CN114380904A - 检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用 - Google Patents

检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114380904A
CN114380904A CN202111464981.1A CN202111464981A CN114380904A CN 114380904 A CN114380904 A CN 114380904A CN 202111464981 A CN202111464981 A CN 202111464981A CN 114380904 A CN114380904 A CN 114380904A
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
cells
fusion protein
gly
gfp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111464981.1A
Other languages
English (en)
Inventor
赵礼军
毛文超
李静静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Hualong Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Henan Hualong Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Hualong Biotechnology Co ltd filed Critical Henan Hualong Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111464981.1A priority Critical patent/CN114380904A/zh
Publication of CN114380904A publication Critical patent/CN114380904A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及检测CAR‑T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用，属于生物医药技术领域，所述荧光融合蛋白是将CD19的部分片段与GFP进行融合，经过慢病毒转染于SupB‑1细胞中，使其再在表达WT型的CD19时，形成杂交型的CD19‑GFP蛋白，这种蛋白由于GFP的存在不能与CD81型成复合物，从而存在游离型的CD19‑GFP，用这种Sup‑B‑1细胞培养上清液与生产的CAR‑T细胞外的anti‑CD19‑scFv区进行结合，利用流式细胞仪进行488通道检测，从而能够对CAR‑T细胞CAR阳性率进行检测。与现有常用的PCR、WB、抗抗体/或荧光素酶标CD19‑流式技术，本技术无需对检测蛋白进行纯化，效率更高，成本更低。

Description

检测CAR-T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测CAR-T细胞CAR阳性表达效率的荧光融合蛋白。
背景技术
嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是一种基于体外改造T细胞，使其表面表达特异性识别肿瘤表面抗原的受体片段的癌症免疫疗法，改造后的T细胞输入患者体内，不需要抗原递呈细胞（APC）的帮助，直接靶向体内癌细胞并发挥免疫杀伤作用。对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率。
CD19是B细胞表达的一种CD分子（即白细胞分化抗原），属于Ig超家族。除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞与FDC都会表达该分子。它是参与B细胞增殖、分化、活化及抗体产生的重要膜抗原，还可促进BCR的信号转导（见图1）。CD19也是CAR-T细胞识别B细胞源肿瘤细胞的重要桥梁.
绿色萤光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。
在细胞生物学与分子生物学中，绿色萤光蛋白(GFP)基因常用做报告基因(reporter gene)。绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子)上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术，绿色萤光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色萤光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼（例如斑马鱼），植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞。
CAR-T细胞治疗技术作为一种新型的癌症治疗手段，在临床上已经得到了很好的验证，同时也取得了显著的商业运营效果，其实CAR-T的制备流程复杂，质控环节众多，尤其CAR-T表达阳性率的检测作为CAR-T疗法质量控制的重要一环，目前尚无标准的检测方案。
发明内容
针对上述问题，本发明开发一种CD19胞外结构域与荧光蛋白GFP的融合蛋白细胞上清液通过流式方法进行表达效率检测的方法。与现有常用的PCR、WB、抗抗体/或荧光素酶标CD19-流式技术，本技术无需对检测蛋白进行纯化，效率更高，成本更低。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案如下：
本发明的目的一在于保护：CD19胞外结构域在用于CAR-T细胞CAR阳性表达率检测的融合蛋白构建方面的应用，所述CD19胞外结构域的氨基酸序列如SEQ NO：05或SEQ NO：06所示。
本发明的目的二在于保护：绿色荧光蛋白GFP在用于CAR-T细胞CAR阳性表达率检测的融合蛋白构建方面的应用。进一步地，将CD19胞外结构域与GFP通过GSGSGS连接构建融合蛋白，所述CD19胞外结构域的氨基酸序列如SEQ NO：05或SEQ NO：06所示。
本发明的目的三在于保护：利用GFP标记CD19检测CAR-T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白，所述融合蛋白是将CD19胞外结构域与荧光蛋白GFP融合所得；所述荧光融合蛋白的氨基酸序列如SEQ NO：01或SEQ NO：03所示。
本发明的目的四在于保护：编码上述融合蛋白的基因，其中，编码如SEQ NO：01所示蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ NO：02所示；表达如SEQ NO：03所示蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ NO：04所示。
本发明的目的五在于保护：包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的病毒载体。所述病毒载体包括但不限于慢病毒、腺病毒或逆转录病毒。
本发明的目的六在于保护：上述病毒载体用于原核真核细胞转染后生成的细胞系以及所述细胞系的副产品或提取物；所述副产品或提取物包括但不限于一切蛋白、浓缩液、细胞培养上清液等样品、产品。
本发明的目的七在于保护：上述融合蛋白、上述基因、上述病毒载体或上述细胞系在CAR-T细胞CAR阳性表达率检测方面的应用。
本发明的目的八在于保护：CAR-T细胞CAR阳性表达率的检测方法，将所述融合蛋白基因经过慢病毒转染于SupB-1细胞中，用转染后的SupB-1细胞培养上清液与生产的CAR-T细胞外的anti-CD19-scFv区进行结合，利用流式细胞仪进行488通道检测，从而实现对CAR-T细胞CAR阳性表达率的检测。
有益效果：
本发明将CD19的部分片段，即胞外结构域与GFP进行融合，经过慢病毒转染于SupB-1细胞中，使其在表达WT型的CD19时，形成杂交型的CD19-GFP蛋白，这种蛋白由于GFP的存在不能与CD81型成复合物，从而存在游离型的CD19-GFP，用这种Sup-B-1细胞培养上清液与生产的CAR-T细胞外的anti-CD19-scFv区进行结合，利用流式细胞仪进行488通道检测，从而能够对CAR-T细胞CAR阳性率进行检测。
本发明开发一种CD19胞外结构域与荧光蛋白GFP的融合蛋白细胞上清液通过流式方法进行表达效率检测的方法。与现有常用的PCR、WB、抗抗体/或荧光素酶标CD19-流式技术，本技术无需对检测蛋白进行纯化，效率更高，成本更低。
附图说明
图1是CD19在B细胞膜上的结构蛋白分子结构图；
图2是GFP在CD19亚基上的偶联模式图；
图3是pCDH-CMV- MSC-EF1-Puro质粒图；
图4是重组SupB-1细胞系荧光结果图；
图5是SupB-1细胞上清于CAR-T细胞共孵育流式检测结果图。
具体实施方式
本发明创造最相近似的实现方案如下案例一或案例二，其与本申请相比较而言可能存在空间位阻造成CD19蛋白无法正常进行折叠。
案例一：anti-BCMA CAR表达阳性率检测
检测方法：流式细胞术；检测对象为：转染anti-BCMA CAR的人原代T淋巴细胞;主要试剂：生物素标记的BCMA蛋白 (Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, FcTag, Avi Tag (Avitag™), ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0)，PE标记的链霉亲和素（PE-SA，Biolegend, Cat.No.405204)
检测流程：
1. 构建anti-BCMA CAR 慢病毒载体，转染患者自体T淋巴细胞，转染3天后收集细胞，并用含2% BSA的PBS缓冲液洗两次；
2. 进行细胞计数，取 1*106个转染后的T细胞加入每个离心管中；
3. 向每个加入细胞的离心管中加入50ul生物素标记的BCMA蛋白（ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0），4℃孵育30分钟，生物素标记的BCMA蛋白终浓度为8ug/ml；
4. 30min 后，离心后弃去上清，用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞两次；
5. 每管加入50ul PE标记的链霉亲和素（Biolegend, Cat.No.405204)，4℃孵育30分钟， PE标记的链霉亲和素的稀释比例为1:50；
6. 30min后，离心并弃去上清，用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞两次；
7. 每管加入400ul PBS中重悬细胞，用BD FACSCalibur流式细胞分析仪进行检测分析。
案例二：anti-CD19 CAR表达阳性率检测
检测方法：流式细胞术；检测对象：R1013-C6细胞(过表达Anti-CD19[FMC63] scFv& RFP tag的293F细胞)；主要试剂：生物素标记的CD19蛋白 (Biotinylated Human CD19,Fc Tag , ultra sensitivity (primary amine labeling), ACROBiosystems,Cat.No.CD9-H8259) FITC标记的链霉亲和素（FITC-SA，Biolegend, Cat.No.405201)
检测流程：
1. 用含10% FBS的DMEM培养基培养R1013-C6细胞，37℃，5% CO2培养箱中；
2. 收集细胞，并用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞1次；
3. 计数细胞，取2*105个R1013-C6细胞加入每个离心管中；
4. 每管加入100ul生物素标记的CD19蛋白（ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259），混匀后在4℃孵育1小时，生物素标记的CD19蛋白终浓度为10ug/ml；
5. 离心并弃去上清，用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞1次；
6. 每管加入100ul 稀释的FITC标记的链霉亲和素（Biolegend,Cat.No.405201)，混匀后4℃孵育1小时， FITC标记的链霉亲和素的稀释比例为1:500；
7. 离心后弃去上清，用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞三次；
8. 每管加入100ul PBS重悬细胞，使用NovoCyteTM Flow Cytometer流式细胞分析仪进行检测分析。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1、CD19-GFP慢病毒表达基因重组技术。
（1）CD19-GFP的基因序列设计。设计1：蛋白序列如SEQ NO：01所示，基因序列如SEQNO：02所示；设计2：蛋白序列如SEQ NO：03所示，基因序列如SEQ NO：04所示。CD19部分多肽与GFP连接后呈现的细胞膜上结构状态如图2所示。
（2）载体构建选择。载体选择：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，酶切位点选择：Xba1和Not1。如图3所示。
<1>对含有pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro进行DH5α菌种进行培养后，质粒提取。
<2>分别对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒和合成的CD19-GFP-1（设计1）、CD19-GFP-2（设计2）进行Xba1和Not1双酶切。
<3>对酶切后的上述DNA进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收。
<4>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 分别与CD19-GFP-1 和CD19-GFP-2在DNA T4 连接酶中进行连接。
<5>连接后的重组载体pCDH-CMV- CD19-GFP-1 -EF1-Puro和pCDH-CMV- CD19-GFP-2-EF1-Puro进行DH5α转化鉴定、质粒大提。
（3）CD9-GFP慢病毒的包装技术。
A．转染24h前，在175培养瓶接种1.5-3×106个293T细胞，添加25ml的培养基(DMEM+10%FBS)。在37℃，5% CO2条件下过夜。保证在加入转染复合物前培养板有50-80%的覆盖率。
B. 转染前1h换液为新鲜培养基并加入终浓度为15ul 50mM的Choloroquine。
C. Vortex转染所需试剂，每个10cm培养板转染样品需准备两个50ml离心管，按顺序添加如下试剂：
Figure 686367DEST_PATH_IMAGE001
D. 一边轻轻vortex solution A（调节转速确保液体不会溅出）或者一边用1ml一次性移液管往solution A中吹泡泡。逐滴轻轻加入solution B。完成后溶液由于沉淀形成应呈不透明状(promega加入顺序与clontech相反是边混匀B液逐滴加入A液)。
E. 室温孵育15min(promega说明书室温22-25℃30min较适合转染复合物形成)。
F. 将转染复合加入细胞之前再次vortex混匀。逐滴并多位置轻轻滴加入培养板，完全加入后前后来回摇晃培养板以以便沉淀均匀地吸附在细胞表面。
G. 在37℃，5％CO2培养箱中孵育。转染8h后换液(或8-12h)。如果包装的慢病毒质粒携带荧光基团，24-48h后可观察到荧光。
H. 转染30h后再换新鲜培养基。收集转染48h后的病毒上清（也可再收集72h的病毒）。option：浓缩病毒。分装病毒保存于-80℃。
2、CD9-GFP-SupB-1细胞系的构建。
（1）慢病毒转染前18～24h，将supB-1以1×105（根据细胞大小而定，一般转染前细胞长到40-60%为宜）孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。
（2）加入 polybrene6-8 ug/ml（这个相当是破膜剂，只有细胞膜破了，病毒才有机会进入细胞内发挥作用），设置合适的病毒浓度梯度，比如 24 孔板，设置5个梯度，分别加入病毒量是 0，1，2，3，4，5ul，37℃ 孵育。这时候用的是无血清的培养基培养。
（3） 4～6 h 换液 （正常的含血清的新鲜培养基），继续培养，如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染 48 小时后可见明显荧光表达，72 小时后更加明显。用荧光显微镜观察细胞的转染效率，一般病毒量达到一定程度之后就荧光强度就不再增加了。
（4）选择一个合适的病毒量就可以做实验了，如果 3ul 的时候病毒的转染效率已经和后面的没有区别了，在 24 孔板里，合适的病毒量就是 3ul。这时候就可以构建的稳转细胞系了。
（5）当把实验组对照组转完病毒后 24 h 就可以进行嘌呤筛选，因为病毒转完之后转染效率不可能达到100%，而慢病毒在构建的时候就含有嘌呤抗性基因，一旦转入细胞，嘌呤抗性基因就能表达嘌呤抗性蛋白，可以抵抗嘌呤对细胞的杀伤作用。
SupB-1细胞被转染CD19-GFP筛选后的表达结果如图4所示。
结论：此图证明构建的pCDH-CMV- CD19-GFP-1/2 -EF1-Puro慢病毒能够正确地整合到SupB-1细胞中使其能够正确地表达到细胞膜上。可以用于CAR-T的后续检测。
3、CD19-GFP对CAR-T细胞的有效性检测。
从-80去除封装的CD19-GFP上清液，对细胞系raji继续过夜孵育，次日进行流式检测。结果如5所示。
结论：经过孵育后流式检测的结果显示CD19-GFP能够有效地与CAR-T细胞结合，来指示CAR19在T细胞中的正确表达。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省华隆生物技术有限公司
<120> 检测CAR-T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> 293T细胞
<400> 1
Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala
20 25 30
Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr
35 40 45
Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp
50 55 60
Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser
65 70 75 80
Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Glu Ser Asp Glu Ser Gly Leu Pro
85 90 95
Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg Ile Thr Gly Thr Leu Asn Gly Val Glu
100 105 110
Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly Glu Gly Thr Pro Lys Gln Gly Arg Met
115 120 125
Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Thr Phe Ser Pro Tyr
130 135 140
Leu Leu Ser His Val Met Gly Tyr Gly Phe Tyr His Phe Gly Thr Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Leu His Ala Ile Asn Asn Gly Gly
165 170 175
Tyr Thr Asn Thr Arg Ile Glu Lys Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu His
180 185 190
Val Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gly Arg Val Ile Gly Asp Phe
195 200 205
Lys Val Val Gly Thr Gly Phe Pro Glu Asp Ser Val Ile Phe Thr Asp
210 215 220
Lys Ile Ile Arg Ser Asn Ala Thr Val Glu His Leu His Pro Met Gly
225 230 235 240
Asp Asn Val Leu Val Gly Ser Phe Ala Arg Thr Phe Ser Leu Arg Asp
245 250 255
Gly Gly Tyr Tyr Ser Phe Val Val Asp Ser His Met His Phe Lys Ser
260 265 270
Ala Ile His Pro Ser Ile Leu Gln Asn Gly Gly Pro Met Phe Ala Phe
275 280 285
Arg Arg Val Glu Glu Leu His Ser Asn Thr Glu Leu Gly Ile Val Glu
290 295 300
Tyr Gln His Ala Phe Lys Thr Pro Ile Ala Phe Ala Arg Ser Arg Ala
305 310 315 320
Gln Ser Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ser Thr
325 330 335
Gly Ser Arg
<210> 2
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc ccgcttaaac ccttcttaaa actcagcctg 60
gggctgccag gcctgggaat ccacatgagg cccctggcca tctggctttt catcttcaac 120
gtctctcaac agatgggggg cttctacctg tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc 180
tggcagcctg gctggacagt caatgtggag ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt 240
tcggacggtt cgggttcggg ttcgatggga gtgaaagttc tttttgccct tatttgtatt 300
gctgtggccg aggccaaacc aactgaaaac aatgaagatt tcaacattgt agctgtagct 360
agcaactttg ctacaacgga tctcgatgct gaccgtggta aattgcccgg aaaaaaatta 420
ccacttgagg tactcaaaga aatggaagcc aatgctagga aagctggctg cactagggga 480
tgtctgatat gcctgtcaca catcaagtgt acacccaaaa tgaagaagtt tatcccagga 540
agatgccaca cctatgaagg agacaaagaa agtgcacagg gaggaatagg agaggctatt 600
gttgacattc ctgaaattcc tgggtttaag gatttggaac ccatggaaca attcattgca 660
caagttgacc tatgtgtaga ctgcacaact ggatgcctca aaggtcttgc caatgtgcaa 720
tgttctgatt tactcaagaa atggctgcca caaagatgtg caacttttgc tagcaaaatt 780
caaggccaag tggacaaaat aaagggtgcc ggtggtgatc atcaccatca ccatcacgga 840
ttcgcggccg ctgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 900
ggcccttccg gaatggagag cgacgagagc ggcctgcccg ccatggagat cgagtgccgc 960
atcaccggca ccctgaacgg cgtggagttc gagctggtgg gcggcggaga gggcaccccc 1020
aagcagggcc gcatgaccaa caagatgaag agcaccaaag gcgccctgac cttcagcccc 1080
tacctgctga gccacgtgat gggctacggc ttctaccact tcggcaccta ccccagcggc 1140
tacgagaacc ccttcctgca cgccatcaac aacggcggct acaccaacac ccgcatcgag 1200
aagtacgagg acggcggcgt gctgcacgtg agcttcagct accgctacga ggccggccgc 1260
gtgatcggcg acttcaaggt ggtgggcacc ggcttccccg aggacagcgt gatcttcacc 1320
gacaagatca tccgcagcaa cgccaccgtg gagcacctgc accccatggg cgataacgtg 1380
ctggtgggca gcttcgcccg caccttcagc ctgcgcgacg gcggctacta cagcttcgtg 1440
gtggacagcc acatgcactt caagagcgcc atccacccca gcatcctgca gaacgggggc 1500
cccatgttcg ccttccgccg cgtggaggag ctgcacagca acaccgagct gggcatcgtg 1560
gagtaccagc acgccttcaa gacccccatc gccttcgcca gatcccgcgc tcagtcgtcc 1620
aattctgccg tggacggcac cgccggaccc ggctccaccg gatctcgcta g 1671
<210> 3
<211> 349
<212> PRT
<213> 293T细胞
<400> 3
Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His
20 25 30
Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp
35 40 45
Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu
50 55 60
Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly
65 70 75 80
Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Met Glu Ser Asp Glu Ser Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys
100 105 110
Arg Ile Thr Gly Thr Leu Asn Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Pro Lys Gln Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Ala Leu Thr Phe Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met
145 150 155 160
Gly Tyr Gly Phe Tyr His Phe Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn
165 170 175
Pro Phe Leu His Ala Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Thr Arg Ile
180 185 190
Glu Lys Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg
195 200 205
Tyr Glu Ala Gly Arg Val Ile Gly Asp Phe Lys Val Val Gly Thr Gly
210 215 220
Phe Pro Glu Asp Ser Val Ile Phe Thr Asp Lys Ile Ile Arg Ser Asn
225 230 235 240
Ala Thr Val Glu His Leu His Pro Met Gly Asp Asn Val Leu Val Gly
245 250 255
Ser Phe Ala Arg Thr Phe Ser Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ser Phe
260 265 270
Val Val Asp Ser His Met His Phe Lys Ser Ala Ile His Pro Ser Ile
275 280 285
Leu Gln Asn Gly Gly Pro Met Phe Ala Phe Arg Arg Val Glu Glu Leu
290 295 300
His Ser Asn Thr Glu Leu Gly Ile Val Glu Tyr Gln His Ala Phe Lys
305 310 315 320
Thr Pro Ile Ala Phe Ala Arg Ser Arg Ala Gln Ser Ser Asn Ser Ala
325 330 335
Val Asp Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Arg
340 345
<210> 4
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atgaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg 60
tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc 120
cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc 180
cctgagatct ggggttcggg ttcgggttcg atgggagtga aagttctttt tgcccttatt 240
tgtattgctg tggccgaggc caaaccaact gaaaacaatg aagatttcaa cattgtagct 300
gtagctagca actttgctac aacggatctc gatgctgacc gtggtaaatt gcccggaaaa 360
aaattaccac ttgaggtact caaagaaatg gaagccaatg ctaggaaagc tggctgcact 420
aggggatgtc tgatatgcct gtcacacatc aagtgtacac ccaaaatgaa gaagtttatc 480
ccaggaagat gccacaccta tgaaggagac aaagaaagtg cacagggagg aataggagag 540
gctattgttg acattcctga aattcctggg tttaaggatt tggaacccat ggaacaattc 600
attgcacaag ttgacctatg tgtagactgc acaactggat gcctcaaagg tcttgccaat 660
gtgcaatgtt ctgatttact caagaaatgg ctgccacaaa gatgtgcaac ttttgctagc 720
aaaattcaag gccaagtgga caaaataaag ggtgccggtg gtgatcatca ccatcaccat 780
cacggattcg cggccgctga gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag 840
aatcccggcc cttccggaat ggagagcgac gagagcggcc tgcccgccat ggagatcgag 900
tgccgcatca ccggcaccct gaacggcgtg gagttcgagc tggtgggcgg cggagagggc 960
acccccaagc agggccgcat gaccaacaag atgaagagca ccaaaggcgc cctgaccttc 1020
agcccctacc tgctgagcca cgtgatgggc tacggcttct accacttcgg cacctacccc 1080
agcggctacg agaacccctt cctgcacgcc atcaacaacg gcggctacac caacacccgc 1140
atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg cacgtgagct tcagctaccg ctacgaggcc 1200
ggccgcgtga tcggcgactt caaggtggtg ggcaccggct tccccgagga cagcgtgatc 1260
ttcaccgaca agatcatccg cagcaacgcc accgtggagc acctgcaccc catgggcgat 1320
aacgtgctgg tgggcagctt cgcccgcacc ttcagcctgc gcgacggcgg ctactacagc 1380
ttcgtggtgg acagccacat gcacttcaag agcgccatcc accccagcat cctgcagaac 1440
gggggcccca tgttcgcctt ccgccgcgtg gaggagctgc acagcaacac cgagctgggc 1500
atcgtggagt accagcacgc cttcaagacc cccatcgcct tcgccagatc ccgcgctcag 1560
tcgtccaatt ctgccgtgga cggcaccgcc ggacccggct ccaccggatc tcgctag 1617
<210> 5
<211> 81
<212> PRT
<213> 293T细胞
<400> 5
Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala
20 25 30
Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr
35 40 45
Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp
50 55 60
Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser
65 70 75 80
Asp
<210> 6
<211> 91
<212> PRT
<213> 293T细胞
<400> 6
Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His
20 25 30
Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp
35 40 45
Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu
50 55 60
Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly
65 70 75 80
Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
85 90

Claims (10)

1.CD19胞外结构域在用于CAR-T细胞CAR阳性表达率检测的融合蛋白构建方面的应用，所述CD19胞外结构域的氨基酸序列如SEQ NO：05或SEQ NO：06所示。
2.绿色荧光蛋白GFP在用于CAR-T细胞CAR阳性表达率检测的融合蛋白构建方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将CD19胞外结构域与GFP通过GSGSGS连接构建融合蛋白，所述CD19胞外结构域的氨基酸序列如SEQ NO：05或SEQ NO：06所示。
4.利用GFP标记CD19检测CAR-T细胞CAR阳性表达率的荧光融合蛋白，其特征在于：所述荧光融合蛋白是将CD19胞外结构域与荧光蛋白GFP融合所得；所述荧光融合蛋白的氨基酸序列如SEQ NO：01或SEQ NO：03所示。
5.编码如权利要求4所述融合蛋白的基因，其特征在于：编码如SEQ NO：01所示蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ NO：02所示；编码如SEQ NO：03所示蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ NO：04所示。
6.包含编码如权利要求4所述融合蛋白的核苷酸序列的病毒载体。
7.根据权利要求6所述的病毒载体，其特征在于：所述病毒载体为慢病毒、腺病毒或逆转录病毒。
8.如权利要求6所述的病毒载体用于原核真核细胞转染后生成的细胞系。
9.如权利要求4所述的融合蛋白、如权利要求5所述的基因、如权利要求6所述的病毒载体或如权利要求8所述的细胞系在CAR-T细胞的CAR阳性表达率检测方面的应用。
10.CAR-T细胞CAR阳性表达率的检测方法，其特征在于：将如权利要求4所述融合蛋白基因经过慢病毒转染于SupB-1细胞中，用转染后的SupB-1细胞培养上清液与生产的CAR-T细胞外的anti-CD19-scFv区进行结合，利用流式细胞仪进行488通道检测，从而实现对CAR-T细胞CAR阳性表达率的检测。
CN202111464981.1A 2021-12-03 2021-12-03 检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用 Pending CN114380904A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111464981.1A CN114380904A (zh) 2021-12-03 2021-12-03 检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111464981.1A CN114380904A (zh) 2021-12-03 2021-12-03 检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114380904A true CN114380904A (zh) 2022-04-22

Family

ID=81196122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111464981.1A Pending CN114380904A (zh) 2021-12-03 2021-12-03 检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114380904A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1526184A1 (en) * 2003-10-24 2005-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Promoter sequences specific for cells of the B lymphoid lineage and pharmaceutical compositions containing the same
CN105859891A (zh) * 2016-05-26 2016-08-17 河南大学 Gfp-cd19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用
WO2018235787A1 (ja) * 2017-06-19 2018-12-27 株式会社医学生物学研究所 蛍光タンパク質を用いたタンパク質間相互作用の判定方法
CN111944063A (zh) * 2020-08-20 2020-11-17 深圳市因诺转化医学研究院 特异性识别人cd19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1526184A1 (en) * 2003-10-24 2005-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Promoter sequences specific for cells of the B lymphoid lineage and pharmaceutical compositions containing the same
CN105859891A (zh) * 2016-05-26 2016-08-17 河南大学 Gfp-cd19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用
WO2018235787A1 (ja) * 2017-06-19 2018-12-27 株式会社医学生物学研究所 蛍光タンパク質を用いたタンパク質間相互作用の判定方法
CN111944063A (zh) * 2020-08-20 2020-11-17 深圳市因诺转化医学研究院 特异性识别人cd19嵌合抗原受体的融合蛋白、核酸分子及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUELLA等: "Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell", 《NATURE MEDICINE》, pages 1499 - 1503 *
SOTILLO等: "Convergence of Acquired Mutations and Alternative Splicing of CD19 Enables Resistance to CART-19 Immunotherapy", 《CANCER DISCOV》, pages 1282 - 1295 *
徐溪悦 等: "一种无标记且实时检测CD19 CAR-T细胞杀伤功能的方法", 《医学研究生学报》, pages 844 - 849 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111499765B (zh) 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
Goldfarb et al. Synthetic peptides as nuclear localization signals
CN107868791B (zh) 一种加强型Slit2 CAR-T和CAR-NK细胞制备方法和应用
CN108165593A (zh) 胶原蛋白7及相关方法
US10000541B2 (en) Trail cell-penetrating peptide-like mutant MUR6 and preparation method thereof
CN104910278B (zh) 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒
CN113480619A (zh) 多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用
CN113817040A (zh) 一种细粒棘球蚴重组蛋白及其制备方法
US10000552B2 (en) TRAIL cell-penetrating peptide-like mutant MuR5 and preparation method thereof
KR102453605B1 (ko) 신규 펩타이드 태그, 이에 결합하는 항체 및 이들의 용도
WO2011067553A1 (en) Cells for the production of biotin - tagged viral vectors or proteins
CN114380904A (zh) 检测car-t细胞car阳性表达率的荧光融合蛋白及其应用
CN107236046A (zh) 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用
CN110903402A (zh) 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
US20200231633A1 (en) MGAT1-Deficient Cells for Production of Vaccines and Biopharmaceutical Products
EA007273B1 (ru) Выделенный полипептид, связывающийся с каспазой -8, и способы его применения
He et al. Nonclassical secretion of human catalase on the surface of CHO cells is more efficient than classical secretion
CN114057861A (zh) 一种靶向UBE2C的bio-PROTAC人工蛋白
CN113087807B (zh) 用于检测糖类抗原的基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针、制备方法
CN113480666B (zh) Ca153融合蛋白及其制备方法和ca153检测质控品或校准品
CN103388001A (zh) 一种含凝血酶切割位点gst膜型表达载体及转染阳性细胞的方法
CN113943718B (zh) 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用
CN109384838B (zh) 三重转录因子及其在哺乳动物蛋白表达系统的应用
CN116003624B (zh) Sirt1融合蛋白及其用途
CN107056899A (zh) 一种细胞膜定位信号肽及其编码基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination