CN105524942A - 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法 - Google Patents

一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105524942A
CN105524942A CN201610082935.8A CN201610082935A CN105524942A CN 105524942 A CN105524942 A CN 105524942A CN 201610082935 A CN201610082935 A CN 201610082935A CN 105524942 A CN105524942 A CN 105524942A
Authority
CN
China
Prior art keywords
igfbp3
expression
gene
expression vector
tev
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610082935.8A
Other languages
English (en)
Inventor
王一飞
陈海佳
葛啸虎
任哲
马岩岩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority to CN201610082935.8A priority Critical patent/CN105524942A/zh
Publication of CN105524942A publication Critical patent/CN105524942A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法。本发明提供了用于IGFBP3蛋白表达的载体、宿主和表达方法及制备方法，以本发明提供方法制备的融合蛋白为mFc类型，经检测，经过24h的培养，仍有70％～80％的细胞内存在表达载体。每100万个细胞能够产生20～30μg的IGFBP3蛋白，所得蛋白的纯度大于90％。

Description

一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法。
背景技术
身材矮小(shortstature)是指在相似环境下,儿童身高低于同种族个体正常身高2个标准差以上，或者低于正常儿童生长曲线第三百分位。在众多因素中，内分泌的生长激素(GH)对身高的影响起着十分重要的作用。患儿因GH缺乏所导致的矮小，称为生长激素缺乏症，又称为垂体性侏儒症。
IGF-1是一种具有广泛作用的生长激素依赖性细胞因子，对成骨细胞有促进有丝分裂的作用，还可刺激成骨细胞的AKP活性促进骨钙素的合成，对成骨细胞其它分化功能亦有影响。IGF-1在一些患侏儒症、生长激素缺乏症、矮小症等的儿童中，比正常对照组儿童会明显减少。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)是血液中IGF-1的主要载体，它结合了血清中大部分游离的IGF-1，当IGFBP-3与IGF-1结合后,可以减少游离IGF-1的浓度，有利于增强和发挥IGF-1受体的活性，可以延长IGF-1的半衰期,提高血清中的水平。
科学研究发现GH缺乏或不足会影响循环中的IGF-1和IGFBP-3含量；反之，血液IGF-1和IGFBP-3水平也反映了内源性的生长激素的分泌情况，而且数值稳定，几乎没有昼夜变化，所以，检测GH、IGF-1和IGFBP-3能较好反映机体GH的分泌情况，对临床早期诊断矮小症和GH分泌减低患儿有较重要意义。
开发IGFBP-3检测试剂，特别是以ELISA法检测IGFBP-3含量，最重要的环节是IGFBP-3抗体的制备，而决定抗体免疫原性的重要因素就是抗原。含量高、纯度好的抗原为抗体免疫原性的提高提供了保障。因此，开发产物得率高、纯度好的IGFBP-3的表达方法是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种表达载体胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的表达方法。以本发明提供方法制备IGFBP-3得率高，所得产物纯度良好。
本发明提供了一种表达载体，包括IGFBP-3基因和TEV基因。
作为优选，表达载体的骨架为pUC57-simple。
TEVProtease是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的蛋白酶经改进后的50kDa的蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。本发明将该TEV基因与IGFBP-3基因共同连接入表达载体，经表达产生融合蛋白后，以TEV为亲和标签进行纯化后再以TEV蛋白酶将融合蛋白中的TEV部分去除，从而获得纯度更好的IGFBP-3蛋白。
本发明采用的IGFBP-3基因来自Genbank，登录号为3486，其制备采用人工合成的方式。TEV基因来自武汉淼灵生物科技有限公司的载体pUC57simple-KF001AG2aFc，采用PCR的方式扩增获得。
在本发明提供的表达载体中，TEV基因可位于IGFBP-3基因的3’端，也可位于IGFBP-3基因的5’端。
在本发明的实施例中，TEV基因位于IGFBP-3基因的5’端。
不同的载体会影响表达产物的得率，本发明以pUC57-simple为骨架制备表达载体，表达产物得率较高。
作为优选，IGFBP-3基因和TEV基因的插入位点位于XbaI和BamHI之间。
本发明提供的表达载体的制备方法，包括：
步骤1：以重叠PCR的方式连接IGFBP-3基因和TEV基因，获得IGFBP3-TEV片段；
步骤2：分别以XbaI和BamHI酶切IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体后，将酶切后的IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体连接获得表达载体。
在本发明中，IGFBP-3基因的制备方法为根据Genbank登录号为3486的序列人工合成后，将所述IGFBP-3基因克隆到大肠杆菌质粒载体pUC57-simple中，获得pUC57simple-IGFBP3载体，以pUC57simple-IGFBP3载体为模板，PCR扩增IGFBP3基因。
作为优选，PCR扩增IGFBP3基因的引物对的核酸序列如SEQIDNO:1～2所示。
PCR扩增IGFBP3基因的反应体系为：
ddH2O补充至20μl。
PCR扩增IGFBP3基因的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
作为优选，以质粒pUC57simple-KF001AG2aFc为模板PCR扩增TEV基因的引物对的核酸序列如SEQIDNO:3～4所示。
PCR扩增TEV基因的反应体系为：
PCR扩增TEV基因的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
以胶回收的IGFBP3和TEV-mIgG2aFc基因作为模板，以重叠PCR的方式连接IGFBP-3基因和TEV基因，获得IGFBP3-TEV片段。作为优选，重叠PCR的引物对的核酸序列如SEQIDNO:5～6所示。
ddH2O补充至20μl。
重叠PCR的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
XbaI和BamHI酶切IGFBP3-TEV片段的酶切温度为37℃，酶切的时间为1h。
XbaI和BamHI酶切pUC57-simple载体的酶切温度为37℃，酶切的时间为1h。
用T4DNA连接酶连接IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体，反应体系在水浴锅中16℃过夜连接。
经过连接的质粒转化入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素筛选阳性克隆。以菌落PCR法进行验证。
本发明实验结果表明，采用pUC57-simple载体对IGFBP3融合蛋白进行表达可获得较大的表达量。
本发明还提供了一种宿主细胞，其被本发明提供的表达载体转染。
作为优选，宿主细胞为293f细胞。
作为优选，转染的条件具体为：采用无血清DMEM培养基，室温静置15～30min。优选的，室温为10℃～30℃。
本发明还提供了一种融合蛋白的表达方法，以本发明提供的表达载体转染宿主细胞后培养。
作为优选，宿主细胞为293f细胞。
293f细胞为是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，多用于瞬时表达系统，其可高表达转染的蛋白。
通常认为，以哺乳动物细胞表达能够知道蛋白质的正确折叠，表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近天然蛋白质。但是，哺乳动物细胞表达系统的表达量却通常较低，本发明通过对宿主细胞、表达载体、表达条件的优化，使得融合蛋白的表达量大大提高，从而使制备得到的IGFBP3蛋白收率较高，纯度较大。另外，本发明表达融合蛋白的类型为mFc类型，免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与Ig不同片断相连，可将其分为二大类：一类为Fab(Fv)融合蛋白；另一类为Fc融合蛋白。
作为优选，培养的培养基为含有体积分数为10％的FBS的DMEM培养基。
作为优选，培养的条件为37℃，CO2体积分数为5％。
作为优选，培养过程中静置培养。
作为优选，培养的时间为24小时。
本发明还提供了一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的制备方法，以本发明提供的表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，获得胰岛素样生长因子结合蛋白3。
作为优选，TEV蛋白酶处理具体为使所述融合蛋白经过proteinA预装柱后，以含有TEV蛋白酶的溶液洗脱。
经过转染的293f细胞经培养后，融合蛋白存在于上清液中。融合蛋白经TEV蛋白酶处理具体为：利用GE公司的proteinA预装柱(HiTrapproteinAHP)纯化，样品经proteinA预装柱后，加入含有5％(质量分数)TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目的蛋白IGFBP3。
本发明提供了用于IGFBP3蛋白表达的载体、宿主和表达方法及制备方法，以本发明提供方法制备的融合蛋白为mFc类型，经检测，经过24h的培养，仍有70％～80％的细胞内存在表达载体。每100万个细胞能够产生20～30μg的IGFBP3蛋白，所得蛋白的纯度大于90％。
附图说明
图1示琼脂糖凝胶电泳鉴定pUC57-IGFBP3重组子克隆；其中，M1示5kbDNAmarker，条带由上至下依次为5kb，3kb，2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；M2示2kbDNAmarker条带由上至下依次为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1～4示pUC57-IGFBP3表达载体；
图2示细胞培养上清液的SDS-PAGE凝胶电泳；泳道M为蛋白标准品，泳道1为悬浮293f细胞转染前的培养上清，泳道2为悬浮293f细胞转染后的培养上清；
图3示经纯化的IGFBP3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳；M为蛋白标准品。
具体实施方式
本发明提供了一种表达载体胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法。，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的细胞、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、IGFBP3基因的获取及扩增
通过NCBI查找IGFBP3基因序列，登录号为3486。并交由上海生工生物合成IGFBP3基因，克隆到大肠杆菌质粒载体pUC57-simple中，以pUC57simple-IGFBP3载体为模板，PCR扩增IGFBP3基因，
上游引物为F1：TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGGAG，
下游引物为R1：GTGGGGCCTCGTGGTCCCTGGAAATAC。
PCR扩增IGFBP3基因的反应体系为：
ddH2O补充至20μl。
PCR扩增IGFBP3基因的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
2、TEV基因的扩增
以pUC57simple-KF001AG2aFc载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司)为模板，PCR扩增TEV基因：
上游引物为F2：GGACCACGAGGCCCCACAAT；
下游引物为R2：ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT。
PCR扩增TEV基因的反应体系为：
ddH2O补充至20μl。
PCR扩增TEV基因的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于-20℃保存。
3、重叠PCR将两个片段连接成IGFBP3-TEV基因，并插入到pUC57-simple载体中。
分别以胶回收的IGFBP3和TEV-mIgG2aFc基因作为模板，PCR扩增IGFBP3-TEV基因，
上游引物为F1：TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGGAG，
下游引物为R2：ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT。
ddH2O补充至20μl。
重叠PCR的反应条件为：
所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收IGFBP3-TEV片段，并置于-20℃保存。
实施例2
利用XbaI和BamHI酶切实施例1制得的IGFBP3-TEV和pUC57-simple载体，产物经琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和pUC57-simple载体，反应体系在水浴锅中16℃过夜连接。
将连接后的载体转化到感受态大肠杆菌DH5α中，取菌液100ul均匀涂在含氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃生化培养箱培养过夜。挑取单克隆，放置于37℃恒温培养箱中，摇菌培养过夜，并利用Promega质粒提取试剂盒提取质粒，所得质粒经通过菌落PCR扩增后利用琼脂凝胶电泳鉴定是否连接成功，电泳结果如图1：图中的1～4在500bp左右具有目的基因条带，说明挑取的单克隆为阳性菌落，重组子克隆成功。
实施例3
采用脂质体介导转染法将实施例2连接成功的质粒转染处于对数期的293f细胞系，转染后，采用DMEM+10％FBS培养基在37度、5％二氧化碳培养箱中静置培养。培养前进行细胞计数，每皿培养细胞数目约为100万个。
培养所获得融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。培养24h后收集上清培养液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察融合蛋白的表达情况。结果如图2。
由图2可知，在蛋白标准品60kDa左右有一条明显加深的蛋白条带，该条带大小符合预期。即为融合蛋白的目的条带。
实施例4
利用GE公司的proteinA预装柱(HiTrapproteinAHP)纯化，实施例3制得的融合蛋白经proteinA预装柱后，加入含有5％TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目的蛋白IGFBP3，最终收集目的蛋白10～15mL；目的蛋白进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察蛋白的纯化情况。结果如图3，图3在60kDa左右有一条目的蛋白条带，而其他杂带已基本没有。重复取样检测3次，蛋白的浓度为2～3μg/ml；纯化率达到90％以上，获得较高纯度的IGFBP3蛋白。
对比例1
利用XbaI和BamHI酶切实施例1制得的IGFBP3-TEV和pUC57-Kan载体，产物经琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和pUC57-Kan载体，反应体系在水浴锅中16℃过夜连接。
将连接后的载体转化到感受态大肠杆菌DH5α中，取菌液100ul均匀涂在含氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃生化培养箱培养过夜。挑取单克隆，放置于37℃恒温培养箱中，摇菌培养过夜，并利用Promega质粒提取试剂盒提取质粒。
采用脂质体介导转染法将连接成功的质粒转染处于对数期的293f细胞系，转染后，采用DMEM+10％FBS培养基在37度、5％二氧化碳培养箱中静置培养。培养前进行细胞计数，每皿培养细胞数目约为100万个。培养所获得融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。培养24h后收集上清培养液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，在蛋白标准品60kDa左右有一条明显加深的蛋白条带，该条带大小符合预期。即为融合蛋白的目的条带。
利用GE公司的proteinA预装柱(HiTrapproteinAHP)纯化，融合蛋白经proteinA预装柱后，加入含有5％TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目的蛋白IGFBP3，最终收集目的蛋白10mL；目的蛋白进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察蛋白的纯化情况。重复取样检测3次，获得蛋白的浓度为1～2μg/ml纯化率达到70％以上，获得较高纯度的IGFBP3蛋白。
对比例2
利用XbaI和BamHI酶切实施例1制得的IGFBP3-TEV和pUC57-simple载体，产物经琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和pUC57-simple载体，反应体系在水浴锅中16℃过夜连接。
将连接后的载体转化到感受态大肠杆菌DH5α中，取菌液100ul均匀涂在含氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃生化培养箱培养过夜。挑取单克隆，放置于37℃恒温培养箱中，摇菌培养过夜，并利用Promega质粒提取试剂盒提取质粒。
采用脂质体介导转染法将连接成功的质粒转染处于对数期的COS-7细胞系，转染后，采用DMEM+10％FBS培养基在37度、5％二氧化碳培养箱中静置培养。培养前进行细胞计数，每皿培养细胞数目约为100万个。培养所获得融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。培养24h后收集上清培养液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，在蛋白标准品60kDa左右有一条明显加深的蛋白条带，该条带大小符合预期。即为融合蛋白的目的条带。
利用GE公司的proteinA预装柱(HiTrapproteinAHP)纯化，融合蛋白经proteinA预装柱后，加入含有5％TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目的蛋白IGFBP3，最终收集目的蛋白10mL；目的蛋白进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察蛋白的纯化情况。重复取样检测3次，获得蛋白的浓度为1～2μg/ml；纯化率达到70％以上，获得较高纯度的IGFBP3蛋白。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种表达载体，其特征在于，包括IGFBP-3基因和TEV基因。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架为pUC57-simple。
3.一种宿主细胞，其特征在于，其被权利要求1或2的表达载体转染。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为293f细胞。
5.一种融合蛋白的表达方法，其特征在于，以权利要求1或2的的表达载体转染宿主细胞后培养。
6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述宿主细胞为293f细胞。
7.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述培养的培养基为含有体积分数为10％的FBS的DMEM培养基。
8.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃，CO2体积分数为5％。
9.一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的制备方法，其特征在于，以权利要求1或2的的表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，获得胰岛素样生长因子结合蛋白3。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述TEV蛋白酶处理具体为使所述融合蛋白经过proteinA预装柱后，以含有TEV蛋白酶的溶液洗脱。
CN201610082935.8A 2016-02-05 2016-02-05 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法 Pending CN105524942A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610082935.8A CN105524942A (zh) 2016-02-05 2016-02-05 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610082935.8A CN105524942A (zh) 2016-02-05 2016-02-05 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105524942A true CN105524942A (zh) 2016-04-27

Family

ID=55767470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610082935.8A Pending CN105524942A (zh) 2016-02-05 2016-02-05 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105524942A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107991492A (zh) * 2017-11-17 2018-05-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3的定量检测试剂盒及其非诊断目的的检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481705A (zh) * 2009-01-19 2009-07-15 河北大学 人胰岛素样生长因子结合蛋白3真核表达载体、构建及应用
CN102618575A (zh) * 2011-09-16 2012-08-01 江苏普罗赛生物技术有限公司 哺乳动物细胞大规模生产重组人IGF1-Fc融合蛋白的实验技术
CN104066745A (zh) * 2012-01-23 2014-09-24 莫佛塞斯公司 溶菌酶作为标签的用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481705A (zh) * 2009-01-19 2009-07-15 河北大学 人胰岛素样生长因子结合蛋白3真核表达载体、构建及应用
CN102618575A (zh) * 2011-09-16 2012-08-01 江苏普罗赛生物技术有限公司 哺乳动物细胞大规模生产重组人IGF1-Fc融合蛋白的实验技术
CN104066745A (zh) * 2012-01-23 2014-09-24 莫佛塞斯公司 溶菌酶作为标签的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王洪亮: "SARS冠状病毒与H5N1型禽流感病毒致病机理的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107991492A (zh) * 2017-11-17 2018-05-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3的定量检测试剂盒及其非诊断目的的检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021083072A1 (zh) 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途
CN102747097B (zh) Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体及其表达纯化方法
CN116333097A (zh) 一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用
CN103710367B (zh) 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法
CN101302517B (zh) 人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法
CN104232611A (zh) 一种重组布氏白僵菌蛋白酶k及其工业化生产与纯化方法
CN105524942A (zh) 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法
CN116063459B (zh) 一种高表达和高活性纤连蛋白突变体及其应用
CN102898512B (zh) 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途
CN101736009B (zh) 一种高密度发酵生产人白细胞介素6的方法
CN110357970A (zh) 一种易于纯化的人表皮生长因子融合蛋白及其核酸分子、一种人表皮生长因子制备方法
CN105504058A (zh) 一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法
CN103215292A (zh) 人Pcid2蛋白的可溶性表达及抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体2D7-F11和分泌该抗体的杂交瘤细胞系
CN103509100B (zh) 一种白细胞介素‑1受体拮抗剂突变体
CN107012150A (zh) 重组人成纤维细胞生长因子‑16的克隆、表达和应用及其生物学活性的测定方法
CN106929512A (zh) St2抗原的制备及其专用编码dna分子
CN113151343A (zh) 一种酿酒酵母表达长效重组人egf-hsa融合蛋白及其标准品的制备方法
CN101402954A (zh) 一种用毕赤嗜甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白n叶的方法
CN113480666B (zh) Ca153融合蛋白及其制备方法和ca153检测质控品或校准品
CN103382481B (zh) 人源基质细胞衍生因子1α的表达载体、构建方法及应用
CN116640231B (zh) 一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法
CN107881178A (zh) 八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用
CN103882055B (zh) 一种人表皮生长因子的制备和纯化方法
CN101864438B (zh) 一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法
CN107254481A (zh) 人重组表皮生长因子MJ‑hEGF基因优化序列及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Yifei

Inventor after: Chen Haijia

Inventor after: Ge Xiaohu

Inventor after: Ren Zhe

Inventor after: Ma Yanyan

Inventor after: Yue Kun

Inventor after: Jiang Jiaohua

Inventor before: Wang Yifei

Inventor before: Chen Haijia

Inventor before: Ge Xiaohu

Inventor before: Ren Zhe

Inventor before: Ma Yanyan

CB03 Change of inventor or designer information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160427

RJ01 Rejection of invention patent application after publication