细胞的可能性。氧依赖性CAR表达的另一个好处是，它可以通过让T细胞在实体瘤中常见的缺氧(低氧)条件下存活和发挥更好的功能来提高治疗效果。肿瘤通常以血管灌注不良为特征，这会导致低氧水平和对T细胞生存和发挥功能具有挑战性的微环境。通过将CAR表达限制在氧气不充足的区域，T细胞可以在肿瘤微环境中更好地生存和发挥作用。氧依赖性CAR表达可以通过将T细胞活性限制在氧气不充足的区域并允许T细胞在缺氧的肿瘤微环境中生存和发挥更好的功能来提高CAR T细胞疗法的安全性和有效性。这种方法有可能改善癌症患者的预后，是一个活跃的研究领域。本公开的实施方案涉及增强淋巴细胞治疗癌症患者的能力的组合物和方法。实施方案涉及包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸、编码氧依赖性降解(ODD)结构域的核酸和编码缺氧反应元件(HRE)的一个或多个序列的核酸的多核苷酸。

本发明内容不旨在识别要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在限制要求保护的主题的范围。

附图说明

具体实施方式参照附图进行描述。在不同的图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。

图1是示例性修饰细胞的示意图。

图2显示了各种CAR T细胞的抗肿瘤作用。

图3分别为第5天、第11天和第17天小鼠外周(PB)中CAR T细胞表达的流式细胞术结果。

图4显示了hypo CLDN18.2 CAR的结构以及当与底物细胞共培养时表达这些hypoCLDN18.2 CAR和常规CLDN18.2 CAR的T细胞的杀伤能力。“175”是指CLDN 18.2scFv。“LV”是指慢病毒载体。“9X HRE”如SEQ ID NO：1所示(HRE重复9次)。“BBZ”或“bbz”是指4-1BB和CD3zeta。“ODD”是指全长氧依赖性降解结构域(SEQ ID NO：10)。“MiniODD”是指重复3次的ODD的一部分(SEQ ID NO：27)。

图5A、5B和5C显示了当与底物细胞共培养时表达hypo CLDN18.2 CAR和常规CLDN18.2CAR的CAR T细胞释放的细胞因子。

图6A、6B和6C显示了hypo GPC3 CAR的结构和表达hypo GPC3 CAR和常规GPC3 CAR的CAR T细胞在与底物细胞共培养时释放的细胞因子。“GPC3”是指GPC3 scFv。“LV”是指慢病毒载体。“9X HRE”如SEQ ID NO：1所示(HRE重复9次)。“BBZ”或“bbz”是指4-1BB和CD3zeta。“ODD”是指全长氧依赖性降解结构域(SEQ ID NO：10)。“MiniODD”是指重复3次的ODD的一部分(SEQ ID NO：27)。

图7显示了hypo GCC CAR的结构以及当与底物细胞共培养时表达这些hypo GCCCAR和常规GCC CAR的T细胞的杀伤能力。“GUCY2C”是指GUCY2C scFv。“LV”是指慢病毒载体。“9X HRE”如SEQ ID NO：1所示(HRE重复9次)。“BBZ”或“bbz”是指4-1BB和CD3zeta。“ODD”是指全长氧依赖性降解结构域(SEQ ID NO：10)。“MiniODD”是指重复3次的ODD的一部分(SEQID NO：27)。

图8A、8B、8C和8D显示了当与底物细胞共培养时表达hypo GUCY2C CAR和常规GUCY2C CAR的CAR T细胞释放的细胞因子。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

所谓“约”是指数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度变化多达20,15,10,9,8,7,6,5,4,3,2或1％至参考数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度。

如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广义使用，指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性或功能。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体以及Fv、Fab、Fab'和F(ab')2及其片段，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999，在：使用抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow等人，1989，在：抗体：实验室手册，冷泉港，纽约；休斯顿等人.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988,Science242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成，紧密、非共价结合。这两个结构域的折叠产生六个高变环(重链和轻链各有3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含抗原特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点(二聚体).

如本文所用，“抗体重链”是指以天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用，“抗体轻链”是指以天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。合成DNA是使用本领域已知的技术获得的。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引起免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。可以从包括组织样本，肿瘤样本，细胞或生物流体的生物样本产生，合成或衍生抗原。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少，肿瘤细胞数量减少，转移瘤数量减少，肿瘤细胞增殖减少，肿瘤细胞存活，具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过肽，多核苷酸，细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。

术语“自身抗原”或“自身抗原”是指被免疫系统错误识别为外来抗原。自身抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述源自受试者的材料，随后将其重新引入相同的受试者。

术语“同种异体”用于描述源自同一物种的不同受试者的移植物。例如，供体受试者可能与受体受试者相关或不相关，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标记。

术语“异种”用于描述源自不同物种受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，并且供体受试者和受体受试者在遗传和免疫学上可能不相容。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾癌，肝癌，脑癌，淋巴瘤，白血病，肺癌等。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(诸如血液性肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。利用本公开的CAR治疗的癌症的类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、以及恶性肿瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。

血液性癌症为血液或骨髓的癌症。血液性(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(不活跃形式和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤是异常的组织块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤的实例，例如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌,前列腺癌,肝细胞癌,鳞状细胞癌,基底细胞癌,腺癌,汗腺癌,甲状腺髓样癌,甲状腺乳头状癌,嗜铬细胞瘤皮脂腺癌,乳头状癌,乳头状腺癌,髓样癌,支气管癌,肾细胞癌,肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤))、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经鞘瘤瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。表1中提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。

表格1

如本文所用，术语“肿瘤相关抗原(TAA)”是指与相应的正常组织相比，在具有肿瘤的组织中被恶性细胞选择性表达或过度表达的抗原。肿瘤相关抗原包括肿瘤特异性抗原、致癌抗原、癌基因产物、器官谱系抗原、病毒抗原等各种组。例如，癌基因和抑制基因产物，如未突变的HER-2/neu和p53，是类似的癌胎抗原，因为它们可以在肿瘤中过度表达，并可能在某些胎儿组织中表达。TAA的其他示例包括成纤维细胞活化蛋白-α(FAP)、HER2、MART-1、MUC1、酪氨酸酶、MAGE、乳房珠蛋白-A和NY-ESO-1。

例如，FAP是一种II型整合丝氨酸蛋白酶，由活化的成纤维细胞特异性表达。肿瘤间质中的癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)大量稳定表达FAP，在促进肿瘤生长、侵袭、转移和免疫抑制中发挥重要作用。例如，在乳腺癌高发女性中，CAF占肿瘤微环境中细胞的50-70％。FAP的CAF过表达通过影响细胞外基质重塑、细胞内信号传导、血管生成、上皮-间质转化和免疫抑制来促进肿瘤的发展和转移。

本文使用的术语“肿瘤特异性抗原(TSAs)”是指在肿瘤中独特表达的抗原，例如点突变的ras致癌基因、p53突变、抗独特型抗体(Abs)和核糖核酸(RNA)的产物剪接变体和基因易位。TSA的另一个例子是人类MUC1(tMUC1)的肿瘤形式。

例如，MUC1是上皮粘蛋白分子家族之一。MUC1是一种跨膜粘蛋白糖蛋白，通常在主要器官的所有腺体上皮细胞上表达。在正常细胞中，MUC1仅在顶端表面表达，并被糖基化，其核心蛋白被碳水化合物隔离。随着细胞向恶性表型转化，MUC1的表达增加数倍，并且表达不再局限于顶端表面，而是遍布细胞表面和细胞质。此外，肿瘤相关MUC1(tMUC1)的糖基化是异常的，与在正常组织中表达的MUC1上发现的相比，肽核心的暴露更多。

如本文所用，术语“器官谱系抗原(OLA)”是指在给定类型的肿瘤和肿瘤来源的正常器官中表达的抗原。器官谱系抗原的实例包括前列腺特异性抗原(PSA)和黑素细胞抗原，例如CD19、BCMA、CD20、CD22、GCC、PAP、MSLN和ALPP。如果表达它们的正常器官不是必需的，例如前列腺、乳腺或黑素细胞，器官谱系抗原可以作为免疫治疗的靶点。如本文所用，器官是指具有共同结构、细胞间物质和/或功能的整合细胞群。

例如，鸟苷酸环化酶2C(GUCY2C或GCC)主要在肠上皮细胞中表达。GUCY2C是致腹泻细菌性肠毒素和肠道旁分泌激素、鸟苷和尿鸟苷的受体。这些配体调节肠和肾上皮细胞中的水和电解质转运，并最终导致急性分泌性腹泻。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含”、“包括”和“包括”将被理解为暗示包括规定的步骤或要素(成分或组分)或步骤或要素组(成分或组件)，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素组。

“由...组成”一词旨在包括并限于“由...组成”一词之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列要素或步骤是必需的或强制性的，并且不得存在其他要素。

短语“基本上由......组成”意在包括在该短语之后列出的任何元素，并且可以包括不干扰或有助于在公开内容中针对所列元素或步骤指定的活动或动作的其他元素或步骤。因此，“基本上由……组成”一词表示所列要素或步骤是必需的或强制性的，但其他要素或步骤是可选的，可能存在也可能不存在，具体取决于它们是否影响所列要素或行动要素或步骤。在实施例中，那些不影响实施例的要素或步骤是那些不以统计学上显着的方式改变实施例在体外或体内执行功能(例如在体外或体内杀死癌细胞)的能力的那些要素或步骤.

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则仅匹配一些核酸的碱基，或者核酸之间可能存在“完全”或“完全”的互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显着影响。

术语“对应于”或“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸在肽或蛋白质中；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供该信号除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外，还介导T细胞反应，包括增殖、激活、分化和其他细胞反应中的至少一种回应。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子，BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指信号，其与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。

术语“共刺激信号区域”、“共刺激结构域”和“共刺激结构域”可互换使用，指除刺激或信号结构域(例如CD3 zeta)之外的一个或多个附加刺激结构域。术语“刺激”或“信号”结构域(或区域)也可以互换使用，例如，当提到CD3 zeta时。在实施例中，共刺激信号传导结构域和信号传导结构域可以在相同分子或相同细胞中的不同分子上。

术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认识到作为一种疾病，但仅作为一种不良状况或综合征，其中临床医生已经确定了一组或多或少特定的症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病未得到改善，则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状况不如没有病症时的健康状态。如果不治疗，疾病不一定会导致动物的健康状况进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，可作为生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有以下任一特征：确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了“T”被“U”替代)并且通常在序列表中提供，以及非编码链，用作模板对于基因或cDNA的转录，可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源”是指不是天然存在于野生型细胞或生物中但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源”或“天然”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。而且，通过分子生物学技术从第一生物分离并转移到第二生物的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在特定的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”到已经含有这样的多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，从而促进其的过表达。编码的多肽。

术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制(调节)序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒(AAV))。

术语“同源的”是指当两个比较的序列中的两个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个多肽DNA分子被腺嘌呤占据，那么分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是由两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配或同源，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对以给出最大的同源性时进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA，IgG，IgM，IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液，泪液，母乳，胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集，补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是免疫球蛋白，其没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体。IgE是免疫球蛋白，其通过在暴露于过敏原时从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质而介导即时超敏反应。

术语“分离的”是指基本上或基本上不含通常伴随其天然状态的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常是正常序列中去除的DNA片段与片段相邻。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境的体外分离和/或纯化，以及与其他组分细胞。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与之结合的成分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指已经从其他细胞类型中分离出来的细胞，其他细胞类型在其天然存在或天然状态下通常与之相关。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在其他情况下，该术语仅指已与在其自然状态下与它们自然相关的细胞分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。此外，慢病毒的使用使得遗传信息能够整合到宿主染色体中，从而产生稳定转导的遗传信息。HIV，SIV和FIV都是慢病毒的例子。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显着水平的基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比，调节受试者中反应水平的可检测增加或减少，和/或与在其他方面相同但未经处理的主题中的回应。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者，优选人的有益治疗反应。

当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。

术语“在转录控制下”是指与多核苷酸有效连接并处于正确位置和方向的启动子，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

术语“过度表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示肿瘤抗原在来自疾病区域的细胞中的异常表达水平，所述疾病区域例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤到来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。

组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)，静脉内(iv)，肌内(im)，胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且指任何动物，例如哺乳动物，例如人类或服从本文描述的方法的任何活生物体。在实施例中，患者、受试者或个体是人或哺乳动物。在实施例中，术语“受试者”旨在包括可在其中引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的例子包括人和动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠，以及它们的转基因物种

需要治疗或需要治疗的受试者包括患有需要治疗的疾病、病症或病症的受试者。有此需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病症或病症的受试者。因此，受试者也可能需要预防疾病状况或病症。在实施例中，疾病是癌症。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA，RNA，cRNA，rRNA，cDNA或DNA。该术语通常是指至少10个碱基长度的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或者脱氧核苷酸，或者是任一种核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加，缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变，添加，缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％以及所有整数百分比之间，例如90％，95％或98％)序列同一性的多核苷酸在此描述。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直向同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在实施例中，多肽可包括酶促多肽或“酶”，其通常催化(即，增加速率)各种化学反应。

术语“多肽变体”是指通过添加，缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在实施方案中，多肽变体通过一个或多个取代而与参考多肽区别开，所述取代可以是保守的或非保守的。在实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，某些氨基酸可以改变为具有大致相似性质的其他氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸已添加或缺失或被不同氨基酸残基取代的多肽。

术语“启动子”是指由启动多核苷酸序列的特定转录所需的细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。术语“表达控制(调节)序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，多腺苷酸化信号和增强子。

“NFAT启动子”是指连接到由T细胞表达的任何基因的最小启动子的一个或多个NFAT结合位点或基序。在实施方案中，由T细胞表达的基因的最小启动子是最小人IL-12启动子。活化T细胞核因子(NFAT)是转录因子。NFAT转录因子的例子包括NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4和NFAT5。这些转录因子结合NFAT启动子中的NFAT结合位点或基序。NFAT启动子(或其功能部分或功能变体)可以包含任意数量的结合基序，例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或最多十二个装订图案。在实施例中，NFAT启动子包含六个NFAT结合基序。

NFAT启动子(或其功能部分或功能变体)与编码IL-12(或其功能部分或功能变体)的核苷酸序列可操作地相关。“可操作地关联”是指当NFAT蛋白结合NFAT启动子序列(或其功能部分或功能变体)时，编码IL-12(或其功能部分或功能变体)的核苷酸序列被转录成IL-12mRNA).不受特定理论的束缚，据信NFAT受钙信号通路调节。特别地，据信TCR刺激(通过例如抗原)和/或细胞钙信号通路的刺激(通过例如PMA/离子霉素)增加细胞内钙浓度并激活钙通道。据信，NFAT蛋白然后被钙调蛋白去磷酸化并易位至细胞核，在细胞核中它结合NFAT启动子序列(或其功能部分或功能变体)并激活下游基因表达。通过提供与编码IL-12(或其功能部分或功能变体)的核苷酸序列可操作地相关的NFAT启动子(或其功能部分或功能变体)，本文描述的核酸有利地使得仅当包含核酸的宿主细胞被例如PMA/离子霉素和/或抗原刺激时表达IL-12(或其功能部分或功能变体)成为可能。更多信息可以在美国专利号：8,556,882中找到，该专利通过引用并入。

术语“结合”，“结合”或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的第二分子但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体，蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于存在。特定结构(例如，抗原决定簇或表位)对化学物质的影响；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记A的量。

“结合蛋白”是能够与另一个分子非共价结合的蛋白质。结合蛋白可以结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)，RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白质的情况下，它可以与自身结合(形成同型二聚体，同源三聚体等)和/或其可以结合不同蛋白质或蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合，RNA结合和蛋白结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白质或更大蛋白质内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是在其结构通过配位锌离子稳定结构域。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

锌指结合域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如通过工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指蛋白的识别螺旋区域。此外，锌指结合结构域可以与DNA切割结构域融合以形成靶向特定所需DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)。例如，一对ZFN(例如，ZFN-左臂和ZFN-右臂)可以被工程化以靶向并引起特定所需DNA序列(例如，TRAC基因)的修饰。

“切割”是指DNA分子的共价主链的断裂。切割可通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链裂解和双链裂解都是可能的，并且由于两个不同的单链裂解事件的结果，可能发生双链裂解。DNA切割可导致产生平末端或交错末端。在实施方案中，融合多肽用于靶向的双链DNA切割。

“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子将结合的核酸的一部分的核酸序列，条件是存在足够的结合条件。例如，序列5'GAATTC 3'是Eco RI限制性核酸内切酶的靶位点。

“融合”分子是其中两个或多个亚单位分子连接，优选共价的分子。亚基分子可以是相同的化学类型的分子，也可以是不同化学类型的分子。第一类融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP DNA结合结构域和一个或多个激活结构域之间的融合物)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白)。第二类融合分子的实例包括但不限于三链体形成核酸和多肽之间的融合，以及小沟粘合剂和核酸之间的融合。

融合蛋白在细胞中的表达可以通过将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而产生，其中多核苷酸被转录并翻译转录物以产生融合蛋白。跨剪接，多肽切割和多肽连接也可以参与蛋白质在细胞中的表达。将多核苷酸和多肽递送到细胞的方法在本公开的其他地方有描述。

基因表达的“调节”是指基因活性的变化。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因抑制。基因组编辑(例如，切割，改变，失活，随机突变)可用于调节表达。基因失活是指与不包含本文所述的ZFP的细胞相比，基因表达的任何降低。因此，基因失活可能是部分或完全的。

“目的区域”是细胞染色质的任何区域，例如期望结合外源分子的基因或基因内或附近的非编码序列。结合可以出于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。例如，目标区域可以存在于染色体，附加体，细胞器基因组(例如线粒体，叶绿体)或感染性病毒基因组中。目的区域可以在基因的编码区域内，在转录的非编码区域内，例如前导序列，尾随序列或内含子，或在非转录区域内，在编码区域的上游或下游。感兴趣的区域可以小到单个核苷酸对，或最多2,000个核苷酸对，或者任何整数对。

“统计上显著”意味着结果不可能偶然发生。统计学显著性可通过本领域已知的任何方法确定。常用的重要度量包括p值，如果零假设为真，则p值是观察事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显着性水平，则拒绝原假设。在简单的情况下，显着性水平定义为p值为0.05或更小。“减少”或“减少”或“减少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括约1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6 1.7,1.8,1.9的减少。，2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40或50次或更多次(例如100,500,1000次)(包括所有整数和小数点在1和1之间，例如1.5,1.6,1.7.1.8等，这里描述的数量或水平。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件(例如通过TCR/CD3复合物的信号转导)诱导的初级反应。刺激可以介导某些分子的表达改变，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。就主要反应而言，CD3zeta不是CAR构造的唯一合适的主要信号域。例如，早在1993年，CD3 zeta和FcRγ都被证明是CAR分子的功能性主要信号域。Eshhar等人，“通过由抗体结合域和免疫球蛋白和T细胞受体的γ或zeta亚基组成的嵌合单链特异性激活和靶向细胞毒性淋巴细胞”PNAS，1993年1月15日；90(2):720-图4表明，其中一个scFv融合到“FcRγ链或CD3复合物链”的两个CAR构建体触发了T细胞激活和靶细胞。值得注意的是，如Eshhar等人所证明的，仅包含主要信号域CD3 zeta或FcRγ的CAR构建体在没有共同存在的共刺激域的情况下具有功能。多年来，已经开发了其他基于非CD3 zeta的CAR构建体。例如，Wang等人。(“基于杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的嵌合抗原受体(CARs)在实体瘤中触发强大的细胞毒活性”，MolecularTherapy，第22卷，增刊1，2014年5月，第S57页)测试了一个CAR分子，其中scFv融合到“杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜和细胞质结构域”。Wang等人报告说，“基于KIR的CAR靶向间皮素(SS 1-KIR)触发抗原-与基于CD3～的CAR相当的特异性细胞毒性活性和细胞因子产生。”来自同一组的第二篇出版物，Wang等人(“Generation of Potent T-cellImmunotherapy for Cancer Using DAP12-Based,Multichain,ChimericImmunoreceptors”Cancer Immunol Res.2015Jul；3(7):815-26)显示了一个CAR分子，其中“用于抗原识别的单链可变片段融合到KIR2DS2的跨膜和细胞质结构域，KIR2DS2是一种刺激性杀伤免疫球蛋白-样受体(KIR)”在体外和体内均发挥作用“将DAP12引入到人类T细胞中，DAP12是一种基于免疫酪氨酸的含有激活基序的衔接子。

术语“刺激分子”是指T细胞上的分子，其特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体。例如，衍生自刺激分子的功能信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的zeta链。刺激分子包括负责信号转导的结构域。

术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC，树突细胞，B细胞等)上时可以与同源结合配偶体特异性结合的配体(在本文中称为作为“刺激分子”)在细胞(例如T细胞)上的表达，从而介导T细胞的主要应答，包括激活，启动免疫应答，增殖和类似过程。刺激性配体在本领域中是公知的，并且尤其包括装载有肽，抗CD3抗体，超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

术语“治疗剂”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制，缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态症状而获得。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员，兽医，医生或另一临床医生正在寻求的组织，系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种症状或症状的发展或在一定程度上减轻所述病症或疾病的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物，疾病及其严重程度和年龄，体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包括主要受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。细胞可以是受试者体内的体外细胞或体内细胞。许多载体在本领域是已知的，包括线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些例子包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体是通过多重减弱HIV毒力基因产生的，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使载体在生物学上是安全的。

在实施方案中，编码抗原结合分子和/或治疗剂的多核苷酸可用于实施本文所述的技术。该方法或用途包括：提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，该载体基因组包含多核苷酸，其中多核苷酸可操作地连接至赋予多核苷酸转录的表达控制元件；向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达。在实施例中，AAV制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。有关病毒颗粒给药和制备的更多信息，请参见美国专利号：9840719和Milani等人，Sci.翻译。医学。11,eaav7325(2019)2019年5月22日，通过引用将其并入本文。在实施方案中，多核苷酸可以整合到修饰细胞的基因组中并且修饰细胞的后代也将表达多核苷酸，从而产生稳定转染的修饰细胞。在实施例中，经修饰的细胞表达编码CAR的多核苷酸，但多核苷酸不整合到经修饰的细胞的基因组中，使得经修饰的细胞在有限的时间段(例如，几天)内表达瞬时转染的多核苷酸，之后多核苷酸因细胞分裂或其他因素而丢失。例如，多核苷酸存在于重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中的修饰细胞中，和/或多核苷酸是mRNA，其未整合到修饰细胞的基因组中。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

受试者中的T细胞反应是指与辅助、杀伤、调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞反应可能包括在免疫过程中协助其他白细胞以及识别和破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞等活动。受试者中的T细胞反应可以通过各种指标来测量，例如T细胞杀死的病毒感染细胞和/或肿瘤细胞的数量，T细胞释放的细胞因子的量，例如，在与病毒共培养时受感染的细胞和/或肿瘤细胞、受试者中T细胞的增殖水平、T细胞的表型变化(例如，记忆T细胞的变化)，以及受试者中T细胞的寿命或寿命。

在实施方案中，可以通过将CAR T细胞与抗原阳性细胞共培养来测量CAR T细胞的杀伤效力来进行体外杀伤测定。通过显示与CAR T细胞共培养的相应抗原阳性细胞数量减少和IFN-γ等细胞因子释放增加，可认为CAR T细胞对相应抗原阳性细胞具有杀伤作用、TNF-α等，与不表达相应抗原的对照细胞相比。此外，可以测试CAR T细胞的体内抗肿瘤活性。例如，可以使用本文所述的抗原在免疫缺陷小鼠中建立异种移植模型。在过去的二十年中，将人类癌细胞或肿瘤活组织检查异种移植到免疫缺陷啮齿动物(异种移植模型)中，构成了开发新型药物的主要临床前筛选癌症治疗(Song等人，Cancer Res.PMC 2014年8月21日，和Morton等人，Nature Protocols,2,-247-250(2007))。为了评估CAR T细胞在体内的抗肿瘤活性，对携带肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠评估了CAR T细胞的抗肿瘤活性，例如，小鼠肿瘤和/或小鼠血液细胞因子(如IFN-γ)的减少、TNF-α等。

术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”是指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，细胞质结构域)的重组多肽构建体。在实施例中，CAR多肽中的结构域在同一多肽链上(例如，包含嵌合融合蛋白)。在实施例中，CAR多肽的结构域不在同一分子上，例如彼此不连续，或在不同的多肽链上。

在实施方案中，细胞内信号结构域可以包括源自本文所述的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号结构域。在实施例中，细胞内信号传导结构域包括源自初级信号传导结构域(例如，CD3-zeta的初级信号传导结构域)的功能性信号传导结构域。在实施方案中，细胞内信号结构域还包括一个或多个源自至少一种共刺激分子的功能性信号结构域。共刺激信号区是指CAR的一部分，包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子可包括用于诱导淋巴细胞有效反应(响应抗原)的细胞表面分子。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指起到将跨膜结构域连接到多肽链中的细胞外结构域和/或细胞质结构域的功能的任何寡核苷酸或多肽。间隔结构域可包括多达300个氨基酸、10至100个氨基酸或25至50个氨基酸。

CAR的细胞外结构域可以包括靶向特定肿瘤标志物(例如，肿瘤抗原)。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，可引发免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。肿瘤抗原是本领域熟知的并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺素、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。例如，当CAR结合的抗原为CD19时，其CAR称为CD19 CAR(19CAR、CD19CAR、CD19 CAR或CD19-CAR)，是一种包含抗原结合域的CAR分子，该抗原结合域结合CD19。

在实施方案中，细胞外配体结合结构域包含scFv，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段(Bird等人，Science 242:423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)₃(SEQ ID：24)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。其他序列的接头已被设计和使用(Bird等人，1988，同上)。通常，接头可以是包含约20个或更少氨基酸残基的短而灵活的多肽。连接子可以依次被修改以获得额外的功能，例如药物的附着或与固体支持物的附着。单链变体可以通过重组或合成方式产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组生产，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞，可以是真核细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者是原核细胞，例如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操作例如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

在实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D ligands、B7-H6、IL-13receptorα2、IL-11receptorα、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8或病毒相关抗原由肿瘤表达。在实施方案中，CAR的结合元件包括任何抗原结合部分，当与其同源抗原结合时，其影响肿瘤细胞，使得肿瘤细胞不能生长、尺寸减小或死亡。

CAR可以是双特异性CAR。例如，两个抗原结合结构域位于同一CAR(双特异性CAR或串联CAR(tanCAR))、不同CAR分子或CAR和T细胞受体(TCR)上。单个CAR可以包括两个不同的抗原结合结构域，或者两个不同的抗原结合结构域各自位于单独的CAR上。CAR可以具有多于两个的抗原结合结构域，例如，多特异性CAR。多特异性CAR的抗原结合域可以在相同的CAR上或在不同的CAR上，例如每个CAR上的一个抗原结合域。

在实施方案中，CAR的胞内结构域包含共刺激信号传导区域，该共刺激信号传导区域包含选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1的共刺激分子的胞内结构域、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及其任意组合。

在实施方案中，胞内结构域包含CD3 zeta信号结构域。实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的载体。实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞。

本文所述的细胞，包括CAR细胞和修饰细胞，可源自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞或非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。细胞也可以是树突细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。在实施方案中，细胞可来源于由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在对本文所述的细胞进行扩增和遗传修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。T细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤.在实施方案中，可以使用本领域技术人员可用和已知的任何数量的T细胞系。在实施方案中，细胞可来源于健康供体、诊断为癌症的患者或诊断为感染的患者。在实施方案中，细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

细胞群体是指两个或多个细胞组成的组。种群的细胞可以是相同的，从而种群是同质的细胞种群。群体的细胞可以是不同的，以使得该群体是细胞的混合群体或异质群体。例如，混合的细胞群可以包括包含第一CAR的修饰细胞和包含第二CAR的细胞，其中第一CAR和第二CAR结合不同的抗原。

术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化成其他种类细胞能力的任何类型的细胞。例如，一个干细胞要么产生两个子代干细胞(如体外培养的胚胎干细胞)，要么产生一个干细胞和一个经历分化的细胞(如造血干细胞，产生血细胞)。不同类别的干细胞可以根据它们的来源和/或它们分化成其他类型细胞的能力的程度来区分。干细胞可包括胚胎干(ES)细胞(即多能干细胞)、成体干细胞、诱导多能干细胞和任何其他类型的干细胞。

多能胚胎干细胞可以在囊胚的内细胞团中找到，并具有很高的先天分化能力。例如，多能胚胎干细胞有可能在体内形成任何类型的细胞。当在体外长时间生长时，ES细胞保持多能性，而子代细胞保留了多向分化的潜力。

体干细胞可以包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成体干细胞(存在于各种组织中，例如骨髓)。这些细胞被认为具有低于多能胚胎干细胞的分化能力——胎儿干细胞的能力高于成体干细胞；它们显然只分化成数量有限的不同类型的细胞，并被描述为多能细胞。“组织特异性”干细胞通常只产生一种类型的细胞。例如，胚胎干细胞可以分化成血液干细胞(例如，造血干细胞(HSCs))，其可以进一步分化成各种血细胞(例如，红细胞、血小板、白细胞等)。

诱导的多能干细胞(iPS细胞或iPSC)可以包括通过诱导特定基因的表达从非多能细胞(例如，成体细胞)人工衍生的一类多能干细胞。诱导多能干细胞在许多方面类似于天然多能干细胞，例如胚胎干细胞(ES)，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、可行的嵌合体形成以及效力和可区分性。诱导的多能细胞可以从成人的胃、肝、皮肤细胞和血细胞中分离出来。

在实施方案中，CAR细胞、修饰细胞或细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞、修饰细胞或细胞是T细胞。

T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的一种白细胞。有多种类型的T细胞，包括T辅助(TH)细胞、细胞毒性T(TC)细胞(T杀伤细胞、杀伤T细胞)、自然杀伤T(NKT)细胞、记忆T(Tm)细胞、调节性T(Treg))细胞和gamma delta T(γδT)细胞。

T辅助(TH)细胞协助其他淋巴细胞，例如，激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞以及B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞。这些T辅助细胞在其表面表达CD4糖蛋白，也称为CD4+T细胞。一旦被激活，这些T细胞就会迅速分裂并分泌细胞因子。

细胞毒性T(TC)细胞会破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。它们在其表面表达CD8蛋白。细胞毒性T细胞释放细胞因子。

自然杀伤T(NKT)细胞不同于自然杀伤细胞。NKT细胞识别由CD1d呈递的糖脂抗原。一旦被激活，NKT细胞就会产生细胞因子并释放细胞杀伤分子。

记忆T(Tm)细胞寿命长，并且在再次暴露于其同源抗原后可以扩展为大量效应T细胞。Tm细胞为免疫系统提供针对先前遇到的病原体的记忆。Tm细胞有多种亚型，包括中央记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、组织驻留记忆T(TRM)细胞和虚拟记忆T细胞。Tm细胞要么是CD4+要么是CD8+，通常是CD45RO。

调节性T(Treg)细胞在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺负选择过程的自身反应性T细胞。Treg细胞亚群包括胸腺Treg和外周衍生的Treg。Treg的两个子集都需要转录因子FOXP3的表达。

Gamma delta T(γδT)细胞是T细胞的一个子集，在细胞表面具有γδT细胞受体(TCR)，因为大多数T细胞表达αβTCR链。γδT细胞在人和小鼠中不太常见，主要存在于肠道黏膜、皮肤、肺和子宫中。它们参与免疫反应的启动和传播。

在实施方案中，抗原结合分子是T细胞受体(TCR)。在实施例中，TCR是修饰的TCR。在实施方案中，TCR源自患者体内自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。在实施例中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链。

在实施方案中，可以分离表达对靶抗原具有高亲和力的TCR的T细胞克隆。在实施方案中，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)或外周血单核细胞(PBMCs)可以在抗原呈递细胞(APCs)存在的情况下培养，抗原呈递细胞(APCs)用代表表位的肽脉冲，已知当呈递于定义的HLA等位基因的上下文。然后可以根据MHC-肽四聚体染色和/或识别和裂解用低滴定浓度的同源肽抗原脉冲的靶细胞的能力来选择高亲和力克隆。选择克隆后，通过分子克隆鉴定和分离TCRα和TCRβ链或TCRγ和TCRδ链。例如，对于TCRα和TCRβ链，然后使用TCRα和TCRβ基因序列生成表达构建体，理想地促进人T细胞中两条TCR链的稳定、高水平表达。然后可以生成转导载体(例如，γ逆转录病毒或慢病毒)并测试功能(抗原特异性和功能亲和力)，并用于生产临床批次的载体。然后将最终产品的等分试样用于转导目标T细胞群(通常从患者PBMC中纯化)，在输注到受试者体内之前将其扩增。

在实施方案中，APC包括树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞和B细胞或T细胞。

在实施例中，CAR的结合元件可以包括任何抗原结合部分，当与其同源抗原结合时，其影响肿瘤细胞，例如，它杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长或促进肿瘤的死亡细胞。

可以使用本领域已知的重组方法获得编码所需分子的核酸序列，例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含相同基因的载体中获得基因，或通过分离使用标准技术直接从含有相同细胞和组织的细胞和组织中提取。或者，感兴趣的核酸可以合成产生，而不是克隆。

本公开的实施方案还涉及其中插入了本文描述的核酸的载体。载体可以衍生自逆转录病毒，如慢病毒，它们是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定整合并在子细胞中繁殖。慢病毒载体比源自致癌逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有更多优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。

病毒可用于在体外和体内(在受试者中)将核酸递送到细胞中。可用于将核酸递送到细胞中的病毒的例子包括逆转录病毒，腺病毒，单纯疱疹病毒，牛痘病毒和腺伴随病毒。

还存在用于将核酸递送到细胞中的非病毒方法，例如电穿孔，基因枪，声穿孔，磁转染，以及使用寡核苷酸，脂复合物，树状聚合物和无机纳米颗粒。

编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至一个或多个启动子并将构建体整合到表达载体中来实现。载体可以适合复制和整合到真核生物中。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。

与编码CARs的合成核酸的表达和基因转移到哺乳动物细胞中有关的其他信息在美国专利US8,906,682，5,500,000中提供。通过引用整体并入。

本公开的药物组合物可以以适合待治疗(或预防)的疾病的方式施用。给药的量和频率将由诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。

当指明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”、“治疗量”或“有效量”时，本公开的组合物的精确量至可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定施用的剂量。可以说，包含本文所述T细胞的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可由本领域技术人员通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗而容易地确定。在实施方案中，将活化的T细胞施用于受试者，随后重新抽血(或进行单采术)。T细胞被收集、扩增并重新注入受试者体内。这个过程可以每隔几周进行多次。在实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc的血液抽取中被激活。在实施例中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中激活。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案，可以选择某些T细胞群。

本文所述的药物组合物的给药可以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的药物组合物可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、静脉内(iv)或腹膜内施用于患者。在实施方案中，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在实施例中，本公开的T细胞组合物通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在本公开的实施方案中，使用本文描述的方法或本领域已知的其中将T细胞扩增至治疗水平的其他方法激活和扩增的细胞与(例如，之前、同时或之后)一起施用于患者任何数量的相关治疗方式，包括但不限于抗病毒治疗、西多福韦和白细胞介素2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或MS患者的那他珠单抗治疗或牛皮癣患者的依法珠单抗治疗或其他治疗等药物治疗对于PML患者。在进一步的实施方案中，本公开的T细胞可以与化疗、放疗、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达里滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号转导(雷帕霉素)很重要的p70S6激酶。(Liu等人，Cell 66:807-815,1991；Henderson等人，Immun73:316-321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5:763-773,1993；Isoniemi(同上)).在实施方案中，本公开的细胞组合物与(例如，之前、同时或之后)骨髓移植、使用诸如氟达拉滨的化疗剂的T细胞消融疗法、外部束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或OKT3或CAMPATH等抗体。在实施方案中，本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法之后施用，例如与CD20反应的药剂，例如Rituxan。例如，受试者可以接受高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在实施方案中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。

待给予患者的上述治疗剂量将随着被治疗病症和治疗接受者的确切性质而变化。根据各种因素，医师可根据本领域公认的实践进行人用药剂量的缩放。

在美国专利No.5,315,418中提供了关于使用工程化或修饰的T细胞的癌症治疗方法的其他信息。美国专利US8,906,682，通过引用整体并入。

在实施方案中，本文所述的细胞群用于自体CAR T细胞疗法。在实施方案中，CAR T细胞疗法是同种异体CAR T细胞疗法、TCR T细胞疗法和NK细胞疗法。

实施方案涉及用于制备修饰的细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可以包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用编码至少一种CAR的DNA转染细胞，在选择性增强表达CAR的T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。

在实施例中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，细胞样品通过血液分离术或静脉穿刺获得。在实施方案中，细胞样品是T细胞亚群。

如本文所用，术语“基因融合”是指基因的至少一部分与另外基因的至少一部分的融合。基因融合不需要包括整个基因或基因的外显子。在某些情况下，基因融合与癌症的变化有关。基因融合产物是指基因融合产生的嵌合基因组DNA、嵌合信使RNA、截短蛋白或嵌合蛋白。基因融合产物可以通过美国专利9,938,582中描述的各种方法检测，该专利作为参考并入本文。“基因融合抗原”是指基因融合产生的截短蛋白或嵌合蛋白。在实施方案中，基因融合抗原的表位可以包括基因融合抗原的一部分或由基因融合引起的另一种抗原的免疫原性部分。在实施方案中，基因融合抗原与细胞膜相互作用，或者是细胞膜的一部分。

在实施方案中，可以使用诸如qPCR和FACS的实验方法来检测人细胞中靶分子(例如，CAR和细胞因子)的mRNA和蛋白质表达水平。此外，可以鉴定在相应肿瘤细胞中特异性表达而在正常组织细胞中表达非常低或检测不到的靶分子。

在实施例中，可以进行体外杀伤试验以及与抗原阳性细胞共培养的CAR T细胞的杀伤实验。CAR T细胞可表现出对相应抗原阳性细胞的杀伤作用，减少与CAR T细胞共培养的相应抗原阳性细胞数量，增加IFN-γ、TNF-α的释放，等与不表达相应抗原的对照细胞相比。

在实施例中，可以进行体内杀伤试验。例如，可以给小鼠移植相应抗原的肿瘤细胞，致瘤，输注CAR T细胞，小鼠肿瘤减少，小鼠血液IFN-γ、TNF-α等信号缺陷。

实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，该方法包括施用有效量的包含本文所述的CAR的T细胞。在实施方案中，CAR的胞内结构域包含共刺激信号传导区域，该共刺激信号传导区域包含选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1的共刺激分子的胞内结构域、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及其任意组合。在实施方案中，胞内结构域包含CD3zeta信号结构域。

实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸的载体。

实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞。实施方案涉及包含T细胞群的组合物，所述T细胞群包含本文所述的CAR。实施方案涉及由本文所述的分离的核酸序列编码的CAR。实施方案涉及在受试者中引发和/或增强T细胞反应或治疗受试者肿瘤的方法，该方法包括：施用有效量的包含本文所述CAR的T细胞。

在实施例中，本文所述的CAR分子包含一个或多个互补决定区(CDR)以结合感兴趣的抗原。CDR是免疫球蛋白和T细胞受体可变域的一部分，用于结合特定抗原。每个可变域有三个CDR。由于存在可变重结构域和可变轻结构域，因此有六个CDR用于结合抗原。此外，由于抗体具有两条重链和两条轻链，因此抗体总共可以具有十二个用于结合抗原的CDR。

在实施方案中，本文所述的修饰细胞包括含有至少两个不同抗原结合结构域的CAR分子。CAR分子可以是双特异性CAR分子。例如，两个抗原结合结构域可以在相同的CAR分子上、在不同的CAR分子上或在CAR分子和T细胞受体(TCR)上。单个CAR可以包括至少两个不同的抗原结合结构域，或者这两个不同的抗原结合结构域各自位于单独的CAR分子上。至少两个不同的抗原结合结构域可以在相同的CAR分子或不同的CAR分子上，但在相同的修饰细胞中。此外，至少两个不同的抗原结合结构域可以在同一修饰细胞中的CAR分子和T细胞受体上。在实施例中，双特异性CAR分子可以包括结合WBC抗原(例如，CD19)的结合结构域和结合实体瘤抗原的结合结构域。在实施例中，双特异性CAR分子可以包括结合两种不同实体瘤抗原的两个结合结构域。

在实施方案中，至少两个不同的抗原结合结构域在不同的CAR分子上，所述CAR分子由不同的修饰细胞表达。此外，一种或多种不同的抗原结合结构域位于由不同修饰细胞表达的CAR分子和T细胞受体上。

虽然CAR T细胞疗法对血液肿瘤具有强大的抗肿瘤活性，但单独使用CAR T疗法可能不足以克服肿瘤微环境、抑制肿瘤生长并最终治疗癌症患者，至少对于某些实体瘤类型而言。当免疫细胞被修饰以在患者体内表达治疗剂时，诸如细胞因子的治疗剂可以增强细胞疗法。然而，必须调节治疗剂的表达以避免治疗剂引起的潜在毒性。

本公开提供了使用表达一种或多种具有工程安全性的治疗剂的修饰细胞来治疗癌症患者的组合物和方法。在许多情况下，可能需要多重安全控制。例如，NFAT驱动的细胞因子如IL12已被用于安全地驱动IL12由T细胞表达和分泌。在诸如的情况下，实体瘤CAR T细胞可以在不接触其抗原的情况下被激活。在另一种情况下，正常组织可以表达CAR T细胞结合的抗原。在这些情况下，活化的T细胞可以表达和释放IL12，直到它们耗尽，从而增加IL12引起毒性的风险。拥有第二个安全开关可以避免这种风险。在实施例中，当T细胞进入肿瘤微环境时，额外设计的安全控制开关可以增强T细胞的功能(例如，表达IL12)。

本公开提供了使用表达一种或多种治疗剂的修饰细胞治疗癌症患者的组合物和方法，所述治疗剂被设计有一个或多个安全控制开关。在许多情况下，可能需要多个安全控制开关。例如，HRE驱动的CAR已被用于安全地控制T或NK细胞对CAR的表达。

肿瘤微环境(TME)包括肿瘤细胞、脉管系统、细胞外基质(ECM)、基质和免疫细胞。ECM包括许多分子(ECM分子)，传统上分为胶原蛋白、弹性蛋白和微纤维蛋白、蛋白聚糖(包括透明质酸)和非胶原糖蛋白。与TME的其他成分一样，肿瘤的ECM与正常组织或器官中的ECM存在显着差异。例如，肿瘤的细胞外基质影响肿瘤的恶性程度和生长，并帮助肿瘤细胞抵抗治疗。ECM的总结可以在H,Sainio A,Koulu M,Wight TN,Penttinen R.ECMmolecules:potential targets in pharmacytherapy找到。Pharmacol Rev.2009；61(2):198-223。doi:10.1124/pr.109.001289，其全部内容通过引用并入本文。在实施方案中，ECM分子的实例包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白VI、胶原蛋白IV和纤连蛋白。在实施方案中，靶向ECM的药剂是指降解和/或导致或增加一种或多种ECM分子降解的药剂。在实施方案中，靶向ECM的药剂包括靶向ECM合成的药剂，包括细胞因子抑制剂和细胞因子。靶向ECM合成的药物的实例包括针对TGF-β1的抗体、针对TGF-β2的抗体、TGF-β1信号转导抑制剂和TGF-β受体I激酶抑制剂，以及针对CTGF、重组TGF-β3和重组白细胞介素的抗体-10。在实施例中，靶向ECM的试剂包括靶向ECM降解的试剂。靶向ECM降解的药物的例子包括MMP抑制剂、胶原酶、MMP-14抑制剂、广谱MMP抑制剂、选择性组织蛋白酶K抑制剂、乙酰肝素酶活性抑制剂和/或胶原酶刺激剂。在实施例中，以ECM为目标的代理包括以ECM的信号为目标的代理。靶向ECM信号转导的药剂的实例包括针对αv/β3整联蛋白的抗体、针对α4/β7整联蛋白的抗体和/或针对α5/β1整联蛋白的抗体。

本公开的实施方案涉及增强淋巴细胞治疗癌症患者的能力的组合物和方法。实施方案涉及包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸、编码ODD结构域的核酸和编码一个或多个HRE的序列的核酸的多核苷酸。实施方案涉及包含多核苷酸的载体。实施方案涉及包含该载体的细胞。实施方案涉及包含细胞群的组合物，并且该细胞是淋巴细胞。实施方案涉及抑制患有某种形式癌症的受试者的肿瘤细胞的淋巴细胞用于一种方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物。实施方案涉及一种用于治疗患有某种形式的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物。

肿瘤微环境(缺氧肿瘤微环境)中的缺氧或低氧浓度具有广泛的影响，从改变血管生成和淋巴管生成到肿瘤代谢、生长和不同癌症类型的治疗耐药性。实施方案涉及在低氧条件下促进维持T细胞群的方法，该方法包括：将包含编码ODD结构域的核酸和编码一个或多个HRE序列的核酸的多核苷酸引入T细胞群；并且允许T细胞群暴露于缺氧条件，其中T细胞群的维持高于没有编码ODD结构域的核酸和编码该一个或多个HRE的多个序列的核酸的T细胞群的维持。

在实施方案中，促进在低氧条件下维持T细胞群包括维持T细胞群，例如维持T细胞总数，以便有足够数量的T细胞有效地发挥杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞功能的作用。肿瘤细胞的生长。

在实施方案中，ODD结构域包含人HIF-1α的第532至585、548至603或557至574位残基。

在实施例中，ODD结构域包含SEQ ID NO:17、19或27。

在实施例中，一个或多个HRE序列包含九个重复的HRE序列。

在实施例中，CAR包含SEQ ID NO：6并结合成纤维细胞活化蛋白-α(FAP)。在实施例中，CAR包含SEQ ID NO：25并结合GCC。在实施例中，CAR包含SEQ ID NO：21并结合CLDN18.2。在实施例中，CAR包含SEQ ID NO：23并结合GPC3。

在实施例中，CAR结合tMUC 1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

在实施例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。在实施方案中，抗原结合结构域结合GCC、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRS S2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或IGLL1。在实施方案中，细胞内信号传导结构域包含信号传导结构域，或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中信号传导结构域和共刺激信号传导结构域包含蛋白质的功能性信号传导结构域，所述蛋白质包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a结合、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(S LAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46或NKG2D。

在实施方案中，T细胞群被工程化以表达和分泌治疗剂例如细胞因子。在实施例中，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ或其组合。在实施方案中，治疗剂是或包含IL-15或IL-12或其组合。在实施方案中，治疗剂是或包含重组或天然的或天然存在的细胞因子。在实施方案中，T细胞群来源于健康供体或患有癌症的受试者。在实施方案中，T细胞群具有降低的内源TRAC基因表达。在实施方案中，T细胞群包括包含结合实体瘤抗原的第一CAR的第一T细胞群和包含结合白细胞抗原的第二CAR的第二T细胞群。在实施方案中，白细胞抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。实施方案涉及包含NFAT启动子、编码治疗剂的核苷酸序列和编码缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)的VHL相互作用结构域(VHLD)的核苷酸序列的多核苷酸。实施方案涉及包含对应于Hif-1α、NFAT、FOXP3或NFkB的启动子、编码治疗剂的核苷酸序列和编码氧敏感多肽结构域的核苷酸序列的多核苷酸。在实施方案中，治疗剂包含IL-12、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-23、GCSF和GM-CSF中的至少一种。

实施方案涉及包含HRE核苷酸序列、编码治疗剂的核苷酸序列和编码HIF-1α的VHLD的核苷酸序列的多核苷酸。HRE序列被缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)识别，HIF-1α是在缺氧条件下募集的主要转录因子。HRE的示例性序列在本文中提供，例如在表2中(SEQ ID NO：1和11)。

实施方案涉及包含有效量的无载体核酸的试剂盒，所述无载体核酸包含本文所述的任何实施方案的多核苷酸，以提供对在受试者细胞表面上表达的肿瘤抗原具有特异性的免疫细胞群。

实施方案涉及使用本文所述的多核苷酸的方法，该方法包括提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，该载体基因组包含该多核苷酸和编码抗原结合分子的多核苷酸，该与赋予多核苷酸转录的表达控制元件可操作地连接的多核苷酸；向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达，其中一种或多种分子在癌细胞中过表达，与免疫细胞的募集相关，和/或与自身免疫相关。在实施例中，AAV制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。

实施方案涉及包含本文所述的多核苷酸的修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞包含抗原结合分子。抗原结合分子为CAR，包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。

在实施例中，氧敏感性多肽结构域包含HIF-1α、HIF-3α，或包含与HIF VHL相互作用结构域(SEQ ID NO：10)，HIF氨基酸344-417，或HIF氨基酸380-603。在实施方案中，氧敏感性多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。

有关HIF-1αODD域的更多信息，请参阅Harada等人。(Cancer Research,2002,62,2013-2018)和Kosti等人。(Cell Reports Medicine,April 20,2021,2,100227)，其全部内容通过引用并入本文。

在实施例中，治疗剂包含或是细胞因子。在实施方案中，治疗剂包含或为IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、IFN-y、MIP-ln、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM-CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L、铁蛋白或其任何组合。在实施方案中，细胞因子包括促炎细胞因子，例如IFN-γ、IL-15、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF、MIP-1α或任何它们的组合。在实施例中，治疗剂包含或为IL-12、IL-6、IL-7、IL-15、IL-23、GCSF、GM-CSF或其任何组合。

在实施方案中，修饰的细胞包含抗原结合分子。抗原结合分子是修饰的TCR。在实施方案中，TCR源自患者体内自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。在实施例中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合。

在实施方案中，细胞是免疫细胞(例如，免疫效应细胞的群体)。在实施方案中，免疫细胞是T细胞或NK细胞。在实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在实施方案中，T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞或其组合。在实施方案中，细胞是人细胞。

在实施方案中，修饰的细胞包含编码结合分子和抑制性免疫检查点分子或其受体的显性负型的核酸序列。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD-1)，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，B和T淋巴细胞减毒剂(BTLA)，T细胞免疫球蛋白mucin-3(TIM-3)，淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)，具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)，白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)，自然杀伤细胞受体2B4(在实施方案中，抑制性免疫检查点分子是修饰的PD-1。在实施方案中，修饰的PD-1缺乏用于PD-1信号转导的功能性PD-1胞内结构域，干扰人细胞的人T细胞的PD-1与某些细胞的PD-L1之间的途径，包括或为PD-1细胞外结构域或PD-1跨膜结构域或其组合，或与野生型PD-1细胞内结构域相比包含取代或缺失的修饰的PD-1细胞内结构域，或包含或“可溶性受体”是包含与特定细胞的PD-L1结合的PD-1细胞外结构域的可溶性受体。

实施方案涉及包含修饰细胞群和另外修饰细胞群的药物组合物，其中修饰细胞结合第一抗原，并且另外修饰细胞结合不同于第一抗原的第二抗原。在实施方案中，第一抗原是白细胞抗原，而第二抗原是实体瘤抗原。在实施方案中，第二抗原是白细胞抗原，而第一抗原是实体瘤抗原。在实施方案中，白细胞抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。

在实施方案中，第一抗原是CD205、CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，第二抗原是实体瘤抗原。实体瘤抗原的实例包括tMUC 1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

在实施方案中，实体瘤抗原包含肿瘤相关的MUC1，ACPP，TSHR，GUCY2C，UPK2，CLDN18.2，PSMA，DPEP3，CXCR5，B7-H3，MUC16，SIGLEC-15，CLDN6，Muc17，PRLR和FZD10。

实施方案涉及引发或增强T细胞反应、治疗有此需要的受试者或增强其癌症治疗的方法，该方法包括施用有效量的本文药物组合物。在实施方案中，实体瘤抗原是ACPP，并且癌症是前列腺。

在实施方案中，结合分子和/或治疗剂与自杀基因相关。在实施例中，多核苷酸包含自杀基因。在实施例中，自杀基因是RQR8。“自杀基因”是编码产物的核酸，其中该产物自身或在其他化合物存在的情况下导致细胞死亡。这种治疗性核酸(自杀基因)的代表性实例编码单纯疱疹病毒(HSV-TK)或RQR8的胸苷激酶。其他例子有水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，后者可将5-氟胞嘧啶转化为剧毒化合物5-氟尿嘧啶。实施方案包括用于T细胞的136个氨基酸标记/自杀基因。翻译的蛋白质在逆转录病毒转导后在细胞表面稳定表达。它以与全长CD34相同的亲和力结合QBEND10。

此外，该构建体结合Rituximab，双表位设计产生高效的补体介导杀伤。由于构建体体积小，它可以很容易地与典型的T细胞工程转基因(如T细胞受体或CAR等)共表达，从而在面对不可接受的细胞时实现轻松检测、细胞选择和细胞删除现成的临床级试剂/药物的毒性。关于RQR8和自杀基因的更多信息可以在EPO专利公开号EP2836511中找到，该专利通过引用并入本文。

据报道，使用IL-12治疗癌症的临床试验导致反应不足和高毒性。因此，它们被停止了(例如，Motzer等人在干扰素和细胞因子研究杂志21:257–263,2001中)。本公开提供了一种使用IL-12治疗癌症如淋巴瘤的安全有效的疗法。例如，治疗患有淋巴瘤的受试者、增强其治疗、增强受试者的抗肿瘤活性或增强受试者的T细胞反应的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的本文修饰的细胞，其中修饰的细胞包含含有NFAT启动子的多核苷酸、编码治疗剂的核苷酸序列和/或编码HIF-1α的VHL相互作用结构域的核苷酸序列，其中治疗剂包含IL-12中的至少一种，经修饰的细胞包含结合CD19、CD20和/或CD22的CAR或TCR。关于CAR T细胞的更多信息可以在美国申请号16/439,901中找到，该申请通过引用并入本文。

实施方案涉及包含混合细胞群的组合物。混合细胞包含包含结合第一抗原的第一CAR的第一细胞群，并且包含结合第二抗原的第二CAR的第二细胞群，第一抗原包含CD205，并且第二抗原包含实体瘤抗原。

实施方案涉及增强受试者中细胞扩增的方法，该方法包括：向患有表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的组合物，其中该组合物包含第一细胞群，所述第一细胞群包含第一CAR结合第一抗原，第二细胞群包含结合第二抗原的第二CAR，第一抗原包含CD205，第二抗原包含实体瘤抗原；允许第一和第二细胞群扩增，其中与施用包含第二细胞群但不含第一细胞群的组合物的受试者相比，受试者中第二细胞群的扩增得到增强。

CD205，也称为DEC-205，或淋巴细胞抗原75(LY75)，是由LY75基因编码的蛋白质。CD205是一种I型C型凝集素受体，通常在各种APC和一些白细胞亚群上表达，其特征在于含有细胞质结构域的蛋白质基序对内吞作用和内化作用至关重要。CD205是一种表面多凝集素受体，具有包含细胞质结构域的蛋白质基序，对于连接后的内吞作用和内化作用至关重要。此外，已知CD205可作为凋亡和坏死细胞的表面受体，导致抗原摄取和加工。CD205在造血细胞中表达，主要由抗原呈递细胞(APC)表达，但也在其他组织中表达，包括实体瘤。CD205呈现出快速的内化率和在肿瘤组织与健康组织之间的差异表达方面的有利特征，是技术的良好目标。有关CD205及其在治疗癌症中的用途的更多信息，请参见Gaudio等人。在doi.org/10.3324/haematol.2019.227215。

在实施方案中，第一细胞群包括T细胞、NK细胞或树突细胞，并且第二细胞群包括T细胞、NK细胞或树突细胞。

在实施方案中，实体肿瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，B7-H3，MAGE A4或EGFR。

在实施例中，第一和第二CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3zeta结构域。在实施例中，共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、结合CD83的配体或其组合。在实施例中，第一CAR包含结合CD19的scFv、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3zeta结构域。第二个CAR包含一个scFv结合tMUC1、一个4-1BB或CD28的细胞内结构域和一个CD3 zeta结构域。

在实施例中，第二细胞群包含编码第二CAR和PD-1的显性失活形式的慢病毒载体。在实施例中，第一细胞群包含编码第一CAR和治疗剂的慢病毒载体。在实施例中，治疗剂包含细胞因子。在实施方案中，细胞因子是IL6和/或IFN-γ。在实施方案中，细胞因子是IL6、IL12、IL-2、TNF-α或IFN-γ中的至少一种。

在实施例中，IL-2是IL-2v(IL-2变体)，包含IL2的氨基酸序列和Asp20Thr、Asn88Arg和Gln126Asp突变，可以消除IL2与Treg上CD25受体的结合，降低免疫抑制，并增强抗肿瘤活性。

在实施方案中，该方法还包括治疗患有实体瘤癌症的受试者。在实施方案中，实体瘤癌症是胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、甲状腺癌或前列腺癌。在实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1。在实施方案中，实体瘤抗原是GUCY2C。在实施方案中，实体瘤抗原是TSHR。在实施方案中，实体瘤是CLND18.2。在实施方案中，实体瘤抗原是ACPP。在实施方案中，实体瘤抗原是MAGE A4。在实施方案中，第一细胞群是T细胞。在实施方案中，第一细胞群是T细胞或NK细胞。

通过参考以下示例性实施例和示例来进一步描述本公开。这些示例性实施例和示例仅出于说明的目的而提供并且不旨在限制，除非另有说明。因此，本公开不应以任何方式被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

示例性实施例

以下是示例性实施例：

1.一种多核苷酸，包含编码治疗分子的核酸和编码缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的VHL相互作用结构域的核酸。

2.实施例1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸还包含一个或多个缺氧反应元件(HRE)的序列。

3.实施例2的多核苷酸，其中治疗分子包括抗原结合分子(例如，嵌合抗原受体(CAR)或TCR)。

4.实施例1-3中任一项的多核苷酸，其中VHL相互作用结构域包含氧依赖性降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)。

5.实施例4的多核苷酸，其中ODD结构域是人HIF-1α的第532至585、548至603或557至574位残基。

6.实施例4的多核苷酸，其中ODD结构域包含SEQ ID NO：19或17。

7.一种载体，其包含实施例1-6中任一项的多核苷酸。

8.包含实施例7的载体的细胞。

9.一种组合物，其包含实施例8的细胞群。

10.一种治疗或使用药物的方法，该方法包括将有效量的实施例9的组合物施用于患有某种形式的癌症的受试者。

11.一种增强HIF-1α对治疗分子表达的条件调节的方法，该方法包括将多核苷酸引入细胞群，该多核苷酸包含HRE、编码治疗分子的核酸和编码一个迷你ODD结构域(miniODD)或两个、三个重复的迷你ODD结构域；并且允许细胞暴露于缺氧环境，其中细胞表达治疗分子低于包含包含HRE的多核苷酸、编码治疗分子的核酸和编码野生型ODD域核酸的细胞表达治疗分子。

12.实施例11的方法，其中迷你ODD结构域是SEQ ID NO：19或17。

13.如实施例1-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述缺氧反应元件包含HRE结构域或HRE结构域的多个重复(例如，9个)。

14.实施例1-13的多核苷酸，其中VHL相互作用结构域包含Hif-1α、Hif-3α或包含分别与Hif-1αVHL相互作用结构域，Hif-1α氨基酸344-417，或Hif-1α氨基酸380-603具有超过80％、90％或95％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。

15.实施例1-14中任一项所述的多核苷酸，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO：1、11、17和19中的至少一个。

16.一种包含有效量的无载体核酸的试剂盒，所述无载体核酸包含任何前述实施方案的多核苷酸，以提供对在受试者细胞表面上表达的肿瘤抗原具有特异性的免疫细胞群。

17.多核苷酸的方法或用途，该方法包括提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，该载体基因组包含该多核苷酸和编码抗原结合分子的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接到赋予多核苷酸转录的表达控制元件；和

向受试者施用一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达，其中一种或多种分子在癌细胞中过表达，与免疫细胞的募集有关，和/或与自身免疫有关。

18.如实施例17所述的方法，其中AAV制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。

19.一种修饰的细胞，其包含实施例1-15中任一项的多核苷酸。

20.实施例19的修饰细胞，其中修饰细胞包含编码治疗剂的多核苷酸。

21.实施例20的修饰细胞，其中治疗剂包含或为IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、IFN-y、MIP-ln、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM-CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L、铁蛋白及其任何组合。在实施方案中，细胞因子包括促炎细胞因子，例如IFN-γ、IL-15、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF、CCL19和/或MIP-lα。

22.实施例20的修饰细胞，其中治疗剂包含或为IL-12、IL-6、IL-7、IL-15、IL-23、GCSF和/或GM-CSF

23.实施方案1-22中任一项的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中治疗分子是CAR。

24.实施例23的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。

25.实施例24的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中抗原结合结构域结合肿瘤抗原选自：GCC、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-acetyl-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、生存素和端粒酶、PCTA-1/Galectin 8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。

26.实施例24的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中共刺激信号传导结构域包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2的蛋白质的功能信号域、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta特异性结合的配体、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SE MA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D。

27.实施例1-22中任一项的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中治疗分子是修饰的TCR。

28.实施例27的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中TCR来源于患者体内自发产生的肿瘤特异性T细胞。

29.实施例27的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中TCR结合肿瘤抗原。

30.实施例27的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。

31.实施例27的多核苷酸、方法或修饰细胞，其中TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合。

32.前述实施例中任一项的修饰细胞，其中所述细胞是免疫细胞(例如，免疫效应细胞群)。

33.实施例32的修饰细胞，其中免疫细胞是T细胞(γδT和/或αβT)或NK细胞。

34.实施例32的修饰细胞，其中免疫效应细胞是T细胞。

35.实施例32的修饰细胞，其中T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。

36.前述实施例中任一项的修饰细胞，其中所述细胞是人类细胞。

37.任何前述实施例的修饰细胞，其中修饰细胞包含编码结合分子和抑制性免疫检查点分子或其受体的显性失活形式的核酸序列。

38.实施例37的修饰细胞，其中抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD 160。

39.实施例37的修饰细胞，其中抑制性免疫检查点分子是修饰的PD-1。

40.实施例39的修饰细胞，其中修饰的PD-1缺乏用于PD-1信号转导的功能性PD-1细胞内结构域，干扰人细胞的人T细胞的PD-1和PD-L1之间的途径。某种细胞，包含或是PD-1胞外结构域或PD-1跨膜结构域，或其组合，或与野生型PD-1胞内结构域，或者包含或者是包含PD-1胞外结构域的可溶性受体，其与特定细胞的PD-L1结合。

41.任何前述实施例的修饰细胞，其中修饰细胞被工程化以表达和分泌治疗剂例如细胞因子。

42.实施例41的修饰细胞，其中治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。

43.实施例41的修饰细胞，其中治疗剂是或包含IL-15或IL-12，或其组合。

44.实施例41-43中任一项的修饰细胞，其中治疗剂是或包含重组的、天然的或天然存在的细胞因子。

45.实施例44的修饰细胞，其中治疗剂是或包含IL-12、IL-6或IFN-γ。

46.任何前述实施例的修饰细胞，其中修饰细胞源自健康供体或患有癌症的受试者。

47.实施例46的修饰细胞，其中修饰细胞具有降低的内源TRAC基因表达。

48.任何在前的实施例的修饰细胞，其中修饰细胞包含结合白细胞抗原的第一CAR和结合实体瘤抗原的第二CAR。

49.任何前述实施例的修饰细胞，其中修饰细胞包含结合白细胞抗原和实体瘤抗原的双特异性CAR。

50.一种药物组合物，其包含任何前述合适的实施方案的修饰细胞群，其中修饰细胞结合第一抗原，并且另外的修饰细胞结合不同于第一抗原的第二抗原。

51.实施例50的药物组合物，其中第一抗原是白细胞抗原，第二抗原是实体瘤抗原。

52.实施例50的药物组合物，其中第二抗原是白细胞抗原，并且第一抗原是实体瘤抗原。

53.实施例50-52中任一项的药物组合物，其中白细胞抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。

54.实施例50-52中任一项的药物组合物，其中白细胞抗原是CD19、CD20、CD22或BCMA。

55.实施例50-54中任一项的药物组合物，其中实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。

56.实施例50-54中任一项的药物组合物，其中实体瘤抗原包括肿瘤相关MUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2、CLDN18.2、PSMA、DPEP3、CXCR5、B7-H3、MUC16、SIGLEC-15、CLDN6、Muc17、PRLR或FZD10。

57.一种引发或增强T细胞反应、治疗有此需要的受试者或增强其癌症治疗的方法，该方法包括施用有效量的任何前述合适实施例的药物组合物。

58.一种用于治疗患有淋巴瘤的受试者、增强其治疗、增强受试者的抗肿瘤活性或增强受试者的T细胞反应的方法，该方法包括：对受试者施用有效量的任何前述合适的实施例的修饰细胞，其中修饰的细胞包含含有NFAT启动子的多核苷酸、编码治疗剂的核酸和/或编码HIF-1α的VHL相互作用结构域的核酸，其中治疗剂包含IL-12，修饰的细胞包含结合CD19、CD20和/或CD22的CAR或TCR中的至少一种。关于CAR T细胞的更多信息可以在美国申请号16/439,901中找到，该申请通过引用并入本文。

59.一种使用CAR T细胞增强癌症治疗、增强CAR T细胞在受试者中的抗肿瘤活性或增强受试者中T细胞反应的方法，该方法包括：对受试者施用有效量的任何前述适用于受试者的实施例的经修饰的细胞，其中修饰的细胞包含含有HRE启动子的多核苷酸、编码CAR的核酸和编码HIF-1α的VHL相互作用结构域的核酸，其中治疗、抗肿瘤活性和/或T细胞反应大于施用修饰细胞的受试者，其包含在缺氧肿瘤微环境中编码CAR的多核苷酸。

60.一种使用CAR T细胞增强癌症治疗、增强CAR T细胞在受试者体内的抗肿瘤活性或增强受试者体内T细胞反应的方法，该方法包括：对受试者施用任何前述合适的实施例有效量的经修饰的细胞，其中修饰的细胞包含含有HRE启动子和编码CAR的核酸的多核苷酸，其中治疗、抗肿瘤活性和/或T细胞反应大于施用修饰的受试者细胞包含在低氧肿瘤微环境中编码CAR的多核苷酸。

61.一种使用CAR T细胞增强癌症治疗、增强CAR T细胞在受试者体内的抗肿瘤活性或增强受试者体内T细胞反应的方法，该方法包括：对受试者施用有效量的任何前述适用于受试者的实施例的经修饰的细胞，其中修饰的细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码CAR的核酸和编码HIF-1α的VHL相互作用结构域的核酸，其中治疗、抗肿瘤活性和/或在低氧肿瘤微环境中，T细胞反应大于施用包含编码CAR的多核苷酸的修饰细胞的受试者。

62.根据实施例59-61中任一项所述的方法，其中修饰的细胞包含在ICT的PCT公开号WO2020106843和WO2020146743中描述的混合CAR T细胞，将其整体并入。

63.包含靶向实体瘤抗原的第一细胞群和靶向实体瘤抗原的第二细胞群的组合物，其中：

第一和第二细胞群包含结合实体瘤抗原的第一结合分子，并且被设计成使得第一结合分子在肿瘤微环境(TME)中的第一细胞群中的表达低于第一结合分子的表达TME中第二个细胞群中的分子，第一和第二细胞群包含结合实体瘤抗原的第一结合分子并且被工程化使得第一细胞群中第一结合分子的量低于第二细胞群中第一结合分子的量TME中的细胞，和/或

第一和第二细胞群包含结合实体瘤抗原的第一结合分子，TME中第一细胞群的活化小于TME中第二细胞群的活化。

64.如实施例63所述的组合物，其中第一细胞群与第二细胞群的比率包括1:1至1:104的比率，或1:1、1:10、1:100的比率,1:1000或1:104。

65.如实施例63所述的组合物，其中第一细胞群与第二细胞群的比率包括1:2至1:1000的比率，或1:2、1:3、1:4的比率、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:100或1:1000。

66.如实施例63所述的组合物，其中第一细胞群与第二细胞群的比率包括小于1:1和大于1:100的比率。

67.实施例63的组合物，其中第一细胞群与第二细胞群的比率包括小于1:1和大于1:10的比率。

68.实施例63-67中任一项的组合物，其中所述组合物还包含第三细胞群，所述第三细胞群包含靶向肿瘤相关抗原(TAA)和/或肿瘤特异性抗原(TSA)的第二结合分子或第二结合分子结合FAP或tMUC1。

69.实施例68的组合物，其中第一结合分子结合器官谱系抗原(OLA)的实体瘤抗原。

70.如实施例63-68中任一项所述的组合物，其中该组合物还包含第四细胞群，该第四细胞群包含靶向WBC抗原的第三结合分子。

71.实施例70的组合物，其中WBC抗原包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138、FCRL5、CD13或其组合。

72.实施例70的组合物，其中WBC抗原包括CD19、CD20、CD22、BCMA或其组合。

73.实施例70的组合物，其中WBC抗原包括B细胞抗原。

74.实施例63-73中任一项的组合物，其中结合分子是嵌合抗原受体(CAR)或TCR。

75.实施例74的组合物，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域。

76.实施例75的组合物，其中所述抗原结合结构域结合表1中列出的肿瘤抗原。

77.实施例75或76的组合物，其中第二细胞群包含CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含共刺激信号结构域或初级信号结构域信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导结构域包含蛋白质的功能信号传导结构域，所述蛋白质包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80特异性结合的配体(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(C D244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D或其组合。

78.实施例74的组合物，其中抗原结合分子包含修饰的TCR或TCR。

79.实施例78的组合物，其中TCR源自患者体内自发产生的肿瘤特异性T细胞，并且TCR结合肿瘤抗原。

80.实施例79的组合物，其中肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3、NY-ESO-1或其组合。

81.实施例78的组合物，其中TCR包含TCRγ和TCRδ链，或TCRα和TCRβ链，或其组合。

82.实施例1-19中任一实施方式所述的组合物，其中第一、第二和/或第三细胞群包含T细胞或NK细胞。

83.实施例1-19中任一实施例所述的组合物，其中第一、第二和/或第三细胞群包含T细胞。

84.实施例1-21中任一实施例所述的组合物，其中第一、第二和/或第三细胞群的至少一部分包含治疗剂。

85.实施例84的组合物，其中治疗剂包括IL-12、IL-6、IFN-γ或其组合。

86.实施例63-85中任一项的组合物，其中第二细胞群包含实施例1-62中任一项的多核苷酸。

87.实施例86的组合物，其中第一细胞群不包含外源HRE或ODD结构域。

88.实施例87的组合物，其中第三细胞群不包含外源HRE或ODD(但可以包含HRE)结构域。

89.实施例88的组合物，其中第四细胞群不包含外源ODD结构域。

90.实施例86的组合物，其中第一细胞群不包含含有HRE和ODD结构域的外源多核苷酸。

91.实施例90的组合物，其中第三细胞群不包含含有HRE和ODD结构域的外源多核苷酸。

92.实施例91的组合物，其中第四细胞群不包含含有ODD结构域的外源多核苷酸(但可以包含HRE)。

93.实施例63-92中任一项的组合物，其中TME是缺氧的、较低的养分储存和/或较高的酸性pH。

94.实施例93的组合物，其中第二、第三或第四种群以高于或低于野生型细胞表达的一种或多种分子的水平表达一种或多种分子，其中一种或更多分子与修饰细胞的新陈代谢有关。

95.实施例94的组合物，其中修饰的细胞包含与一种或多种分子的生物合成或转运途径相关的内源基因的破坏或外源基因的添加。

96.实施例94或95的组合物，其中所述一种或多种分子包含MCT1、MCT2、MCT3、LDHB和MPC中的至少一种，一种或多种分子的功能变体，或一种或多种分子的功能片段分子；和/或代谢包括乳酸的代谢。

97.实施例94的组合物，其中所述代谢包括改变的修饰细胞的乳酸转运。

98.实施例94的组合物，其中与相应的野生型细胞相比，修饰细胞将更少或更多的乳酸输送到修饰细胞中。

99.实施例94的组合物，其中与相应的野生型细胞相比，修饰的细胞过度表达MCT3并表达较少的MCT1和MCT2，并且将较少的乳酸输送到修饰的细胞中。

100.实施例94的组合物，其中与相应的野生型细胞相比，修饰的细胞过表达MCT1、MCT2、LDHB和MPC，表达较少的MCT3，并且将更多的乳酸转运到修饰的细胞中。

101.实施例94的组合物，其中所述一种或多种分子包含Frataxin、HBA、HBB、HBD、HBE、HBG、TOMM20和TOMM22中的至少一种，一种或多种分子的功能变体，或功能片段一个或多个分子；和/或代谢包括乳酸的代谢。

102.实施例94所述的组合物，其中所述代谢包括修饰细胞的线粒体的氧化功能得到增强。

103.实施例94的组合物，其中修饰细胞过表达Frataxin、HBA、HBB、HBD、HBE、HBG，以增强修饰细胞的线粒体储氧能力。

104.实施例94的组合物，其中修饰细胞过表达TOMM20和TOMM22以增强修饰细胞的线粒体功能。

105.实施例94的组合物，其中所述一种或多种分子包含CD98、SNAT1、SNAT2、ASCT2、一种或多种分子的功能变体或一种或多种分子的功能片段中的至少一种；和/或代谢包括氨基酸的代谢。

106.实施例94所述的组合物，其中所述代谢包括增强的修饰细胞的乳酸和/或氨基酸的代谢。

107.实施例94的组合物，其中修饰细胞过表达CD98、SNAT1、SNAT2和ASCT2以增强修饰细胞将氨基酸转运到修饰细胞中的转运能力。

表2提供了示例性序列。相关的序列、组合物和癌症的治疗方法详见PCT专利WO2016138846,WO2018126369,WO2017167217,WO2019140100,WO2020146743,WO2021216731,WO2020106843,WO2020047306,WO2022150831和美国专利US20210060069,US20210100841，其通过引用整体并入。

表2序列和相应的序列标识符

序列号	ID
		1	9XHRE(EPO)
2	IL2 promoter
		3	CD8sp DNA
4	CD8sp aa
		5	FAP scFv 1(示例)DNA
6	FAP scFv 1(Example)aa
		7	BBZ DNA
8	BBZ AA
		9	ODD domain DNA
10	ODD domain AA
		11	5XHRE(epo)
12	5XHRE(VEGF)
		13	EF-1A
14	FAP scfv 2
		15	EA
16	3X mini ODD domain DNA
		17	3X mini ODD domain AA
18	2X mini ODD domain DNA
		19	2X mini ODD domain AA
20	CLDN18.2scfv DNA
		21	CLDN18.2scfv AA
22	GPC3 scfv DNA
		23	GPC3 scfv AA
24	链接
		25	GCC scFv
26	1X mini ODD domain DNA
		27	1X mini ODD domain AA

例子

生成了编码单个CAR分子的慢病毒载体并用T细胞转染，这将在下面讨论。此外，与细胞培养和细胞毒性T淋巴细胞检测构建相关的技术可参见“Control of large,established tumor xenografts with genetically retargeted human T cellscontaining CD28 and CD137 domains”，PNAS，2009年3月3日，第1卷。106号9,3360–3365和“含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活率和增强的体内抗白血病功效”，分子疗法，2009年8月，卷。17号8,1453–1464，其全部内容通过引用并入本文。

进行体内和体外实验以测试靶向FAP的缺氧增强FAP CAR(hypo FAP CAR)T细胞的表达和功能(参见图1中的构建体：E102和E106以及FAP scFv：SEQ ID NO：6)。Hypo FAPCARs在正常条件下的表达和功能(例如细胞因子释放和杀伤能力)与常规FAP CAR相似(没有HRE和ODD结构域的调节)。然而，缺氧条件下CAR T细胞的活化明显高于常规CAR T细胞，CD4+CAR T细胞比CD8+CAR T细胞更容易缺氧。hypo FAP CAR的表达量有限，可能会降低在靶肿瘤外的细胞毒性。由于FAP在肿瘤中广泛表达，是清除肿瘤基质细胞的理想靶点，hypoFAP CAR T细胞可能更能适应缺氧的肿瘤环境。至于体内实验，建立JIMIT-1小鼠模型以过表达FAP。在第0天，小鼠被注入hypo CAR T和常规CAR T细胞。第5天，采集小鼠外周血样本。在第31天，处死小鼠以测量外周血、脾脏和肿瘤中的CAR表达和/或肿瘤大小。图2显示了各种CAR T细胞的抗肿瘤作用。如图所示，hypo CAR T细胞的抗肿瘤作用明显高于非转导T细胞。此外，hypo CAR-1T细胞(E102)显示出比常规CAR T细胞更好的抗肿瘤作用。图3分别为第5天、第11天和第17天CAR T细胞在小鼠外周中表达的流式细胞术结果。如图所示，外周血中几乎没有CAR T细胞表达。

此外，与表达常规FAP CAR的T细胞相比，表达缺氧元素和FAP CAR(hypo FAP CAR)的CAR T细胞似乎比常规FAP CAR T细胞在肿瘤内维持更长的时间。这些结果表明，FAPCARs在缺氧条件下的表达显着降低，hypo FAP CAR T细胞可用于降低中靶脱瘤细胞毒性。此外，令人惊讶的是，与传统的CAR T细胞相比，低氧CAR T细胞在低氧肿瘤微环境中具有增强的抗肿瘤作用，因为低氧元素最初是出于安全考虑而设计用于限制低氧微环境中的CAR表达。这些结果表明，增强的缺氧元素不仅使CAR T细胞更安全，而且增强了CAR T细胞在肿瘤微环境(TME)中的反应(CAR T细胞群的维持)。

还研究了靶向其他肿瘤标志物的Hypo CAR。设计并生成了两个hypo CLDN18.2CAR T细胞(即图4中的6023和6024)。CAR T细胞6004(对照，无ODD结构域)、6023(全长ODD)和6024(3X迷你ODD)中的CAR表达使用流式细胞术在常氧和缺氧条件下进行测量。CAR T细胞6023和6024的杀伤作用随着氧浓度的增加逐渐减弱，两种CAR T细胞的安全性和杀伤作用相似，而对照CAR T细胞的杀伤作用仍高于CAR T细胞6023和6024。在缺氧条件下，CAR T细胞6024在缺氧条件下比CAR T细胞6023释放更多的细胞因子，这是一个令人惊讶的发现。即使在低氧条件下，当细胞变弱时，与对照细胞CAR T 6004相比，6024CAR T细胞可以释放相似或更多数量的细胞因子，并且可以释放比具有全长ODD的CAR T细胞6023更多的细胞因子领域。图4显示了hypo CLDN18.2 CAR的结构以及当与底物细胞共培养时表达这些hypoCLDN18.2 CAR和常规CLDN18.2 CAR的T细胞的杀伤能力。图5A-5C显示当与底物细胞共培养时表达hypo CLDN18.2 CAR和常规CLDN18.2 CAR的CAR T细胞释放的细胞因子。

对于其他肿瘤标志物(GPC3和GCC)也发现了类似的结果。图6A-6C显示了hypoGPC3 CAR的结构和表达hypo GPC3 CAR和常规GPC3 CAR的CAR T细胞在与底物细胞共培养时释放的细胞因子。图7显示了hypo GCC CAR的结构以及当与底物细胞共培养时表达这些hypo GCC CAR和常规GCC CAR的T细胞的杀伤能力。最后，图8A-8D显示当与底物细胞共培养时表达低GCC CAR和常规GCC CAR的CAR T细胞的细胞因子释放。这些结果令人惊讶，因为在缺氧条件下，具有3X mini-ODD结构域的hypo CAR T细胞比具有全长ODD结构域的hypo CART细胞释放更多的细胞因子。

本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指示为通过引用并入。虽然已经根据各种实施例描述了前述内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改，替换，省略和改变。

Claims (15)

1.用于促进患有实体瘤的受试者在低氧条件下维持T细胞群的方法的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸、编码HIF-1α的VHL相互作用结构域的核酸，以及一个或多个缺氧反应元件(HRE)的序列的核酸。

2.根据权利要求1所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述HIF-1α的VHL相互作用结构域包括氧依赖性降解结构域(ODD)或其部分，所述ODD结构域包含人HIF-1α的第532至585、548至603或557至574位残基。

3.根据权利要求2所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述ODD结构域包含SEQ IDNO:17、19或27。

4.根据权利要求1-3任一所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述一个或多个缺氧反应元件(HRE)包括5个或9个。

5.根据权利要求4所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述一个或多个缺氧反应元件序列包含SEQ ID NO：1、11或12。

6.根据权利要求4所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述ODD结构域包含SEQ IDNO:17，所述一个或多个缺氧反应元件序列包含SEQ ID NO：1。

7.根据权利要求1-6任一所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，抗原结合结构域结合tMUC 1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3、EGFR、GCC、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、GD3、BCMA、Tn Ag、FLT3、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、B7H3、KIT、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、生存素和端粒酶、PCTA-1/Galectin 8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、sa rcoma易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、FCRL5，或IGLL1。

8.根据权利要求7所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述CAR包含SEQ ID NO：6并结合成纤维细胞活化蛋白-α(FAP)；

或所述CAR包含SEQ ID NO：25并结合GUCY2C(GCC)；

或所述CAR包含SEQ ID NO：21并结合CLDN18.2；

或所述CAR包含SEQ ID NO：23并结合GPC3。

9.根据权利要求7或8所述的用途的多核苷酸，其特征在于，所述CAR的细胞内信号传导结构域包含信号传导结构域，或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述信号传导结构域或共刺激信号传导结构域包含功能性信号传导结构域蛋白质，包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，一种与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha特异性结合的配体、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和/或NKG2D。

10.一种载体，其特征在于，其包含权利要求1-9中任一项的用途的多核苷酸。

11.包含权利要求10的载体的细胞。

12.包含权利要求11所述的细胞群的组合物，其特征在于，其中所述细胞是淋巴细胞，并且任选地所述淋巴细胞是T细胞。

13.根据权利要求12所述的细胞群的组合物，其特征在于，其中所述组合物用于治疗患有实体瘤的受试者的方法。

14.权利要求1-13中所述的多核苷酸、载体、细胞、组合物在制备实体瘤治疗药物中的应用。

15.一种促进患有实体瘤的受试者在低氧条件下维持T细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-9任一所述多核苷酸引入T细胞群，向受试者施用有效量的T细胞，将T细胞暴露于缺氧条件，并在缺氧条件下维持T细胞群。