CN108642086A - 一种高灵敏融合细胞筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种高灵敏融合细胞筛选方法属于基因工程领域，具体涉及一种基于Cre重组酶与Loxp序列特异识别实现融合细胞快速筛选的方案，涉及一种通过Cre重组酶与Loxp序列的切割，实现融合细胞的荧光切换与细胞抗性切换，从而实现融合细胞的单细胞筛选与后续扩大培养。同时，通过利用泛表达Cre蛋白裸鼠，将改造的肿瘤细胞注入体内，可观察细胞融合作用导致的肿瘤细胞转移与发展。本发明提供了一套慢病毒质粒载体，其能够实现融合细胞高灵敏度快速筛选与体内肿瘤转移的荧光成像分析载体A其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；载体B其：核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于Cre重组酶与Loxp序列特异识别实现融合细胞快速筛选的方案。特别涉及一种通过Cre重组酶与Loxp序列的切割，实现融合细胞的荧光切换与细胞抗性切换，从而实现融合细胞的单细胞筛选与后续扩大培养。同时，通过利用泛表达Cre蛋白裸鼠，将改造的肿瘤细胞注入体内，可观察细胞融合作用导致的肿瘤细胞转移与发展。
背景技术
1.细胞融合与肿瘤
细胞融合是指两个或两个以上细胞相互接触，进而发生细胞膜、细胞质和细胞核融合而形成杂种细胞的过程，也被称为细胞杂交。细胞融合现象虽发生概率较低但其具有较高规律性。目前对肿瘤的研究很多，人类肿瘤的形成是一个多步骤的复杂过程，这些过程由基因的突变导致，从而使正常人类细胞转向高度恶性的肿瘤细胞。而肿瘤转移则是一个十分复杂的过程，其步骤一般为：原发肿瘤生长与血管生成；肿瘤侵入周围组织和基底膜；侵入血管、淋巴管或腹膜空隙并在其中生存；最后实现肿瘤的转移；最近研究表明癌细胞与宿主细胞或者癌细胞与癌细胞之间的融合能够在一定程度上解释肿瘤高转移潜能的获得、非整倍体产生、多药耐性、上皮向充质转化、肿瘤干细胞起源及肿瘤异质性的产生等现象。该现象可能是肿瘤发生和转移的重要驱动机制。目前数据显示，90％以上的癌症病人死于肿瘤的转移。
近些年来研究表明，肿瘤细胞之间的融合，如黑色素瘤之间融合或者肿瘤细胞与宿主细胞之间的融合，如巨噬细胞、白细胞、淋巴细胞、内皮细胞等与肿瘤细胞的融合，融合之后的细胞能够获得新的生物学特性或者获得新的基因，这在不同程度上有利于肿瘤的转移过程，因此直接或者间接的促进了肿瘤细胞转移至新的器官或组织。目前，细胞融合与肿瘤的研究不断取得进展，从自发融合到诱发融合，从肿瘤细胞与正常体细胞融合到肿瘤细胞之间的融合。有研究表明，内皮细胞位于血管与淋巴管内层，肿瘤细胞要到达循环系统必须穿过这层内皮细胞。因此，他们利用腺癌细胞以及内皮细胞进行联合培养，体内和体外的实验均证明，乳腺癌细胞与内皮细胞进行融合，使得肿瘤细胞能够穿过内皮细胞屏障入侵血液，然后进行转移。同时也有研究表明，血液循环系统来源的细胞与肿瘤上皮细胞融合可发生于肿瘤形成阶段，通过将免疫细胞(如巨噬细胞等)与肿瘤细胞的融合，可导致迁移性巨噬细胞的形成，而这可导肿瘤细胞避开免疫系统的防御反应。雄性激素水平与前列腺癌的发展息息相关，最近有研究表明雄性激素依赖性的前列腺癌与前列腺基质细胞自发性形成的融合细胞，能够摆脱雄性激素的作用，产生不依赖于雄激素的前列腺癌，实验结果表明细胞融合可能是前列腺癌的生存、发展的一种新机制。
尽管目前尚无理想的技术能够证实癌肿患者体内存在融合现象，但细胞融合及在肿瘤转移中的作用已经在动物实验中得到广泛证实。经动物实验研究证实，无论是癌细胞一癌细胞融合还是癌细胞一宿主细胞融合，均能使肿瘤细胞获得更高的转移潜能。尽管对细胞融合与肿瘤转移的研究取得一些进展，但目前对它们的了解仍然有限。在细胞融合与肿瘤转移关系上，还有许多问题亟待解决。例如细胞融合与肿瘤转移的分子机制的研究，目前的理论主要有非整倍体假说，认为细胞融合导致四倍体等多倍体的产生，多倍体的基因型不稳定，从而导致非整倍体的形成，最后导致肿瘤的形成与转移。然而缺乏更确凿的证据；也有研究者认为：肿瘤的转移是因为肿瘤细胞与骨髓来源细胞融合形成的，但是不能解释肿瘤细胞之间的相互融合可以促进转移的事实。因此，为了更深入的了解，需要建立更多的动物实验模型，并且还需要更多临床数据的观察以及总结。
2.细胞融合目前筛选方案
针对细胞融合，目前的筛选方案主要依赖荧光重叠原理，若A细胞与B细胞融合，首先要将A细胞用荧光蛋白标记，如绿色荧光蛋白，将B细胞用另外一种荧光蛋白标记，如红色荧光蛋白。若A、B两细胞发生融合，则融合后的细胞呈现两种荧光蛋白的交叉色，如红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白将产生黄色交叉色。进而利用流式细胞仪或显微操作技术将阳性细胞进行筛选，最终获得融合阳性细胞。该方法存在较为明显的缺陷，首先，A细胞与B细胞均存在荧光，阳性细胞的筛选过程中，需要用到两种荧光蛋白的激发光同时激发，会造成很强的背景荧光干扰，筛选后的细胞有较多的假阳性存在。且由于细胞融合的低效率，很难将少量的融合细胞成功筛选。同时，由于细胞体内的表达调控和沉默效应，若采用传统的筛选方式，则对筛选的时间点要求较高，一旦时间过长，则细胞内的沉默效应不容忽视，融合后的细胞若不能稳定的同时表达两种荧光蛋白，则融合后的细胞与背景细胞将无法区分，难以达到筛选目的。同时，因为融合细胞具有跟原始细胞相同的抗生素抗性，因此无法通过抗生素将极为少量的融合细胞进行筛选，只能采用流式细胞仪进行分辨筛选，当融合细胞的数目极少时，流式细胞仪往往难以检出。因此，针对目前筛选方法的劣势，建立一种稳定的高灵敏筛选方法非常有必要。
发明内容
本发明提供了一套慢病毒质粒载体，其能够实现融合细胞高灵敏度快速筛选与体内肿瘤转移的荧光成像分析。
具体而言，本发明提供了一套重组质粒，载体A其特征在于：核苷酸序列如Seq IDNo.1所示；载体B其特征在于：核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
另一方面，本发明提供一种骨干质粒载体，其特征在于，载体A特征在于，在真核启动子下游，具有两种荧光蛋白编码序列且两个同向Loxp位点分别置于第一荧光蛋白前后两侧，在第二个Loxp位点3’方向，第二荧光蛋白5’方向，带有真核筛选抗性蛋白编码序列，抗性蛋白与第二荧光蛋白通过T2A连接肽相连。其中载体B特征在于，在真核启动子下游，具有Cre蛋白编码序列，且Cre蛋白编码序列的上游具有SV40核定位序列，下游具有核质素定位序列，核质素定位序列下游通过T2A连接真核筛选抗性蛋白编码序列。
进一步，载体A的真核启动子为CAG启动子，其包含CMV增强子，鸡β-actin核心启动子，嵌合体内含子。其中CMV增强子位置与序列如Seq ID No.1第2188至2567位所示；鸡β-actin核心启动子位置与序列如Seq ID No.1第2569至2846位所示；嵌合体内含子位置与序列如Seq ID No.1第2847至3864位所示。
载体A包含红色与绿色荧光蛋白表达框、条件性真核抗性筛选蛋白表达框及两段同向Loxp序列，其中红色荧光蛋白表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第3970至4680位所示；绿色荧光蛋白表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第5191至5949位所示，两段同向Loxp序列位置及核苷酸序列如Seq ID No 1第3928至3961位及4687至4720位所示；条件性抗性筛选标记核苷酸序列如Seq ID No.1第4729至5124位所示；T2A连接肽位置及序列如Seq IDNo.1第5131至5184位所示。
载体A包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为PGK启动子，位置与序列如Seq ID No.1第5966到6465位所示；嘌呤霉素表达框位置与序列信息如Seq ID No.1第6486到7085所示。
本发明提供的慢病毒载体，其特征在于，载体B为Cre蛋白表达载体，在Cre蛋白表达框两侧具有核定位序列，具体的，载体B的真核启动子为CAG启动子，其包含CMV增强子，鸡其β-actin核心启动子，嵌合体内含子。其中CMV增强子位置与序列如Seq ID No.2第2188至2567位所示；鸡β-actin核心启动子位置与序列如Seq ID No.2第2569至2846位所示；嵌合体内含子位置与序列如Seq ID No.2第2847至3864位所示。
载体B包含3*Flag标签编码序列，SV40核定位序列，Cre蛋白表达框，及核质素定位序列。其中，3*Flag标签的位置与序列如Seq ID No.2第3928到3993位所示；SV40核定位序列位置与序列如Seq ID No.2第4000到4020位所示；Cre蛋白编码序列位置与序列如Seq IDNo.2第4045到5073位所示；核质素定位序列位置与序列如Seq ID No.2第5074到5124位所示。
载体B包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为PGK启动子，位置与序列如Seq ID No.2第5152到5651位所示；嘌呤霉素表达框位置与序列信息如Seq ID No.2第5672到6271所示。
本发明提供的一套慢病毒质粒名称为pFusionScreen-A和pFusionScreen-B。
另一方面，本发明提供一种利用所述的骨干质粒载体构建重组载体的方法，其特征在于，所述构建方法包括：
pFusionScreen-A的重组构建方法，所述方法包括：将两个不同荧光蛋白编码序列通过同方向Loxp序列进行连接，第一个Loxp位点前端带有Kozak序列(GCCACC)，Kozak序列后是ATG起始密码子，起始密码子与第一个荧光蛋白编码序列相连，第一个荧光蛋白编码序列带有终止密码子。在终止密码子后方，连接第二个同向Loxp序列，第二个Loxp序列3’端与抗性蛋白编码序列连接，抗性蛋白编码无终止密码子。抗性蛋白编码区3’端通过T2A连接肽编码序列，连接第二个荧光蛋白的编码序列。在第二个荧光蛋白的下游，连接PGK启动子序列，PGK启动子启动下游嘌呤霉素抗性蛋白表达。两个荧光蛋白、条件性抗性蛋白及T2A连接肽的表达，均由CAG启动子所驱动。
pFusionScreen-B的重组构建方法。所述方法包括：在CAG启动子驱动下，启动SV40核定位肽段、Cre蛋白及核质素定位肽段融合表达，其中SV40核定位序列位于Cre蛋白表达框上游，核质素定位序列位于Cre蛋白表达框下游。
另一方面，本发明提供一种所述慢病毒载体在细胞融合筛选及动物活体成像中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：
将载体pFusionScreen-A和pFusionScreen-B分别包装病毒，分别感染至不同细胞，将两株感染阳性细胞进行共培养，采用自发融合或人工刺激融合，根据荧光变化可判断是否出现融合细胞，同时加入条件性筛选标记进行融合细胞筛选。也可通过显微操作进行单融合细胞挑选。
重组载体在肿瘤细胞体内转移活体成像中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：将载体A包装病毒，分别感染至不同肿瘤细胞，挑选感染阳性的肿瘤细胞，通过尾静脉注射方式注入泛表达Cre蛋白的裸鼠体内，观察靶器官肿瘤成像，同时，若肿瘤细胞在体内发生融合转移，可通过荧光变化观察转移细胞在小鼠体内的分布，同时可获得不同的肿瘤细胞在体内的融合转移倾向。
附图说明
图1是组1中293T细胞转染前后示意图。
图2是组2细胞转染前后示意图。
图3是稳定传代前后荧光强度示意图。
图4是用PCR验证选择表达量最高的细胞用于后续实验示意图。
图5是双荧光细胞融合平行实验，并进行融合细胞筛选示意图。
图6是WesternBlot验证外泌体中不存在Cre蛋白示意图。
图1.2.5中的标尺均为100微米。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、载体质粒设计
采用Clonetech的慢病毒载体作为骨架载体，利用同源重组原理，将pLVX-Puro载体线性化，设计引物，以pCAGGS、pmCherry-N1、pEGFP-N1与pcDNA6.2载体为模板，克隆得到CAG启动子、mCherry、BSD与EGFP全长序列(包含终止密码子)，其中mCherry的扩增正向引物中加入正向Loxp位点，并于该位点前端加入起始密码子ATG序列，mCherry的反向引物中位于终止密码子末端加入同方向Loxp序列。在此过程中，要保证当mCherry与其中一个loxp位点移除后，对BSD与EGFP的表达不造成读码框的改变。
胶回收载体后与CAG启动子、mCherry、BSD与EGFP片段同源重组，并将重组产物转化入Stbl3感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。
采用Clonetech的慢病毒载体作为骨架载体，利用同源重组原理，将pLVX-Puro载体线性化，设计引物，以pCAGGS、以pcDNA3.1-Cre为模板，克隆CAG启动子与Cre全长序列，为了增加Cre重组酶翻译后的入核能力，正向引物中加入SV40NLS序列，在反向引物中加入nucleoplasmin NLS序列，胶回收载体后与Cre片段同源重组，并将重组产物转化入Stbl3感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。
2、系统有效性验证
培养293T细胞至合适转染浓度，按照下表进行质粒瞬时转染并观察
组1中293T细胞转染后呈现红色，如图1所示。
组2细胞99％以上呈现绿色，如图2所示。
3、重组载体在肿瘤细胞融合筛选中的应用
荧光载体与Cre载体的慢病毒包装：准备293T细胞：按照每10cm细胞培养皿接种6～8×106cells到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。在转染前2～4h，用5mL不含P/S的完全培养基换液(DMEM+10％FBS)。分别配制两管溶液体系标记为A，B：A、加入500μL HET BufferA；B、加入目的载体(10μg)，包装系统预混液(15μg)，HET buffer 50μL，用水补齐终体系为500μl。将B管中的DNA温合液逐滴加入到A管中，用移液器轻轻混匀10min。将混匀后的混合物室温静置30min，然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。培养12h～16h后弃去培养基，用10mL新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S)。换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，加入10mL新鲜的完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养。24h后再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm PVDF滤器过滤至50mL圆底离心管中。4℃，50000g高速离心2h，小心弃去上清，晾干，按200μL/10cm培养皿加入DMEM(不含血清、双抗)重悬病毒沉淀，室温静置2h，分装到洁净EP管中，-80℃冰箱保存待用。其中每一份病毒取少量交付于生物公司进行病毒滴度测定。
双荧光载体稳转细胞筛选：选取不同类型的癌细胞(Hela，PANC-1，MCF7，A549)，将制备好的双荧光慢病毒，感染不同癌细胞，因为载体表达mCherry，因此可以使用荧光显微镜观察感染效率，感染24h后，加入嘌呤毒素进行细胞筛选，待荧光稳定后，将细胞进入流式细胞仪进行分选，选取荧光强度较高的细胞继续进行培养，同时培养基中维持嘌呤浓度不变。稳定传代5次后，荧光强度不发生明显衰减。如图3所示
Cre重组酶稳转细胞筛选：从取材及原代细胞培养的便利程度，本实例采用小鼠作为MSC取材的对象，从小鼠骨髓中分离MSC，培养至合适浓度感染浓度，加入已经制备好的Cre病毒，感染24h后，加入嘌呤毒素进行细胞筛选，待细胞传代稳定后，采用流式细胞仪进行单细胞分选，将分选细胞接种至96孔板中，扩增至合适浓度后，采用Western-Blot验证Cre的蛋白表达效率，控制细胞数目约为1*106，加入RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，提取细胞总蛋白，将蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将电泳胶分离，进行电转膜仪转膜，转膜完成后，采用5％脱脂牛奶室温封闭1h。加入一抗，封膜之后室温条件下柔和震荡1h然后放入4℃冰箱中过夜。完成后PBST洗膜3次，10min/次，加入二抗室温孵育1h，PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次，完成后加入显色剂显色，观察Cre蛋白在不同分选组的表达情况。同时采用PCR验证，选择表达量最高的细胞用于后续实验。如图4所示。
癌细胞与间充质干细胞或巨噬细胞共培养：分别消化稳定表达mCherry的细胞A(Hela，PANC-1，MCF7，A549)和稳定表达Cre重组酶的细胞B(间充质干细胞，巨噬细胞)，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度。将两种细胞按照一定比例在同一培养皿中共同培养。显微镜下观察细胞荧光变化及增殖情况。同时进行常规的双荧光细胞融合平行实验，并进行融合细胞筛选观察。绿色细胞即为融合成功细胞，如图5所示。
采用流式筛选方式，对比二种方法的筛选难易程度，和阳性率高低，并进行数据统计。为了提高结果可信度，须将不同癌细胞与MSC或巨噬细胞进行Transwell间接共培养，取癌细胞与MSC或巨噬细胞接种共培养于Transwell小室内,MSC或巨噬细胞接种于培养板底层，癌细胞接种于Transwell膜内膜上。同培养后，观察癌细胞的荧光变化，可排除细胞分泌物例如外泌体等因素引起的假阳性融合细胞。同时对Cre阳性细胞外泌体进行分离提取，采用WesternBlot验证外泌体中不存在Cre蛋白。如图6所示。
3、重组载体在肿瘤细胞体内转移成像的应用
体细胞泛表达Cre重组酶裸鼠的制备：(1)、F0代交配方式：雌性UBC-CreERT2-C57转基因小鼠与雄性BALB/c裸鼠交配，得到的F1子代均为有毛小鼠，保留表达Cre的雌性小鼠，其余淘汰。(2)、F1代交配方式：F1代雌性Cre+有毛小鼠与雄性BALB/c裸小鼠交配，得到的F2代有四种表型，Cre-裸鼠，Cre-有毛鼠，Cre+有毛鼠，Cre+裸鼠。保留雌性Cre+有毛鼠和雄性Cre+裸鼠，其余淘汰。(3)、F2代交配方式：F2代雌性Cre+有毛鼠和F2代雄性Cre+裸鼠兄妹交配，得到的F3代具有四种表型，Cre-裸鼠，Cre-有毛鼠，Cre+裸鼠，Cre+有毛鼠，保留雌性Cre+有毛鼠和雄性Cre+裸鼠，其余淘汰。(4)F3代与F4代重复F2代的交配与筛选方式，在得到的F5子代中Cre+裸鼠和Cre+有毛鼠的比例接近1：1，保留雌性Cre+有毛鼠和雄性Cre+裸鼠，其余淘汰。(5)F5代交配方式：F5代雌性Cre+有毛鼠与F4代雄性Cre+裸鼠回交，F4代雌性Cre+有毛鼠与F5代雄性Cre+裸鼠回交，或F5代雌性Cre+有毛鼠和F2代雄性Cre+裸鼠兄妹交配，在得到的F6代中，保留雌性雌性Cre+有毛鼠和全部Cre+裸鼠。
肿瘤注射Cre+裸鼠荧光成像分析：稳定表达mCherry癌细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。取Cre+/+裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。肿瘤细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取细胞用PBS悬浮，在Cre+/+裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后，取致瘤小鼠进行进行整体成像，同时取肿瘤细胞靶向脏器及肝脏、胰腺、睾丸、肺、脑组织等分别在GFP，RFP模式下进行荧光成像。
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ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt 3300
cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt 3360
cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc 3420
ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc tcgggggaag 3480
gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc 3540
cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag 3600
ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc 3660
gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt 3720
ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg gggacggggc 3780
agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt 3840
catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat 3900
cattttggca aagaattcgc caccatgata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta 3960
tgcggatcca tggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg 4020
cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 4080
ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc 4140
cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac 4200
gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag 4260
tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc 4320
ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac 4380
ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc 4440
gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac 4500
tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc 4560
tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa 4620
cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa 4680
gaattcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gcacgcgtat ggccaagcct 4740
ttgtctcaag aagaatccac cctcattgaa agagcaacgg ctacaatcaa cagcatcccc 4800
atctctgaag actacagcgt cgccagcgca gctctctcta gcgacggccg catcttcact 4860
ggtgtcaatg tatatcattt tactggggga ccttgtgcag aactcgtggt gctgggcact 4920
gctgctgctg cggcagctgg caacctgact tgtatcgtcg cgatcggaaa tgagaacagg 4980
ggcatcttga gcccctgcgg acggtgccga caggtgcttc tcgatctgca tcctgggatc 5040
aaagccatag tgaaggacag tgatggacag ccgacggcag ttgggattcg tgaattgctg 5100
ccctctggtt atgtgtggga gggcctcgag gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt 5160
gacgtggagg agaatcccgg cccttccggg atggagagcg acgagagcgg cctgcccgcc 5220
atggagatcg agtgccgcat caccggcacc ctgaacggcg tggagttcga gctggtgggc 5280
ggcggagagg gcacccccaa gcagggccgc atgaccaaca agatgaagag caccaaaggc 5340
gccctgacct tcagccccta cctgctgagc cacgtgatgg gctacggctt ctaccacttc 5400
ggcacctacc ccagcggcta cgagaacccc ttcctgcacg ccatcaacaa cggcggctac 5460
accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac ggcggcgtgc tgcacgtgag cttcagctac 5520
cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac ttcaaggtgg tgggcaccgg cttccccgag 5580
gacagcgtga tcttcaccga caagatcatc cgcagcaacg ccaccgtgga gcacctgcac 5640
cccatgggcg ataacgtgct ggtgggcagc ttcgcccgca ccttcagcct gcgcgacggc 5700
ggctactaca gcttcgtggt ggacagccac atgcacttca agagcgccat ccaccccagc 5760
atcctgcaga acgggggccc catgttcgcc ttccgccgcg tggaggagct gcacagcaac 5820
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tcccgcgctc agtcgtccaa ttctgccgtg gacggcaccg ccggacccgg ctccaccgga 5940
tctcgctaat ctagataatt ctaccgggta ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga 6000
gcatgcgctt tagcagcccc gctgggcact tggcgctaca caagtggcct ctggcctcgc 6060
acacattcca catccaccgg taggcgccaa ccggctccgt tctttggtgg ccccttcgcg 6120
ccaccttcta ctcctcccct agtcaggaag ttcccccccg ccccgcagct cgcgtcgtgc 6180
aggacgtgac aaatggaagt agcacgtctc actagtctcg tgcagatgga cagcaccgct 6240
gagcaatgga agcgggtagg cctttggggc agcggccaat agcagctttg ctccttcgct 6300
ttctgggctc agaggctggg aaggggtggg tccgggggcg ggctcagggg cgggctcagg 6360
ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga ggcccggcat tctgcacgct tcaaaagcgc 6420
acgtctgccg cgctgttctc ctcttcctca tctccgggcc tttcgacctg cagcccaagc 6480
ttaccatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg 6540
ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc 6600
cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 6660
tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 6720
cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 6780
gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 6840
aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 6900
tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 6960
tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 7020
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cctgaccgcg tctggaacaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 7140
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gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact 7380
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tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc 7560
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tgggttttcc agtcacacct caggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 7860
atcttagcca ctttttaaaa gaaaagaggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 7920
gacaagatat ccttgatctg tggatctacc acacacaagg ctacttccct gattagcaga 7980
actacacacc agggccaggg gtcagatatc cactgacctt tggatggtgc tacaagctag 8040
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gctgatatcg agcttgctac aagggacttt ccgctgggga ctttccaggg aggcgtggcc 8280
tgggcgggac tggggagtgg cgagccctca gatcctgcat ataagcagct gctttttgcc 8340
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cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 8700
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 8760
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 8820
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 8880
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 8940
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tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 9240
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 9300
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 9360
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ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 9540
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cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 10200
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 10260
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 10320
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gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 10560
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 10620
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cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 10740
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 10800
gccacctgac gtcgacggat cgggagatca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 10860
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 10920
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ggtttcattt actctaaacc tgtgattcct ctgaattatt ttcattttaa agaaattgta 11100
tttgttaaat atgtactaca aacttagtag t 11131
<210> 2
<211> 10317
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
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ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
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aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
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cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
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tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
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cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
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caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 2280
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ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg gggacggggc 3780
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gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga 6000
aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt 6060
ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc 6120
ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt 6180
ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac 6240
ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg accgcgtctg gaacaatcaa cctctggatt 6300
acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 6360
gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 6420
cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 6480
aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 6540
ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 6600
tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 6660
ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct 6720
ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 6780
cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 6840
cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctggaat taattctgca gtcgagacct 6900
agaaaaacat ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg 6960
gctagaagca caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag 7020
accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa agaggggact 7080
ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac 7140
acaaggctac ttccctgatt agcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact 7200
gacctttgga tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataaggtag aagaggccaa 7260
taaaggagag aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga 7320
gagagaagtg ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga 7380
gctgcatccg gagtacttca agaactgctg atatcgagct tgctacaagg gactttccgc 7440
tggggacttt ccagggaggc gtggcctggg cgggactggg gagtggcgag ccctcagatc 7500
ctgcatataa gcagctgctt tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 7560
cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 7620
gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 7680
gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 7740
agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggccttga cattgctagc 7800
gttttaccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 7860
tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 7920
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 7980
ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 8040
ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 8100
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 8160
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 8220
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 8280
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 8340
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 8400
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 8460
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 8520
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 8580
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 8640
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 8700
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 8760
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 8820
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 8880
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 8940
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 9000
agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 9060
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cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 9180
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cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 9300
aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 9360
ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 9420
gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 9480
ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 9540
tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 9600
tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 9660
ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 9720
tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 9780
agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 9840
acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 9900
ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 9960
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtcg acggatcggg agatcaactt 10020
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 10080
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 10140
tgtctggatc aactggataa ctcaagctaa ccaaaatcat cccaaacttc ccaccccata 10200
ccctattacc actgccaatt acctgtggtt tcatttactc taaacctgtg attcctctga 10260
attattttca ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagt 10317
Claims (7)
1.慢病毒质粒载体，其特征在于，包括载体A和载体B；其中载体A特征在于，在真核启动子下游，具有两种荧光蛋白编码序列且两个同向Loxp位点分别置于第一荧光蛋白前后两侧，在第二个Loxp位点3’方向，第二荧光蛋白5’方向，带有真核筛选抗性蛋白编码序列，抗性蛋白与第二荧光蛋白通过T2A连接肽相连；；其中载体B特征在于，在真核启动子下游，具有Cre蛋白编码序列，且Cre蛋白编码序列的上游具有SV40核定位序列，下游具有核质素定位序列，核质素定位序列下游通过T2A连接真核筛选抗性蛋白编码序列。
2.如权利要求1所述慢病毒质粒载体，其特征在于，载体A核苷酸序列如Seq ID No.1所示，载体B核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
3.如权利要求1所述慢病毒载体，其特征在于，载体A核苷酸序列如Seq ID No.1所示，载体A的真核启动子为CAG启动子，其包含CMV增强子，鸡β-actin核心启动子，嵌合体内含子；其中CMV增强子位置与序列如Seq ID No.1第2188至2567位所示；鸡β-actin核心启动子位置与序列如Seq ID No.1第2569至2846位所示；嵌合体内含子位置与序列如Seq ID No.1第2847至3864位所示；
载体A包含红色与绿色荧光蛋白表达框、条件性真核抗性筛选蛋白表达框及两段同向Loxp序列，其中红色荧光蛋白表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第3970至4680位所示；绿色荧光蛋白表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第5191至5949位所示，两段同向Loxp序列位置及核苷酸序列如Seq ID No 1第3928至3961位及4687至4720位所示；条件性抗性筛选标记核苷酸序列如Seq ID No.1第4729至5124位所示；T2A连接肽位置及序列如Seq IDNo.1第5131至5184位所示；
载体A包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为PGK启动子，位置与序列如Seq ID No.1第5966到6465位所示；嘌呤霉素表达框位置与序列信息如Seq ID No.1第6486到7085所示；
载体B的真核启动子为CAG启动子，其包含CMV增强子，鸡β-actin核心启动子，嵌合体内含子；其中CMV增强子位置与序列如Seq ID No.2第2188至2567位所示；鸡β-actin核心启动子位置与序列如Seq ID No.2第2569至2846位所示；嵌合体内含子位置与序列如Seq IDNo.2第2847至3864位所示；
载体B包含3*Flag标签编码序列，SV40核定位序列，Cre蛋白表达框，及核质素定位序列；其中，3*Flag标签的位置与序列如Seq ID No.2第3928到3993位所示；SV40核定位序列位置与序列如Seq ID No.2第4000到4020位所示；Cre蛋白编码序列位置与序列如Seq IDNo.2第4045到5073位所示；核质素定位序列位置与序列如Seq ID No.2第5074到5124位所示；
载体B包含嘌呤霉素筛选标记，其启动子为PGK启动子，位置与序列如Seq ID No.1第5152到5651位所示；嘌呤霉素表达框位置与序列信息如Seq ID No.2第5672到6271所示。
4.如权利要求1所述慢病毒质粒载体，其特征在于，载体A的重组构建方法；包括：将两个不同荧光蛋白编码序列通过同方向Loxp序列进行连接，第一个Loxp位点前端带有Kozak序列(GCCACC)，Kozak序列后是ATG起始密码子，起始密码子与第一个荧光蛋白编码序列相连，第一个荧光蛋白编码序列带有终止密码子；在终止密码子后方，连接第二个同向Loxp序列，第二个Loxp序列3’端与抗性蛋白编码序列连接，抗性蛋白编码无终止密码子；抗性蛋白编码区3’端通过T2A连接肽编码序列，连接第二个荧光蛋白的编码序列；在第二个荧光蛋白的下游，连接PGK启动子序列，PGK启动子启动下游嘌呤霉素抗性蛋白表达；两个荧光蛋白、条件性抗性蛋白及T2A连接肽的表达，均由CAG启动子所驱动。
5.如权利要求1所述慢病毒质粒载体，其特征在于，所述载体B的重组构建；包括：在CAG启动子驱动下，启动SV40核定位肽段、Cre蛋白及核质素定位肽段融合表达，其中SV40核定位序列位于Cre蛋白表达框上游，核质素定位序列位于Cre蛋白表达框下游。
6.权利要求4-6任意一项所述的载体在细胞融合筛选中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：将载体A和载体B分别包装病毒，分别感染至不同细胞，将两株感染阳性细胞进行共培养，采用自发融合或人工刺激融合，若细胞发生融合，Cre重组酶能够将mCherry荧光蛋白编码区切下，使细胞由原来的红色荧光转变为绿色荧光，根据荧光变化判断是否出现融合细胞，同时加入条件性筛选标记进行融合细胞筛选；也通过显微操作进行单融合细胞挑选。
7.权利要求4-6任意一项所述的方法构建的重组载体在肿瘤细胞体内转移活体成像中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：将载体A包装病毒，将载体B包装病毒，分别感染至不同肿瘤细胞，挑选感染阳性的肿瘤细胞，通过尾静脉注射方式注入泛表达Cre蛋白的裸鼠体内，观察靶器官肿瘤成像，同时，若肿瘤细胞在体内发生融合转移，通过荧光变化观察转移细胞在小鼠体内的分布，同时获得不同的肿瘤细胞在体内的融合转移倾向。
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