CN103882055B - 一种人表皮生长因子的制备和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，包括构建重组质粒pBSAZ？1.1？myc-His6、构建重组质粒pBSAZ？1.1？myc-His6-SUMO-hEGF、重组质粒pBSAZ？1.1？myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞和hEGF蛋白的分泌和纯化的步骤。本发明采用现代生物技术，构建了微生物表达载体重组质粒pBSAZ？1.1？myc-His6-SUMO-hEGF，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的CHO细胞，构建稳定的高分泌型工程菌，实现人表皮生长因子的生产。表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子，经过Balb/c？3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比具有较高生物学活性，可达到1×105U/mg。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种人表皮生长因子的制备和纯化方法。。
背景技术
人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor，简称hEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6216道尔顿。hEGF是一种多功能细胞生长因子，通过与细胞膜上hEGF受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hEGF受体，其中表皮细胞含量最高。hEGF接近细胞后与细胞膜上的hEGEF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得RNA、DNA和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖，加速细胞新陈代谢。
人的尿液、血液、乳汁及胃液等含有的内源性hEGF很少，并且为与受体结合的生理状态，从生物来源中提取hEGF比较困难，仅仅限于理论研究。目前生产hEGF主要有2种途径：一种是化学合成法，虽然产物纯度高但是产率不高，而且蛋白质不能像生物合成一样折叠，无法工业化生产。另一种方法是采用基因工程技术构建重组质粒表达hEGF。基因重组hEGF的基本策略是首先从制备hEGF目的基因，然后将目的基因连接至表达载体上，从而构建出含hEGF目的基因的重组质粒，最后将质粒转化至基因工程菌中表达，分离纯化得到hEGF目的蛋白。目前表达载体主要有大肠杆菌和酵母菌，hEGF在这两种表达载体中的表达量小，发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hEGF活性不高。
发明内容
本发明的目的在于提供提供一种高效、稳定的表达hEGF工程菌的构建、筛选，以及分离纯化目的蛋白hEGF的方法，解决重组人表皮生长因子在哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中分泌表达的问题。
一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6：
提取质粒pcDNA3.1(+)/myc-His A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到3392bp的片段；
提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到2186bp的片段；
将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6；
(b) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF：
提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理；
提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUMO-hEGF，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切得到486bp的hEGF基因片段；
将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF；
(c) 重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞：在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株；
(d) hEGF蛋白的分泌和纯化：将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入Ni-NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulp1室温反应10-30分钟或4℃下2-6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。
步骤c中所述的CHO细胞的培养方法为：100mm的培养皿中以3×106个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培养基，37℃置于恒温培养箱，5%CO2培养，至转染时要求80%-90%细胞汇合。
步骤c中的转染方法具体为：分别把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF质粒和12ul的转染试剂稀释到200ul无血清培养基中，室温放置五分钟再混合，将混合液在室温放置10―15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养4h后换液，继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。
步骤d中所述的清洗液含有20mmol/L咪唑，300mmol/L NaC，150 mmol/L NaH2PO4，pH值为8.0。
步骤d中所述的洗脱液含有250mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，150 mmol/LNaH2PO4，pH值为8.0。
步骤d中所述SUMO特异性切割酶Ulp1由以下方法制备得到：
(a) 构建重组质粒pET-28a-Ulp1：提取含Ulp1基因片段的质粒pMD18-T-Ulp1，经限制性内切酶Nde I和Xho I酶切得到Ulp1基因片段；与经同样双酶切的质粒pET-28a连接得到pET-28a-Ulp1；
(b) 构建重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1：将重组质粒pET-28a-Ulp1加入感受态细胞BL21，冰上放置30分钟，然后42℃水浴中热激90-120秒，冰上放置2-3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37℃恒温培养箱过夜培养；
(c) Ulp1的诱导表达及纯化：挑取重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1单克隆于含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，待OD600值0.6-0.8时加入IPTG至终浓度0.2mM，22℃诱导过夜；离心收菌，用破菌缓冲液重悬沉淀，加入PMSF，超声波破菌；细菌破碎液离心，取上清；上Ni-NTA柱纯化，Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用FPLC进一步纯化。
本发明采用现代生物技术，构建了微生物表达载体重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞），构建稳定的高分泌型工程菌，实现人表皮生长因子的生产。哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子。胞外分泌型表达是目前最先进的且适于工业化的表达方式，细胞外表达可以避免蛋白在保内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简单，利于大规模处理。
通过本发明的方法得到的hEGF，经过Balb/c 3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比具有较高生物学活性，可达到1×105U/mg。
附图说明
图1是重组质粒pET-28a-Ulp1构建示意图。
图2是重组质粒pET-28a-Ulp1经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切验证电泳图。
图3是重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6构建示意图。
图4是重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切验证电泳图。
图5是重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF构建示意图。
图6是重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切验证电泳图。
图7是hEGF蛋白纯化SDS-PAGE蛋白电泳图。
具体实施方式
实施例1：重组质粒pET-28a-Ulp1的构建
一）试验材料
(1)质粒和菌株
质粒pET-28a和大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
(2)试剂
限制性内切酶Nde I和Xho I，卡纳青霉素购自NEB公司。去磷酸化酶购自Takara生物科技有限公司。
(3)基因片段
Ulp1由华大基因合成。
二）实施方案
1.质粒pET-28a的酶切
大量提取重构质粒pET-28a，纯化后加入限制性内切酶Nde I和Xho I，置于37℃恒温培养箱1-4h做双酶切处理，将酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理，将去磷酸化产物纯化后置4℃冰箱保存待用。
2.Ulp1基因片段的获得
大量提取含Ulp1基因片段的质粒pMD18-T-Ulp1，纯化后加入限制性内切酶Nde I和Xho I，置于37℃恒温培养箱1-4h做双酶切处理，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收729bp片段，纯化后置4℃冰箱保存待用。
3.重组质粒pET-28a-Ulp1的构建
重组质粒pET-28a-Ulp1构建示意图如图1所示。
将步骤1和步骤2中4℃冰箱保存的基因片段按照以下配比加连接酶进行连接处理：线性化pET-28a 1μL；Ulp1基因片段4μL；连接酶0.5μL；dd H2O 3.5μL；Buffer 1μL。
将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过卡纳青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pET-28a-Ulp1。重组质粒pET-28a-Ulp1经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切验证电泳图如图2所示。
实施例2：重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1的构建
一）试验材料
(1)菌株
大肠杆菌BL21(DE3)购自Takara生物科技有限公司。
(2)试剂
卡纳青霉素购自NEB公司。
二）实施方案
1.质粒pET-28a-Ulp1的提取
大量提取重构质粒pET-28a-Ulp1，纯化后置4℃冰箱保存待用。
2.转化BL21感受态细胞
感受态细胞BL21(DE3)从-70℃取出，放在冰上1-5分钟使其融化，在超净台中取pET-28a-Ulp1 质粒0.5-1ul加入感受态细胞中，冰上放置15-30分钟，然后42℃水浴中热激90-120秒，冰上放置1-3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37℃恒温培养箱过夜培养。
实施例3.：Ulp1的诱导表达及纯化
一）试验材料
(1)试剂
卡纳青霉素、IPTG购自NEB公司。
二）实施方案
1.Ulp1的诱导表达
挑取单克隆于10ml含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养。将过夜培养物按1：100比例转接到新的1L含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养约2-3小时，待OD600值0.2-1.2时加入IPTG至终浓度0.2mM，22℃诱导过夜。
2.Ulp1的纯化
5000rpm15分钟离心收菌，弃上清倒置1分钟使残余培养基流尽。用破菌缓冲液（50mM NaH2PO4，500mM NaCl，pH8.0）重悬沉淀，5000rpm10分钟离心收菌，弃上清。取50ml破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1：200加入苯甲基磺酰氟 PMSF，超声波破菌5-15分钟，至半透明。细菌破碎液15000rpm15分钟离心，取上清。上Ni-NTA柱纯化，样品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用梯度洗脱缓冲液（50mMNaH2PO4，500mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脱，15％SDS-PAGE检测蛋白洗脱情况。Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用快速蛋白液相色谱FPLC进一步纯化。
实施例4：重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6的构建
一）试验材料
(1)质粒和菌株
质粒pcDNA3.1/mys-His A由江苏大学医学生物化学系郑学明教授惠赠；质粒pSecTag2 A购自Invitrogen公司；大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
(2)引物
限制性内切酶Bgl II和Stu I购自NEB公司；
二）实施方案
1.质粒pcDNA3.1/mys-His的酶切
将质粒pcDNA3.1(+)/myc-His A电转化法转入大肠杆菌JM109感受态，接种阳性转化子37℃摇床过夜培养，大量提取质粒纯化，加限制性内切酶Bgl II和Stu I置于37℃恒温培养箱进行双酶切处理，将处理产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收3392bp的片段，纯化后置4℃冰箱保存待用。
2.质粒pSecTag2 A的酶切
将质粒pSecTag2 A电转化法转入大肠杆菌JM109感受态，接种阳性转化子37℃摇床过夜培养，大量提取质粒纯化，加限制性内切酶Bgl II和Stu I置于37℃恒温培养箱进行双酶切处理，将处理产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收2186bp的片段，纯化后置4℃冰箱保存待用。
3.重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6的构建
重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6构建示意图如图3所示。
将步骤1和步骤2中得到的片段按照以下配比加连接酶进行连接处理：3392bp的片段2μL；2186bp的片段3μL；连接酶0.5μL；dd H2O 3.5μL；Buffer 1μL。将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6。重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切验证电泳图如图4所示。
实施例5：重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF的构建
一）试验材料
(1)质粒和菌株
大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。
(2)试剂
限制性内切酶BamH I和Xho I购自NEB公司。去磷酸化酶购自Takara生物科技有限公司。
(3)基因片段
hEGF由华大基因合成。
二）实施方案
1.质粒pBSAZ 1.1 myc-His6的酶切
大量提取重构质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，纯化后加入限制性内切酶BamH I和XhoI，置于37℃恒温培养箱1-4h做双酶切处理，得5525bp的片段。将酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理，将去磷酸化产物纯化后置4℃冰箱保存待用。
2.hEGF基因片段的获得
大量提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUMO-hEGF，纯化后加入限制性内切酶BamH I和Xho I，置于37℃恒温培养箱1-4h做双酶切处理，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收486bp片段，纯化后置4℃冰箱保存待用。
3.重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF的构建
重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF构建示意图如图5所示。
1步骤和2步骤中所得的4℃冰箱保存的基因片段按照以下配比加连接酶进行连接处理：5525bp的片段1μL；486bp的片段4μL；连接酶0.5μL；dd H2O 3.5μL；Buffer 1μL。
将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF。
重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切验证电泳图如图6所示。
实施例6：重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞
一）试验材料
(1)质粒和菌株
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）由上海交通大学系统生物医学研究院吴方老师惠赠。
(2)试剂
G418购自购自Invitrogen公司；
二）实施方案
1.重组质粒提取
大量提取重构质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF，纯化后置4℃冰箱保存待用。
2.CHO细胞的培养
100mm的培养皿中以3×106个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml培养基(含血清，不含抗生素)，37℃置于恒温培养箱，5%CO2培养，至转染时要求80%-90%细胞汇合。
3.重组质粒转染CHO细胞
分别把1-6ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF质粒和3-18ul的转染试剂PolyJet™稀释到200ul无血清培养基中，室温放置5-10分钟再混合，将混合液在室温放置5-15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养2-7h后换液（G418+培养基），继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。
实施例7：hEGF蛋白的纯化
收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心去除不容性的杂质，取上清。上清液利用AKTA purifier 100系统经过His TrapTM FF crude亲和层析，用清洗液（20mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8.0）洗去杂蛋白，再用洗脱液（250mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8.0）洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白。含有目的蛋白的样品缓慢加入Ni-NTA柱，使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS（pH7.3，140 mM NaCl，2.7mM NaCl，50 mM NaH2PO4）洗3个柱体积。向结合有Ig kappa-chain-His6-SUMO-hEGF蛋白的Ni-NTA柱中加入0.1mg的SUMO特异性切割酶Ulp1室温反应半小时或 4℃下2-6小时。酶切下来的hEGF用PBS洗脱下来，收集流出液进行SDS-PAGE电泳检测。
过柱纯化的hEGF蛋白进行SDS-PAGE电泳，最后在凝胶成像仪上成像，得到结果如图7所示。
实施例8：MTT法测定hEGF蛋白的活性
一）试验材料
1.小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/c 3t3细胞）购自ATCC。
2.试剂：
RPMI 1640培养基 1000ml 加青霉素105IU和链霉素105IU，再加NaHCO3 2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4度保存
维持培养液 牛血清 4ml 加RPMI1640 1000ml；
完全培养液 牛血清100ml 加RPMI1640 1000ml；
PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO3 1.44g KH2PO3 0.24g 加水至1000ml 经121度 15分钟灭菌；
噻唑蓝（MTT）溶液 取MTT粉末0.1g 加PBS20ml 溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，4度避光保存。
二）实施方案
1.取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作；
2.取样品复溶后，用维持培养液稀释。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作；
Balb/c 3t3细胞株用完全培养液于37度，5%CO2培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105-5.0×105个细胞，传代后24-36h用于生物活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×104-8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。在37度，5%CO2培养培养15-24h。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和样品溶液，每孔100μl。于37度，5%CO2培养60-72h。每孔加入MTT溶液20μl，于37度，5%CO2培养2-8h。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养液中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜（DMSO）100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
Balb/c 3t3细胞的活性测定实验显示与标准品相比hEGF样品具有较高生物学活性，检测到hEGF样品的活性为1×105U/mg。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。
Claims (6)
1.一种人表皮生长因子的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6：
提取质粒pcDNA3.1(+)/myc-His A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到3392bp的片段；
提取质粒pSecTag2 A，经限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切处理，得到2186bp的片段；
将3392bp片段与2186bp片段以体积比2:3的比例用连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶Bgl II和Stu I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6；
(b) 构建重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF：
提取重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6，经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，得到5525bp的片段，酶切产物纯化后，加去磷酸化酶做去磷酸化处理；
提取含hEGF基因片段的质粒pMD18-T-His6-SUMO-hEGF，经限制性内切酶BamH I和XhoI酶切得到486bp的hEGF基因片段；
将5525bp片段与486bp片段以体积比1:4的比例用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF；
(c) 重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞：在转染试剂存在下将重组质粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF转染CHO细胞，筛选得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株；
(d) hEGF蛋白的分泌和纯化：将转染后稳定细胞株于培养基中培养，收集含有分泌的目的蛋白培养基，离心取上清液；亲和层析，用清洗液除去杂蛋白后，加入洗脱液将hEGF洗脱，收集唯一的洗脱峰即为目的蛋白；将含有目的蛋白的样品缓慢加入Ni-NTA柱，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用PBS缓冲液洗3个柱体积；最后加入SUMO特异性切割酶Ulp1室温反应10-30分钟或4℃下2-6小时；用PBS洗脱酶切下来的hEGF，收集流出液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的CHO细胞的培养方法为：100mm的培养皿中以3×106个细胞的浓度接种CHO细胞，培养基为含5%的小牛血清的DMEM/F12培养基，转染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培养基，37℃置于恒温培养箱，5%CO2培养，至转染时要求80%-90%细胞汇合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中的转染方法具体为：分别把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUMO-hEGF质粒和12ul的转染试剂稀释到200ul无血清培养基中，室温放置五分钟再混合，将混合液在室温放置10―15分钟后滴入CHO细胞培养基中，培养4h后换液，继续筛选培养24-48小时得到阳性转化子，将转化子连续传代直至得到稳定细胞株。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述的清洗液含有20mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH值为8.0。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述的洗脱液含有250mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH值为8.0。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中所述SUMO特异性切割酶Ulp1由以下方法制备得到：
(a) 构建重组质粒pET-28a-Ulp1：提取含Ulp1基因片段的质粒pMD18-T-Ulp1，经限制性内切酶Nde I和Xho I酶切得到Ulp1基因片段；与经同样双酶切的质粒pET-28a连接得到pET-28a-Ulp1；
(b) 构建重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1：将重组质粒pET-28a-Ulp1加入感受态细胞BL21，冰上放置30分钟，然后42℃水浴中热激90-120秒，冰上放置2-3分钟，涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，置37℃恒温培养箱过夜培养；
(c) Ulp1的诱导表达及纯化：挑取重组菌株BL21/pET-28a-Ulp1单克隆于含卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，待OD600值0.6-0.8时加入IPTG至终浓度0.2mM，22℃诱导过夜；离心收菌，用破菌缓冲液重悬沉淀，加入PMSF，超声波破菌；细菌破碎液离心，取上清；上Ni-NTA柱纯化，Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用FPLC进一步纯化。
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