CN100567482C - 高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及构建一种可以高效表达外源rhBMP2的CHO细胞株。主要是利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)作为宿主细胞，稳定转染外源的hBMP2质粒，经药物抗性筛选和基因扩增后得到稳定、高效表达rhBMP2的细胞株。细胞株的分泌表达产物能高效诱导成肌细胞系C2C12表达碱性磷酸酶来显示其刺激成骨的活性。获得CHO(rhBMP-2)单克隆细胞株，其BMP2表达量最高可达7.83ug/24h·10⁶细胞。通过本方法建立的重组CHO细胞株表达的rhBMP2具有与天然人BMP2相似的理化性质和生物活性，可用于治疗临床上不同原因引起骨缺损、骨不连和骨折延迟愈合等疾病。

Description

高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法

技术领域

本发明属于基因工程制药技术领域，涉及一种高效表达人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞CHO(rhBMP-2)及其建立方法。具体的说，是构建稳定转染人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因编码序列的永生化哺乳动物细胞系，通过压力筛选和基因扩增后，获得稳定、高效表达rhBMP2的克隆细胞株。

背景技术

由于创伤、感染、肿瘤以及发育异常等原因使骨丧失了一些骨质，形成的难治性骨缺损、骨不连以及骨折延迟愈合等症状是临床实践中棘手的难题之一。治疗骨缺损的最好方法是自体骨移植，但除了存在来源有限、取骨区会有并发症发生的可能之外，自体骨移植的修复速度较为缓慢，因而极大地限制其广泛使用。异体骨移植自然更不在话下了。寻找促进骨生长的因子与合适的骨移植替代材料混合来治疗临床上不同原因引起骨缺损、骨不连和骨折延迟愈合等疾病，一直是国内外许多实验室竟相努力的目标，寻找并建立一个体外大量获得稳定并具有生物活性的人骨形态发生蛋白2一直是国内外十分活跃的研究领域。

目前临床常用的骨移植替代材料大多没有骨诱导活性，仪具有骨传导和支持作用的人工或天然材料。如果将这些材料与具有高效骨诱导活性的成骨因子-骨形态发生蛋白(BMP)，根据组织工程原理结合起来，使其既具有骨诱导活性，又具有骨传导和支持作用，能大大提高骨移植修复材料的临床实用价值。

1889年，Senn发现脱钙的骨基质能够促进骨缺损的修复。1930年，Levander将骨的乙醇粗提物注射到小鼠组织中，发现能诱导新骨形成。1961年，Sharrard和Collins用乙二氨四乙酸去钙自体骨用于儿童脊柱融合的治疗。1965年，Urist在骨基质中找到了可以诱导骨形成的活性物质，并将这种活性物质命名为“骨形态发生蛋白”。1983年，Reddi和Sampath证实具有诱导骨形成活性的是骨基质中的蛋白组分而不是骨基质本身。1988年，Johnson和其同事开展了用纯化的人BMP治疗骨缺损的临床试验。

目前，已发现十多种骨形态发生蛋白，其中骨形态发生蛋白2、6、7具有较强的骨诱导作用。特别是BMP-2具有很强的诱导成骨的活性，能够单独在体内诱导骨形成，因此已被应用于骨折愈合，脊柱融合术，整形外科以及牙齿组织工程等众多临床应用中。

不同骨形态发生蛋白分子之间同源性很高，均以包含氮端信号肽、前肽和碳端成熟肽前体形式合成，经加工修饰后，切去信号肽和前肽部分后，成熟肽部分形成糖基化的同源或异源二聚体，诱导骨形成。但是天然BMP组织含量低、来源有限、分离纯化步骤繁琐，成本昂贵，而且存在感染、过敏等不良反应，难以满足临床实践的需要。

基因重组技术的建立为生产治疗用蛋白开辟了新途径。现在可以通过基因重组技术，大量制备人BMP，用于临床骨缺损等相关疾病的治疗。由于原核细胞外源基因表达系统自身的局限性难以克服，真核细胞外源基因表达系统广泛应用于表达需要翻译后修饰的生物活性蛋白，特别是哺乳动物表达系统具有准确的转录后修饰功能，与原核细胞表达系统和酵母细胞表达系统相比，表达的糖基化蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子，是目前重组糖蛋白生产的首选体系。

在不同的哺乳动物细胞表达系统中，中华仓鼠卵巢细胞(CHO)外源蛋白表达系统经过多年的实践运用，成为最成功的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，其优点是外源基因能够稳定整合于细胞染色体内，且易于规模化培养，这两个特点为大规模制备外源蛋白创造了条件。其中二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞缺乏内源性二氢叶酸还原酶，将含二氢叶酸还原酶基因和目的基因的表达载体共转染时，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因与目的基因通常整合于宿主染色体同一位点，在DHFR的竞争性抑制物：氨甲基喋呤(MTX)存在的条件下，DHFR基因拷贝数的增加带动从而达到提高目的基因表达量的目的。

目前在中国专利有关资料检索结果表明，通过将人BMP2与DHFR基因共转染DHFR缺失型的CHO细胞，经筛选扩增后，高效、稳定表达人BMP2的重组CHO细胞株尚未见报道。

发明内容

本发明的目的主要在于提供一种能够高效表达人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞株CHO(rhBMP-2)。

本发明的另一个目的在于通过建立重组CHO(rhBMP-2)细胞株的方法，建立一个有可能应用于表达其他生物活性蛋白的技术平台。

本发明的再一个目的在于公开了重组CHO细胞株CHO(rhBMP-2)在制备治疗具有诱导骨形成活性和促进骨缺损修复方面的应用。特别是表达的重组CHO细胞株CHO(rhBMP-2)在体外诱导骨形成、体内诱导异位骨形成和促进骨缺损修复方面已证明具有明显的治疗作用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效表达重组人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞株，命名为CHO(rhBMP-2)，该细胞株已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏时间2006年9月12日。分类命名中华仓鼠卵巢细胞株，保藏号为CGMCC NO.1813

本发明所述的高效表达重组人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞株，其特征在于，主要是利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达的细胞株。细胞株的分泌表达产物能高效诱导成肌细胞系C2C12表达碱性磷酸酶，获得CHO(rhBMP-2)单克隆细胞株，其表达量达到7.83ug/24h·10⁶细胞。

本发明所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能与所述DNA片段重组，形成适宜的表达质粒即可。例如原核细胞外源基因表达系统；真核细胞外源基因表达系统；酵母细胞表达系统等等，优选的表达载体是真核细胞外源基因表达系统；它能够与所述DNA片段重组，易于合成，可有效的分泌到培养液中。并且可以形成适宜表达有活性蛋白的表达质粒。

本发明重组人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞株CHO(rhBMP-2)的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工寡核苷酸合成与聚合酶链式扩增技术，克隆人BMP2全长序列的cDNA。

(2)人BMP2全长序列的cDNA克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中，构建哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1(+)-BMP2。

(3)用阳离子质脂体lipofect ine2000将pCDNA3.1(+)-BMP2和pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr^-。

(4)用G418和次黄嘌呤、胸腺嘧啶和甘氨酸的选择培养基筛选整合BMP2和dhfr基因的稳定转染细胞株。

(5)逐步递增氨甲蝶呤浓度的方式，扩增目的基因的拷贝数。

(6)用Westen Blot检测重组CHO细胞培养基中rhBMP2。

(7)通过有限稀释法从混合克隆中分离到单克隆，利用ELISA法检测单克隆培养基中rhBMP2的表达量，筛选到高效表达rhBMP2的工程细胞株。

(8)工程细胞株培养过程中分泌表达rhBMP2于培养基中。

本发明的具体制备方法描述如下：

1.试验材料和方法

1.1.细胞培养

二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr^-(CRL-9096；ATCC)购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，以IMDM培养基培养(GIBCO公司)，并在其中添加10^-4mol/L的次黄嘌呤和1.6×10^-5mol/L的胸苷(均购自Sigma公司)以及10％透析过的胎牛血清(购自天津市灏洋生物制品有限公司)。本实验涉及的细胞均是在含有5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养。

1.2真核表达质粒的构建：

以本实验室原有已构建的含有hBMP-2cDNA全长序列(GenBank accessionNo.NM 001200)的质粒pCDNA6A-hBMP-2为模板，通过PCR反应扩增得到全长序列hBMP-2的cDNA，并将其连接至表达载体质粒pCDNA3.1(+)中，构建了真核表达质粒pCDNA3.1(+)-hBMP-2。为方便克隆，在上下游引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点。

上游引物：5’-GCTGGATCCACCATGGTGGCCGGGACCCGCTGTC-3’

下游引物：5’-GCGTCTCGAGCTAGCGACACCCACAACCCTCCAC-3’

连接反应的产物转化感受态细胞E.coliDH5α，采用菌落PCR的方法筛选阳性菌落，并进一步提取质粒DNA进行酶切鉴定，鉴定结果与预期吻合，测序结果表明读码框完全正确。

1.3.转染及筛选阳性克隆

将构建好的质粒pCDNA3.1(+)-hBMP-2以及pSV2-dhfr按照摩尔比5∶1混合，Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)共转染CHO-dhfr^-细胞，同时用空载质粒pCDNA3.1(+)和pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr^-细胞作为对照。细胞转染24h后更换新鲜的IMDM选择培养基(含10％的FBS，700μg/ml的G418)培养，每三天换一次液，直至细胞克隆形成。

1.4.氨甲蝶呤的加压培养：

将步骤1.3中形成的所有克隆用细胞消化液Tryps in-EDTA(购自GIBCO公司)消化下来，接种到细胞培养皿中混合培养，待细胞生长达到90％的密度后，1∶6接种到新的细胞培养皿中，并在选择培养基中加入氨甲蝶呤(MTX)(购自Sigma公司)，使其终浓度达到0.1μmol/L，约2个星期后可见抗性克隆出现，将所有克隆消化下来，混合培养，细胞生长状况正常后，再以同样的程序用1μmol/L的MTX扩增转化子，最终得到能够在1μmol/L的MTX中正常生长的重组CHO细胞的混合克隆株，命名为CHO(rhBMP-2)。

1.5.Western blot鉴定rhBMP-2

将CHO(rhBMP-2)接种到细胞培养皿中，待细胞达到90％的密度后，换用无血清培养基培养(不加MTX)，2天后收集细胞培养液。采用三氯乙酸沉淀法提取细胞培养液中的蛋白。提取的蛋白做Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳以及Western blot进行分析鉴定。将样品分别用含有DTT和不含DTT的加样缓冲液混合，和Rainbow Marker一起在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后电转移到硝酸纤维素膜上，用含有5％脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭过夜。分别用一抗anti-BMP-2(购自R&D公司)单克隆抗体和带有辣根过氧化物酶的二抗anti-mouse IgG(购自Promega公司)孵育2h，然后与ECL试剂反应并曝光。

1.6.rhBMP-2的表达量检测

参照《组织培养和分子细胞学技术》所述的方法对CHO(rhBMP-2)细胞混合克隆进行单细胞分离培养，得到了14株单克隆细胞株。将这14株单克隆细胞株接种到96孔板，细胞生长达到90％的密度后更换新鲜培养基，24h后收取培养液上清，用hBMP-2ELISA Kit(购自武汉博士德公司)检测培养液上清中rhBMP-2的浓度，同时用CCK-8试剂盒(购自日本同仁化学研究所)测定各孔细胞数，根据结果计算出各单克隆细胞株的rhBMP-2表达量。

1.7.rhBMP-2的生物学活性检测

有文献报道鼠成肌细胞系C2C12在BMP-2的刺激培养下，由成肌细胞分化转变成成骨细胞，而碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是成骨细胞的标志酶。我们用不同浓度的rhBMP-2条件培养基刺激培养C2C12，通过测定ALP的活性变化来分析rhBMP-2的生物学活性。

1.7.1条件培养基的制备

将CHO(rhBMP-2)接种于含有10％FBS和1μmol/L MTX的IMDM培养基，待细胞生长达到90％的密度后，换用不含血清的DMEM培养(不加MTX)，24h后收集细胞培养液，4000g，4℃离心5min，取上清分装于1.5ml离心管，-70℃保存，使用时与正常培养基按比例混合使用。

1.7.2碱性磷酸酶活性的测定：

将收集的CHO(rhBMP-2)培养液上清分别以5％、10％和20％的比例添加到DMEM中，并同时添加FBS，使FBS的终浓度达到5％，以此混合培养基培养C2C12细胞，并以只含5％FBS的DMEM培养C2C12细胞作为对照，每两天换一次液。刺激培养5天后，先用CCK-8试剂检测各孔在450nm处的O.D值，再用PBS缓冲液洗涤3次，每孔加入50μl碱性磷酸酶反应底物溶液(4片Sigma#104phosphatasesubstrate溶解于15mL 50mmol/L glycine，1mmol/L MgCl2，pH10.5)，室温孵育20min。用Microplate Reader在405nm波长测定O.D值，结果除以使用CCK-8试剂测定的O.D值以标准化ALP结果。每组样品取6个复孔的平均值作图。

2.结果

2.1rhBMP-2真核表达载体的构建和鉴定：

以质粒pCDNA6A-hBMP-2为模板，进行PCR反应，扩增hBMP-2cDNA，再将PCR产物插入质粒pCDNA3.1(+)中，得到hBMP-2的真核表达载体pCDNA3.1(+)-hBMP-2(图1，Fig1)。对提取的质粒进行限制性内切酶酶切，电泳，可得到约1.2kb/5.4kb大小的片断，与预期结果相符(图2，Fig2)，测序结果证实插入片段的碱基序列和读码框完全正确。

2.2Western blot鉴定rhBMP-2在CHO细胞中的表达：

将CHO(rhBMP-2)细胞接种于细胞培养皿中，细胞生长达到90％的密度后更换成不含血清的DMEM继续培养，48h后收集培养液，三氯乙酸沉淀法提取培养液蛋白。将提取的蛋白样品用含有DTT和不含DTT的加样缓冲液混合，Tris-Tricine电泳及Western blot鉴定(图3，Fig3)。结果显示在还原和非还原的样品泳道中分别出现大小约为18kDa和大小约为30kDa的两条特异性蛋白条带，表明CHO(rhBMP-2)分泌表达rhBMP-2蛋白。根据hBMP-2的氨基酸组成计算可知，没有经过翻译后修饰的rhBMP-2蛋白大小约为13kDa，由此推测表达的rhBMP-2是经过糖基化等翻译后修饰的且以同源二聚体的形式分泌到培养基中的。

2.3rhBMP-2的表达量检测

通过单细胞分离培养的方法得到了14株rCHO(hBMP-2)的单克隆细胞株，ELISA法检测其表达量。结果显示，表达量可达3.6-7.83μg/24h/10⁶cells。

2.4rhBMP-2的生物学活性检测

采用分别含有5％、10％和20％CHO(rhBMP-2)细胞24h培养液的条件培养基刺激培养C2C12，并以只含5％FBS的DMEM培养C2C12细胞作为对照，5天后检测碱性磷酸酶活性(图4，Fig4)。结果显示，以CHO(rhBMP-2)细胞培养液制成的条件培养基培养的C2C12细胞中碱性磷酸酶活性与对照组相比有显著高，且表现出明显的剂量依赖型，这表明表达的rhBMP-2具有很强的生物学活性。

本发明的有益效果在于：

在综合分析前人对骨形态发生蛋白2的研究基础上，以二氢叶酸还原酶缺陷型的中华仓鼠卵巢细胞为表达系统，通过基因重组技术，建立了稳定高效表达重组人BMP2的工程细胞株。并通过活性试验证明重组CHO细胞株分泌表达的重组人BMP2具有显著的诱导成骨活性，重组人BMP2。通过本方法建立的重组CHO细胞株表达的rhBMP2具有与天然人BMP2更相似的理化性质和生物活性，可用于治疗临床上不同原因引起骨缺损、骨不连和骨折延迟愈合等疾病。

附图说明

图1hBMP-2表达载体pcDNA3.1(+)-hBMP-2的构建流程图。

图2pCDNA3.1(+)-BMP2构建验证。其中A：hBMP2D：pCDNA3.1(+)-BMP2酶切鉴定。

图3重组CHO细胞表达rhBMP2的Western Blot鉴定。其中M为分子量；1为对照；2非还原条件；3为还原条件。

图4重组人BMP2的生物学活性分析。其中ALP/CCK-8：碱性磷酸酶的相对活性rhBMP2CM：CHO(BMP2)条件培养基。

具体实施方式

下面结合说明书附图和以下具体实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：pCDNA3.1(+)-BMP2构建

根据人骨形态发生蛋白2(BMP2，SEQ ID NO.1)的基因序列，设计并合成2对特异引物(B2F，B2R)。以B2F，B2R为引物，利用聚合酶链式反应扩增得到约1200bp大小的片段(图2A)。将此片段克隆到真核表达载体中得到pCDNA3.1(+)-BMP2，经酶切(图2B)、测序证实与预期目的序列一致。

B2F：5’-gctggatccaccatggtggccgggacccgctgtc-3’

B2R：5’-gcgtctcgagctagcgacacccacaaccctccac-3’

实施例2：稳定高效表达重组人BMP2的工程细胞株的建立

二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)用添加甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶10％FBS IMEDM(Hyclone)的完全培养基，在37℃、5％CO2、10cm培养板培养细胞至80％左右融合。用阳离子质脂体Lipofectine 2000(Invitrogen)将pCDNA3.1(+)-BMP2与pSV2-DHFR以10∶1比例，按照操作手册方法转染，然后用含700ug/ml G418和10％FCS IMDM的选择培养基筛选neo和dhfr阳性克隆。获得的阳性克隆以1×10⁶/10ml细胞接种于10cm细胞培养皿，逐步用含有100nM和1uM氨甲蝶呤(MTX)和10％FBS的IMDM培养基培养细胞，以扩增目的基因，最终得到能在含有1uM MTX培养基中正常生长的重组细胞。提取重组细胞的细胞培养液蛋白进行Western Blot，检测重组细胞rhBMP2蛋白表达情况(图3)。将经1uM MTX扩增后的混合克隆，以0.3-0.5个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，用10％FBS DMEM培养。待细胞接近汇合时，收集培养基，ELISA法检测筛选稳定高效表达rhBMP2的工程细胞株rCHO(BMP2)。

实施例3：重组人BMP2体外诱导骨形成活性分析

成肌细胞系C2C12用含10％FBS的DMEM培养至70-80％汇合时，PBS洗涤、胰酶消化、计数，以2x10⁴个细胞/孔接种于48孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱孵育。24小时后吸净培养基，以PBS冲洗两遍，分别加入含有5％、10％、20％rCHO(BMP2)24h细胞培养液的条件培养基刺激培养C2C12。5天后用CCK-8试剂盒计数每孔细胞数，然后比色法测碱性磷酸酶活性(图4)，表达量最高可达7.83μg/24h/10⁶细胞。

序列表：

<110>南开大学

<120>高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法

<160>1

<210>1

<211>1547bp

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

ggggacttct tgaacttgca gggagaataa cttgcgcacc ccactttgcg ccggtgcctt 60

tgccccagcg gagcctgctt cgccatctcc gagccccacc gcccctccac tcctcggcct 120

tgcccgacac tgagacgctg ttcccagcgt gaaaagagag actgcgcggc cggcacccgg 180

gagaaggagg aggcaaagaa aaggaacgga cattcggtcc ttgcgccagg tcctttgacc 240

agagtttttc catgtggacg ctctttcaat ggacgtgtcc ccgcgtgctt cttagacgga 300

ctgcggtctc ctaaaggtcg accatggtgg ccgggacccg ctgtcttcta gcgttgctgc 360

ttccccaggt cctcctgggc ggcgcggctg gcctcgttcc ggagctgggc cgcaggaagt 420

tcgcggcggc gtcgtcgggc cgcccctcat cccagccctc tgacgaggtc ctgagcgagt 480

tcgagttgcg gctgctcagc atgttcggcc tgaaacagag acccaccccc agcagggacg  540

ccgtggtgcc cccctacatg ctagacctgt atcgcaggca ctcaggtcag ccgggctcac  600

ccgccccaga ccaccggttg gagagggcag ccagccgagc caacactgtg cgcagcttcc  660

accatgaaga atctttggaa gaactaccag aaacgagtgg gaaaacaacc cggagattct  720

tctttaattt aagttctatc cccacggagg agtttatcac ctcagcagag cttcaggttt  780

tccgagaaca gatgcaagat gctttaggaa acaatagcag tttccatcac cgaattaata  840

tttatgaaat cataaaacct gcaacagcca actcgaaatt ccccgtgacc agacttttgg  900

acaccaggtt ggtgaatcag aatgcaagca ggtgggaaag ttttgatgtc acccccgctg  960

tgatgcggtg gactgcacag ggacacgcca accatggatt cgtggtggaa gtggcccact  1020

tggaggagaa acaaggtgtc tccaagagac atgttaggat aagcaggtct ttgcaccaag  1080

atgaacacag ctggtcacag ataaggccat tgctagtaac ttttggccat gatggaaaag  1140

ggcatcctct ccacaaaaga gaaaaacgtc aagccaaaca caaacagcgg aaacgcctta  1200

agtccagctg taagagacac cctttgtacg tggacttcag tgacgtgggg tggaatgact  1260

ggattgtggc tcccccgggg tatcacgcct tttactgcca cggagaatgc ccttttcctc  1320

tggctgatca tctgaactcc actaatcatg ccattgttca gacgttggtc aactctgtta  1380

actctaagat tcctaaggca tgctgtgtcc cgacagaact cagtgctatc tcgatgctgt  1440

accttgacga gaatgaaaag gttgtattaa agaactatca ggacatggtt gtggagggtt  1500

gtgggtgtcg ctagtacagc aaaattaaat acataaatat atatata                1547

Claims (5)

1、高效表达重组人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞株CHO(rhBMP-2)其保藏号为CGMCC NO.1813。

2、如权利要求1所述的高效表达重组人骨形态发生蛋白2的重组CHO细胞株，其特征在于利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达的细胞株；该细胞株的分泌表达产物能高效诱导成肌细胞系C2C12表达碱性磷酸酶，获得CHO(rhBMP-2)单克隆细胞株，其rhBMP-2的表达量达到7.83ug/24h·106细胞。

3、权利要求1或2所述的重组CHO细胞株CHO(rhBMP-2)在制备治疗具有诱导骨形成活性和促进骨缺损修复药物方面的应用。

4、权利要求1或2所述CHO(rhBMP-2)细胞株的建立方法，包括以下步骤：

(1)人工寡核苷酸合成与聚合酶链式扩增技术，克隆人BMP2全长序列的cDNA；

(2)人BMP2全长序列的cDNA克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中，构建哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1(+)-BMP2；

(3)用阳离子质脂体lipofectine2000将pCDNA3.1(+)-BMP2和pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr^-；

(4)用G418和次黄嘌呤、胸腺嘧啶和甘氨酸的选择培养基筛选整合BMP2和dhfr基因的稳定转染细胞株；

(5)逐步递增氨甲蝶呤浓度的方式，扩增目的基因的拷贝数；

(6)用Western Blot检测重组CHO细胞培养基中rhBMP2；

(7)通过有限稀释法从混合克隆中分离到单克隆，利用ELISA法检测单克隆培养基中rhBMP2的表达量，筛选到高效表达rhBMP2的工程细胞株；

(8)工程细胞株培养过程中分泌表达rhBMP2于培养基中。

5、权利要求4所述建立方法表达的重组CHO细胞株CHO(rhBMP2)在制备治疗体外诱导骨形成、体内诱导异位骨形成和促进骨缺损修复药物方面的应用。

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