CN113480666B - Ca153融合蛋白及其制备方法和ca153检测质控品或校准品 - Google Patents

Ca153融合蛋白及其制备方法和ca153检测质控品或校准品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品。该融合蛋白由HER2信号肽、可溶标签类蛋白和CA153多肽重复结构构成。本发明将高表达的蛋白(HER2)信号肽、便于纯化的标签蛋白与低表达的多肽蛋白(4～10个CA153多肽)融合表达，在不影响CA153的结构与功能下，可以提高CA153的产量和稳定性，该融合蛋白解决了表达量低与稳定性的问题。并使得CA153多肽蛋白可以分泌到上清中，有利于纯化。

Description

CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品。
背景技术
CA15-3蛋白是mucin1基因编码的，别名又叫做Breast carcinoma-associatedantigen DF3、MUC-1、KL-6、PEMT、PUM、PEM、EMA、CD227等，有将近80种异构体，不同组织的CA15-3的氨基酸序列不相同，其糖基化程度也不相同。CA15-3的肽段的分子量在120-225kDa，糖基化后大小在250–1000kDa，分为α链和β链，α链与β链是非共价键结合，CA15-3属于唾液酸化的糖蛋白亚类，又称多态性上皮粘蛋白(PEM)。
正常情况下，PEM只存在于腺体细胞腔的分泌物中，不出现在血循环中。当细胞恶变时，基底细胞膜渗透性增强，PEM可在血清中由CA15-3方法检测出来。CA15-3在乳腺癌患者血清中升高，在乳腺癌初期的敏感性为60％，在乳腺癌晚期的敏感性为80％；同时CA15-3对乳腺癌的疗效观察、预后判断，复发和转移的诊断有重要价值。CA15-3在其他恶性肿瘤中也有一定的阳性率，例如：肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、原发性肝癌等。目前CA15-3已被列为乳腺癌的最重要的特异性标志物。
目前常采用免疫分析法来检测血浆中CA15-3蛋白含量，因此，需使用高质量的校准品作为对照，作为对照的CA15-3蛋白质需要活性高、稳定性好，经过长时间贮存而活性几乎无下降。目前高品质CA15-3蛋白来源于天然提取，但是，由于天然提取的CA15-3来源不稳定，并且，目的蛋白含量低且蛋白结构不均一等原因，严重阻碍CA15-3蛋白校准品等诊断产品的研究开发，因此，需要研发一种可大量生产CA15-3的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品。该融合蛋白解决了表达量低与稳定性的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种CA153融合蛋白，该融合蛋白由HER2信号肽、可溶标签类蛋白和CA153多肽重复结构构成。
由于单独的CA153多肽表达量太低，本申请选择融合一个表达量相对较高的分泌型蛋白HER2信号肽序列。本技术方案为：构建瞬时表达质粒--细胞培养--细胞转染--收获融合蛋白；构建稳定表达质粒--细胞培养--构建稳定表达细胞株--持续的收获融合蛋白。本发明中利用了本实验室中已经存在的HER2信号肽、GST标签蛋白基因和合成4至10个CA153多肽序列，全长基因序列，将其克隆至瞬时表达质粒和稳定表达质粒中，将质粒转染至CHO细胞中，收获上清中的蛋白。
本发明创新性将降低到CA153重复结构域降低到4-10即可表达，在不影响CA153的结构与功能下，可以提高CA153的产量和稳定性，并使得CA153多肽蛋白可以分泌到上清中，有利于纯化。
作为优选，HER2信号肽位于融合蛋白的N端，可溶标签类蛋白位于HER2信号肽和CA153多肽重复结构之间，CA153多肽重复结构位于融合蛋白的C端。
作为优选，CA153多肽重复结构由4至10个CA153多肽片段组成。
优选地，CA153多肽重复结构由6个CA153多肽片段组成。
在本发明中，CA153多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明中，可溶标签类蛋白选自但不限于GST蛋白、Trx蛋白中的一种或两种。
在本发明中，HER2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因。
本发明还提供了一种表达载体，表达载体包含上述基因。
在本发明中，表达载体为哺乳动物细胞常用表达载体如PCMV3，但不限于此。
本发明还提供了一种表达细胞株，表达细胞株包含上述表达载体。
本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建表达载体，细胞培养，构建表达细胞株，收获融合蛋白。
在本发明具体实施例中，该融合蛋白的制备方法包括如下步骤：构建瞬时表达质粒，细胞培养，细胞转染，收获融合蛋白。
在本发明另一具体实施例中，该融合蛋白的制备方法包括如下步骤：构建稳定表达质粒，细胞培养，构建稳定表达细胞株，收获融合蛋白。
本发明还提供了一种CA153检测质控品或校准品，包括上述融合蛋白。
本发明提供了CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或标准品。该融合蛋白由HER2信号肽、可溶标签类蛋白和CA153多肽重复结构构成。本发明的优点在于：
将高表达的蛋白(HER2)信号肽、便于纯化的标签蛋白与低表达的多肽蛋白(4～10个CA153多肽)融合表达，在不影响CA153的结构与功能下，可以提高CA153的产量和稳定性，该融合蛋白解决了表达量低与稳定性的问题。并使得CA153多肽蛋白可以分泌到上清中，有利于纯化。
附图说明
图1为构建瞬转体系中PCMV3质粒图；
图2为瞬转体系中蛋白的表达和纯化：SDS-PAGE结果中，SY是细胞上清，LC是纯化流穿；JL是纯化后样品还原电泳，JL非是纯化后样品非还原电泳。
具体实施方式
本发明公开了CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
CA153多肽序列如SEQ ID NO：1所示：APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
HER2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：MELAALCRWGLLLALLPPGAAS
本发明提供的CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品中所用质粒、细胞、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1用293细胞构建瞬时表达融合蛋白的体系
(1)构建含目的基因质粒
根据实验需求选用实验室带有HER2信号肽的PCMV3质粒作为骨架，将CA153合成目的基因片段插入多克隆位点。
表1 GST标签扩展PCR体系
表2 CA153多肽扩增PCR体系
表3 PCR程序
胶回收：
将DNA片段跑1％的DNA琼脂胶，而后用回收试剂盒进行回收，而后进行PCR。
搭桥PCR：
引物信息如下，经过PCR后，胶回收，而后进行同源重组。
表4 GST和CA153多肽搭桥PCR体系
表5载体酶切体系
体系 体积
10*CUTSMARTbuffer 4μL
XbaI 2μL
NotI 2μL
质粒 2000ng
ddH2O Upto40μL
37℃PCR仪中酶切2h，跑DNA胶胶回收后进行同源重组。
表6同源重组体系
50℃同源重组2h，连接产物取出冰浴10min后转化。
质粒转化
1)将感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上使其化开。取1.5mL的EP管，冰浴。
2)取100μL的感受态细胞于1.5mL EP管中，加入10μL的酶连接液，混合后冰浴半小时。其阴性对照为0.5μL的酶切回收液。
3)42℃水浴锅中热激90sec，冰浴2min。
4)在超净台中向EP管中加入1mL的无抗LB培养基，于37℃，220rpm摇床中摇1h孵育。
5)室温4000rpm，离心5min。
6)在超净台中弃上清，留100μL上清，将菌混匀后涂平板(平板为含卡那霉素的LB平板)。
7)37℃培养箱中放置过夜，约14小时后即可看到单克隆菌落。
8)测序验证
序列正确后保存质粒并表达该蛋白(菌株为DH5α)
1)接菌，早上挑取单克隆至5mL的含卡那霉素的LB培养基中，在37℃摇床中以260rpm摇菌12h。将5mL的菌液接菌于1L三角摇瓶(含300μL的卡那霉素LB培养基)中，在37℃摇床中以260rpm过夜摇菌，约16-18h。
2)收菌，4℃，4000rpm离心15min，弃上清。
3)细胞悬浮，加入8mL的4℃的RES溶液(含Rnase A)，用涡旋仪剧烈震荡，使菌液充分混匀。将混合菌液移至50mLBD管中。
4)细胞裂解，加入8mL的LYS溶液，轻轻的上下颠倒5-10次，室温静置5min。
5)加入8mL的NEU溶液，上下颠倒混匀，此时有大量的白色絮状沉淀生成，室温静置5min。
6)离心，4℃，4000rpm离心30min。离心的同时用12mL的EQU溶液平衡纯化柱(内嵌有过滤管)，操作时用移液管在过滤管的管口圆圈上液，从而保证过滤管处处湿润。
7)纯化柱平衡后，将上步离心所得的上清缓慢的在过滤管的管口圆圈上液，要保证不要将上清不经过滤就到纯化柱里。
8)加入5mL的EQU溶液洗涤，操作时同样用移液管在过滤管的管口圆圈上液。丢弃纯化柱内的过滤管。
9)加入8mL的washbuffer，洗涤纯化柱。
10)加入5mL的ELU溶液洗脱纯化柱吸附的DNA质粒，用15mL的BD管收集洗脱液。
11)向洗脱液中加入3.5mL的异丙醇，混匀后室温静置2min。
12)用30mL注射器将11)步中的混合液缓慢的过NucleoBondFinalizer蓝色滤头，过滤液以滴滴滴落为佳，弃过滤液。
13)配制70％－80％的乙醇，类似上步，用30mL注射器将2mL的乙醇液缓慢的过蓝色滤头，弃流出液。
14)用30mL注射器将空气单方向吹过蓝色滤头，至少吹过3次，使滤头内乙醇蒸发干净。
15)用1mL注射器将55℃的ddH2O缓慢的洗脱滤头，收集洗脱液，测DNA质粒浓度。
(2)融合蛋白瞬时表达
细胞培养/细胞传代/细胞冻存/细胞转染(90cm培养皿为例)
1)细胞复苏：将于液氮中保存的细胞取出后快速放置于37℃水浴锅中，使细胞液体快速融化，融化后直接将细胞液加入30mL SMM-293无血清培养基的125mL三角瓶中(Corning)，置于37℃5％CO2100rpm/min的细胞培养摇床，注意融化后的细胞液不进行离心处理。
2)细胞培养：将细胞活率大于95％的接种于含30mL相应的无血清培养基的125mL三角瓶中(Corning，货号431144)，置于37℃5％CO2100rpm/min的细胞培养摇床。密度控制在0.5×10^6cells/mL-4×10^6cells/mL，传代放大时使用稀释传代的方法，不使用离心重悬方法。
PEI转染：将HEK293F细胞以5×105cell/mL接种到揺瓶中，72h后细胞密度长到30-40×105cell/mL，活率大于90％可进行转染。转染当天将细胞稀释到30×105cell/mL，使用PEI将提取质粒转入HEK293F细胞，将转染试剂PEI和质粒DNA按照设计的比例用稀释液进行稀释，后混匀静置，逐滴加入细胞培养液中，转染后第1、3和5天进行补料计数，观察细胞生长状态，当细胞活率低于50％时收获细胞。使用Countstar进行细胞计数，检测活细胞密度和细胞活率。
(3)纯化目的蛋白
收集的293细胞上清，使用0.02M PBS ph7.4进行浓缩洗滤置换缓冲液，然后上样已平衡过的GST亲和层析填料，最后使用10mM GSH一步解离目的蛋白，并进行电泳分析纯度。如图2。
(4)重组蛋白效价考察
使用罗氏试剂盒上机检测抗原(抗原浓度1.62mg/ml)效价如下，取平均值13772U/ml。
表7
样品编号 蛋白检测值U/ml 发光值 换算效价值U/ml
100* 154.6 62930 15460
200* 71.28 30687 14356
1000* 11.60 6035 11600
PBS(空白对照) 1.0 1051 /
试验例本申请融合蛋白与HIS-CA153融合蛋白表达量的比较
采用与实施例1相同的方法进行构建HER2-CA153-HIS融合蛋白表达体系和纯化，HER2-GST-CA153和HER2-CA153-HIS融合蛋白表达情况如下所示：
表8融合蛋白表达情况
融合蛋白 表达情况 纯化结果
HER2-GST-CA153 945U/ml 8500U/mg
HER2-CA153-HIS 646U/ml 1900U/mg
可见，HER2-GST-CA153融合蛋白表达水平及应用性是强于高表达蛋白HER2-CA153-HIS融合蛋白的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司
<120> CA153融合蛋白及其制备方法和CA153检测质控品或校准品
<130> MP21011896
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
1 5 10 15
Gly Val Thr Ser
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser
20

Claims (7)

1.一种CA153融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由HER2信号肽、可溶标签类蛋白和CA153多肽重复结构构成；
所述HER2信号肽位于融合蛋白的N端，所述可溶标签类蛋白位于HER2信号肽和CA153多肽重复结构域之间，所述CA153多肽重复结构位于融合蛋白的C端；
所述CA153多肽重复结构由4至10个CA153多肽片段组成；所述CA153多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述HER2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述可溶标签类蛋白选自但不限于GST蛋白、Trx蛋白中的一种或两种。
3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3所述的基因。
5.一种表达细胞株，其特征在于，所述表达细胞株包含权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建表达载体，细胞培养，构建表达细胞株，收获融合蛋白。
7.一种CA153检测质控品或校准品，其特征在于，包括权利要求1或2所述的融合蛋白。
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