CN107164405A - 用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。本发明构建了tg(‑6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼，可利用其检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质，检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染。实验证明其能够用于评价乙酰胆碱酯酶抑制剂导致斑马鱼体内所产生的生物效应，由于其是一种基于斑马鱼hspb11基因的上游调控序列调控报告基因即荧光蛋白编码基因表达的检测方法，因而具有简单、快速和廉价的特点；另外，对具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质具有特异性和敏感性；且适用于对含有乙酰胆碱酯酶抑制剂的水溶液进行检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。
背景技术
乙酰胆碱酯酶是降解乙酰胆碱的水解酶。乙酰胆碱酯酶存在于神经传导组织和红细胞膜，在神经细胞突触和神经肌肉接点-运动终板的发育过程中具有重要作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂通过抑制乙酰胆碱水解酶活性阻断神经之间，神经和肌肉间的信号传递，影响神经和运动功能并导致动物瘫痪和死亡。乙酰胆碱酯酶抑制剂被广泛应用于治疗阿尔茨海默病、神经毒剂和杀虫剂(沙林、VX毒气、有机磷和氨基甲酸类农药等)。由于有机磷农药具有毒性强、毒性效应广、在环境中可快速降解等特点，被广泛应用于农业生产和作为室内外杀虫剂。有机磷和氨基甲酸类农药的广泛使用对食物、水和土壤的污染引起了公众对健康影响的关注，对生态环境安全的担忧。评价乙酰胆碱酯酶抑制剂类物质对人类健康和环境的影响效应，研究、发明特异性好，高效的检测乙酰胆碱酯酶抑制剂类物质的方法和技术成为关键。
检测环境中乙酰胆碱酯酶抑制剂的水平已经被广泛用做土壤、水环境中有机磷农药的动物暴露水平和导致动物生理效应的评价指标。分析化学技术虽然可以分析、辨别目前食物、生物和环境样品中多数有机磷和氨基甲酸类化学物质，但是这些技术需要特殊的分析仪器和专业人员，限制了其应用范围。同时绝大多数有机磷类农药在环境中快速降解，经过几小时或者数天后有机磷农药的浓度会低于仪器的检测限，直接影响分析结果。检测乙酰胆碱酯酶活性的电化学装置不但需要制备灵敏性高的乙酰胆碱酯酶，而且乙酰胆碱酯酶抑制剂会导致感应器中乙酰胆碱酯酶活性的不可逆性抑制，影响电化学感应器的重复使用。基于细胞活性的检测方法具有快速、敏感性高的特点，但是不能反映乙酰胆碱酯酶抑制剂在生物体内代谢的相关信息，同时细胞对不同类型的化学物质的生物学效应具有相似性，直接影响乙酰胆碱酯酶抑制剂检测的特异性。
斑马鱼具有个体小、养殖费用低、生长周期短、产卵量大、胚胎透明和体外发育等优点，被广泛用于遗传、发育、环境毒理和人类疾病等方面的研究。用斑马鱼评价环境化学污染物的毒性效应的标准方法已经建立并得到广泛应用(OECD 203,OECD 236,ISO 7346)，但是这些标准方法检测污染物毒性效应的敏感性较低，特异性不高。通过基因重组技术，构建表达荧光蛋白的转基因斑马鱼已经被广泛应用于研究发育过程中基因调控，药物的作用位点和安全性评价等领域。表达荧光蛋白的转基因鱼不但能用于研究化学物质诱导的靶基因的表达活性，还可以半定量分析化学物质在组织和器官的累积量，为化学物质毒性的生物学效应评价提供了一种敏感性高，重复性和特异性好的方法。一些对环境中一种或者一类化学物质敏感性高，特异性强的表达荧光蛋白的转基因斑马鱼已经被用于评价环境中重金属和有机化学污染物的毒性效应和机理研究。目前所有构建的转基因鱼不能或不适合用于检测环境样品中具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。
首先，本发明提供了一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法。
本发明所提供的利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，具体可包括如下步骤：
(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24-72小时(如44-48小时)暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；
所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；
所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；
所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；
(A2)如果经过不同浓度的所述待测物质暴露后，存在至少一个浓度使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测物质为或候选为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；反之，则所述待测物质不为或候选不为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；
所述本底值为没有加入所述待测物质的所述转基因斑马鱼培养体系中培养的转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。
步骤(A1)中，用所述转基因斑马鱼的培养体系检测所述待测物质时，用同一常数稀释因子(如＝2)稀释所述待测物质为不少于5个浓度，浓度范围应包括使所述转基因斑马鱼的胚胎100％死亡的最高浓度和不会对所述转基因斑马鱼的胚胎造成任何可见影响的最低浓度。
其中，培养体系中所述待测物质的5个浓度梯度的设置，以“只要步骤(A2)中存在使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于所述本底值的所述待测物质的浓度，就一定不能全部错过”为标准。这一标准主要是针对所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值会随着所述待测物质的浓度剂量关系曲线呈抛物线的待测物质而言的。
在本发明的一个实施例中，所述待测物质的浓度梯度设置于0.01μM至3mM之间。
在本发明的一个实施例中，所述待测物质具体选自如下：谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、残杀威(propoxur)、加兰他敏(galanthamine)、甲基汞、二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)。
其次，本发明还提供了一种检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染的方法。
本发明所提供的检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染的方法，具体可包括如下步骤：
(B1)用同一常数稀释因子(如＝2)稀释所述待测水体为不少于5个浓度，在转基因斑马鱼培养体系中加入所述不少于5个浓度的所述待测水体，经24-72小时(如44-48小时)后检测所述转基因斑马鱼肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；
所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；
所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；
所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；
(B2)如果步骤(B1)中检测所得的任何一个浓度导致所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测水体被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染或疑似被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；反之，则所述待测水体未被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；
所述本底值为没有加入所述待测水体的所述转基因斑马鱼的培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。
其中，所述待测水体可为淡水，也可为海水。
根据本发明的一个实施例，所述待测水体的污染源可选自如下：谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、残杀威(propoxur)、加兰他敏(galanthamine)、甲基汞、二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)。
在上述两种方法中，对于所述转基因斑马鱼A来说，所述修饰的BAC DNA是通过目的DNA片段与编号为DKEY-30K6的斑马鱼BAC DNA发生同源重组后得到的；所述目的DNA片段包括位于两端的上下游同源臂序列和位于中间的荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；其中，上游同源臂序列为序列表中序列1，下游同源臂序列为序列表中序列2。对于所述转基因斑马鱼B来说，所述hspb11基因6kb上游调控序列如序列表中序列5所示。
进一步，对于所述转基因斑马鱼A来说，所述编号为DKEY-30K6的斑马鱼BAC DNA的GenBank登录号为AL844141.7，其中hspb11的GenBank登录号为NM_001099427；所述荧光蛋白编码基因为绿色或红色荧光蛋白的编码基因；所述抗性筛选标记基因为卡那霉素抗性基因。对于所述转基因斑马鱼B来说，所述荧光蛋白编码基因为绿色或红色荧光蛋白的编码基因；所述抗性筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因。
更进一步，对于所述转基因斑马鱼A来说，所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第470-1246位；所述卡那霉素抗性基因为序列表中序列3的第1999-2793位。对于所述转基因斑马鱼B来说，所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列6的第100-816位；所述氨苄青霉素抗性基因为序列表中序列6的第2293-3153位。
具体的，对于所述转基因斑马鱼A来说，所述目的DNA片段的序列为序列表中序列3。对于所述转基因斑马鱼B来说，所述含有目的DNA片段的重组质粒为将序列表中序列5所示DNA片段插入到序列6所示质粒的酶切位点BamHI和EcoRI之间后得到的重组质粒。
在上述两种方法中，所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度显著高于本底值，更加严谨的可为：所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度为所述本底值的1.5倍以上。
在上述两种方法中，所述转基因斑马鱼可为转基因斑马鱼的胚胎或幼鱼。
在本发明的一个实施例中，所述转基因斑马鱼具体为发育至4小时的转基因斑马鱼的胚胎。
在上述两种方法中，所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质为乙酰胆碱酯酶抑制剂或其它具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质。
在本发明的一个实施例中，所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质具体为谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、残杀威(propoxur)、加兰他敏(galanthamine)或甲基汞。
在上述两种方法中，一次完整的检测中所涉及的所有所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度的测定，全部图象均使用相同的曝光参数，且保持同样的荧光采集部位(如采集所述转基因斑马鱼的第12至18体节，全部图像呈背面观)。
用于制备所述转基因斑马鱼的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的用于制备所述转基因斑马鱼的试剂盒，具体可含有前文所述的修饰后的BAC DNA，或者含有前文所述的含有目的DNA片段的重组质粒。
如下(A)或(B)所示应用也属于本发明的保护范围。
(A)前文所述的转基因斑马鱼在如下(a)或(b)中的应用；
(B)受体斑马鱼和所述试剂盒在如下(a)或(b)中的应用；
(a)检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；
(b)检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染。
本发明构建了tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼，实验证明其能够用于评价乙酰胆碱酯酶抑制剂导致斑马鱼体内所产生的生物效应，由于其是一种基于斑马鱼hspb11基因的上游调控序列调控报告基因即荧光蛋白编码基因表达的检测方法，因而具有简单、快速和廉价的特点；另外，对具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质具有特异性和敏感性；且适用于对含有乙酰胆碱酯酶抑制剂的水溶液(含淡水和海水)进行检测。
附图说明
图1为用同源重组方法在包含hspb11基因组序列的BAC(DKEY-30K6)DNA中插入荧光蛋白基因的示意图。
图2为斑马鱼胚胎显微注射及瞬时表达荧光蛋白胚胎的挑选。其中，A为胚胎注射；B为瞬时表达绿色荧光蛋白的6-8小时胚胎；C为瞬时表达绿色荧光蛋白的24小时胚胎。
图3为稳定表达荧光蛋白的转基因斑马鱼构建。其中，A为稳定表达绿色荧光蛋白的48小时胚胎；B为表达绿色荧光蛋白的肌肉细胞(图A白色方框侧面观)；C为表达绿色荧光蛋白的肌肉和脊索细胞(图A白色方框背面观)；D为斑马鱼hspb11mRNA 24小时胚胎表达区域(原位杂交)；E为表达hspb11mRNA的肌肉细胞(图D黑色方框侧面观)。
图4为各种化学物质诱导tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼荧光蛋白表达情况(化学物质诱导tg(-6kb hspb11:egfp)的结果与图4基本一致)。其中，A为表达绿色荧光蛋白的对照胚胎；B为谷硫磷(azinphosmethyl)诱导绿色荧光蛋白表达；C为残杀威(propoxur)诱导绿色荧光蛋白表达；D为毒死蜱(chlorpyrifos)诱导绿色荧光蛋白表达；E为加兰他敏(galanthamine)诱导绿色荧光蛋白表达；F为甲基汞诱导绿色荧光蛋白表达；G为二溴乙烷(1,2-dibromoethane)处理胚胎；H为百菌清(chlorothalonil)处理胚胎。全部图象均使用相同的曝光参数，采集于48小时胚胎的第12至18体节，全部图像呈背面观。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
斑马鱼系：野生型斑马鱼(AB品系)；转基因斑马鱼tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)，具体构建方法见实施例1。
化学物质：有机磷农药谷硫磷(azinphosmethyl，CAS 86-50-0)，毒死蜱(chlorpyrifos,CAS 2921-88-2)。乙酰胆碱酯酶抑制剂残杀威(propoxur,CAS 114-26-1)，加兰他敏(galanthamine,CAS 357-70-0)。重金属甲基汞(CAS 115-09-3)。有机溴和氯类农药：二溴乙烷(1,2-dibromoethane,CAS 106-93-4)，百菌清(chlorothalonil,CAS 1897-45-6)。
仪器：显微注射仪。
斑马鱼培养：水温28.5℃，14/10小时的日/夜周期，循环水培养。商业饲料和孵化的卤虫喂养。
斑马鱼卵收集：雌雄成鱼按照1:2比例放置于产卵盒中，收集的受精卵放置于胚胎专用培养液，胚胎培养条件：水温28.5℃，14/10小时的日/夜周期，72小时开始孵化，胚胎发育阶段按照标准确定。
实施例1、转基因斑马鱼tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)的构建
本发明是基于斑马鱼基因hspb11，GenBank ID为NM_001099427的表达调控序列，采用同源重组的方法来构建具有和内源性hspb11基因表达区域一致的、调控报告基因—荧光蛋白表达的转基因斑马鱼。
一、构建由斑马鱼hspb11上游调控序列调控报告基因的tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼
(一)斑马鱼基因hspb11同源重组质粒的构建
1、上下游同源臂序列的扩增
以斑马鱼BAC克隆(DKEY-30K6，GenBank登录号为AL844141.7，Source BioScience公司产品，货号为DKEY-30K6)为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增，得到A片段(GGTACC+序列表中序列1+AAGCTT)。
引物1：5’-GGTACCGTTGGAATGCTCGCTGGTTA-3’；
引物2：5’-AAGCTTCTCGGGCAAAGCATCTTCAG-3’。
以斑马鱼BAC克隆(DKEY-30K6，GenBank登录号为AL844141.7，Source BioScience公司产品，货号为DKEY-30K6)为模板，以引物3和引物4进行PCR扩增，得到B片段(CCGCGG+序列表中序列2+GAGCTC)。
引物3：5’-CCGCGGCACAATGGAATGAACCGCCA-3’；
引物4：5’-GAGCTCCGTGAGCCAAACCAAACCAA-3’。
两次PCR的反应程序均为：98℃5分钟；98℃30秒，55℃20秒，60℃4分钟，30个循环；60℃5分钟；4℃保存。
所得片段A和片段B即为用于同源重组时的同源臂序列。
2、带有荧光蛋白基因的同源重组质粒的构建
步骤1经PCR扩增所得片段A和片段B，经过凝胶电泳、片段回收、T4连接酶连接反应分别插入pGEM-T载体。经测序验证后，片段A经过KpnI和HindIII酶切，片段B经过SacI和SacII酶切，回收、依次连接入包含荧光蛋白、多聚腺嘌呤(Poly A)、卡那霉素抗性基因的同源重组质粒pCS2-GFP-PolyA-KanR(全序列见序列4)，并测序验证，测序验证正确的质粒命名为pCS2-A+GFP-PolyA-KanR+B。
重组载体pCS2-A+GFP-PolyA-KanR+B的结构描述如下：经限制性内切酶KpnI和HindIII酶切回收的片段A插入pCS2-GFP-PolyA-KanR载体中的荧光蛋白序列的5’端的相应酶切位点处，且经SacI和SacII酶切回收的片段B插入pCS2-GFP-PolyA-KanR载体中卡那霉素抗性基因序列的3’端的相应酶切位点处。
(二)经同源重组技术构建插入荧光蛋白基因的包含斑马鱼基因hspb11的BAC DNA
1、斑马鱼基因hspb11的BAC(DKEY-30K6)DNA的细胞转化
加入250-500纳克(体积不超过5微升)提纯的斑马鱼BAC(DKEY-30K6)DNA于42微升电转化感受态细胞EL250中，设置电转化仪电压为2.5kv，放入电转化细胞进行转化。转化后的细胞在含有氯霉素的培养板涂板，32℃培养箱培养。挑选生长的细菌，培养、PCR鉴定，确定包含DKEY-30K6DNA的转化细胞。
2、用同源重组在包含hspb11基因组序列的BAC(DKEY-30K6)DNA中插入荧光蛋白基因
示意图如图1所示。
(1)将步骤一制备的带有荧光蛋白基因的同源重组质粒pCS2-A+GFP-PolyA-KanR+B经KpnI和SacI酶切、电泳、回收的包含同源序列A、绿色荧光蛋白基因、卡那霉素抗性基因和同源序列B的DNA，记为“目的DNA片段”。“目的DNA片段”的序列如序列表中序列3所示，其中第1-440位为片段A，第470-1246位为绿色荧光蛋白的编码基因，第1289-1423位为SV40Poly A信号序列，第1999-2793位为卡那霉素抗性基因，第3006-3439位为片段B。
(2)在制备的激活重组酶的电转化感受态(包含BAC DKEY-30K6DNA)EL250细胞中，加入150-500纳克“目的DNA片段”，以2.5kv电压进行转化。转化后的细胞在氯霉素和卡那霉素的培养基上涂板，挑选，培养，PCR鉴定获取插入荧光蛋白基因的克隆，提取、纯化插入荧光蛋白基因的BAC DNA，记为“修饰后的BAC DNA”。
(三)构建由斑马鱼hspb11上游调控序列调控报告基因的tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼
1、斑马鱼胚胎显微注射插入荧光蛋白基因的hspb11基因重组BAC DNA
用显微注射仪在斑马鱼1-2细胞期胚胎的细胞中，注入加入0.1％的酚红显示剂的50-150纳克/微升的步骤二纯化的“修饰后的BAC DNA”。用斑马鱼胚胎培养液培养注射后的胚胎，胚胎发育过程中挑选发育正常的胚胎，在荧光体视显微镜下观察、挑选表达荧光的胚胎(见图2)。
2、稳定表达荧光蛋白转基因斑马鱼的筛选
挑选健康的培养至性成熟(2-3个月)的注射过“修饰后的BAC DNA”的斑马鱼和正常培养斑马鱼(AB野生型)，按照1:2的雌雄比例进行交配，收集受精卵，培养至24小时，荧光显微镜镜检鉴定表达荧光的胚胎。用原位杂交技术比较转基因斑马鱼胚胎表达荧光蛋白的区域和内源性hspb11基因的表达，挑选表达一致的胚胎培养，建成稳定表达荧光蛋白的转基因斑马鱼(见图3)，即为tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼。
二、构建由斑马鱼hspb11上游调控序列调控报告基因的tg(-6kb hspb11:egfp)转基因斑马鱼
1、上游调控序列的扩增
以斑马鱼BAC克隆(DKEY-30K6，GenBank登录号为AL844141.7，Source BioScience公司产品，货号为DKEY-30K6)为模板，以引物5和引物6进行PCR扩增，得到6017个碱基的上游调控序列片段(GGATCC+序列表中序列5+GAATTC)。
引物5：5’-GGATCC TGGATACATCGTGGGGATTT-3’；
引物6：5’-GAATTC TTTGCTGTTGAGCTGTTTGG-3’。
PCR的反应程序均为：98℃5分钟；98℃30秒，55℃30秒，60℃7分钟，30个循环；60℃15分钟；4℃保存。
所得片段为6017个碱基的上游调控序列，记为-6kb hspb11(参见序列表中序列5)。
2、-6kb上游调控序列插入报告基因载体pCS2-GFP-PolyA-AmpR
步骤1经PCR扩增所得上游调控序列片段-6kb hspb11(序列5)经测序验证后，经过BamHI和EcoRI酶切，回收、连接入包含荧光蛋白、多聚腺嘌呤(Poly A)、氨苄青霉素抗性基因的同源重组质粒pCS2-GFP-PolyA-AmpR(全序列见序列6，其中第100-816位为绿色荧光蛋白的编码基因，第846-980位为SV40 Poly A信号序列，第2293-3153位为氨苄青霉素抗性基因)，并测序验证，测序验证正确的质粒命名为pCS2+-6kb hspb11-GFP-PolyA-AmpR。
重组载体pCS2+-6kb hspb11-GFP-PolyA-AmpR的结构描述如下：经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切回收的-6kb上游调控序列插入pCS2-GFP-PolyA-AmpR的荧光蛋白序列的5’端的相应酶切位点处。
3、斑马鱼胚胎显微注射插入hspb11基因6kb上游调控序列和荧光蛋白基因的重组质粒
用显微注射仪在斑马鱼1-2细胞期胚胎的细胞中，注入加入0.1％的酚红显示剂的50-150纳克/微升的纯化的“pCS2+-6kb hspb11-GFP-PolyA-AmpR”DNA。用斑马鱼胚胎培养液培养注射后的胚胎，胚胎发育过程中挑选发育正常的胚胎，在荧光体视显微镜下观察、挑选表达荧光的胚胎(见图2)。
4、稳定表达荧光蛋白转基因斑马鱼的筛选
挑选健康的培养至性成熟(2-3个月)的注射过“pCS2+-6kb hspb11-GFP-PolyA-AmpR”DNA的斑马鱼和正常培养斑马鱼(AB野生型)，按照1:2的雌雄比例进行交配，收集受精卵，培养至24小时，荧光显微镜镜检鉴定表达荧光的胚胎。用原位杂交技术比较转基因斑马鱼胚胎表达荧光蛋白的区域和内源性hspb11基因的表达，挑选表达一致的胚胎培养，建成稳定表达荧光蛋白的转基因斑马鱼(见图3)，即为tg(-6kb hspb11:egfp)转基因斑马鱼。
实施例2、乙酰胆碱酯酶抑制剂对tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼荧光蛋白表达的诱导及其特异性分析
一、定量分析化学物质诱导tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼荧光蛋白表达水平
发育至4小时的tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)斑马鱼胚胎，分别用不同浓度的有机磷农药谷硫磷(azinphosmethyl)，毒死蜱(chlorpyrifos)，乙酰胆碱酯酶抑制剂残杀威(propoxur)，加兰他敏(galanthamine)，重金属甲基汞，有机溴和氯类农药二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)水溶液处理。采集48小时胚胎的第12至18体节的荧光图像，全部图像呈背面观。通过比较荧光强度来定量分析经过暴露的胚胎和未经暴露的对照胚胎的绿色荧光来评价不同化学物质诱导荧光蛋白表达的浓度效应关系。
结果见图4为各种化学物质诱导tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼荧光蛋白表达情况(化学物质诱导tg(-6kb hspb11:egfp)的结果与图4基本一致)。具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质(B为谷硫磷(azinphosmethyl)，C为残杀威(propoxur)，D为毒死蜱(chlorpyrifos)，E为加兰他敏(galanthamine)，F为甲基汞)诱导斑马鱼胚胎表达绿色荧光蛋白的荧光强度比A对照胚胎荧光强度增加1.5倍。不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质(G二溴乙烷(1,2-dibromoethane)，H百菌清(chlorothalonil))不能诱导斑马鱼胚胎表达绿色荧光蛋白的荧光强度的增加。
二、具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质诱导tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达的特异性分析
发育至4小时的tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)斑马鱼胚胎，分别用不同浓度的有机磷农药谷硫磷(azinphosmethyl)，毒死蜱(chlorpyrifos)，乙酰胆碱酯酶抑制剂残杀威(propoxur)，加兰他敏(galanthamine)，重金属甲基汞，有机溴和氯类农药二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)水溶液处理。采集48小时胚胎的第12至18体节的荧光图像，全部图像呈背面观。分析具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质诱导tg(-6kb hspb11:egfp)和/或tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达的特异性。
结果显示：具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质诱导绿色荧光蛋白的表达并呈现浓度效应关系。比较对照组斑马鱼胚胎和化学物质暴露胚胎的荧光强度，0.199μM谷硫磷，4.374μM毒死蜱，51.790μM残杀威，1043μM加兰他敏和0.538μM甲基汞分别诱导荧光强度升高1.5倍。没有乙酰胆碱酯酶抑制活性的二溴乙烷和百菌清不诱导绿色荧光蛋白表达。例如2660μM的二溴乙烷导致28％的胚胎呈现运动功能异常，并没有诱导绿色荧光蛋白的表达(图4中G和表1)。同样导致24％胚胎运动功能异常的0.5μM的百菌清也没有诱导绿色荧光蛋白表达的活性(图4H和见表1)，表明具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质具有诱导绿色荧光蛋白表达的特异性。化学物质诱导tg(-6kb hspb11:egfp)的结果与图4基本一致。
三、tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼胚胎对乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的敏感性分析
发育至4小时的tg(-6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)斑马鱼胚胎，分别用不同浓度的有机磷农药谷硫磷(azinphosmethyl)，毒死蜱(chlorpyrifos)，乙酰胆碱酯酶抑制剂残杀威(propoxur)，加兰他敏(galanthamine)，重金属甲基汞，有机溴和氯类农药二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)水溶液处理。采集48小时胚胎的第12至18体节的荧光图像，全部图像呈背面观。分析tg(-6kb hspb11:egfp)和/或tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼胚胎对乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的敏感性。
结果显示：具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质暴露会导致斑马鱼胚胎呈现非自主性运动，躯干扭曲等运动功能损伤。0.3μM谷硫磷可以导致23％的胚胎呈现运动功能损害，而0.199μM谷硫磷诱导的荧光强度水平超过对照组的1.5倍。120μM的残杀威导致20％的胚胎出现非自主性运动变化，51.790μM的残杀威诱导的荧光强度比对照组升高1.5倍。1000μM的加兰他敏导致35％的胚胎出现运动功能损害，1043μM加兰他敏诱导胚胎荧光强度升高1.5倍。4μM毒死蜱导致10％的胚胎呈现运动功能损害，4.374μM毒死蜱诱导胚胎荧光强度增加1.5倍。不具有乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的二溴乙烷和百菌清虽然造成形态和运动功能的改变，但是并不诱导荧光蛋白表达活性(见表1)。
表1 tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼胚胎评价乙酰胆碱酯酶抑制剂生物效应的特异性和敏感性(tg(-6kb hspb11:egfp)转基因斑马鱼与表1所示结果基本一致)
注：谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、残杀威(propoxur)、加兰他敏(galanthamine)和甲基汞为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质。
<110> 中国环境科学研究院
<120> 用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法
<130> GNCLN170987
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<210> 1
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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gttggaatgc tcgctggtta aatttaaaca ccaccgacag catgtgaaag aacttcccaa 60
aaaaaagctc tgatgtgaca ttaaaccatt cacttcagta atcacgatta taaaccttta 120
agtgtgtgat cagtaaacct tatatcatcc cccacatgaa ctcttcccct aatagaaagg 180
catgcaaact cattacagcg ccactctaaa tagaacaatg atgtggttca ctggtattta 240
acagatgctt gcaaaaatac aaccgacttg ttttggaaca tgacagcaag tgctcagcat 300
aacagctcat cgacacatac tggaatgttc tgaggcacca tataaaagca cagagtcgcg 360
ttcgttggga cagaagcaca gaagaagcca aacagctcaa cagcaaaccc gagaaatcca 420
ctgaagatgc tttgcccgag 440
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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agctgcaacc cagtactgga aaacacccat acacgttcac acttacctat agtgcatctc 120
tttagacttt ggatgtcttt ggagcaaata gaggaaaccc atgccaacga ggagaacatg 180
caaactcctt gctgtgaggc aacagtatcc actgagtcat cgtgttgccc ctggatggaa 240
attttttgtt tattaaatgc atatttttca gtaaacttaa aatgtcctgt ttctatagat 300
acaattatca atttttttaa tttttttatg aaaataatgt gttgttttta tttcatcata 360
ttatttaatg agcataattg gattgtaatt atttctgtca gtaaacaaag tttgttggtt 420
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<223>
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aaaaaagctc tgatgtgaca ttaaaccatt cacttcagta atcacgatta taaaccttta 120
agtgtgtgat cagtaaacct tatatcatcc cccacatgaa ctcttcccct aatagaaagg 180
catgcaaact cattacagcg ccactctaaa tagaacaatg atgtggttca ctggtattta 240
acagatgctt gcaaaaatac aaccgacttg ttttggaaca tgacagcaag tgctcagcat 300
aacagctcat cgacacatac tggaatgttc tgaggcacca tataaaagca cagagtcgcg 360
ttcgttggga cagaagcaca gaagaagcca aacagctcaa cagcaaaccc gagaaatcca 420
ctgaagatgc tttgcccgag agcttgatat cgaattcctg cagcccggga tggtgagcaa 480
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 540
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cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 660
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cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 840
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 900
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 960
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ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 1140
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggcg gtggaagatc 1200
tgggaattca aggcctctcg agcctctaga ttctgcagcc ctatagcaga tctcgagcct 1260
ctagaactat agtgagtcgt attacgtaga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt 1320
tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc 1380
tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat 1440
tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaattcg cggccgggcg 1500
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ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 1740
cttcaataat attgaaaaag gaagagtcct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt 1800
gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 1860
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gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 2700
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tagatacaat tatcaatttt tttaattttt ttatgaaaat aatgtgttgt ttttatttca 3360
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<210> 4
<211> 5395
<212> DNA
<213> 人工序列
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gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
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catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga 1260
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agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4740
cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4800
tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4860
agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4920
gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4980
gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 5040
ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 5100
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 5160
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 5220
gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 5280
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 5340
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccac 5395
<210> 5
<211> 6017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tggatacatc gtggggattt acttcaaaat ggtgtcagag tttgctgtga agataaaaag 60
agatattaag atattttaat atttatgttt caagaaacac tgtattacta caaaaatgtg 120
attttggcca cgcaagcata cacattgaaa tttgatgtat tataaactga gcttattttt 180
cttaatatta atagcatttc attggatttt ttctttatat agaacacact ttttatcata 240
actttgataa tatgatacat ttttattatg tttaatttta gtcatattat ttttagttgt 300
attattatta gttatatttt tctgtagagt ataacgtatg ttgttgtttt ttttacctga 360
gcaaataaat gacaaatatt ttaacactga ttttacaaaa gacaaaaaat aaaatgccat 420
tcagtgtaac aattcatata ccaaatgatt taacttttac agggtgtttg cggggtctta 480
aaaagtattt aaagttgata aatcaatgta gagaaattta aggcccttaa agtattaaaa 540
agtcttaaat gctattttgc aatgtattaa attttgtata atttttgatt atgcaatgca 600
tgctaaagtt agcctgaatt aaatctgtga acatcaggat gctgtttagt ttatgaaatc 660
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tgaaaaatgg ttataaggtc ttaaaatata tggaaagtct taaaaaggtc ttaaaaggta 900
ttgaatttca ctttctggtt cctgtatata ctcaatctta aatcttaagc tttaccataa 960
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ttttgtgttt aacagaagaa agaaagccaa acaggtctaa aacatacgga ggcccggaag 1260
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tagcctatag atctgtgcat tcttacagtg acacctctgt tatcaaataa aacgagattc 1800
atttgctgtt cttcacttgt ttgataacag aggtgtcact ttaaatgacg tatacataag 1860
ctgttctggg atcagtttat catacggagc gcatccgtca gtttaagctt atacatgcat 1920
tcgctgattc aggggttgca tataaatggc tatgatcgac gcacagcttt aatggaaaga 1980
atgtgaatgc agacattttt ataaatttca gcatgctttc aagattaaaa atatatgaga 2040
aatatgggaa aatacttatg ataggatgat agcaggacag aatggtaaaa tctgggagaa 2100
tactgttaaa aaagggaggg ttgacatgta tgaagttaac aggaagggtt tgttaaaaac 2160
atctttgcga gataacacaa tctttgcaag ggaacgcaaa aactgttatt atatatatat 2220
atatatatat atatatatat atatatatat atatcactgt ttttgttttt cccccaccca 2280
gttttatttt attccaccta tttttccccc accatcatgt cccttccggg tggaaacacg 2340
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attttcattg ctttttttat gaaataactg aacaaacata taggaggcta agaaaaatgc 3840
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tattattaat tcatgcattt atttatttac ttactaagcc tacttatttg gcatatggtt 3960
tattcattca ttcattcatt catcttcttg tcggcttagt ccctttattg atccggggtc 4020
gccacagtgg aatgaaccgc caacttattc agcaagtttt ttcgcatcgg atgcccttcc 4080
agcaacaacc catctctggg aaacatccac acacacactc atacacggac aatttagcct 4140
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attaattagt caaaatcatt actattatac aaggacttcc atcatcatac ttcctaaaca 5460
gacacttgac atcagtctcc aggtttgttt ttaaatatgc agacggacgt cctccttcct 5520
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 6
cgccattctg cctggggacg tcggagcaag cttgatttag gtgacactat agaatacaag 60
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Claims (10)
1.一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，包括如下步骤：
(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24-72小时暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；
所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；
所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；
所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；
(A2)如果经过不同浓度的所述待测物质暴露后，存在至少一个浓度使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测物质为或候选为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；反之，则所述待测物质不为或候选不为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；
所述本底值为没有加入所述待测物质的所述转基因斑马鱼培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。
2.一种检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染的方法，包括如下步骤：
(B1)用同一常数稀释因子稀释待测水体为不少于5个浓度，在转基因斑马鱼培养体系中分别加入所述不少于5个浓度的所述待测水体，24-72小时后检测所述转基因斑马鱼肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；
所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；
所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；
所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；
(B2)如果步骤(B1)的检测中存在任何一个浓度导致所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测水体被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染或疑似被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；反之，则所述待测水体未被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；
所述本底值为没有加入待测水体的所述转基因斑马鱼的培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述修饰后的BAC DNA是通过目的DNA片段与编号为DKEY-30K6的斑马鱼BAC DNA发生同源重组后得到的；所述目的DNA片段包括位于两端的上下游同源臂序列和位于中间的荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；其中，上游同源臂序列为序列表中序列1，下游同源臂序列为序列表中序列2；
在所述转基因斑马鱼B中，所述hspb11基因6kb上游调控序列如序列表中序列5所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述编号为DKEY-30K6的斑马鱼BAC DNA的GenBank登录号为AL844141.7；所述荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白的编码基因；所述抗性筛选标记基因为卡那霉素抗性基因；
在所述转基因斑马鱼B中，所述荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白的编码基因；所述抗性筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第470-1246位；所述卡那霉素抗性基因为序列表中序列3的第1999-2793位；
在所述转基因斑马鱼B中，所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列6的第100-816位；所述氨苄青霉素抗性基因为序列表中序列6的第2293-3153位。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述目的DNA片段的序列为序列表中序列3；
在所述转基因斑马鱼B中，所述含有目的DNA片段的重组质粒为将序列表中序列5所示DNA片段插入到序列6所示质粒的酶切位点BamHI和EcoRI之间后得到的重组质粒。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度显著高于本底值，为：所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度为所述本底值的1.5倍以上。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼的胚胎或幼鱼；或
所述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质为乙酰胆碱酯酶抑制剂或其它具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质。
9.用于制备权利要求1-8任一中所述的转基因斑马鱼的试剂盒，含有权利要求1-8任一中所述的修饰后的BAC DNA，或者含有权利要求1-8任一中所述的含有目的DNA片段的重组质粒。
10.应用，为(A)或(B)：
(A)权利要求1-8任一中所述的转基因斑马鱼在如下(a)或(b)中的应用；
(B)受体斑马鱼和权利要求9所述的试剂盒在如下(a)或(b)中的应用；
(a)检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；
(b)检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染。
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|---|---|---|---|---|
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