CN112501126B - 一种cho-dhfr+细胞株及其应用 - Google Patents

一种cho-dhfr+细胞株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112501126B
CN112501126B CN202011393700.3A CN202011393700A CN112501126B CN 112501126 B CN112501126 B CN 112501126B CN 202011393700 A CN202011393700 A CN 202011393700A CN 112501126 B CN112501126 B CN 112501126B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cho
recombinant
dhfr
cell strain
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011393700.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112501126A (zh
Inventor
乔磊
杨盼盼
郑彬彬
王建刚
吴明远
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd
Original Assignee
Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd filed Critical Kanglitai Biomedical Qingdao Co ltd
Priority to CN202011393700.3A priority Critical patent/CN112501126B/zh
Publication of CN112501126A publication Critical patent/CN112501126A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112501126B publication Critical patent/CN112501126B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种CHO‑DHFR+细胞株及其应用。该细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019264。本发明的CHO‑DHFR+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物NH4 +的积累，细胞倍增水平高、细胞活力高。采用含IL‑10基因序列的pcDNA3.1‑β重组质粒载体转染该CHO‑DHFR+细胞株，能够获得表达重组IL‑10的工程细胞株，通过含有G418的CD OptiCHO培养基培养，高效表达重组IL‑10蛋白，重组IL‑10蛋白的瞬转表达量大于0.96mg/L，有较好的商业应用价值。

Description

一种CHO-DHFR+细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种CHO-DHFR+细胞株及其应用。
背景技术
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞，因为与其他系统相比，CHO细胞具有以下优点：①CHO细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能，因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②CHO细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强，可根据培养要求选择可贴壁培养或悬浮培养的方式；③整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达；④表达的目的蛋白可由细胞内运输到细胞外，并且CHO细胞只表达少量的内源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市场上一半以上最为畅销的生物制剂是由CHO细胞产生的。如，阿达木单抗(Humira)、贝伐单抗(Avastin)和利妥昔单抗(Rituxan)。可以说，CHO细胞对现代生物药工业发展做出了不可磨灭的贡献。
目前CHO细胞在工业上的筛选类型有：
①二氢叶酸还原酶营养缺陷突变细胞株(代表细胞CHO-DG44(Thermo),CHO-DUXB11(Chasin Lab))：DHFR是dihydrofolate reductase的缩写。该细胞系为DHFR基因缺陷型。DHFR用于催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。突变体不能合成四氢叶酸。因而不能在缺乏次黄嘌呤(Hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)的培养基上生长。只有导入DHFR或者培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶才能生长。因此DHFR可作为筛选标记或报告基因。
CHO-DG44在1983年诞生。CHO-DG44具有DHFR双缺陷，被敲除了2个位点。DG44可用于筛选，在工业使用也最广泛。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的拮抗剂，可使DHFR大量表达，因此可使细胞外源基因的拷贝数扩增并得到较高表达。
DHFR基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。但该系统也存在一些不足，如该方法需要较高浓度的MTX，而外源基因表达水平不高，增加了筛选细胞克隆的工作量等。
②谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统(代表细胞CHOK1SV-KO(Lonza)，CHOZN(Merk)，CHO-S(Thermo))是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，速度快，稳定性好，产量高等优势，同时该系统由于不需要额外谷氨酰胺的添加导致了更低的代谢废物氨的含量，更好的细胞活率，更有利于后续的工业化生产，但使用成本较高。
CN107760650A公开了一种经改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及其用途，所述经改造的CHO细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度生长，并且优选地不表达功能性的谷氨酰胺合成酶和岩藻糖基转移酶8。该方法敲除了CHO细胞的内源性GS基因，因此，后续培养过程中需要在培养基中补加较大量的谷氨酰胺，而谷氨酰胺不稳定，4℃下放置7天即可分解约50％，而且降解产物不利于细胞生长。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种高效表达重组蛋白的CHO-DHFR+细胞株，该CHO-DHFR+细胞株经过筛选获得并进行了生物材料保藏，保藏日期：2019.11.09；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏编号：CCTCC NO：C2019264；分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-DHFR+。本发明的第二目的在于提供该保藏的CHO-DHFR+细胞株在表达重组蛋白中的应用。本发明的第三目的在于提供一种表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法。本发明的第四目的在于提供上述构建方法构建获得的表达重组IL-10的工程细胞株。本发明的第五目的在于提供一种利用上述表达重组IL-10的工程细胞株培养表达重组IL-10的方法。
本发明的目的通过以下技术手段得以实现：
一方面，本发明提供一种CHO-DHFR+细胞株，该细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019264。本发明的CHO-DHFR+细胞株是通过脂质体将pSV2-DHFR质粒转染后利用无HT的CDOptiCHO培养基加压筛选获得，其与谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统细胞株具有类似的性能，该CHO-DHFR+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物NH4 +的积累，同时能够高效表达重组蛋白(例如：重组IL-10)。
另一方面，本发明还提供上述筛选保藏的CHO-DHFR+细胞株在表达重组蛋白中的应用。
上述的应用中，优选地，所述重组蛋白包括重组IL-10。
再一方面，本发明还提供一种表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：
将优化后的IL-10基因连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体；
采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入上述筛选保藏的CHO-DHFR+细胞株中，得到表达重组IL-10的工程细胞株。
上述的构建方法中，优选地，所述优化后的IL-10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：
ATGCACTCCAGCGCCCTGCTGTGCTGTCTGGTGCTGCTGACCGGCGTGAGAGCTTCTCCTGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACTCCTGCACACATTTCCCCGGCAACCTGCCTAATATGCTGAGGGACCTGCGGGATGCCTTTTCCCGCGTGAAGACATTCTTTCAGATGAAGGACCAGCTGGATAATCTGCTGCTGAAGGAGAGCCTGCTGGAGGACTTCAAGGGCTACCTGGGCTGTCAGGCTCTGTCTGAGATGATCCAGTTTTATCTGGAGGAAGTGATGCCACAGGCCGAGAACCAGGACCCCGATATCAAGGCTCACGTGAACTCCCTGGGCGAGAATCTGAAGACCCTGAGACTGCGCCTGAGGCGGTGCCATAGGTTCCTGCCATGTGAGAATAAGTCCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAACGCTTTTAATAAGCTGCAGGAGAAGGGCATCTACAAGGCCATGAGCGAGTTCGATATCTTTATCAACTACATCGAGGCTTATATGACAATGAAGATCAGGAATTGA
所述优化后的IL-10基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：2：
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
将优化后的IL-10基因(SEQ ID NO：1)连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体的核苷酸序列如下SEQ ID NO：7所示。
SEQ ID NO：7：
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGCACTCCAGCGCCCTGCTGTGCTGTCTGGTGCTGCTGACCGGCGTGAGAGCTTCTCCTGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACTCCTGCACACATTTCCCCGGCAACCTGCCTAATATGCTGAGGGACCTGCGGGATGCCTTTTCCCGCGTGAAGACATTCTTTCAGATGAAGGACCAGCTGGATAATCTGCTGCTGAAGGAGAGCCTGCTGGAGGACTTCAAGGGCTACCTGGGCTGTCAGGCTCTGTCTGAGATGATCCAGTTTTATCTGGAGGAAGTGATGCCACAGGCCGAGAACCAGGACCCCGATATCAAGGCTCACGTGAACTCCCTGGGCGAGAATCTGAAGACCCTGAGACTGCGCCTGAGGCGGTGCCATAGGTTCCTGCCATGTGAGAATAAGTCCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAACGCTTTTAATAAGCTGCAGGAGAAGGGCATCTACAAGGCCATGAGCGAGTTCGATATCTTTATCAACTACATCGAGGCTTATATGACAATGAAGATCAGGAATTGAGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
再一方面，本发明还提供上述构建方法构建获得的表达重组IL-10的工程细胞株。
再一方面，本发明还提供一种利用上述表达重组IL-10的工程细胞株培养表达重组IL-10的方法，其包括以下步骤：
将上述的表达重组IL-10的工程细胞株采用含有G418的CD OptiCHO培养基培养，表达获得重组IL-10。
上述的方法中，优选地，所述重组IL-10的瞬转表达量大于0.96mg/L。
上述的方法中，优选地，每ml含有G418的CD OptiCHO培养基中，所述G418的质量为200～700μg。
本发明的CHO-DHFR+细胞株是通过脂质体将重组质粒转染后利用无次黄嘌呤和胸腺嘧啶的CD OptiCHO培养基加压筛选获得，其与谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统细胞株具有类似的性能，该CHO-DHFR+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物NH4 +的积累，细胞倍增水平高、细胞活力高。采用含IL-10基因序列的pcDNA3.1-β重组质粒载体转染该CHO-DHFR+细胞株，能够获得表达重组IL-10的工程细胞株，通过含有G418的CDOptiCHO培养基培养，能够高效表达重组IL-10蛋白，重组IL-10蛋白的瞬转表达量大于0.96mg/L，有较好的商业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中采用的pSV2-DHFR质粒的图谱。
图2为本发明实施例2中采用本发明实施例1的CHO-DHFR+细胞株与市售CHO-S细胞株的细胞生长曲线对比图。
图3为本发明实施例3中pcDNA3.1-β质粒的图谱。
图4为本发明实施例4中采用本发明实施例1的CHO-DHFR+细胞株构建的表达重组IL-10的工程细胞株与市售的CHO-S细胞株构建的表达重组IL-10的工程细胞株的Westren-blot对比检测结果。
图5为本发明实施例5中采用本发明实施例1的CHO-DHFR+细胞株与市售CHO-S细胞株的代谢废物NH4 +积累量的对比图。
用于专利程序的培养物保藏：
本发明的CHO-DHFR+细胞株；
保藏日期：2019.11.09；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；
保藏编号：CCTCC NO：C2019264；
分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-DHFR+。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。本发明实施例中所采用的试剂原料等，若无特殊说明，均为市售获得；本发明实施例中所采用的方法，若无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例1：CHO-DHFR+细胞株筛选过程
本实施例提供一种CHO-DHFR+细胞株，该CHO-DHFR+细胞株是通过如下方法筛选获得的：
(1)复苏CHO-DG44细胞(市售获得)进行传代适应培养，待细胞生长状态恢复正常，则开始准备进行转染。
(2)转染当天，将CHO-DG44细胞用OptiMEM离心清洗后重悬至3.0×106cells/ml，然后按0.8ml/孔将细胞加入6孔板中备用。
(3)混合DNA(每孔)，将2.5μg的DNA(pSV2-DHFR质粒)加入到100μL的OptiMEM培养基中，轻轻混匀。空白孔使用2.5μL的PBS代替DNA，将混合物室温孵育30min。
所述pSV2-DHFR质粒的信息如下表1所示：
表1：
Figure BDA0002813737910000071
Figure BDA0002813737910000081
所述pSV2-DHFR质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述pSV2-DHFR质粒中的DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述pSV2-DHFR质粒图谱如图1所示。
(4)混合lipofectamine2000(每孔)，将10μL的lipofectamine2000加入到100μL的OptiMEM培养基中，轻轻混匀后室温孵育30min。
(5)混合(每孔)，将混合DNA轻轻加入混合lipofectamine2000中，轻轻混匀后，室温孵育10min。
(6)转染；将孵育好的混合样品均匀加入准备好的6孔板中，并轻轻混匀，混匀完成后将细胞放入37℃，5％二氧化碳培养箱培养5～6小时。
(7)换液加压筛选：将以上转染好的细胞分别收集离心，然后按2ml/孔加入新鲜的筛选培养基CD OptiCHO重悬，然后转入新的6孔板培养。CD OptiCHO培养基不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶，CHO-DG44细胞不能正常生长，只有转入目的基因的细胞才能在CD OptiCHO培养基中生长。
(8)转移：换液48小时后将6孔板细胞转入对应数目的10cm细胞培养皿，补加8ml/皿新鲜的CD OptiCHO培养基继续培养筛选。
(9)传代筛选：每隔3～4天将培养皿中的细胞收集至15ml离心管中1000rpm 5min离心后弃上清，加入10ml/皿新鲜的CD OptiCHO培养基重悬培养。传代筛选五个代次后，空白对照细胞几乎全部死亡，转染组pSV2-DHFR细胞存活并转移至摇瓶继续传代培养。
(10)单克隆铺板：摇瓶传代适应5个代次后，取适量细胞悬液，按0.5cell/200μL/孔的密度铺96孔板，进行单克隆筛选。
(11)换液培养：每隔3～4天从96孔单克隆板中吸出50μL/孔上清液，补加100μL/孔新鲜的CD OptiCHO培养基继续培养，并显微镜观察细胞生长情况。
(12)克隆转移：换液培养4代后，将96孔板中有明显细胞生长的孔转移至24孔板中扩大培养。
(13)扩大培养：24孔板中细胞长满后进一步转移至6孔板中扩大培养。6孔板细胞长满后转移至125ml摇瓶培养，初始摇瓶培养体积10ml，培养条件37℃，5％CO2，125rpm培养。
(14)扩大冻存：每隔2～3天传代摇瓶细胞，待细胞适应10个代次左右，细胞生长稳定后，冻存细胞获得成功转入DHFR基因的细胞株CHO-DHFR+。
经鉴定，该筛选获得的细胞株为中国仓鼠卵巢细胞CHO-DHFR+，该筛选获得的CHO-DHFR+细胞株已进行了生物材料保藏，保藏日期：2019.11.09；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏编号：CCTCC NO：C2019264；分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-DHFR+。
实施例2：CHO-DHFR+细胞株生长性能的对比评估
将本发明实施例1构建保藏的CHO-DHFR+细胞株与市售的CHO-S细胞株进行细胞生长性能评估对比实验，具体如下：
(1)复苏本发明实施例1的CHO-DHFR+细胞株和市售的CHO-S细胞株(对照组)至新鲜的CD OptiCHO培养基(含3mM谷氨酰胺)中进行传代适应培养，至细胞生长状态恢复正常。
(2)将恢复至正常生长状态的细胞以0.5×106cells/ml密度接种至125ml的摇瓶中，每瓶30ml。
(3)接种当天记做day0，从接种后每天取50μl细胞悬液在细胞计数仪上进行细胞活率和密度的检测，依次获得day1,day2,day3....等检测数据，直至细胞活率低于70％。
(4)汇总整理所得数据，即得两株细胞的生长曲线图，实验结果如图2所示。
由图2可以看出：本发明CHO-DHFR+细胞在相同条件下(均用低浓度3mM谷氨酰胺培养)，该细胞株密度略高于CHO-S细胞，而细胞活率维持显著高于CHO-S细胞，证明该本发明CHO-DHFR+细胞株有较好的商业应用价值。
实施例3：高效表达重组IL-10的工程细胞株的构建
本实施例提供一种高效表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：
(1)复苏本发明实施例1的CHO-DHFR+细胞株至新鲜的CD OptiCHO培养基中进行传代适应培养，至细胞生长状态恢复正常。
(2)将恢复至正常生长状态的细胞以0.5×106cells/ml密度接种至125ml的摇瓶中，每瓶30ml。
(3)将优化后的IL-10基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体(其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)。
所述pcDNA3.1-β质粒如下：
pcDNA3.1-β质粒的复制子为pUC origin，启动子为CMV promoter，抗性标记为Amp(R)，主要酶切位点包括EcoRⅠ和XbaⅠ。质粒中所插入Neo(R)基因是氨基糖苷磷酸转移酶基因，该基因表达的蛋白能够使G418(长那霉素衍生物)失活，因此可以用G418对阳性目的基因受体细胞进行筛选。
所述pcDNA3.1-β质粒的图谱如图3所示。
图3中，hCMV promoter：232bp-819bp，人巨细胞病毒启动子序列。
β：967bp-1953bp，人白介素12蛋白β亚基基因序列。5’端插入位点为EcoR I，3’端插入位点为Xba I。
BGH pA：1994bp-2218bp，牛生长因子多聚腺苷酸序列。
f1 origin：2264bp-2692bp，噬菌体DNA复制起始位点。
SV40 early promoter：2697bp-3066bp，猴空泡病毒40早期启动子序列。
Neo(R)：3102bp-3896bp，新霉素抗性基因。
SV40 pA：4070bp-4200bp，猴空泡病毒40多聚腺苷酸序列。
pUC Ori：4583bp-5253bp，大肠杆菌DNA复制起始位点。
Amp(R)：5398bp-6258bp，氨苄青霉素抗性基因序列。
(4)采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入步骤(1)的CHO-DHFR+细胞株中。
(5)收获检测：将单克隆筛选获得的细胞株进行Elisa和Westren-blot检测重组IL-10蛋白的表达量。
实施例4：CHO-DHFR+细胞株生产性能的对比评估
采用实施例3构建的表达重组IL-10的工程细胞株，与之进行对比的为采用市售的CHO-S细胞株按照实施例3的构建方法，构建获得表达重组IL-10的工程细胞株。Elisa对比检测结果如表2所示，Westren-blot对比检测结果如图4所示。
表2：
Figure BDA0002813737910000111
由表2的Elisa实验结果可以看出：本发明的CHO-DHFR+细胞株构建的表达重组IL-10的工程细胞株的重组IL-10蛋白的瞬转表达量为0.9652214mg/L(965221.4pg/mL)，而采用市售的CHO-S细胞株构建的表达重组IL-10的工程细胞株的重组IL-10蛋白的瞬转表达量为0.32mg/L；其与图4的Westren-blot实验结果具有较好的一致性，本发明CHO-DHFR+细胞株的生产性能要优于市售的CHO-S细胞株。另外通过与外购阳性品对照，结果表明本发明表达重组IL-10的工程细胞株能够表达重组IL-10蛋白，且表达蛋白的分子量与阳性品一致。
实施例5：CHO-DHFR+细胞株代谢性能的对比评估
将本发明实施例1构建保藏的CHO-DHFR+细胞株与市售的CHO-S细胞株进行细胞代谢性能评估对比实验，具体如下：
(1)复苏本发明实施例1的CHO-DHFR+细胞株和市售的CHO-S细胞株(对照组)至新鲜的CD OptiCHO培养基(含3mM谷氨酰胺)中进行传代适应培养，至细胞生长状态恢复正常。
(2)将恢复至正常生长状态的细胞以0.5×106cells/ml密度接种至125ml的摇瓶中，每瓶30ml。
(3)接种当天记做day0，从接种后每天取1ml细胞悬液在1000rpm离心5min后收集上清，在生化分析仪上进行NH4 +的检测，依次获得day1，day2，day3....等检测数据，直至细胞活率低于60％。
(4)汇总整理所得数据，即得两株细胞的NH4 +积累曲线图，实验结果如图5所示。
由图5以看出：本发明同样浓度3mM谷氨酰胺供应条件下，CHO-DHFR+细胞株的代谢废物NH4 +积累量显著低于CHO-S细胞，这有利于后期工业化生产细胞活率维持和蛋白表达。
综上所述，本发明的CHO-DHFR+细胞株生长性能，生产性能，代谢性能等均优于市售同类型的对照细胞，本发明的该CHO-DHFR+细胞株具有较好的商业化应用前景。
序列表
<110> 康立泰药业有限公司
<120> 一种CHO-DHFR+细胞株及其应用
<130> GAI19CN6355
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 优化后的IL-10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(537)
<400> 1
atg cac tcc agc gcc ctg ctg tgc tgt ctg gtg ctg ctg acc ggc gtg 48
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1               5                   10                  15
aga gct tct cct ggc cag ggc acc cag tct gag aac tcc tgc aca cat 96
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
            20                  25                  30
ttc ccc ggc aac ctg cct aat atg ctg agg gac ctg cgg gat gcc ttt 144
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
        35                  40                  45
tcc cgc gtg aag aca ttc ttt cag atg aag gac cag ctg gat aat ctg 192
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
    50                  55                  60
ctg ctg aag gag agc ctg ctg gag gac ttc aag ggc tac ctg ggc tgt 240
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65                  70                  75                  80
cag gct ctg tct gag atg atc cag ttt tat ctg gag gaa gtg atg cca 288
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
                85                  90                  95
cag gcc gag aac cag gac ccc gat atc aag gct cac gtg aac tcc ctg 336
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
            100                 105                 110
ggc gag aat ctg aag acc ctg aga ctg cgc ctg agg cgg tgc cat agg 384
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
        115                 120                 125
ttc ctg cca tgt gag aat aag tcc aag gcc gtg gag cag gtg aag aac 432
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
    130                 135                 140
gct ttt aat aag ctg cag gag aag ggc atc tac aag gcc atg agc gag 480
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145                 150                 155                 160
ttc gat atc ttt atc aac tac atc gag gct tat atg aca atg aag atc 528
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
                165                 170                 175
agg aat tga 537
Arg Asn
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1               5                   10                  15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
            20                  25                  30
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
    50                  55                  60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
                85                  90                  95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
            100                 105                 110
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
        115                 120                 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
    130                 135                 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145                 150                 155                 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
                165                 170                 175
Arg Asn
<210> 3
<211> 4900
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSV2-DHFR载体
<400> 3
ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 60
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 120
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 180
actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 240
ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag 300
tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctttatcc ccgctgccat 360
catggttcga ccattgaact gcatcgtcgc cgtgtcccaa gatatgggga ttggcaagaa 420
cggagaccta ccctggcctc cgctcaggaa cgagttcaag tacttccaaa gaatgaccac 480
aacctcttca gtggaaggta aacagaatct ggtgattatg ggtaggaaaa cctggttctc 540
cattcctgag aagaatcgac ctttaaagga cagaattaat atagttctca gtagagaact 600
caaagaacca ccacgaggag ctcattttct tgccaaaagt ttggatgatg ccttaagact 660
tattgaacaa ccggaattgg caagtaaagt agacatggtt tggatagtcg gaggcagttc 720
tgtttaccag gaagccatga atcaaccagg ccacctcaga ctctttgtga caaggatcat 780
gcaggaattt gaaagtgaca cgtttttccc agaaattgat ttggggaaat ataaacttct 840
cccagaatac ccaggcgtcc tctctgaggt ccaggaggaa aaaggcatca agtataagtt 900
tgaagtctac gagaagaaag actaacagga agatgctttc aagttctctg ctcccctcct 960
aaagctatgc atttttataa gaccatggga cttttgctgg ctttagatct ttgtgaagga 1020
accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa 1080
ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt 1140
attttagatt ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga 1200
ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc 1260
tcaacattct actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc 1320
agaattgcta agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc 1380
tatttacacc acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc 1440
tgtaaccttt ataagtaggc ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc 1500
acacaggcat agagtgtctg ctattaataa ctatgctcaa aaattgtgta cctttagctt 1560
tttaatttgt aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca 1620
taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 1680
ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 1740
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 1800
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcccca 1860
ggaagctcct ctgtgtcctc ataaacccta acctcctcta cttgagagga cattccaatc 1920
ataggctgcc catccaccct ctgtgtcctc ctgttaatta ggtcacttaa caaaaaggaa 1980
attgggtagg ggtttttcac agaccgcttt ctaagggtaa ttttaaaata tctgggaagt 2040
cccttccact gctgtgttcc agaagtgttg gtaaacagcc cacaaatgtc aacagcagaa 2100
acatacaagc tgtcagcttt gcacaagggc ccaacaccct gctcatcaag aagcactgtg 2160
gttgctgtgt tagtaatgtg caaaacagga ggcacatttt ccccacctgt gtaggttcca 2220
aaatatctag tgttttcatt tttacttgga tcaggaaccc agcactccac tggataagca 2280
ttatccttat ccaaaacagc cttgtggtca gtgttcatct gctgactgtc aactgtagca 2340
ttttttgggg ttacagtttg agcaggatat ttggtcctgt agtttgctaa cacaccctgc 2400
agctccaaag gttccccacc aacagcaaaa aaatgaaaat ttgacccttg aatgggtttt 2460
ccagcaccat tttcatgagt tttttgtgtc cctgaatgca agtttaacat agcagttacc 2520
ccaataacct cagttttaac agtaacagct tcccacatca aaatatttcc acaggttaag 2580
tcctcattta aattaggcaa aggaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 2640
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 2700
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 2760
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 2820
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 2880
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 2940
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 3000
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg 3060
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 3120
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 3180
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 3240
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 3300
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag 3360
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 3420
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 3480
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 3540
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 3600
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 3660
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 3720
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 3780
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3840
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3900
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3960
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 4020
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 4080
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 4140
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 4200
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 4260
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 4320
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 4380
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 4440
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 4500
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 4560
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 4620
tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 4680
tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg 4740
tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 4800
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 4860
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag 4900
<210> 4
<211> 564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHFR
<400> 4
atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaag atatggggat tggcaagaac 60
ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 120
acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180
attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240
aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300
attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360
gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420
caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480
ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540
gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40pro-F
<400> 5
tatttatgca gaggccgagg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40pA-R
<400> 6
gaaatttgtg atgctattgc 20
<210> 7
<211> 5951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重组质粒载体
<400> 7
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccatgcac tccagcgccc tgctgtgctg 960
tctggtgctg ctgaccggcg tgagagcttc tcctggccag ggcacccagt ctgagaactc 1020
ctgcacacat ttccccggca acctgcctaa tatgctgagg gacctgcggg atgccttttc 1080
ccgcgtgaag acattctttc agatgaagga ccagctggat aatctgctgc tgaaggagag 1140
cctgctggag gacttcaagg gctacctggg ctgtcaggct ctgtctgaga tgatccagtt 1200
ttatctggag gaagtgatgc cacaggccga gaaccaggac cccgatatca aggctcacgt 1260
gaactccctg ggcgagaatc tgaagaccct gagactgcgc ctgaggcggt gccataggtt 1320
cctgccatgt gagaataagt ccaaggccgt ggagcaggtg aagaacgctt ttaataagct 1380
gcaggagaag ggcatctaca aggccatgag cgagttcgat atctttatca actacatcga 1440
ggcttatatg acaatgaaga tcaggaattg agaattctgc agatatccag cacagtggcg 1500
gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag 1560
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 1620
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 1680
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 1740
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 1800
ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 1860
tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 1920
cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 1980
tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 2040
tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 2100
cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 2160
ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 2220
gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 2280
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 2340
accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 2400
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 2460
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 2520
gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 2580
ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga 2640
tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 2700
gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 2760
gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 2820
gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 2880
ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 2940
gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 3000
atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 3060
caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 3120
gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 3180
gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 3240
atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 3300
gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 3360
tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 3420
ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc 3480
aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt 3540
tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca 3600
tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 3660
gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 3720
tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct 3780
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 3840
acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 3900
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 3960
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 4020
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 4080
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 4140
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 4200
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 4260
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 4320
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 4380
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 4440
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 4500
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 4560
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 4620
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 4680
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 4740
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4800
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4860
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 4920
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 4980
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 5040
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 5100
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 5160
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 5220
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 5280
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 5340
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 5400
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 5460
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 5520
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 5580
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 5640
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5700
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5760
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5820
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5880
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5940
cacctgacgt c 5951

Claims (8)

1.一种CHO-DHFR+细胞株，该细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019264。
2.权利要求1所述CHO-DHFR+细胞株在表达重组蛋白中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述重组蛋白包括重组IL-10。
4.一种表达重组IL-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：
将优化后的IL-10基因连接至pcDNA3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体；所述优化后的IL-10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示；
采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入权利要求1所述CHO-DHFR+细胞株中，得到表达重组IL-10的工程细胞株。
5.权利要求4所述构建方法构建获得的表达重组IL-10的工程细胞株。
6.一种利用权利要求5所述表达重组IL-10的工程细胞株培养表达重组IL-10的方法，其包括以下步骤：
将权利要求5所述的表达重组IL-10的工程细胞株采用含有G418的CD OptiCHO培养基培养，表达获得重组IL-10。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述重组IL-10的瞬转表达量大于0.96mg/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，每ml含有G418的CD OptiCHO培养基中，所述G418的质量为200～700μg。
CN202011393700.3A 2020-12-03 2020-12-03 一种cho-dhfr+细胞株及其应用 Active CN112501126B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011393700.3A CN112501126B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 一种cho-dhfr+细胞株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011393700.3A CN112501126B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 一种cho-dhfr+细胞株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112501126A CN112501126A (zh) 2021-03-16
CN112501126B true CN112501126B (zh) 2023-04-07

Family

ID=74969468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011393700.3A Active CN112501126B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 一种cho-dhfr+细胞株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112501126B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5328989A (en) * 1993-03-05 1994-07-12 Schering-Plough Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium
CN101012453A (zh) * 2006-10-12 2007-08-08 南开大学 高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法
WO2018032464A1 (zh) * 2016-08-18 2018-02-22 广东东阳光药业有限公司 一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法
CN111040999A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 南京拂晓生物科技有限公司 一种稳定表达gpc3的重组cho细胞株及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5328989A (en) * 1993-03-05 1994-07-12 Schering-Plough Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium
CN101012453A (zh) * 2006-10-12 2007-08-08 南开大学 高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法
WO2018032464A1 (zh) * 2016-08-18 2018-02-22 广东东阳光药业有限公司 一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法
CN111040999A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 南京拂晓生物科技有限公司 一种稳定表达gpc3的重组cho细胞株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of recombinant glycosylated human interleukin 2 produced by a recombinant plasmid transformed CHO cell line;P Ferrara等;《FEBS Lett.》;19871221;第226卷(第1期);第47-52页 *
人白细胞介素10基因克隆及真核表达;孙辉等;《中国公共卫生》;20010131;第21卷(第1期);摘要，第46页右栏第2段，第47页右栏第2段 *
马建岗等.基因工程学原理.《基因工程学原理》.西安交通大学出版社,2001,第172页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112501126A (zh) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102630017B1 (ko) 프로그램화된 사멸 1 리간드 1 (pd-l1) 결합 단백질 및 그의 사용 방법
CN112480264B (zh) 一种以tigit和pd-1为靶点的嵌合抗原受体、car-t细胞及其制备方法
CN109714962A (zh) 用于在体外培养细胞的系统和方法
CN108424931A (zh) CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法
CN107098969B (zh) 一种治疗hiv感染的嵌合抗原受体的重组基因构建及其应用
CN112210543B (zh) 一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞
CN110656090A (zh) 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用
CN112779292B (zh) 构建瘦肉率高、生长快且抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用
CN112522264B (zh) 一种导致先天性耳聋的CRISPR/Cas9系统及其在制备模型猪核供体细胞中的应用
CN112779291A (zh) 构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗系列流行病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用
JP6298455B2 (ja) 産生細胞株エンハンサー
CN111089972B (zh) 一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒及其应用
CN111272998A (zh) 一种同时检测中枢脱髓鞘自身抗体aqp4、mog和mbp的方法
CN107002041B (zh) 在分泌弗林蛋白酶的哺乳动物表达系统中产生被完全加工且功能性的因子x
CN114958762B (zh) 一种构建神经组织特异过表达人源snca的帕金森病模型猪的方法及应用
CN108707626B (zh) 一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法
CN112501126B (zh) 一种cho-dhfr+细胞株及其应用
KR20220139344A (ko) 신경변성 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CN112877362A (zh) 构建高繁殖力、抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN108059675B (zh) 重组pg9-car分子的构建及其在清除hiv-1感染细胞中的应用
CN112029797B (zh) 一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用
CN109097392A (zh) 一种基于PiggyBac载体的Her2-CAR-T系统构建方法
CN108070033A (zh) 一种3bnc-car分子的构建及其在杀灭hiv-1感染细胞中的应用
CN106591207B (zh) 用于表达aif及整合有aif的重组单链抗体的菌株及该菌株的应用
CN112877363A (zh) 一种构建瘦肉率高、生长快且繁殖力高的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20211102

Address after: 266111 Room 405, building 6, Qingdao blue biomedical industrial park, No. 368 Hedong Road, high tech Zone, Qingdao, Shandong

Applicant after: Kanglitai biomedical (Qingdao) Co.,Ltd.

Address before: 266001 Room 401, building 6, Qingdao blue biomedical industrial park, No. 368 Hedong Road, high tech Zone, Qingdao, Shandong

Applicant before: KANGLITAI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant