CN112029797B - 一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用 - Google Patents

Abstract

一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用属于基因工程领域，具体涉及一种基于目的蛋白连接Cre重组酶与Lox2272‑Loxp序列特异识别实现评价目的蛋白与基因启动子相互作用的方案。通过Cre重组酶与Lox2272‑Loxp序列的特异性识别，实现启动子先反转，后启动，从而实现下游的萤火虫荧光素酶延迟转录。该方案的优势可极大降低荧光素酶背景，使荧光素酶滞后于目的蛋白表达，更灵敏反应目的蛋白对靶基因启动子的调控作用。本发明提供了一套瞬时转染质粒载体，其能够实现蛋白与启动子互相作用高灵敏分析。载体A其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；载体B其：核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

Description

一种哺乳动物启动子活性评价质粒载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于目的蛋白连接Cre重组酶与Lox2272-Loxp序列特异识别实现评价目的蛋白与基因启动子相互作用的方案。特别涉及一种通过Cre重组酶与Lox2272-Loxp序列的特异性识别，实现启动子序列的反转，从而实现启动子下游的萤火虫荧光素酶得以表达。该方案的优势可极大降低荧光素酶背景，使荧光素酶的表达滞后于目的蛋白表达，更灵敏反应目的蛋白对靶基因启动子的调控作用。

背景技术

1.DNA与蛋白相互作用的研究

在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。随着DNA重组技术的发展，人们已经分离得到了很多重要基因，且对基因的调控研究越发趋于透彻。在DNA与蛋白相互作用的研究中，科研工作者取得了越来越多丰硕的成果，但是细胞内的调控属于类似网状结构，错综复杂，给科研工作带来了很多挑战。然而，了解DNA与蛋白互作对生命科学和临床医学研究至关重要，目前研究表明，DNA与蛋白的互作可以调控基因的转录，翻译，表观遗传修饰等重要的生理过程。目前研究DNA-蛋白质相互作用的经典实验方法主要包括：1、凝胶阻滞法；2、DNaseI足迹法；3、甲基化干扰法；4、体内足迹法与下拉实验法。

凝胶阻滞法，又称为DNA迁移率变动实验，或条带阻滞实验，产生于80年代初期，其原理主要是在凝胶电泳中，由于电场的作用，DNA分子在电场中由负极向正极泳动的速度与距离与DNA分子量成反比。若DNA分子与某个蛋白结合，则会改变DNA 的整体分子质量，从而使其在凝胶电泳中受到阻滞，使得泳动距离缩短，呈现片状弥散的放射状条带，从而可判定DNA与某个蛋白存在相互作用。该方法操作简便，可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA(含有转录因子结合位点)结合的转录因子蛋白质。但该方法阴性率较高，某些DNA与蛋白的互作须在辅助作用因子的参与下进行，或在体内的互作具有严格的时空效应。因此，采用该方式进行时，只能判断直接与DNA分子有较强亲和力的直接作用蛋白，对于复杂的多因素互相作用，该方式无法进一步判别。

在上一步方案的基础上，科学家又发展了DNaseI足迹实验，一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为"足迹"。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNaseI消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸， 3个核苷酸--等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的DNA片段集合。如果 DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNaseI酶的降解作用。实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。该实验方法具有较高的灵敏度，但是需要精细的操作和反复的摸索尝试，从多次的结果中按照概率进行统计分析，同时，该实验较多的应用同位素标记，对实验人员的安全也有一定的挑战。

在目前的蛋白与DNA互作的研究中，应用较多的是下拉实验法，拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验(binding assay invitro)，是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽(例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等)的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化目的蛋白并与磁珠或琼脂糖凝胶珠结合，固定化后，将结合有目的蛋白的磁珠或琼脂糖珠投放至靶细胞DNA 片段化裂解液中，摇动孵育一定时间后，采用高通量测序方式，对结合的DNA片段进行鉴定。该方式可较为精确的判定与靶蛋白相互做用的DNA信息，但是成本较为巨大，由于体内DNA与蛋白的相互作用存在时空性，而采用下拉实验只能考察某一短暂时刻下靶蛋白与DNA的相互作用信息。

2.蛋白调控基因转录研究

在蛋白调控基因转录的研究领域中，最常用到的是启动子的活性分析，一个基因在体内的含量大小，与该基因的启动子活性密不可分，当启动子活性升高时，位于下游的目的基因可以在细胞内累计，反之则蛋白含量减少。若要衡量某个蛋白对某个基因转录是否具有调控作用，通常我们选择衡量该蛋白对靶基因的启动子的调控作用。在该调控作用的研究中，最广谱的方式为双荧光素酶分析测定法。

双荧光素酶是包含了两种荧光素酶，分别为萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，二者在对应的底物存在条件下，能高灵敏的产生化学发光，采用相应的仪器可对该发光值进行测定。通常情况下，将萤火虫荧光素酶挂载于目的基因启动子下，而海肾荧光素酶为转染效率参比对照。在进行目的蛋白对某基因启动子活性分析时，首先要构建目的蛋白的瞬时表达载体，同时将靶基因的启动子构建至双荧光素酶分析载体上。采用瞬时转染方式将两个载体转入293T细胞，并于转染完成后48小时进行细胞裂解液双荧光素酶分析测定。从而得到靶蛋白对某基因启动子启动效率的影响。

但是传统的方式存在较大的弊端，首先，当两个载体瞬时转染进入293T细胞后，无法控制表达的先后次序，在靶蛋白还未表达时，荧光素酶可能已经开始表达，这部分荧光素酶，会形成较高的化学发光背景，从而使蛋白对基因启动子活性的影响得到弱化，对分析结果带来不利的影响，形成较高的假阳性和不稳定性。

基于上述情况，本发明设计了一套启动子活性评价载体，采用Cre重组酶与靶蛋白连接共表达，同时将靶基因启动子序列逆向插入Lox2272与Loxp组合序列内，该方式使得启动子序列在体内首先经过反转，进行反转的前提是融合有靶蛋白的Cre蛋白表达。启动子序列反转完成后，再进行荧光素酶的转录启动过程，从而使荧光素酶的表达始终滞后于靶蛋白的表达，极大的降低了荧光素酶的本低表达对结果的分析带来的影响，提高了阳性率和活性分析灵敏度

发明内容

本发明提供了一套瞬时转染质粒载体，其能够实现指定启动子细胞内转录活性的高灵敏分析。

具体而言，本发明提供了一套重组质粒，载体A其特征在于：核苷酸序列如Seq IDNo.1所示；载体B其特征在于：核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

另一方面，本发明提供一种骨干质粒载体，其特征在于，载体A特征在于，在真核启动子下游，具有载体限制性内切酶线性化位点EcoRI，在EcoRI酶切位点下游，连接有IRES2核糖体进入元件，在IRES2核糖体进入元件下游，连接有ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列。Cre重组酶编码序列与ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列采用T2A连接肽编码序列相连接，且中间带有GSG柔性连接肽段编码序列。

进一步，载体A的真核启动子为CMV启动子，其包含CMV增强子，CMV核心启动子。其中CMV增强子位置与序列如Seq ID No.1第235至614位所示；CMV核心启动子位置与序列如Seq ID No.1第615至818位所示。

载体A包IRES2元件、ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列、T2A连接肽编码序列、 GSG柔性肽编码序列及Cre重组酶编码序列，其中IRES2元件序列如Seq ID No.1第 901至1487位所示；绿色荧光蛋白表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1488至2180 位所示，GSG柔性肽核苷酸序列如Seq ID No 1第2181至2198位所示；T2A连接肽位置及序列如Seq ID No.1第2199至2252位所示；Cre重组酶编码序列如Seq ID No 1第 2259至3290位所示。

载体A包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为SV40启动子，位置与序列如Seq IDNo.1第4028到4357位所示；嘌呤霉素表达框位置与序列信息如Seq ID No.1第4424 到5023所示。

本发明提供的瞬时转染质粒载体，其特征在于，载体B为启动子构建载体，在真核广谱启动子下游连接有海肾荧光素酶蛋白(hRluc)和杀稻瘟菌素抗性蛋白(BSD) 表达框，hRluc与BSD编码序列通过P2A连接肽编码序列相连接。在启动子插入位点的上游，载体B包含cer region元件，PolyA序列及pause site转录终止序列。在pause site 转录终止序列下游，包含Loxp与Lox2273组合元件，其组合元件包含一对反向LoxP 序列和一对反向Loxp2272序列，同时，在Loxp与Lox2272组合元件中间，设计有一对BbsI酶切位点，该位点为启动子插入位点。在组合元件下游包含荧光虫荧光素酶编码序列。

其中，载体B的hRlu-P2A-BSD表达框真核启动子为SV40启动子，SV40启动子位置与序列如Seq ID No.2第1至358位所示。其中，hRluc位置与序列如Seq ID No.2 第409到1341位所示。P2A连接肽位置与序列如Seq ID No.2第1390到1446位所示；BSD抗性蛋白编码序列位置与序列如Seq ID No.2第1453到1851位所示。

载体B包含Cer Region元件与转录终止组合元件，Cer Region元件位置与序列如Seq ID No.2第3956到4239位所示；转录终止组合元件包含PolyA序列与pause site 转录终止元件，其中PolyA信号位置与序列信息如Seq ID No.2第4299到4347所示； pause site元件位置与序列信息如Seq ID No.2第4361到4452所示。载体B包含Loxp 与Lox2273组合元件，其位置与序列信息如Seq ID No.2第4472到4730所示。载体B 包含萤火虫荧光素酶蛋白编码序列，其位置与序列信息如Seq ID No.2第4733到6385 所示。

本发明提供的一套瞬时转染质粒名称为Promoter Assay Vector-A和PromoterAssay Vector-B。

另一方面，本发明提供一种利用所述的骨干质粒载体构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

Promoter Assay Vector-A的重组构建方法，所述方法包括：在EcoRI酶切位点下游连接有IRES序列，将IRES序列与荧光蛋白编码序列进行连接，荧光蛋白无终止密码子，在荧光蛋白下游通过T2A连接肽与Cre重组酶蛋白相连接，在荧光蛋白与T2A中间，插入有GSG柔性肽编码序列。插入基因、荧光蛋白及Cre重组酶均由CMV启动子所驱动，且均为非融合表达。其中荧光蛋白、Cre重组酶，表达丰度弱于插入基因，表达时间滞后于目的基因。

Promoter Assay Vector-B的重组构建方法。所述方法包括：

1、Promoter Assay Vector-B载体hRluc与BSD表达框构建方案：在SV40启动子驱动下，hRluc与BSD可共同表达，中间通过P2A连接肽相连，hRluc与BSD在细胞内摩尔数量相等。

2、Promoter Assay Vector-B载体启动子插入表达框构建方案：在插入位点前端设计有 Cer Region元件及PolyA信号，在PolyA信号下游，设计有pause site转录终止序列。通过PolyA信号与pause site转录终止元件串联，可使下游的荧光素酶转录背景显著降低。在pause site转录种植序列下游，Loxp与Lox2272组合元件的排列如下， Loxp-1——lox2272-1——Loxp-2——Lox2272-2。其中，Loxp-1与Lox2272-1方向相同，均为5’——3’方向，Loxp-2与Lox2272-2方向相反，均为3’——5’方向。Loxp与Lox2272 的间隔序列为48bp，且不包含TAA、TGA、TAG终止密码子序列。在Lox2272-1与Loxp-2 之间，间隔序列为27bp，同时设计有一对BbsI酶切位点，该位点为启动子插入位点。 Lox2272-2下游，设计有萤火虫荧光素酶基因编码序列。

另一方面，本发明提供一种所述瞬转染载体在蛋白与基因启动子相互作用分析的应用，其特征在于，其包括如下步骤：

采用EcoRI限制性内切酶对Promoter Assay Vector-A进行酶切，将指定蛋白X的编码序列插入载体，构建成功后的新载体命名为Promoter Assay Vector-A-X。采用BbsI限制性内切酶对Promoter Assay Vector-B进行酶切，插入指定基因Y的启动子序列，构建成功后的新载体命名为Promoter Assay Vector-B-Y。将Promoter Assay Vector-A-X和Promoter Assay Vector-B-Y混合，共转染至293T细胞。48小时后，对细胞裂解液中的荧光素酶含量进行测定，并于空白对照进行比较，从而得到蛋白X对基因Y的转录是否具有调控作用。

附图说明

图1是三组细胞荧光素酶表达。

图2是细胞裂解-双荧光测定统计结果图。

图3是8h时间点作为本实验的观察点实验结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、载体质粒设计

Promoter Assay Vector-A采用ThermoFisher旗下Invitrogen公司的pcDNA3.1(+)质粒作为骨架载体，将pcDNA3.1载体线性化，设计引物，以pLVX-ZsGreen、pcDNA3.1-Cre与pCDH-EF1α-MCS-T2A-Puro载体为模板，克隆得到ZsGreen、Cre与Puro全长序列，其中ZsGreen的扩增反向引物和Cre蛋白的扩增正向引物中加入GSG连接肽编码序列和 T2A连接肽编码序列，并使二者由18bp碱基重合，且GC含量小于70％。利用同源重组原理，将IRES元件，ZsGreen编码序列及Cre序列，重组至pcDNA3.1载体，统一位于CMV 启动子驱动的表达框内。采用同源重组原理，将pcDNA3.1原有的Neo抗性蛋白编码序列更改为Puro抗性蛋白编码序列。将重组质粒转化入Stbl3感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并进行Sanger测序。

Promoter Assay Vector-B采用多片段重组法从头搭建方式，该载体并无骨架载体。以pcDNA3.1为模板，克隆SV40启动子序列；以Promega公司的pGL4.75载体为模板，克隆hRluc蛋白编码全长序列；以ThermoFisher旗下Invitrogen公司的pLenti CMV V5-LUCBlast为模板克隆BSD抗性蛋白编码序列。BSD下游的bGH-PolyA终止序列为人工合成。hRluc克隆反向引物与BSD克隆正向引物分别引如P2A序列，同时使两个引物存在18bp 重合序列。采用同源重组原理，将4端序列构建至T载体，测序无误后，将重组片段进行克隆，得到SV40-hRluc-P2A-BSD-bGHpolyA完成序列。以pcDNA3.1为模板，克隆AmpR promoter及Amp抗性基因表达框，同时克隆大肠杆菌复制元件Ori序列。以pGL4.75载体为模板，克隆polyA及PauseSite元件序列；以pGL4.11载体为模板，克隆萤火虫荧光素酶 Luciferase2全序列及下游的PolyA转录终止序列。位于Luciferase2序列和Pausesite元件中间的Loxp-Lox2272组合元件采用基因合成方式制作。将AmpR表达框，Ori序列， polyA-Pausesite序列，Loxp-Lox2272元件，Luciferase-polyA序列采用同源重组方式，重组至T载体，并进行大肠杆菌转化测序，无误后，将重组片段克隆，得到 AmpRpromoter-AmpR-polyApausesite-LoxpLox2272-Luciferase2polyA完成序列。进一步，将SV40-hRluc-P2A-BSD-bGHpolyA完整序列与 AmpRpromoter-AmpR-polyApausesite-LoxpLox2272-Luciferase2polyA完整序列进行同源重组环化，形成最终Promoter Assay Vector-B

2、系统有效性验证

为了验证loxp-lox2272系统的引入，在没有Cre蛋白的情况下，可以极大减少荧光素酶的本底表达，甚至检测不到表达。我们采用了以下载体进行对比测试。采用没有挂载启动子的Promoter Assay Vector-B作为阴性对照，标记为Promoter Assay Vector-B-NC，采用去除Loxp-Lox2272组合原件的同时，引入PGK启动子的Promoter Assay Vector-B作为阳性对照，标记为Promoter Assay Vector-B-PC。将PGK反向插入至loxp-lox2272元件中间位置，标记为Promoter Assay Vector-B-T

在12孔板中进行293T细胞传代培养，传代后的终密度控制在70％以上，24小时内培养293T细胞至合适转染浓度，293T细胞的密度在80％为宜。质粒用量为50ng，采用不加双抗的DMEM 30μL对质粒进行稀释，取SignaGen公司的GenJet-Plus转染试剂0.5μL，加入至无双抗DMEM中，混匀备用。将稀释好的GenJet-Plus逐滴加入质粒稀释液。室温静置15min。将转染复合物小心滴入1mL DMEM完全培养基中，颠倒混匀后，加入12 孔板，细胞放置于37℃，5％CO2培养箱培养。转染分组按照下表进行。

细胞分组(293T)	转入质粒
		1	Promoter Assay Vector-B-NC
2	Promoter Assay Vector-B-PC
		3	Promoter Assay Vector-B-T

转染细胞经过24h后进行细胞裂解，然后采用promega公司的Dual-luciferasereport assay kit进行双荧光分析，步骤按照说明书进行操作。经过统计分析，三组细胞hRluc 表达正常，第二组萤火虫荧光素酶表达正常，但第一组和第三组几乎检测不到荧光素酶表达，如图1所示。

3、萤火虫荧光素酶滞后表达验证

该步骤为检验载体的设计思路是否可行，为了验证loxp-lox2272系统的引入，与常规的启动子活性评价载体相比较，由于新的系统引入了Cre蛋白，因此，在采用同样启动子的情况下，新系统的荧光素酶表达时间比传统评价系统荧光素酶表达时间滞后。该滞后有利于更加灵敏的检测蛋白与靶基因启动子的相互作用情况，减少背景干扰。本实验验证中，我们仍采用PGK启动子作为萤火虫荧光素酶的启动子。将EGFP蛋白挂载于 PromoterAssay Vector-A，标记为Promoter Assay Vector-A-EGFP；将PGK启动子反向挂载于Promoter Assay Vector-B，标记为Promoter Assay Vector-B-PGKrev；去除 Loxp-Lox2272组合原件的同时，引入PGK启动子的Promoter Assay Vector-B作为阳性对照，标记为Promoter Assay Vector-B-PGKnolox。

细胞培养方式与步骤2中一致。质粒总用量为500ng，其中Promoter AssayVector-A-EGFP用量为450ng，Promoter Assay Vector-B-PGKrev/Promoter AssayVector-B-PGKnolox质粒用量为50ng。采用不加双抗的DMEM 30μL对混合质粒进行稀释，取SignaGen公司的GenJet-Plus转染试剂1.5μL，加入至无双抗DMEM中，混匀备用。将稀释好的GenJet-Plus逐滴加入质粒稀释液。室温静置15min。将转染复合物小心滴入1 mL DMEM完全培养基中，颠倒混匀后，加入12孔板，细胞放置于37℃，5％CO2培养箱培养。转染分组按照下表进行。转染分组按照下表进行

每组细胞进行6个平行，选择6个时间点进行细胞裂解-双荧光测定。时间点分别为0h、4h、8h、12h、16h、24h。以时间为横轴，相对荧光强度为纵轴，进行作图。结果显示，Loxp-Lox2272系统的引入可以使萤火虫荧光素酶的表达显著滞后，滞后时间约为 4-6小时。该滞后可以进一步降低荧光素酶的转录背景给统计带来的不利因素，同时也为蛋白和目的DNA序列的相互作用带来更多的作用时间。统计结果如图2所示.

4、蛋白与启动子结合验证实验

本载体的设计优势为灵敏检测蛋白与DNA片段(启动子)的结合能力，为了验证载体的功能性，我们采用CymR元件对CuO元件的特异性亲和性模拟蛋白与启动子的相互作用。我们将CuO元件置于CMV5启动子TATA转录信号区下游位置，若细胞内存在 CymR蛋白，则其可以快速与CuO元件结合，从而阻碍CMV5启动子发挥正常转录作用。若CymR蛋白在细胞内的丰度不足或没有及时结合于启动子下游的CuO元件，则会导致 CMV5启动子发挥转录活性。我们将萤火虫荧光素酶编码序列置于CMV5启动子的后方，可通过判定萤火虫荧光素酶活性来间接判断CMV5在细胞内的启动活性，从而间接判断 CymR在细胞内与CuO元件的亲和能力。首先，我们将CMV5启动子下游连接CuO元件，标记为CMV5-CuO-Pro；克隆CMV5-Cuo-Pro，将其反向插入Promoter Assay Vector-B中 Loxp-lox2272中间位置，标记为PromoterAssay Vector-B-PROrev；克隆CMV5-Cuo-Pro，将其正向插入Promoter Assay Vector-B，同时去除Promoter Assay Vector-B的 Loxp-Lox2272作用元件，新载体标记为PromoterAssay Vector-B-RROnolox。将CmyR蛋白挂载于Promoter Assay Vector-A，标记为Promoter Assay Vector-A-CymR。本实验中的阳性对照将CMV5启动子直接正向插入Promoter Assay Vector-B中Loxp-lox2272中间位置，CMV5的后方并未挂载CuO作用元件，该载体标记为Promoter Assay Vector-B-P。

细胞培养方式与步骤2中一致。质粒总用量为500ng，其中Promoter AssayVector-A-CymR用量为450ng，Promoter Assay Vector-B-PROrev/Promoter AssayVector-B-PROnolox质粒用量为50ng。采用不加双抗的DMEM 30μL对混合质粒进行稀释，取SignaGen公司的GenJet-Plus转染试剂1.5μL，加入至无双抗DMEM中，混匀备用。将稀释好的GenJet-Plus逐滴加入质粒稀释液。室温静置15min。将转染复合物小心滴入1 mL DMEM完全培养基中，颠倒混匀后，加入12孔板，细胞放置于37℃，5％CO2培养箱培养。转染分组按照下表进行。

由图2可知，在新的载体系统可使萤火虫荧光素酶的表达显著滞后，因此，选择8h时间点作为本实验的观察点。实验结果如图3所示。由于新的载体系统给予CmyR亲和 CuO元件更多的缓冲时间，因此，8小时时间段荧光素酶表达量更低，更加能够正确的反应CmyR与CuO元件的亲和效果，由于Promoter Assay Vector-B-PROnolox没有Loxp-Lox2272元件，因此，其转入细胞后，在CmyR蛋白结合之前，会启动转录过程，从而使细胞内出现了荧光素酶背景，该背景属于无效数据，对统计分析带来不利影响，使得整个系统的测定灵敏度出现下降。因此，新系统的引入，可显著提高蛋白与DNA 互作的测定灵敏度，尤其针对与较弱的DNA与蛋白的互作结合具有更加明显的灵敏度优势。

<110> 北京工业大学

<120> 一种高灵敏哺乳动物启动子活性评价方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 3.5.1

<210> 1

<211> 7521

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc cttccgggat gtccaattta ctgaccgtac 2280

accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga 2340

tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg cttctgtccg 2400

tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac 2460

ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta 2520

tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa 2580

gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg 2640

gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac 2700

tcatggaaaa tagcgatcgc tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt 2760

ataacaccct gttacgtata gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta 2820

ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag 2880

gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtct 2940

ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg 3000

ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa 3060

ctcatcgatt gatttacggc gctaaggatg actctggtca gagatacctg gcctggtctg 3120

gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg 3180

agatcatgca agctggtggc tggaccaatg taaatattgt catgaactat atccgtaccc 3240

tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc tgctggaaga tggcgattag gtttaaaccc 3300

gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 3360

tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 3420

ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 3480

gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 3540

cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg 3600

gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 3660

ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 3720

cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 3780

tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 3840

cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 3900

ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 3960

tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct 4020

gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 4080

gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc 4140

aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 4200

tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 4260

aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta 4320

gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc 4380

cattttcgga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgaccg agtacaagcc 4440

cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc 4500

gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt 4560

caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt 4620

cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc 4680

ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca 4740

gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc 4800

caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc 4860

cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg 4920

caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga 4980

aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgagcgggac tctggggttc 5040

gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc 5100

ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag 5160

cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat 5220

ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 5280

tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc 5340

tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 5400

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 5460

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 5520

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 5580

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 5640

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 5700

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 5760

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 5820

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 5880

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 5940

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6000

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 6060

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 6120

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 6180

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 6240

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 6300

agcggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 6360

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 6420

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 6480

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 6540

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 6600

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 6660

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 6720

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 6780

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 6840

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 6900

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 6960

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 7020

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 7080

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 7140

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 7200

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 7260

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 7320

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 7380

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 7440

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 7500

cgaaaagtgc cacctgacgt c 7521

11131

<210> 2

<211> 6784

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg 60

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg 120

aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 180

aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 240

ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 300

ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa 360

gcttgattct tctgacacaa cagtctcgaa ccaaaggctg gagccaccat ggcttccaag 420

gtgtacgacc ccgagcaacg caaacgcatg atcactgggc ctcagtggtg ggctcgctgc 480

aagcaaatga acgtgctgga ctccttcatc aactactatg attccgagaa gcacgccgag 540

aacgccgtga tttttctgca tggtaacgct gcctccagct acctgtggag gcacgtcgtg 600

cctcacatcg agcccgtggc tagatgcatc atccctgatc tgatcggaat gggtaagtcc 660

ggcaagagcg ggaatggctc atatcgcctc ctggatcact acaagtacct caccgcttgg 720

ttcgagctgc tgaaccttcc aaagaaaatc atctttgtgg gccacgactg gggggcttgt 780

ctggcctttc actactccta cgagcaccaa gacaagatca aggccatcgt ccatgctgag 840

agtgtcgtgg acgtgatcga gtcctgggac gagtggcctg acatcgagga ggatatcgcc 900

ctgatcaaga gcgaagaggg cgagaaaatg gtgcttgaga ataacttctt cgtcgagacc 960

atgctcccaa gcaagatcat gcggaaactg gagcctgagg agttcgctgc ctacctggag 1020

ccattcaagg agaagggcga ggttagacgg cctaccctct cctggcctcg cgagatccct 1080

ctcgttaagg gaggcaagcc cgacgtcgtc cagattgtcc gcaactacaa cgcctacctt 1140

cgggccagcg acgatctgcc taagatgttc atcgagtccg accctgggtt cttttccaac 1200

gctattgtcg agggagctaa gaagttccct aacaccgagt tcgtgaaggt gaagggcctc 1260

cacttcagcc aggaggacgc tccagatgaa atgggtaagt acatcaagag cttcgtggag 1320

cgcgtgctga agaacgagca gaccggtggt gggagcggag gtggcggatc aggtggcgga 1380

ggctccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagatgttga agaaaacccc 1440

gggccttccg ggatggccaa gcctttgtct caagaagaat ccaccctcat tgaaagagca 1500

acggctacaa tcaacagcat ccccatctct gaagattaca gcgtcgccag cgcagctctc 1560

tctagcgacg gccgcatctt cactggtgtc aatgtatatc attttactgg gggaccttgt 1620

gcagaactcg tggtgctggg cactgctgct gctgcggcag ctggcaacct gacttgtatc 1680

gtcgcgatcg gaaatgagaa caggggcatc ttgagcccct gcggacggtg ccgacaggtg 1740

cttctcgatc tgcatcctgg gatcaaagcc atagtgaagg acagtgatgg acagccgacg 1800

gcagttggga ttcgtgaatt gctgccctct ggttatgtgt gggagggcta agtttaaacc 1860

cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 1920

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 1980

attgcatcgg atcctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac 2040

attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtaatgg tttcttagac 2100

gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2160

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 2220

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 2280

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 2340

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 2400

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact ttcaaagttc tgctatgtgg 2460

cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 2520

tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 2580

agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 2640

tctgacaact atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 2700

tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 2760

tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 2820

acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 2880

accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 2940

tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 3000

cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 3060

tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaattcgaa atgaccgacc aagcgacgcc 3120

caaccggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 3180

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 3240

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 3300

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 3360

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 3420

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 3480

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 3540

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 3600

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 3660

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 3720

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 3780

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatttcaa 3840

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 3900

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt atagtccgga 3960

aatacaggaa cgcacgctgg atggcccttc gctgggatgg tgaaaccatg aaaaatggca 4020

gcttcagtgg attaagtggg ggtaatgtgg cctgtaccct ctggttgcat aggtattcat 4080

acggttaaaa tttatcaggc gcgattgcgg cagtttttcg ggtggtttgt tgccattttt 4140

acctgtctgc tgccgtgatc gcgctgaacg cgttttagcg gtgcgtacaa ttaagggatt 4200

atggtaaatc cacttactgt ctgccctcgt agccatcgag ataaaccgca gtactccggc 4260

cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat ctggccgcaa taaaatatct ttattttcat 4320

tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact aacatacgct ctccatcaaa 4380

acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca 4440

gaacatttct ctggcctaac tggccggtac cataacttcg tatagcatac attatacgaa 4500

gttatgcaga atggctggat tgtagctgct atcaatatga aacctctgga tccataactt 4560

cgtataggat actttatacg aagttatcat ggtggcgggt cttcgagaag acctataact 4620

tcgtataatg tatgctatac gaagttatac gcgtttgcct taacccagaa atctgttctt 4680

tagaatggtg caaagaataa cttcgtataa agtatcctat acgaagttat tcatggaaga 4740

tgccaaaaac attaagaagg gcccagcgcc attctaccca ctcgaagatg ggaccgccgg 4800

cgagcagctg cacaaagcca tgaagcgcta cgccctggtg cccggcacca tcgcctttac 4860

cgacgcacat atcgaggtgg acattaccta cgccgagtac ttcgagatga gcgttcggct 4920

ggcagaagct atgaagcgct atgggctgaa tacaaaccat cggatcgtgg tgtgcagcga 4980

gaatagcttg cagttcttca tgcccgtgtt gggtgccctg ttcatcggtg tggctgtggc 5040

cccagctaac gacatctaca acgagcgcga gctgctgaac agcatgggca tcagccagcc 5100

caccgtcgta ttcgtgagca agaaagggct gcaaaagatc ctcaacgtgc aaaagaagct 5160

accgatcata caaaagatca tcatcatgga tagcaagacc gactaccagg gcttccaaag 5220

catgtacacc ttcgtgactt cccatttgcc acccggcttc aacgagtacg acttcgtgcc 5280

cgagagcttc gaccgggaca aaaccatcgc cctgatcatg aacagtagtg gcagtaccgg 5340

attgcccaag ggcgtagccc taccgcaccg caccgcttgt gtccgattca gtcatgcccg 5400

cgaccccatc ttcggcaacc agatcatccc cgacaccgct atcctcagcg tggtgccatt 5460

tcaccacggc ttcggcatgt tcaccacgct gggctacttg atctgcggct ttcgggtcgt 5520

gctcatgtac cgcttcgagg aggagctatt cttgcgcagc ttgcaagact ataagattca 5580

atctgccctg ctggtgccca cactatttag cttcttcgct aagagcactc tcatcgacaa 5640

gtacgaccta agcaacttgc acgagatcgc cagcggcggg gcgccgctca gcaaggaggt 5700

aggtgaggcc gtggccaaac gcttccacct accaggcatc cgccagggct acggcctgac 5760

agaaacaacc agcgccattc tgatcacccc cgaaggggac gacaagcctg gcgcagtagg 5820

caaggtggtg cccttcttcg aggctaaggt ggtggacttg gacaccggta agacactggg 5880

tgtgaaccag cgcggcgagc tgtgcgtccg tggccccatg atcatgagcg gctacgttaa 5940

caaccccgag gctacaaacg ctctcatcga caaggacggc tggctgcaca gcggcgacat 6000

cgcctactgg gacgaggacg agcacttctt catcgtggac cggctgaaga gcctgatcaa 6060

atacaagggc taccaggtag ccccagccga actggagagc atcctgctgc aacaccccaa 6120

catcttcgac gccggggtcg ccggcctgcc cgacgacgat gccggcgagc tgcccgccgc 6180

agtcgtcgtg ctggaacacg gtaaaaccat gaccgagaag gagatcgtgg actatgtggc 6240

cagccaggtt acaaccgcca agaagctgcg cggtggtgtt gtgttcgtgg acgaggtgcc 6300

taaaggactg accggcaagt tggacgcccg caagatccgc gagattctca ttaaggccaa 6360

gaagggcggc aagatcgccg tgtaataatt ctagagcggc cgcttcgagc agacatgata 6420

agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 6480

tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 6540

aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg ggaggttttt 6600

ttaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt aaaatcgaat tttaacaaaa tattaacgct 6660

tacaatttcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 6720

cgcggatctg cgcagcacca tggcctgaaa taacctctga aagaggaact tggttaggta 6780

cctt 6784

Claims (6)

1.质粒载体，其特征在于，包括载体A和载体B；其中载体A具体为：在真核启动子下游，具有载体限制性内切酶线性化位点EcoRI，在EcoRI酶切位点下游，连接有IRES2核糖体进入元件，在IRES2核糖体进入元件下游，连接有ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列；Cre重组酶编码序列与ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列采用T2A连接肽编码序列相连接，且中间带有GSG柔性连接肽段编码序列；

载体B具体为：在真核广谱启动子下游连接有海肾荧光素酶蛋白(hRluc)和杀稻瘟菌素抗性蛋白(BSD)表达框，hRluc与BSD编码序列通过P2A连接肽编码序列相连接；在启动子插入位点的上游，载体B包含cer region元件，PolyA序列及pause site转录终止序列；在pause site转录终止序列下游，包含Loxp与Lox2273组合元件，该组合元件包含一对反向LoxP序列和一对反向Loxp2272序列，同时，在Loxp与Lox2272组合元件中间，设计有一对BbsI酶切位点，该位点为启动子插入位点；在组合元件下游包含荧光虫荧光素酶编码序列。

2.如权利要求1所述质粒载体，其特征在于，载体A核苷酸序列如Seq ID No.1所示，载体B核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

3.如权利要求1所述质粒载体，其特征在于，载体A的真核启动子为CMV启动子，CMV启动子包含CMV增强子，CMV核心启动子；其中CMV增强子位置与序列如Seq ID No.1第235至614位所示；CMV核心启动子位置与序列如Seq ID No.1第615至818位所示；

载体A包括IRES2元件、ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列、T2A连接肽编码序列、GSG柔性肽编码序列及Cre重组酶编码序列；其中IRES2元件序列如Seq ID No.1第901至1487位所示；ZsGreen绿色荧光蛋白编码序列如Seq ID No.1第1488至2180位所示，GSG柔性肽核苷酸序列如Seq ID No 1第2181至2198位所示；T2A连接肽位置及序列如Seq ID No.1第2199至2252位所示；Cre重组酶编码序列如Seq ID No 1第2259至3290位所示；

载体A包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为SV40启动子，位置与序列如Seq ID No.1第4028到4357位所示；嘌呤霉素编码序列与序列信息如Seq ID No.1第4424到5023所示；

载体B核苷酸序列如Seq ID No.2所示，载体B的hRlu-P2A-BSD表达框真核启动子为SV40启动子，SV40启动子位置与序列如Seq ID No.2第1至358 位所示；其中，hRluc位置与序列如Seq ID No.2第409到1341位所示；P2A连接肽位置与序列如Seq ID No.2第1390到1446位所示；BSD抗性蛋白编码序列位置与序列如Seq ID No.2第1453到1851位所示；

载体B包含Cer Region元件与转录终止组合元件，Cer Region元件位置与序列如SeqID No.2第3956到4239位所示；转录终止组合元件包含PolyA序列与pause site转录终止元件，其中PolyA信号位置与序列信息如Seq ID No.2第4299到4347所示；pause site元件位置与序列信息如Seq ID No.2第4361到4452所示；载体B包含Loxp与Lox2273组合元件，其位置与序列信息如Seq ID No.2第4472到4730所示；载体B包含萤火虫荧光素酶蛋白编码序列，其位置与序列信息如Seq ID No.2第4733到6385所示。

4.如权利要求1所述质粒载体，其特征在于，载体A的重组构建方法；包括：在EcoRI酶切位点下游连接有IRES序列，将IRES序列与荧光蛋白编码序列进行连接，荧光蛋白无终止密码子，在荧光蛋白下游通过T2A连接肽与Cre重组酶蛋白相连接，在荧光蛋白与T2A中间，插入有GSG柔性肽编码序列；插入基因、荧光蛋白及Cre重组酶均由CMV启动子所驱动，且均为非融合表达；其中荧光蛋白、Cre重组酶，表达丰度弱于插入基因，表达时间滞后于目的基因。

5.如权利要求1所述质粒载体，其特征在于，所述载体B的重组构建；包括：1)、PromoterAssay Vector-B载体hRluc与BSD表达框构建方案：在SV40启动子驱动下，hRluc与BSD共同表达，中间通过P2A连接肽相连，hRluc与BSD在细胞内摩尔数量相等；2)、Promoter AssayVector-B载体启动子插入表达框构建方案：在插入位点前端设计有Cer Region元件及PolyA信号，在PolyA信号下游，设计有pause site转录终止序列；通过PolyA信号与pausesite转录终止元件串联，可使下游的荧光素酶转录背景显著降低；在pause site转录终止序列下游，Loxp与Lox2272组合元件的排列如下，Loxp-1——lox2272-1——Loxp-2——Lox2272-2；其中，Loxp-1与Lox2272-1方向相同，均为5’——3’方向，Loxp-2与Lox2272-2方向相反，均为3’——5’方向；Loxp与Lox2272的间隔序列为48bp，且不包含TAA、TGA、TAG终止密码子序列；在Lox2272-1与Loxp-2之间，间隔序列为27bp，同时设计有一对BbsI酶切位点，该位点为启动子插入位点；Lox2272-2下游，设计有萤火虫荧光素酶基因编码序列。

6.权利要求1-5任意一项所述的载体在蛋白与基因启动子相互作用分析的应用，其特征在于，包括如下步骤：采用EcoRI限制性内切酶对Promoter Assay Vector-A进行酶切，将指定蛋白X的编码序列插入载体，构建成功后的新载体命名为Promoter Assay Vector-A-X；采用BbsI限制性内切酶对Promoter Assay Vector-B进行酶切，插入指定基因Y的启动子序列，构建成功后的新载体命名为Promoter Assay Vector-B-Y；将Promoter AssayVector-A-X和Promoter Assay Vector-B-Y混合，共转染至293T细胞；48小时后，对细胞裂解液中的荧光素酶含量进行测定，并于空白对照进行比较，从而得到蛋白X对基因Y的转录是否具有调控作用。

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