CN103074374B - 人β-NGF的重组表达载体及含该载体的重组细胞株 - Google Patents
人β-NGF的重组表达载体及含该载体的重组细胞株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可稳定、高效表达人β-NGF的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组真核细胞，以及一种生产重组人β-NGF的方法。本发明所述重组表达载体包含启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因，在宿主细胞中的整合、表达效率较高。含该重组表达载体的重组真核细胞表达与天然β-NGF活性相当的重组人β-NGF，且经多次传代后仍能稳定表达；所表达的β-NGF分泌到培养基中，易分离、纯化，大大降低了生产下游的难度和成本，具有很好的临床应用前景和商业价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组人β-NGF的分泌型表达载体以及含该载体的重组细胞株。
背景技术
神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现、目前研究最为透彻的一种神经细胞生长调节因子，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经醋氨酸蛋白激酶、脂眈肌醇钙、内源性环腺昔酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。大鼠体内试验结果表明：NGF可改善由己二酮和丙烯胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经-肌肉动作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果表明，NGF有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤维数量等作用。以上结果提示：NGF有促进神经损伤修复的作用。
NGF包含α、β、γ三个亚基，活性区是β亚基，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGFβ亚基（简称β-NGF）具有完整的NGF生物学活性，是与BDNF，NT-3和NT-4结构相关的神经营养因子，为含有半胱氨酸结（cysteineknot）的稳定二聚体结构家族。β-NGF是一种强效的神经营养因子，通过其受体β-NGFR进行信号传递，在外周神经中知觉神经元和交感神经系统的发育中起到重要的作用。β-NGF还在B淋巴细胞中起到生长和分化因子的作用，可以增强B细胞的存活能力，抑制中性粒细胞的凋亡。上述研究结果提示，β-NGF是一种多功能的细胞因子，不仅在神经系统发育中起重要作用，在免疫调节中可能也具有重要的作用。
目前生产β-NGF的方法主要有两种：一种是从小鼠颌下腺提取的分子量约为13-14KD，沉降系数为2.5S的β-NGF，此种方式所获得的β-NGF具有如下缺点：（1）鼠NGF与人NGF在蛋白序列上有10%的差异，使其具有免疫原性，可能诱发抗体反应，从而降低药效；（2）具有鼠源病毒交叉感染的安全隐患；（3）生产依赖活体动物。另一种是由原核表达系统（E.coli）重组表达制备，此种方式的缺陷是，蛋白不能进行翻译后修饰，所得β-NGF活性明显低于天然β-NGF。因此，开发一种可稳定、高效表达天然活性β-NGF的表达系统具有重要的临床及商业价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种可稳定、高效表达天然活性β-NGF的重组表达载体，基于该重组表达载体的重组真核细胞株，以及基于该重组真核细胞株的生产人β-NGF的方法。
具体地，本发明提供了一种表达人β-NGF（即人神经生长因子β亚基）的重组表达载体，依次包含以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID No.1所示，人β-NGF基因序列如SEQ ID No.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ ID No.3所示。
上述重组表达载体中，所述启动子驱动人β-NGF基因和筛选标记基因的共表达；所述β球蛋白基因内含子，简称BGI，可增强人β-NGF基因的转录效率，还可促进mRNA从细胞核转移到内质网；所述内部核糖体进入位点，简称IRES，可招募核糖体对mRNA进行翻译，因此可调控其下游筛选标记基因的表达。
优选地，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。
所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或多色霉素抗性基因中的任意一种。
上述重组表达载体适用的起始构建载体不限，如在哺乳动物细胞中表达用的疫苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴病毒载体。
本发明的另一个目的在于提供一种重组真核细胞，所述真核细胞包含上述重组表达载体；或者所述真核细胞的基因组中整合有以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID No.1所示，人β-NGF基因序列如SEQ ID No.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ ID No.3所示。
上述重组真核细胞中，所述真核细胞为人NIH293细胞、中国仓鼠CHO细胞、COS细胞或MDCK细胞。
所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。
所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或多色霉素抗性基因中的任意一种。
本发明还提供了一种生产重组人β-NGF的方法，包括如下步骤：
（1）将上述重组表达载体转染真核细胞；
（2）筛选含有上述重组表达载体的细胞或整合有以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因的细胞，并进行培养；
（3）收集培养基并纯化细胞分泌出的人β-NGF。
本发明所提供的人β-NGF重组表达载体，与宿主细胞基因组的整合效率较高，包含该重组表达载体的重组细胞株分泌表达β-NGF蛋白的效率也较高，其分泌效率大于20pg/细胞/天；另外，本发明重组表达载体采用一个启动子同时诱导β-NGF基因和筛选标记基因转录、并使用IRES启动后者翻译的方式，使得细胞耐药性和表达量高度统一，因此，当使用该重组表达载体转染宿主细胞时，筛选出阳性表达细胞株的概率较大，所得重组表达细胞株在筛选条件下可持续、稳定表达β-NGF蛋白——细胞系经多次传代后，仍能高效表达β-NGF蛋白。
附图说明
图1为重组质粒pCMV-β-NGF的结构示意图；
图2为重组质粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr的结构示意图；
图3为本发明β-NGF重组细胞株适应无血清培养基培养所分泌的β-NGF的SDS-PAGE电泳图，β-NGF条带在大约13KD的位置；
图4为本发明β-NGF重组细胞株所分泌的β-NGF的部分质谱肽图；A、B、C、D、E、F分别为六段与理论序列相匹配的肽段的质谱图；
图5为本发明β-NGF重组细胞株所分泌的β-NGF诱导PC12细胞分化结果图；低浓度是指β-NGF含量为10ng/ml，高浓度是指β-NGF含量为100ng/ml；
图6为本发明β-NGF重组细胞株所分泌的β-NGF与市售鼠源β-NGF诱导PC12细胞分化的剂量-反应曲线；纵坐标为阳性细胞簇所占百分比，横坐标为β-NGF的浓度；
图7为SDS-PAGE&考马斯亮蓝染色检测10株本发明β-NGF重组细胞株的β-NGF产量；以系列浓度的BSA条带为参照；
图8为SDS-PAGE&考马斯亮蓝染色检测本发明β-NGF重组细胞株传代30、40、50、60次后的β-NGF分泌情况；P30、P40、P50、P60分别代表重组细胞传代30、40、50、60次后的培养基样品。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
试剂来源：
TriZol试剂，Superscript III逆转录酶，pfx DNA聚合酶，FreeStyle293培养基均购自Invitrogen公司。
pCMV-MCS载体、pIRES2-EGFP质粒来自Addgene公司。
实施例1本发明β-NGF重组表达质粒的构建
一、人β-NGF基因的克隆及pCMV-β-NGF重组载体的构建
（1）使用TriZol提取人胎盘细胞总RNA。
（2）以步骤（1）所得总RNA为模板,使用Superscript III逆转录酶逆转录合成cDNA库。
（3）以步骤（2）所得cDNA库为模板，使用特异性扩增β-NGF基因全长的引物，在pfx DNA聚合酶的催化下进行PCR扩增；PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，进行30个循环。
特异性扩增β-NGF基因全长的上、下游引物分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，上、下游引物分别包括了BamHI和HindIII的酶切位点，上游引物上还设计了Kozak序列（GCCACCATGg），并且点突变了β-NGF基因ATG启动密码子后第一个碱基（T突变成G）；下游引物上包含两个终止码（TGATAA）。
（4）收集并纯化PCR扩增产物，利用上、下游引物上的酶切位点——BamH I和Hind III将扩增片段构建到pCMV-MCS载体（包含CMV启动子和SEQ ID No.1所示β球蛋白基因内含子序列）上，即得重组质粒pCMV-β-NGF，其质粒图谱如图1所示。
（5）将步骤（4）所得重组质粒进行酶切电泳及测序分析，结果显示其含有与GeneBank公开的人β-NGF基因全长序列完全相同的序列。
二、重组质粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr的构建
（1）PCR扩增片段1——IRES
以市售pIRES2-EGFP质粒为模板，以IRES正向引物（其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，包含XhoI酶切位点）和IRES-dhfr反向融合引物（其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示）为引物对进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸45s，进行30个循环，得到长度为612bp的扩增片段1，收集并纯化PCR扩增片段1。
（2）PCR扩增片段2——dhfr
以人NIH293细胞总RNA逆转录合成的cDNA为模板，以IRES-dhfr正向融合引物（其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示）和dhfr反向引物（其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，包含BglII酶切位点）为引物对进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸45s，进行30个循环，得到长度为592bp的扩增片段2，收集并纯化PCR扩增片段2。
（3）IRES-dhfr融合扩增片段：
以上述PCR扩增片段1和2为模板，以IRES正向引物和dhfr反向引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，48℃退火30s，68℃延伸45s，进行5个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min20s，进行55个循环，得到IRES与dhfr的融合片段，片段长度为1170bp，收集并纯化IRES-dhfr融合片段。
（4）将IRES-dhfr融合片段构建到pCMV-β-NGF重组载体上
将上述IRES-dhfr融合片段用XhoI和BglII进行双酶切，所得酶切产物与经过XhoI和BglII酶切处理的pCMV-β-NGF重组载体连接，即得pCMV-β-NGF-IRES-dhfr重组质粒，其质粒图谱如图2所示；对pCMV-β-NGF-IRES-dhfr重组质粒进行酶切电泳及测序分析，测序结果显示：该重组质粒包含CMV启动子（序列如SEQ ID No.10所示）、β球蛋白基因内含子（序列如SEQ ID No.1所示）、β-NGF基因全长（序列如SEQ ID No.2所示）、IRES序列（如SEQ ID No.3所示）和dhfr基因（序列如SEQ ID No.11所示）。
实施例2本发明β-NGF重组细胞株的构建
一、NIH293细胞的转染与稳定筛选
（1）质粒纯化：实施例1所制备的pCMV-β-NGF-IRES-dhfr质粒使用氯化铯密度梯度离心法纯化，备用。
（2）转染与重组细胞株筛选：用DEME完全培养基（含10%小牛血清），在37℃、5%CO2的环境下培养NIH293细胞至60%单层，用磷酸钙共沉淀方法转染上述纯化后的pCMV-β-NGF-IRES-dhfr质粒至NIH293细胞中；24h后更换培养基，并加入50nM的MTX进行筛选。当细胞适应选择压力后，逐次递增MTX的浓度，依次为100nM，200nM，400nM和800nM。当细胞适应800nM的MTX后，进一步提升MTX浓度至1000nM，并使用有限稀释法选择高效表达β-NGF的单克隆细胞株，即为β-NGF重组细胞株。发明人通过此方法筛选出10株可稳定表达β-NGF的重组细胞株。
二、重组细胞株与无血清培养基适应
上述β-NGF重组细胞株通过逐步降低血清培养的方式，使其先适应了含1%FBS的DMEM培养基，接着在转瓶培养的方式下，逐步用FreeStyle293无血清培养基替换DMEM培养基，最终完全替换，使其完全适应FreeStyle293无血清培养基。
将一株已适应FreeStyle293无血清培养基的β-NGF重组细胞按1×106细胞/ml的起始密度置于装有FreeStyle293无血清培养基的摇瓶中连续培养6天，期间每天收集适量培养基，第1-6天的取样结果进行SDS-PAGE凝胶电泳（1,2,3,4,5,6分别代表第1、2、3、4、5、6天所收集的培养基，每个泳道的上样量为15微升培养基），考马斯亮蓝染色、脱色，结果如图3所示，图3显示：在大约13KDa的位置处有明显条带，说明β-NGF单体的相对分子量约为13KDa。
实施例3本发明β-NGF重组细胞株所分泌β-NGF的鉴定
将实施例2所得一株β-NGF重组细胞株进行无血清培养，收集培养基并进行蛋白浓缩得β-NGF，对β-NGF进行质谱鉴定。
质谱鉴定方法：
所得β-NGF采用毛细管液相色谱分离-电喷雾离子化-四级杆-飞行时间质谱法（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）进行肽图谱测定：β-NGF用胰蛋白酶水解后溶于0.1%(v/v)甲酸溶液，用反相纳升级液相色谱-电喷雾串联质谱进行分析。采用BEH130毛细管液相色谱，样品上样10μl至富集柱（180μm×20mm Symmetry C18trap column）上，用缓冲液A（即0.1%甲酸水溶液）以10μl/min流速脱盐10分钟，在线切换至反相C18分离柱（75μm×250mm）。洗脱梯度为：体积含量为1%～5%的缓冲液B（即含0.1%甲酸的乙腈溶液）5分钟，然后在90分钟内升高至体积含量为40%的缓冲液B，之后以体积含量为99%的缓冲液B冲洗分离柱15分钟，流速为200nL/min。根据由胰蛋白酶理论水解位点推断的β-NGF胰蛋白酶肽图谱的特征碎片离子数据，对所得质谱肽图进行分析，结果显示：有13段与理论序列相匹配的肽段，其中有代表性的6段序列及所处位置如表1所示，相应质谱图如图4所示；结论：质谱所测得的重组人β-NGF肽段序列与理论β-NGF基因翻译蛋白序列相符。
表1、与理论序列相匹配的肽段及位置
| 与理论序列相匹配的肽段 | 所处位置 |
| GEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIK | 10-32 |
| GKEVMVLGEVNINNSVFK | 33-50 |
| QYFFETK | 51-57 |
| GIDSKHWNSYCTTTHTFVK | 70-88 |
| FIRIDTACVCVLSR | 101-114 |
| IDTACVCVLSRK | 104-115 |
实施例4本发明β-NGF重组细胞株所分泌β-NGF的活性检测
β-NGF的活性检测采用PC-12诱导法，具体步骤如下：
在37℃、5%CO2环境下用DMEM完全培养基（含8%胎牛血清,8%马血清）培养PC12细胞至90%单层，胰酶消化细胞，并将消化后的细胞按每孔5×105个细胞种植于六孔板中；24h后，清除所有培养基并于每孔内加入2ml新鲜培养基和系列稀释的β-NGF，于37℃、5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养20～24小时；相差显微镜下观察PC12细胞，PC12细胞成蔟生长，细胞有纤维状突起的细胞簇为阳性细胞簇，所诱导阳性细胞簇的比例反映了β-NGF的活性。
活性检测试验分以下几组进行：
（1）阴性对照组：不加β-NGF；
（2）阳性对照组：加入系列浓度的市售鼠源β-NGF；
（3）实验组：加入系列浓度的实施例2所制本发明重组细胞株所分泌的β-NGF。
上述各组诱导PC12细胞分化的结果如图5所示，图5显示：与市售鼠源β-NGF相似，本发明重组细胞株分泌的β-NGF组可见阳性细胞簇，而阴性对照组则无阳性细胞簇；说明本发明重组细胞株所分泌的β-NGF具有诱导PC12细胞分化的活性。
统计不同浓度本发明β-NGF组以及市售鼠源β-NGF组所诱导的阳性细胞簇数占总细胞簇数的百分比，以阳性细胞簇百分比为纵坐标，以β-NGF浓度为横坐标绘制剂量-反应曲线，结果如图6所示，图6显示：相同浓度下，本发明重组细胞株所分泌的β-NGF活性与现有市售鼠源β-NGF的活性相当或更强。
实施例5本发明β-NGF重组细胞株分泌β-NGF的效率检测
β-NGF的含量检测方法：
将实施例2所制备的10株稳定表达β-NGF的重组细胞株置于装有低血清培养基（含1%FBS）的摇瓶中培养，1-2天后，离心收集细胞，并用新鲜培养基悬浮，调整细胞密度为1×106个细胞/毫升，继续培养24h后收集培养基，进行SDS-PAGE凝胶电泳，同时进行电泳的还有系列稀释的BSA标准品，电泳结束后将凝胶进行考马斯亮蓝染色、脱色，其结果见图7；密度扫描检测13KD位置处的条带光密度，参照BSA标准品的光密度，计算出β-NGF的含量。
经检测，上述10株β-NGF的重组细胞株培养基中的β-NGF含量为50～100毫克/升培养基，计算其表达效率约为20~50皮克/细胞/天。
实施例6本发明β-NGF重组细胞的细胞系稳定性试验
将实施例2所得β-NGF重组细胞株在无MTX低血清的培养基（含1%FBS）中传代30次，40次，50次和60次后，各取2×106个细胞种植在60mm培养皿里，更换新鲜培养基培养24小时后，收集培养基进行SDS-PAGE凝胶电泳，每泳道上样15微升，电泳结束后用考马斯亮蓝染色、脱色，观察结果，结果如图8所示，图8显示：细胞系经历30次，40次，50次和60次传代后仍能表达β-NGF，且表达效率稳定，培养基中β-NGF含量超过100mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种表达人β-NGF的重组表达载体，其特征在于，依次包含以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ IDNo.1所示，人β-NGF基因序列如SEQ ID No.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ ID No.3所示，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。
2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。
3.一种重组真核细胞，其特征在于，所述真核细胞含有权利要求1所述的重组表达载体；或者所述真核细胞的基因组中整合有以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID No.1所示，人β-NGF基因序列如SEQ ID No.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ IDNo.3所示，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。
4.如权利要求3所述的重组真核细胞，其特征在于，所述真核细胞为人NIH293细胞、中国仓鼠CHO细胞、COS细胞或MDCK细胞。
5.如权利要求3所述的重组真核细胞，其特征在于，所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或多色霉素抗性基因中的任意一种。
6.一种生产重组人β-NGF的方法，包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述重组表达载体转染真核细胞；
（2）筛选含有权利要求1所述重组表达载体的细胞，或整合有权利要求1所述重组表达载体的以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因的细胞，并进行培养；
（3）收集培养基并纯化细胞分泌出的人β-NGF。
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- 2013-01-16 CN CN201310016022.2A patent/CN103074374B/zh active Active
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| CN103074374A (zh) | 2013-05-01 |
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