CN108456681B

CN108456681B - 高效表达重组人神经生长因子的基因组合

Info

Publication number: CN108456681B
Application number: CN201810252273.3A
Authority: CN
Inventors: 陈海; 孙洪亮; 张怡; 王跃生
Original assignee: Xintrum Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Xintrum Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2038-03-26
Also published as: US20200385477A1; CN108456681A; US11299548B2; WO2019184372A1

Abstract

本发明选择了优化的重组人神经生长因子的基因表达调控元件，提供了高效表达rhNGF的基因组合。该组合提高了rhNGF的表达水平，经实验证实，本发明提供的基因组合在真核表达系统中高效表达具有天然活性的重组人神经生长因子。

Description

高效表达重组人神经生长因子的基因组合

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种在真核表达系统中高效表达具有天然活性的重组人神经生长因子(rhNGF)的基因组合。

背景技术：

NGF具有神经元营养和促轴突生长双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。

NGF在体内以前体形式(proNGF)合成，包括“基因B”、前导肽和成熟NGF。“基因B”有助于蛋白的分泌；前导肽中有两部分保守区域为proNGF表达、酶解形成具有生物活性的蛋白以及成熟NGF的分泌所必需，且其还有助于蛋白的正确折叠。proNGF包含潜在的N糖基化位点，proNGF中前导肽的糖基化有助于其出内质网。proNGF经弗林蛋白酶或激素酶原转化酶在特定部位水解后形成具有生物学活性的成熟NGF。成熟NGF有118个氨基酸，呈双链二聚体结构。单链内共有6个半胱氨酸残基，可对应形成3对链内二硫键(Cys⁵⁸-Cys¹⁰⁸，Cys⁶⁸-Cys¹¹⁰，Cys¹⁵-Cys⁸⁰)，二硫键的正确形成是NGF具有活性的必要条件。

我国是世界上第一个也是唯一一个批准注射用mNGF(鼠神经生长因子)上市的国家。mNGF与人神经生长因子(hNGF)在蛋白质氨基酸序列上有10％差异，作为异源蛋白质长期使用有潜在的安全性问题，且存在鼠源病毒污染风险。

20世纪90年代起，国外多家制药公司和研发机构相继开始研究重组人神经生长因子，但迄今尚未有开发成功的rhNGF产品上市。其主要原因是NGF表达水平低、表达产物生物学活性差以及hNGF与mNGF的同源性问题。

例如，意大利Dompé公司研发的rhNGF滴眼液于2017年7月6日获欧洲药品管理局批准用于中度至重度神经营养性角膜炎的治疗，其中的活性成分rhNGF采用大肠杆菌表达系统以proNGF形式进行表达，由于该系统缺乏有效的翻译后修饰功能，不利于成熟NGF蛋白的正确折叠，表达产物为包涵体，后续工艺需要体外复性、蛋白酶切除前导肽才能获得目标蛋白，导致生产工艺复杂、产物得率低、生产成本高等缺点。

在真核表达系统中高效表达rhNGF是目前需要解决的技术难题。因为高效表达载体是实现rhNGF高产率的主要因素。在表达载体构建过程中采用合适的表达调控序列和合理的结构排列，可以提高rhNGF的表达水平。

发明内容

本发明的目的是优化重组人神经生长因子的基因表达调控元件，提供高效表达rhNGF的基因组合。

本发明人发现，通过选择适当的调控元件与人神经生长因子前体基因(以下亦简称为proNGF基因)进行连接，可以显著提高在真核表达系统中rhNGF的表达水平。

本发明提供了一种高效表达rhNGF的基因组合，所述组合为：“基因B—基因A”；

所述基因A，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，称为proNGF基因，包含前导肽基因和成熟hNGF，编码SEQ ID No.8所示序列的氨基酸；

所述基因B，其核苷酸序列如SEQ ID No.3(简称Pre)，或SEQ ID No.5(简称Luc)所示，它们编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示序列的氨基酸。

本发明提供了第二种高效表达rhNGF的基因组合，还包括有基因C的元件，连接顺序为：“基因C—基因B—基因A”；

所述基因C，其核苷酸序列如SEQ ID No.1(简称glo)，或SEQ ID No.2(简称aden)所示。

经实验证实，本发明提供的基因组合可以提高rhNGF的分泌效率，进而提高rhNGF的表达水平。

所述基因组合构建至表达载体。

所述表达载体为真核表达载体，可以通过瞬时转染或稳定转染的方式导入宿主细胞。

所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。

具体地，本发明进行了如下研究工作：

1、从蛋白质序列数据库UniProtKB中查询hNGF的氨基酸序列，获得ID为P01138的proNGF序列，如SEQ ID No.8所示，由金斯瑞生物科技有限公司根据CHO细胞表达的特点将proNGF氨基酸序列逆翻译为DNA序列并合成，如SEQ ID No.7所示。

2、在proNGF的5’端分别添加“基因B”Pre、Luc，如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示，获得不同“基因B”—proNGF基因组合，将其插入到真核表达载体中，通过瞬时转染导入CHO细胞，经培养后离心取上清，利用ELISA测定上清中rhNGF的含量，以proNGF的天然“基因B”为对照，基因序列如SEQ ID No.9(简称Nat)所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，比较不同“基因B”引导下的rhNGF表达水平。

3、利用限制性内切酶将“基因C”glo(如SEQ ID No.1所示)、aden(如SEQ ID No.2所示)分别构建至2所述表达载体中，获得含有“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体，以2所述载体为对照，通过2所述方法评估“基因C”对rhNGF瞬时表达的影响。

4、将3所述表达载体转染CHO细胞中，同时加入嘌呤霉素(puromycin)和甲氨蝶呤(MTX)进行两轮加压筛选以获得细胞池。

5、选择比产率高、细胞生长良好的细胞池利用有限稀释法进行单克隆，筛选获得高效表达rhNGF的工程细胞株。

6、生物反应器中测定工程细胞株的生长曲线、细胞活率及rhNGF表达水平的变化趋势。

7、采用TF-1细胞/MTS比色法测定rhNGF的生物学活性。

经实验证实，本发明提供的“基因B—proNGF”基因组合，相较于NGF天然基因组合，在真核表达系统中，rhNGF瞬时表达水平显著性提高(见实施例1)；

在所述“基因B—proNGF基因”组合5’端添加“基因C”可以进一步显著性提高rhNGF的瞬时表达水平(见实施例1)；基于所述“基因C—基因B—proNGF”基因组合构建的工程细胞株在生物反应器中培养，上清中rhNGF的表达量达78mg/L(见实施例2、3)，生物学活性与国际标准品相当，强于注射用mNGF(见实施例4)。

附图说明

图1：含有“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体p-Pre/Nat/Luc–pro-rhNGF(SfiI)－1的SfiI酶切检测，其中：

M：DL5000DNA Marker；

1：p-Pre-pro-rhNGF-8，SfiI酶切；

2：p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)-1，SfiI酶切；

3：p-Nat-pro-rhNGF(SfiI)-1，SfiI酶切；

4：p-Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1，SfiI酶切。

图2：含有“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体p-Pre/Nat/Luc–pro-rhNGF(SfiI)－1的AvrII、BstZ17I双酶切检测，其中：

M：DL5000DNA Marker；

1：p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)-1，AvrII、BstZ17I双酶切；

2：p-Nat-pro-rhNGF(SfiI)-1，AvrII、BstZ17I双酶切；

3：p-Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1，AvrII、BstZ17I双酶切。

图3：左右二图分别是两次“基因B”—proNGF基因组合对rhNGF瞬时表达的影响实验的结果。

图4：左右二图分别是两次“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合对rhNGF瞬时表达的影响实验的结果。

图5：含“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合的rhNGF真核表达载体简图；

“基因C”、“基因B”、前体序列(Pro)和成熟NGF序列(rhNGF)构成完整的重组基因组合。

图6：6株细胞批次培养上清Capto-S纯化后SDS-PAGE分析。

图7：生物反应器中培养的工程细胞株的生长曲线、细胞活率及rhNGF表达水平的变化趋势。

图8：TF-1细胞/MTS比色法测定的rhNGF刺激TF-1细胞增殖活性曲线。

序列表信息

SEQ ID NO.1：“基因C”glo的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：“基因C”aden的核苷酸序列。

SEQ ID NO.3：“基因B”Pre的核苷酸序列。

SEQ ID NO.4：“基因B”Pre的氨基酸序列。

SEQ ID NO.5：“基因B”Luc的核苷酸序列。

SEQ ID NO.6：“基因B”Luc的氨基酸序列。

SEQ ID NO.7：proNGF的核苷酸序列。

SEQ ID NO.8：proNGF的氨基酸序列。

SEQ ID NO.9：“基因B”Nat的核苷酸序列。

SEQ ID NO.10：“基因B”Nat的氨基酸序列。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。

实施例1表达rhNGF的基因组合的确定

1、proNGF基因的获得

从蛋白质序列数据库UniProtKB中查询rhNGF的氨基酸序列，获得ID为P01138的序列，proNGF的氨基酸序列由103个氨基酸的前导肽和120个氨基酸的成熟hNGF组成，C末端两个氨基酸(RA)对NGF的生物活性无影响，且天然NGF蛋白也会缺失这两个氨基酸，所以本发明的proNGF氨基酸序列由103个氨基酸的前导肽和118个氨基酸的hNGF组成，如SEQ IDNO.8所示，由金斯瑞生物科技有限公司根据CHO细胞表达的特点将proNGF氨基酸序列优化逆翻译为如SEQ ID NO.7所示的DNA序列并合成。

2、表达系统的选择

选择哺乳动物细胞表达系统进行rhNGF的表达，包含CHO细胞和真核表达载体，CHO细胞可以作为宿主细胞，真核表达载体包含两个插入点，可以同时表达两个基因，也可以根据需要移除第二个表达单元，构建单基因表达载体，该载体含有二氢叶酸还原酶选择标记和嘌呤霉素抗性基因，可用于MTX和puromycin的同时加压筛选，提高筛选的质量。

3、“基因B”元件的筛选

选择“基因B”Pre、“基因B”Luc引导rhNGF的分泌表达，与hNGF的天然“基因B”Nat进行比较。

3.1“基因B”—proNGF基因组合的获得

“基因B”Pre，基因序列如SEQ ID NO.3所示，与proNGF基因序列一起由金斯瑞生物科技有限公司合成，获得序列简称Pre-pro-rhNGF，5’和3’端分别添加AvrII、BstZ17I酶切位点，构建于质粒pUC57上，形成质粒pUC57-Pre-pro-rhNGF。基因Pre-pro-rhNGF通过限制性内切酶AvrII、BstZ17I双酶切质粒pUC57-Pre-pro-rhNGF获得，通过双酶切获得大小770bp左右的Pre-pro-rhNGF基因片段，利用胶回收试剂盒纯化后待用。“基因B”Luc、Nat，基因序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9所示，通过引物利用PCR的方法以pUC57-Pre-pro-rhNGF为模板添加至proNGF基因的5’端，获得2条740bp左右的基因片段，分别简称Luc-pro-rhNGF、Nat-pro-rhNGF，利用普通DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物，紫外分光光度计测定浓度。对纯化后的基因Luc-pro-rhNGF、Nat-pro-rhNGF通过限制性内切酶AvrII、BstZ17I进行双酶切，纯化后待用。

3.2含有“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体的构建

为将含不同“基因B”的proNGF基因构建至真核表达载体的EF2/CMV杂合启动子下游，利用限制性内切酶AvrII、BstZ17I对表达载体进行双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒进行纯化。

利用T4DNA连接酶将AvrII、BstZ17I双酶切后的基因Pre-pro-rhNGF、Luc-pro-rhNGF、Nat-pro-rhNGF连接至相同双酶切后的表达载体上，连接子化学转化至Top 10感受态细胞。转化长出的单菌落通过菌体PCR筛选阳性克隆，若目的基因成功连接至表达载体上，则PCR产物大小为1000bp左右；空载体的PCR产物为260bp左右。

挑选PCR筛选的阳性克隆p-Pre-pro-rhNGF-8、p-Nat-pro-rhNGF-1、p-Luc-pro-rhNGF-5进行测序，经序列比对分析，三个载体的“基因B”—proNGF基因组合序列与理论序列一致。

为表达rhNGF，应删去真核表达载体中第二个表达单元(CMV/EF1表达框)，保留第一个表达单元，变构为只表达一个单元的载体。为移除CMV/EF1表达框，利用限制性内切酶SfiI对测序正确的载体p-Pre-pro-rhNGF-8、p-Nat-pro-rhNGF-1、p-Luc-pro-rhNGF-5进行酶切，酶切产物经DNA产物纯化试剂盒纯化后，通过T4DNA连接酶对SfiI酶切的载体进行自连，连接子化学转化至Top 10感受态细胞，长出的单菌落通过菌体PCR筛选阳性克隆，成功移除CMV/EF1表达框的载体PCR产物无条带，否则PCR产物为535bp的条带。

根据菌体PCR的筛选结果，选择PCR产物无条带的单菌落抽提质粒p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)-1，p-Nat-pro-rhNGF(SfiI)-1，p-Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1，分别通过SfiI单酶切和AvrII、BstZ17I双酶切检测，阳性克隆的SfiI单酶切无条带切下，如图1所示，AvrII、BstZ17I双酶切切下大小740bp左右的条带，如图2所示。

将酶切鉴定正确的质粒p-Pre/Nat/Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1进行测序，经序列比对分析，三个表达载体插入的“基因B”—proNGF基因组合序列与设计序列一致。

3.3“基因B”—proNGF基因组合对rhNGF表达的影响

采用瞬时转染的方法测试各种“基因B”—proNGF基因组合表达rhNGF的效率。

(1)CHO细胞培养条件

培养基FortiCHO，补加8mM谷氨酰胺后为完全培养基。培养条件：轨道摇床(轨道直径2.5cm)，转速130rpm，二氧化碳浓度8％，温度37℃。CHO细胞在达到1.5-2.5×10⁶/mL时传代，传代后密度3-5×10⁵/mL。

(2)细胞转染方法

在转染前一天传代细胞，密度为5-6×10⁵/mL。在转染前用完全培养基调整细胞密度到1×10⁶/mL。根据实验目的选择合适的转染体积。在1.5mL微离心管中，按每10⁶待转细胞1.67μg的比例分别加入线性化后的表达载体p-Pre/Nat/Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1，加入optiPRO SFM使终体积为每10⁶待转细胞50μL，温和混均。在另一个1.5mL微离心管中按每10⁶细胞1.67μL FreeStyle Max转染试剂和48.33μL optiPRO SFM的比例加入两种试剂，温和混均。立即把稀释后的Max溶液同DNA溶液混合，室温放置10min，最长不要超过20min。逐滴把DNA：MAX混合溶液加入到细胞悬液中，立即放入摇床培养。

(3)rhNGF表达水平的测定

瞬时转染后，细胞培养48小时收样，ELISA测量不同“基因B”引导下rhNGF的表达水平，独立实验进行两次，如图3所示。结果表明“基因B”Pre、Luc-proNGF基因组合与NGF天然基因组合Nat-proNGF相比，rhNGF表达水平显著提高，所以Pre、Luc“基因B”与proNGF基因组合是较优的选择。

4、“基因C”元件的选择

在目的基因5’端添加“基因C”，可以增强mRNA的稳定性，进而增加目的蛋白的表达。选择“基因C”glo和aden，序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，与“基因B”、proNGF基因进行组合，考察其对rhNGF表达的影响。

4.1“基因C”的获得

“基因C”glo和aden的DNA序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，构建于同一质粒pUC57上，大小分别为150bp和296bp，序列两端都含有AvrII酶切位点，对应的质粒称为pUC57-glo-aden。glo和aden通过限制性内切酶AvrII单酶切质粒pUC57-glo-aden获得，利用胶回收试剂盒纯化后待用。

4.2含有“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体的构建

选择在3中所述瞬时表达rhNGF水平较高的载体p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)－1上添加“基因C”。通过限制性内切酶AvrII对其进行酶切，酶切产物经普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，利用T4DNA连接酶将AvrII酶切后的“基因C”片段glo、aden连接至载体p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)上，连接子化学转化至Top 10感受态细胞。转化长出的单菌落经菌体PCR筛选获得阳性克隆，分别命名为p-glo-Pre-pro-rhNGF(SfiI)和p-aden-Pre-pro-rhNGF(SfiI)，对这两个载体内的重组基因进行测序，经序列比对分析，“基因C”glo、aden序列与设计序列一致，由此获得含有“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体。

4.3“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合对rhNGF表达的影响

同样采用瞬时转染的方法测试“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合表达rhNGF的效率。CHO细胞培养条件、细胞转染方法同3.3中所述。

线性化的p-glo-Pre-pro-rhNGF(SfiI)和p-aden-Pre-pro-rhNGF(SfiI)表达载体瞬时转染CHO细胞，培养48小时后收样，通过ELISA检测上清中rhNGF含量评估表达效率，独立实验进行两次，如图4所示。结果证实在“基因B”—proNGF基因组合5’端添加“基因C”可以进一步显著提高rhNGF的表达水平，两个“基因C”之间无明显差异，由此确定“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合是表达rhNGF更优的选择，对应的真核表达载体中插入的基因元件组合依次为“基因C”、“基因B”、proNGF基因，如图5所示。

实施例2工程细胞株的建立

1、CHO细胞培养条件、细胞转染方法见3.3所述。

2、稳定筛选

转染48小时后，把细胞分成两份。一份加入10μg/mL puromycin和100nM MTX；另一份加入20μg/mL puromycin和200nM MTX。待细胞活率恢复到85％以上时，每份细胞再分成两份，分别加入30μg/mL puromycin/500nM MTX和50μg/mL puromycin/1000nM MTX，继续筛选。筛选结束的准则是细胞活率大于90％。两轮筛选共得到6个细胞池，分析比产率后，选择比产率高、细胞生长良好的细胞池用于单克隆。

3、有限稀释法单克隆和克隆筛选

克隆培养基为FortiCHO补加6mM谷氨酰胺。稀释待克隆的细胞到2-5个细胞/mL。用8通道移液器加细胞悬液到96孔板中，每孔200μL。把细胞放入二氧化碳培养箱中在37℃、5％二氧化碳下培养。根据成克隆的速度，培养11-14天后，从生成单克隆的孔中取20μL用ELISA的方法分析rhNGF的浓度。选取表达量高的克隆从96孔板中移到48孔板中，加入200μL新鲜培养基，加入MTX和puromycin筛选药物到单克隆前细胞池筛选的浓度，长满后传代到12孔板，等12孔板中细胞基本达到传代密度，取出细胞到离心管中，离心除去上清，用PBS洗一遍细胞后，重悬浮在1mL新鲜培养基中，加入到6孔板中，取30μL细胞悬液用于分析细胞密度，把6孔板放入培养箱培养2-4小时，取出100μL培养液离心收获上清，向6孔板每孔中加入1mL新鲜培养基和筛选药物，继续培养。培养上清用ELISA分析rhNGF浓度。采用公式计算细胞的比产率，比产率等于rhNGF浓度/细胞密度/孵育时间。按照比产率对克隆进行第二轮筛选。

对筛选获得的细胞进行传代稳定性试验，选取稳定性试验中表现良好的6株细胞进行批次培养，用Capto S层析柱初步纯化批次培养上清中的rhNGF，进行SDS-PAGE检测，结果如图6所示，表明在批次培养中13C5细胞表达的rhNGF中proNGF蛋白的含量较低，由于proNGF蛋白是产品相关的杂质，其含量越低越好，由此选择13C5细胞作为工程细胞株。

实施例3生物反应器中测定工程细胞株的生长曲线、细胞活率及rhNGF表达水平的变化趋势

采用流加(补料)培养作为工程细胞株的生产培养模式，将培养规模从摇瓶的30mL放大到2.5L，再进一步放大到28L规模可原位灭菌的机械搅拌生物反应器，搅拌桨为单斜叶桨，工作搅拌转速125rpm，大泡通气。溶氧控制先级联控制空气流量，达到最大气体流量设定值后，开始通入氧气，同步减少空气流量，保持总流量不变。pH在培养的初期通过控制CO₂流量维持在7.2，随细胞生长，pH会先降低，后反弹上升，待反弹至7.2时，用稀盐酸控制在设定值(pH7.2)，直到培养结束。细胞培养过程中定时取样监测细胞密度、活率以及rhNGF的浓度，汇总结果如图7所示。

从结果可以看出，培养至第5天细胞由指数生长期进入平台期，在余下6-10天的活细胞密度大致保持稳定，最高细胞密度达1.2×10⁷/mL，细胞活率维持在90％以上，培养过程中rhNGF浓度持续快速升高，培养结束时达78mg/L。

实施例4TF-1细胞/MTS比色法测定rhNGF的生物学活性

TF-1细胞/MTS比色法是《中国药典》2015年版三部收录的用于测定神经生长因子生物学活性的经典方法，采用此方法测定rhNGF的生物学活性，同时与国际标准品(货号：93/556，NIBSC)、注射用mNGF(商品名：苏肽生，舒泰神(北京)生物制药股份有限公司)进行比较。

将生长状态良好的人红细胞白血病细胞(TF-1细胞，已驯化的NGF依赖型，来源为中国食品药品检定研究院重组蛋白室)用基础培养基(1640+10％FBS+1％P/S)以5000个细胞每孔的量接入96孔板，每孔体积100μL；然后每孔分别加入100μL以基础培养基3倍梯度稀释的待测NGF(rhNGF、国际标准品(Std)、苏肽生(Sutaisheng))溶液，浓度设置为100、33、11、3.3、1.1、0.33、0.11、0.033ng/mL，每浓度两个复孔；混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱中培养72h；每孔加入20μL MTS，37℃，混匀孵育3h；于酶标仪492nm处检测各孔的OD值；以Graphpad 6.0软件拟合各组的吸光值-浓度关系曲线(选择四参数非线性回归方程拟合)；计算出各样品刺激TF-1细胞增殖的EC₅₀值，结果如图8所示。

从结果可以看出，在刺激TF-1细胞增殖活性上，rhNGF与国际标准品(Std)活性相当(EC₅₀分别为5.30ng/mL,5.26ng/mL)，而强于苏肽生(Sutaisheng)的活性(EC₅₀为14.82ng/mL)。

序列表

<110> 江苏中新医药有限公司

<120> 高效表达重组人神经生长因子的基因组合

<160> 10

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTCGACTGAT CACAGGTAAG TATCAAGGTT ACAAGACAGG TTTAAGGAGA CCAATAGAAA 60

CTGGGCTTGT CGAGACAGAG AAGACTCTTG CGTTTCTGAT AGGCACCTAT TGGTCTTACT 120

GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT 150

<210> 2

<211> 296

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GAATTAATTC GCTGTCTGCG AGGGCCAGCT GTTGGGGTGA GTACTCCCTC TCAAAAGCGG 60

GCATGACTTC TGCGCTAAGA TTGTCAGTTT CCAAAAACGA GGAGGATTTG ATATTCACCT 120

GGCCCGCGGT GATGCCTTTG AGGGTGGCCG CGTCCATCTG GTCAGAAAAG ACAATCTTTT 180

TGTTGTCAAG CTTGAGGTGT GGCAGGCTTG AGATCTGGCC ATACACTTGA GTGACAATGA 240

CATCCACTTT GCCTTTCTCT CCACAGGTGT CCACTCCCAG GTCCAACTGC AGGTCG 296

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGGACTCTA AAGGCTCCTC TCAGAAGGGT AGTAGGCTGC TGCTGCTGCT GGTGGTGTCA 60

AATCTGCTGC TGTGCCAGGG GGTCGTCAGC 90

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 4

Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser

20 25 30

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ATGGGTGTCA AGGTCCTGTT CGCACTGATT TGTATCGCCG TCGCAGAAGC C 51

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 长腹水蚤(gaussia)

<400> 6

Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu

1 5 10 15

Ala

17

<210> 7

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

GAGCCTCATA GTGAATCAAA CGTGCCTGCT GGCCACACCA TCCCACAGGC ACATTGGACA 60

AAGCTGCAGC ACAGCCTGGA CACAGCTCTG AGGCGGGCAC GCTCTGCCCC AGCCGCTGCA 120

ATCGCCGCTC GCGTCGCCGG ACAGACTCGA AATATTACCG TGGACCCCAG GCTGTTCAAG 180

AAAAGACGCC TGCGATCACC TCGTGTCCTG TTTTCCACTC AGCCCCCTCG AGAGGCAGCC 240

GATACCCAGG ACCTGGATTT CGAAGTGGGC GGAGCTGCAC CCTTCAACAG GACCCACCGG 300

AGTAAGAGAT CCAGCTCTCA CCCCATCTTC CATCGGGGGG AGTTCTCCGT GTGCGATTCC 360

GTGAGCGTCT GGGTGGGTGA CAAAACCACA GCTACAGATA TCAAGGGCAA AGAGGTCATG 420

GTGCTGGGAG AAGTCAATAT TAACAATTCC GTGTTCAAGC AGTACTTCTT TGAAACTAAA 480

TGCCGTGACC CAAACCCCGT CGATTCCGGG TGTAGAGGTA TTGACTCTAA GCATTGGAAT 540

AGTTATTGTA CTACCACACA CACATTTGTG AAGGCCCTGA CTATGGATGG CAAACAGGCC 600

GCTTGGAGAT TCATTCGTAT TGACACTGCT TGCGTCTGCG TGCTGAGTCG TAAGGCTGTG 660

CGG 663

<210> 8

<211> 221

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln

1 5 10 15

Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg

20 25 30

Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln

35 40 45

Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu

50 55 60

Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala

65 70 75 80

Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn

85 90 95

Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg

100 105 110

Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys

115 120 125

Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu

130 135 140

Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys

145 150 155 160

Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser

165 170 175

Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala

180 185 190

Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp

195 200 205

Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

210 215 221

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ATGTCAATGC TGTTTTACAC TCTGATTACC GCTTTTCTGA TCGGAATCCA GGCC 54

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

1 5 10 15

Gln Ala

18

Claims

1.一种表达重组人神经生长因子的基因，由核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的基因片段A与核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的基因片段B连接而成；且连接顺序为：“基因片段B—基因片段A”。

2.权利要求1所述的表达重组人神经生长因子的基因在制备重组人神经生长因子中的应用。

3.权利要求1所述的表达重组人神经生长因子的基因，还连接有基因片段C，连接且顺序为：“基因片段C—基因片段B—基因片段A”；

所述基因片段C，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

4.权利要求3所述的表达重组人神经生长因子的基因在制备重组人神经生长因子中的应用。

5.核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的人神经生长因子前体基因。

6.SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示核苷酸序列的基因在制备重组人神经生长因子中的应用。