CN104321439A - 甲状腺癌生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本文提供的方法将微阵列数据用于特征选择并随后使用选定的靶标以用新的临床样本测定数据产生工业标准的qPCR阵列以便建立分类模型。这种多步骤方法克服了传统生物标志物鉴定的缺点。

Description

甲状腺癌生物标志物
发明背景
序列表
本申请包含以ASCII形式通过EFS-Web提交的序列表并且通过引用以其整体并入此处。将创建于2013年3月5日的所述ASCII拷贝命名为0051-0096-WO1_SL.txt且大小为5,019字节。
发明领域
本文提供的方法将微阵列数据用于特征选择并随后使用选定的靶标以用新的临床样本测定数据产生工业标准的实时定量(qPCR)阵列以便建立分类模型。这种多步骤方法克服了传统生物标志物鉴定的缺点。
发明背景
在使用传统方法对甲状腺结节的临床分类中具有挑战。 这些挑战影响临床决策并导致非必需手术的执行。虽然一些研究者已经探索了使用新的分子分类法以克服这些挑战，但是这些努力在临床环境下仍然远没有实现。
甲状腺结节在大多数人群中常见。例如，据估计2010年在美国会验明44,670名新病患。通常侵入诊断法对于病患中结节类型的准确诊断是必需的。自从1970年代引进以来，细针抽吸活组织检查(FNAB)提供了最重要的诊断手段，然而20-30%的FNAB细胞学结果仍然不确定。尽管可重复不确定的、可疑的或非诊断的FNAB，但这些只对于小部分的病患有帮助而且需要额外的费用和侵入步骤。
许多研究者已经尝试开发其他的诊断测定法和生物标志物以提高诊断精确度。例如，细针抽吸活组织检查(FNAC)在更好的精确度上具有它的价值但其局限性在滤泡性甲状腺癌(FTC)中尤其明显。免疫组化生物标志物例如Hector Battifora间皮细胞1 (HBME-1)、高分子量细胞角蛋白19 (CK19)和半乳凝素-3已经展现出具有甲状腺癌相关的表达，但是它们的表达在灵敏性和特异性上高度可变。其他尝试例如恶性甲状腺细胞中使用基因重排和/或体细胞突变的研究已取得的进展有限。进一步的研究已聚焦于转化/乳头状甲状腺癌的重排(RET/PTC)，其中已发现BRAF和RAS基因的重排和突变增加诊断、预后和验证研究的精确性。最后，微阵列基因概况分析已展示有助于良性结节和恶性肿瘤的分类。但是，这些研究大多数仅专注于简单的微阵列分析和验证以鉴定在良性和恶性群体之间差异表达的基因。显然，使用生物信息学模型的更稳健的测定和更精密的分析将更好地适应肿瘤异质性的挑战和临床样本的复杂性，尤其对于甲状腺瘤。 
但是，基于微阵列的测定具有一些固有缺点。他们对样本质量敏感，这在临床环境中通常表现为挑战。基于微阵列的技术也需要增加的样本制备时间和复杂的数据分析程序。
传统地，微阵列被直接用于生物标志物特征(signature)的产生。然而，微阵列的直接使用在临床环境中产生了许多挑战，尽管观测到一些重要的靶标，但是并没有形成如何将通过微阵列实验所得的观察结果转化为用户友好的临床检测的共识。对于传统直接使用微阵列的另一个缺点是不同微阵列平台间的标准化。存在多种微阵列平台，其各自使用截然不同的基因集合并采用不同杂交和信号检测方法。例如，一些微阵列包含可变长度的cDNA，而其它微阵列包含小的寡核苷酸序列。不同微阵列平台的使用使得额外的平台间的标准化和转化工作成为必要，这使结果一致性较低且增加出错的风险。
研究者们已将例如无监管的分级聚类和2组k-平均数聚类等传统发现聚类分析用于甲状腺癌鉴定的靶标鉴定和最终分类。除了良好设计的基于多模型的特征筛选和qPCR阵列优化外，本文还提供用于监管的机器学习的新训练样本集，其随后用于普遍接受的分类方法——随机森林(Random forest)中用于最终恶性甲状腺结节鉴定。
传统地，用于分类的发现工具的使用限制了他们用于临床诊断的潜在应用。Marschall Stevens Runge在他的著作“Principles of molecular medicine (分子医药原理)”中陈述，“分析的非监管方法，包括主要成分分析、分级聚类、k-平均数聚类和自组织图，可用作用于类别发现的工具。”此外，“用于确定在疾病状况间基因表达概况的差异的非监管方法具有可通过使用监管的学习方法规避的限制。”本文提供的方法将监管的机器学习方法用于恶性甲状腺结节和良性结节的分类并避免先前方法的问题和限制。
发明概述
在实施方案中，提供实时定量聚合酶链反应(qPCR)阵列。 合适地，该阵列包含一种或多种选自NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1的甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物；一个或多个选自TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ的参考基因；和用于产生单一恶性肿瘤分数和可调整(scalable)的截止阈值的相伴分类算法。
该阵列合适地包含3种或者更多种甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物和3个或更多个参考基因，该阵列更合适地包含5种或更多种甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物及4个或更多个参考基因。 
在实施方案中，该阵列包含甲状腺结节恶性分类生物标志物NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1及参考基因TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ。
在本文描述了用于该阵列的示例性的替换基因，在本文亦描述了用于所述算法的示例性的数学模型。
附图简述
图1展示用于制备本文所述生物标志物PCR阵列的开发路线图的实例。
图2展示本文所描述的qPCR阵列开发进程。
图3展示使用本文所述的qPCR阵列系统进行的从样本到生物标志物特征小组(panel)的工作流程。
图4A-4D展示本文所描述甲状腺恶性肿瘤qPCR阵列的开发。
图5展示所述甲状腺恶性肿瘤特征的结果。
图6A展示人类(Homo Sapiens) TATA框结合蛋白(TBP)、转录变体2、mRNA(SEQ ID NO :1)的序列。
图6B展示人类TATA框结合蛋白(TBP)、转录变体1、mRNA(SEQ ID NO :2)的序列。
图7A展示人类尼曼-皮克病(Niemann-pick disease)、C2类型(NPC2)、mRNA(SEQ ID NO :3)的序列。 
图7B展示人类S100钙结合蛋白A11(S100A11)、mRNA(SEQ ID NO :4)的序列。
优选实施方案的详细说明
应该理解的是，本文描述和展示的具体实现是实例而不意图以任何方式另外限制本申请的范围。
本文提到的公开专利、专利申请、网址、公司名称及科学文献通过引用以其整体并入此处，其程度如同各自具体地且单独地指出通过引用并入一样。本文引用的任何参考文献和本说明书的具体教导之间的任何冲突应该按支持后者的方式决断。 同样地，单词或短语的本领域理解定义与本说明书中具体教导的该单词或短语的定义之间的任何冲突应该支持有后者的方式决断。
如本说明书中使用，除非内容清晰地另外指示，单数形式“一”、“一种”和“该”具体还包括它们所提及的术语的复数形式。术语“约”在本文中用于意指大概、在…左右、大致的或大约。当术语“约”连同数值范围使用时，它通过延伸高于和低于陈述的数值的边界修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于修饰高于和低于陈述值达20%变化的数值。
除非另外定义，本文使用的技术和科学术语具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。本文对本领域中普通的技术人员所知的各种方法和材料进行了提及。
生物标志物qPCR阵列的开发
在实施方案中，提供了制备生物标志物实时定量聚合酶链反应(qPCR)阵列的方法。合适地，这些方法包括选择一种或多种高通量特征表达数据集，标准化该特征表达数据集，通过一种或多种数学模型分析该数据集以产生最终候选特征，和生成包含最终候选特征的生物标志物qPCR阵列。
如本文使用，“生物标志物”是指可测量的特征，这些特征提供关于以下方面的信息：在病患体内疾病或受累状态的存在情况和/或严重度、与生物通路的关系、药效关系或产出、相伴诊断、特定物种或生物样本的质量。生物标志物的实例包括基因、蛋白质、肽、抗体、细胞、基因产物、酶、激素等等。
本文使用的“特征”是指基因、基因的部分或其它基因组信息。合适地，特征是指用以制备本文所述阵列的基因。
在实施方案中，所述一种或多种高通量特征表达数据集(包括微阵列数据集，以及包括下一代测序平台的其它测序数据集)是基于临床效用(例如，疾病特异性生物标志物)、研究兴趣(例如，生物通路特异性生物标志物)、药物响应(例如，药效生物标志物或相伴诊断生物标志物)、物种和品质中的一种或多种而进行选择的。
在实施方案中，分析包含用一种或多种数学模型对数据集进行的分析，所述数学模型包括但不局限于：随机森林(RF)建模、支撑向量机(support vector machine, SVM)建模和最近缩小形心(nearest shrunken centroid, NSC)建模。在本领域中已知的另外的模型也能应用于本文描述的方法，包括例如各种遗传算法、决策树(decision tress)和朴素贝叶斯建模(Na?ve Bayes modeling)。
实施这些建模的方法在本领域中为熟知的，且得到了描述，例如RF模型在以下中描述：Touw等人，“Data mining in the Life Sciences with Random Forest: a walk in the park or lost in the jungle?,”，Briefings in Bioinformatics，2012年5月26日，Kursa和Rudnicki，“The All Relevant Feature Selection using Random Forest,” Cornell University Library,，arXiv:11065112，2011年6月25日， Genuer等人，“Variable Selection using Random Forests,”提交至Pattern Recognition Letters的文章，2010年3月17日，Ostroff等，“Early Detection of Malignant Pleural Mesothelioma in Asbestos-Exposed Individuals with a Noninvasive Proteomics-Based Surveillance Tool,”，PLOS ONE 7:e46091(2012年10月)，Chen等人, “Development and Validation of a qRT-PCR Classifier for Lung Cancer Prognosis,” J Thorac Onocl 6:1481-1487 (2011年9月)；NSC模型在以下中描述：Klassen和Kim，“Nearest Shrunken Centroid as Feature Selection of Microarray Data”,，可从http://wwwresearchgatenet/获得，Tibshirani等，“Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression,” Proc Natl Acad Sci 99:6567-6572(2002年5月14日)；及SVM模型在以下中描述：Yousef等人,“Classification and biomarker identification using gene network molecules and support vector machines,” BMC Bioinformatics 10:337(2009年)， 和Brank, J, “Feature Selection Using Linear Support Vector Machines,” Microsoft Research Technical Report，MSR-TR-2002-63 (2002年6月12日) (其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文，特别针对本文描述的模型和它们的实现的公开内容)。在实施方案中，分析包括将这些模型中的两种或更合适地，所有三种用于数据，以产生组合特征集和最终qPCR阵列。
合适地，分析包含基于由数据集所暗示的所需分类组合来自一种或多种数学模型的区别性特征。亦即，依据所需的分析(即,临床的结果,研究兴趣等等)，选出区分一种生物标志物与另一种生物标志物的特征。例如，相对于不指示疾病状态或其他特征的基因挑选存在于疾病状态中的基因。
如本文所述，分析可另外包括文献挖掘(mining)以产生最终候选特征。这允许添加进一步的信息以阐明和限定所需的候选特征。
合适地，该方法另外包括选择一种或多种对照数据集，以在生物标志物qPCR阵列中包含对照特征。如本文所述，正是这些对照特征(即,并不表现出生物标志物特性方面的变化的特征）的选择提供了本文所提供的方法和阵列的独特特征之一，使得产生最有用的阵列信息。
还提供了按本文所述方法制备的qPCR阵列。在合适的实施方案中，在阵列中每个限定的位置对应于生物靶标。例如，阵列合适地包含特征选择(例如,基因选择)以致阵列板的每个孔代表用于分析的靶标。
在实施方案中，将qPCR阵列设计用于各种生物标志物(包括各种核酸分子)的分析，例如用于信使RNA (mRNA)的分析、用于微小RNA(miRNA)的分析、用于长非编码RNA(lncRNA)的分析等，以及它们的组合。
如本文所述，在合适的实施方案中qPCR阵列包括一种或更多种，合适地两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种或五种或更多种对照特征(即,基因)，包括而不局限于的：ACTB、B2M、GUSB、HPRT1、RPL13A、S100A6、TFRC、YWHAZ、CFL1、RPS13、TMED10、UBB、ATP5B、GAPDH、HMBS、HSPCB、RPLPO、SDHA、UBC、PPIA、FLOT2、TMBIM6、TBT1、MRPL19和RPLP0。在合适的实施方案中，该阵列包含6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、20种或更多种、21种或更多种、22种或更多种、23种或更多种、24种或更多种或全部25种本文所述的对照特征。
在进一步的实施方案中，还可将另外的对照特征(参考基因)包括进qPCR阵列，所述对照特征包括来自不同于人的动物(包括例如小鼠、大鼠、猴、狗等)的特征。这些参考特征可通过将本文描述的各种方法应用于来自其它动物的信息而选定。
进一步的示例性的参考特征包括例如：
小鼠参考特征:
Actb　　　　NM_007393
B2m　　　　NM_009735
Gapdh 　　　NM_008084
Gusb　　　　NM_010368
Hsp90ab1　　NM_008302
大鼠参考特征:
Actb　　　　NM_031144
B2m　　　　NM_012512
Hprt1 　　　NM_012583
Ldha　　　　NM_017025
Rplp1 　　　NM_001007604
牛参考特征:
ACTB 　　　NM_173979
GAPDH 　　NM_001034034
HPRT1　　　NM_001034035
TBP 　　　　NM_001075742
YWHAZ 　　NM_174814
恒河猴参考特征：
ACTB 　　　NM_001033084
B2M　　　　NM_001047137
GAPDH 　　XM_001105471
LOC709186　XM_001097691
RPL13A 　　XM_001115079
miRNA参考特征:
SNORD61　　MS00033705
SNORD68　　MS00033712
SNORD72　　MS00033719
SNORD95　　MS00033726
SNORD96A 　MS00033733
RNU6-2　　　MS00033740
在仍进一步的实施方案中，本文所述方法提供对一种或多种生物标志物赋予单一概率分数的方法。合适地，这些方法包括收集样本集。合适地，这些样本集是核酸溶液，但还可以是细胞或组织样本、血样、唾液样本、尿样或其它生物流体样本，并可另外包括各种蛋白质或其它生物材料。
合适地，核酸分子提取自样本集的各个样本。用于实施这种提取的方法在本领域是熟知的。
各个核酸分子随后用如本文所述的qPCR阵列询问。本文所使用的“询问”是指将样本施加到阵列的一个或多个位置（即，孔)。该方法合适地包括评估一种或多种独立的特征的辨别力。亦即，对阵列的一种或多种特征(例如，基因)的能力进行评估以确定它们区分生物标志物的特征(即，疾病对比非疾病状态)的程度如何。
该方法进一步包括通过用一种或多种数学模型分析两种或更多种独立特征的组合的辨别力生成组合特征。本文描述了用于生成该组合特征的方法（包括应用的数学模型），其包括例如随机森林(RF)建模、支撑向量机(SVM)建模和最近缩小形心(NSC)建模。在本领域中已知的另外的模型也能应用于本文描述的方法，包括例如各种遗传算法、决策树和朴素贝叶斯建模。
该方法随后进一步地包含对组合特征赋予单一概率分数。亦即，将单一值赋予该组合特征，其可用来确定生物标志物的水平是否表明所测量/需要的结果。生物标志物的“截止”值——低于或高于其的话生物标记物的存在是决定的的概率分数——合适地为可调整的，即根据需要升高或降低。
在示例性的实施方案中，所述询问包含对在单一阵列中的2-40个独立的特征（即基因）进行评估。如本文所述，阵列合适地为96孔板，因此所需特征数量合适地取决于该板的物理特性（排或列的孔的数量）及将所述特征（例如，基因等）储存于板上的能力。在合适的实施方案中，所述询问包含对2-8个独立的特征、8-16个独立的特征、16-24个独立的特征、24-32个独立的特征、32-40个独立的特征、或20个独立的特征及在这些范围内的值和范围进行评估。
本文提供的方法将微阵列数据用于特征选择并随后使用选定的靶标以用新的临床样本测定数据产生工业标准的qPCR阵列，以便建立分类模型。这种多步骤方法克服了传统生物标志物鉴定的缺点。
本文提供的方法将一种微阵列平台用于特征选择分析以避免与平台标准化和合并数据集相关的问题。
本文提供的方法合适地将7个靶标基因（比上述的小组少很多）连同对照一起用以产生dCt数据以输入用于分类的机器学习模型（诊断）。
本文提供基于模型的分类系统。在训练和测试后，将模型固定并只需要向模型中输入新的样本数据。在不需要任何以前的训练数据的情况下计算分类。
本文提供使用组织特异性输入对照的模型，与传统上使用的一般微阵列或qPCR对照不同，所述输入对照可提供样本间更精确的比较。
本文提供这样的模型，其即使用训练集也用2-组K-平均数聚类分析实现88%精确度和82%特异性，用无监管分级聚类分析实现92%精确度和82%特异性且合适地100％正确地分类该训练集。
本文的方法提供基于机器学习分类模型的实用分子诊断qPCR测定特征小组以鉴定恶性甲状腺结节。 
为更好地将恶性甲状腺结节区分于良性甲状腺结节，本文提供的方法使用更实用的qPCR平台。将来自微阵列测定的甲状腺癌和对照样本数据集用于针对甲状腺恶性肿瘤鉴定的最终特征选择。使用几种特征选择方法（比如随机森林和支撑向量机）以对靶标排序。利用选择的基因，将384-孔qPCR阵列（包括10个所选的特异性甲状腺结节持家基因和3个qPCR测定对照）用于研究49个良性和恶性甲状腺样本的集用于特征小组开发。基于分析进一步地鉴定出5个持家基因。使用随机森林分类模型开发精细调和的分类特征(7个靶基因和5个对照)。除训练集以外，本文提供的方法也在不同于训练集的测试集中执行良好。该方法提供91.7%精确度、87.5%灵敏性和100%特异性、100% PPV和80% NPV。在混合样本试验中，该方法鉴定仅包含与75%良性样本混合的25%真的恶性样本肿瘤样本。这些结果表明所公开生物标志物PCR阵列系统是用于生物标志物开发的有效工具。
本文提供的方法聚焦于可将恶性甲状腺结节与良性或正常组织区分开的定量分子分类物小组。提供这样的方法，其使用生物标志物测定友好平台-实时PCR以针对测量用于限定分类的靶标核苷酸表达水平获得更好的精确度、特异性和一致性。提供以下方法，其将组织特异性标准化对照小组用于靶基因表达的更好标准化并针对临床实践中生物标志物的使用提供坚实基础。本文提供甲状腺结节恶性肿瘤生物标志物，其通过交叉验证和交叉平台再分类方式产生。生物标志物来自具有对照开发-qPCR阵列样本测定和实时PCR数据分析和分类特征重鉴定的高通量筛选特征选择-qPCR阵列开发。结果表明在鉴定恶性样本上有强大的性能。
提供生物化学基因表达分类系统，以尤其当标准病理学检验不明确或不确定时，分类甲状腺结节。
甲状腺组织微阵列基因表达数据可同以下四种基于机器学习的基因排序和选择方法一起使用：随机森林（RF）、最近缩小形心(NSC)、贝叶斯因子回归建模(BFRM)和支撑向量机(SVM)。将预先鉴定的靶标列表也用于最终靶基因列表中。
本文提供的小组中的靶标也可用其他靶标代替，合适的替换物包括：
o   小组中的NPC2可被它的高度相关的备选基因所替换，例如：RXRG、CITED1、TGFA、GALE、KLK10、LRP4、CDH3、NAB2、HMGA2、DPP4、SDC4、TIPARP、S100A11、PSD3、LGALS3、RAB27A、ADORA1、TACSTD2、KLK11、DUSP4、TIMP1、PIAS3、CTSH、MRC2、SCEL、ABCC3、CHI3L1、TSC22D1、PROS1、QPCT、ODZ1、IGFBP6、RRAS、CAPN3、KRT19、SFN、ENDOD1、PLP2、PDLIM4、DOCK9、MAPK4、CDH16、KIT、MATN2、TLE1、ANK2、KIAA1467、COL9A3、TCFL5、TEAD4、SNTA1。
o     小组中的S100A11可被它的高度相关的备选基因所替换，例如：TIMP1、CHI3L1、SFN、LGALS3、MRC2、MVP、NPC2、DPP4、CYP1B1、TACSTD2、PROS1、FN1、RXRG、PDLIM4、DUSP6、CTSH、ABCC3、MTMR11、SDC4、IGFBP6、PLAUR、PIAS3、TIPARP、RRAS、ANXA1、QPCT、MAPK4、KIT、TLE1、KIAA1467、SNTA1、SORBS2、GPR125。
o     小组中的SDC4可被它的高度相关的备选基因所替换，例如：TACSTD2、MET、PDLIM4、SERPINA1、TIPARP、TGFA、TSC22D1、GALE、LGALS3、NPC2、CYP1B1、FN1、IL1RAP、KLK10、ZNF217、DUSP5、CTSH、ANXA1、CHI3L1、DPP4、MSN、RXRG、PROS1、SFN、BID、DUSP6、ENDOD1、DTX4、TIMP1、NRIP1、CD55、NAB2、PIAS3、S100A11、PRSS23、SCEL、LAMB3、CDH3、IGFBP6、CDC42EP1、HMGA2、ADORA1、SLC4A4、HGD、SORBS2、ELMO1、TFF3、TPO、KIT、ITPR1、MAPK4、FMOD、MT1F、FHL1、SLC39A14、TLE1、VEGFB、CDH16、SNTA1、ANK2。
o     小组中的CD53可被它的高度相关的备选基因所替换，例如：TMSB4X、SELL、CD86、CCR7、PLAUR、MYO7A、NFKBIE、S100B和ARHGEF5。
o     小组中的MET可被它的高度相关的备选基因所替换，例如：SDC4、TACSTD2、DTX4、IL1RAP、LGALS3、TGFA、GALE、KLK10、PARP4、HMGA2、PDLIM4、 CHI3L1、SERPINA1、PROS1、TIPARP、FN1、ENDOD1、SLC39A14、HGD、ELMO1、TPO、SORBS2。
o     小组中的CHI3L1可被它的高度相关的备选基因所替换，例如：LGALS3、TIMP1、DPP4、PDLIM4、SFN、CYP1B1、ENDOD1、KRT19、CTSH、TACSTD2、PROS1、ANXA1、PLAUR、S100A11、FN1、DUSP5、PLAU、SERPINA1、TIPARP、KLK10、S100B、MVP、IGFBP6、RAB27A、CDH3、SDC4、IL1RAP、MRC2、ABCC3、BID、NPC2、ADORA1、SLPI、LAMB3、RXRG、DUSP6、GALE、CITED1、TGFA、SCEL、RRAS、MET、ZFP36L1、CD55、ZNF217、RUNX1、SELL、PLP2、MYO7A、KIT、ELMO1、KIAA1467、TPO、SORBS2、HGD、CDH16、ADIPOR2、MATN2、SLC4A4、FASTK、MT1F、MAPK4、PRPS1、SNTA1、HMGCR、ITPR1、PGF、HK1、MPPED2、 DIO1、TRAPPC6A、PRUNE、NDUFA2、FHL1、ARHGEF5、FLRT1、TFF3、CSRP2、SLC39A14、TLE1、TMEM50B、POLD2、FARS2、BMP7、BDH1、FCGBP、TCFL5、PEG3、GPR125、PGD、HSPB11、COL9A3、FKBP4、BCAT2。
表1. 甲状腺结节恶性肿瘤分类基因小组
本文提供的小组在完全不同于训练集的测试集上执行良好。它可达到91.7%精确度、87.5%灵敏性、100%特异性、100% PPV和80% NPV。它也在混合样本测试中证明它的能力，其可鉴定仅含25%真的恶性样本和与75%良性样本混合的肿瘤样本。这些结果表明发明的甲状腺恶性肿瘤生物标志物是用于临床诊断的有效工具。
如图2所示，在实施方案中，基于研究兴趣、研究对象、种类和品质[最少样本数量、良好限定的采样条件、注解的可用性和实验数据的一致性(信号强度、异常值等)]选择高通量基因表达数据集。
将所选数据集标准化并随后通过多种数学模型分析，这些数学模型包括：随机森林（RF)、支撑向量机(SVM）和最近缩小形心(NSC)。.将来自所有统计学分析和文献挖掘的名列前茅的靶标合并以产生最终的候选基因列表。
将所有候选基因的实时定量PCR测定针对技术灵敏性、特异性和动态范围进行设计和测试。将组织特异性的标准化对照测定和性能对照加入以完成最终的疾病特异性qPCR阵列。
图3展示了使用疾病特异性PCR阵列系统进行的从样本到生物标志物特征小组的工作流程。研究者的努力：1）样本收集和处理，随后2）执行qPCR以获得CT值，3）展示数据分析入口：
A. 使用基于研究者的样本表达稳定性选定的最终标准化的基因小组，标准化基因表达以获得ΔCT。
B. 针对其分类能力使用RF排序工具对靶基因排序。为更好的检测稳定性去除不合格的靶标（例如在两组中都检测不到或检测弱的靶标）。
C. 使用RF模型和交叉验证产生生物标志物特征小组和分类算法。
用于甲状腺分类的qPCR阵列. 
在实施方案中，提供了实时定量聚合酶链反应（qPCR）阵列。合适地，该阵列包含一种或多种甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物。合适的这些分类生物标志物选自基因群组，所述基因包括但不局限于：NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1。该阵列进一步包括一种或多种参考基因，其包含但不局限于：TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ。该阵列进一步包含用于产生单一恶性肿瘤分数和可调整的截止阈值的相伴分类算法。
本文描述了用于产生这些算法的示例性的算法和方法，其包括多种数学模型。
本文所用的“恶性肿瘤分数”是指赋值于使用qPCR阵列分析的数据集的单一概率值或分数。
本文所用的“截止阈值”是指生物标志物的取决于应用的低或高的限度——低于或高于其的话生物标记物的存在是决定的的概率分数——合适地为可调整的，即根据需要升高或降低。例如，在恶性肿瘤分类的情况下，该截止阈值合适地将恶性样本与良性样本区分开。
在实施方案中，该qPCR阵列包括2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种或所有的甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物。在实施方案中，该qPCR阵列包括2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个或所有参考基因。该qPCR阵列合适地包括甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物和参考（或对照）基因的任意组合。
该qPCR阵列合适地包括甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1及参考基因TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ。
如本文所述，可将描述用于qPCR阵列的基因用高度相关的备选的基因替换。例如，将阵列中的NPC2用选自以下的基因：RXRG、CITED1、TGFA、GALE、KLK10、LRP4、CDH3、NAB2、HMGA2、DPP4、SDC4、TIPARP、S100A11、PSD3、LGALS3、RAB27A、ADORA1、TACSTD2、KLK11、DUSP4、TIMP1、PIAS3、CTSH、MRC2、SCEL、ABCC3、CHI3L1、TSC22D1、PROS1、QPCT、ODZ1、IGFBP6、RRAS、CAPN3、KRT19、SFN、ENDOD1、PLP2、PDLIM4、DOCK9、MAPK4、CDH16、KIT、MATN2、TLE1、ANK2、KIAA1467、COL9A3、TCFL5、TEAD4和SNTA1。
在实施方案中，将阵列中的S100A11用选自以下的基因替换：TIMP1、CHI3L1、SFN、LGALS3、MRC2、MVP、NPC2、DPP4、CYP1B1、TACSTD2、PROS1、FN1、RXRG、PDLIM4、DUSP6、CTSH、ABCC3、MTMR11、SDC4、IGFBP6、PLAUR、PIAS3、TIPARP、RRAS、ANXA1、QPCT、MAPK4、KIT、TLE1、KIAA1467、SNTA1、SORBS2和GPR125。
在实施方案中，将阵列中的SDC4用选自以下的基因替换：TACSTD2、MET、PDLIM4、SERPINA1、TIPARP、TGFA、TSC22D1、GALE、LGALS3、NPC2、CYP1B1、FN1、IL1RAP、KLK10、ZNF217、DUSP5、CTSH、ANXA1、CHI3L1、DPP4、MSN、RXRG、PROS1、SFN、BID、DUSP6、ENDOD1、DTX4、TIMP1、NRIP1、CD55、NAB2、PIAS3、S100A11、PRSS23、SCEL、LAMB3、CDH3、IGFBP6、CDC42EP1、HMGA2、ADORA1、SLC4A4、HGD、SORBS2、ELMO1、TFF3、TPO、KIT、ITPR1、MAPK4、FMOD、MT1F、FHL1、SLC39A14、TLE1、VEGFB、CDH16、SNTA1和ANK2。
在实施方案中，将阵列中的CD53用选自以下的基因替换：TMSB4X、SELL、CD86、CCR7、PLAUR、MYO7A、NFKBIE、S100B和ARHGEF5。
在实施方案中，将阵列中的MET用选自以下的基因替换：SDC4、TACSTD2、DTX4、IL1RAP、LGALS3、TGFA、GALE、KLK10、PARP4、HMGA2、PDLIM4、CHI3L1、SERPINA1、PROS1、TIPARP、FN1、ENDOD1、SLC39A14、HGD、ELMO1、TPO、SORBS2。
在实施方案中，将阵列中的CH3L1用选自以下的基因替换：LGALS3、TIMP1、DPP4、PDLIM4、SFN、CYP1B1、ENDOD1、KRT19、CTSH、TACSTD2、PROS1、ANXA1、PLAUR、S100A11、FN1、DUSP5、PLAU、SERPINA1、TIPARP、KLK10、S100B、MVP、IGFBP6、RAB27A、CDH3、SDC4、IL1RAP、MRC2、ABCC3、BID、NPC2、ADORA1、SLPI、LAMB3、RXRG、DUSP6、GALE、CITED1、TGFA、SCEL、RRAS、MET、ZFP36L1、CD55、ZNF217、RUNX1、SELL、PLP2、MYO7A、KIT、ELMO1、KIAA1467、TPO、SORBS2、HGD、CDH16、ADIPOR2、MATN2、SLC4A4、FASTK、MT1F、MAPK4、PRPS1、SNTA1、HMGCR、ITPR1、PGF、HK1、MPPED2、DIO1、TRAPPC6A、PRUNE、NDUFA2、FHL1、ARHGEF5、FLRT1、TFF3、CSRP2、SLC39A14、TLE1、TMEM50B、POLD2、FARS2、BMP7、BDH1、FCGBP、TCFL5、PEG3、GPR125、PGD、HSPB11、COL9A3、FKBP4、BCAT2。
如本文所述，该相伴算法基于随机森林(RF)建模，或可基于支撑向量机(SVM)建模，或可基于贝叶斯回归模型(BRM)建模或这些模型的任何组合。
对于相关领域普通技术人员来说容易显而易见的是，在不偏离任何实施方案的范围的情况下可实施对本文所述方法和应用的其他合适的修改和适应。应该理解的是虽然本文已经对某些实施方案进行了说明和描述，但是权利要求并不局限于所描述和所展示的部分的特定形式或安排。在本说明书中，已公开说明性的实施方案，尽管使用了特定术语，但是它们也仅以一般的和描述性的意义使用而不是出于限制的目的使用。鉴于以上所述的教导，实施方案的修改和改变是可能的。因此，应该理解的是，实施方案可按与具体描述不同的方式实施。
实施例
实施例1:qPCR方法
将总RNA按照制造商的方案(Qiagen ,QuantiTECT反转录试剂盒，巴伦西亚，CA)反转录为互补的DNA（cDNA）。将SYBR Green生物标志物定制PCR阵列用于基因表达检测。所有引物通过集成DNA技术(IDT，Coralville，Iowa)合成。随后使用参考通用基因组DNA和cDNA的连续稀释液进行质量控制程序以确保特异性和有效性。扩增特异性通过PCR产物的琼脂糖凝胶电泳确认。印制定制的384-孔引物板。对于每个样本，等同于0.8ng总RNA输入的cDNA与SYBR Green master混合物(QuantiTECT SYBR Green PCR试剂盒, Qiagen )在10微升反应体积中混合。qPCR扩增在ABI 7900HT实时PCR系统中完成。扩增进行了40个循环（在94℃下15秒、在55℃下30秒及在72℃下30秒）。检测每次运行结束时生成的解离曲线以证明特异性的PCR扩增及没有引物二聚体的形成。
实施例2.甲状腺恶性肿瘤qPCR阵列
搜索已公开的文献并将来自51个良性的和恶性的甲状腺样本的已公布的高通量筛选(微阵列)数据选定用于研究。将异常值样本鉴定出来并在图4A中展示。因为异常值样本损害了如图4B所示的样本聚类，将其从数据集中去除。如图4C所示通过去除异常值改进样本聚类。将包括RF、NSC和SVM的多种数学模型用于生物标志物候选者选择，并添加基于文献所选的基因以获得更好的潜在的生物标志物覆盖度。图4D展示了跨越三种代表性的数学模型的前100个基因的重叠。随后对所述名列前茅的靶标实施qPCR测定，并针对它们的灵敏性、特异性和有效性优化qPCR测定。将满足QC标准的靶标测定用于甲状腺恶性肿瘤qPCR阵列。基于用代表性的良性的和恶性的甲状腺样本进行的基因表达稳定性分析，选定10个标准化参考基因候选者。最终，将371个靶标测定、10个标准化对照和3个性能对照用于384-孔甲状腺恶性肿瘤PCR阵列。
将四十九个病理学评定的甲状腺结节样本（新鲜冷冻的，23个恶性的和26个良性的，康奈尔大学韦尔(Weill)医学院）用该甲状腺恶性肿瘤PCR阵列测试。标准化基因是基于基因表达稳定性和组间的变化选定的。将5个选定的标准化基因的几何平均数用于标准化靶基因的表达。将标准化CT值使用RF分类模型进行分析。该优化算法鉴定出一组12个基因作为甲状腺恶性肿瘤的基因表达特征，展示于下表格1中。
表格1：甲状腺恶性肿瘤基因表达特征
NPC2 S100A11 SDC4 CD53 MET GCSH
CHI3L1 TBP RPL13A RPS13 HSP90AB1 YWHAZ
将12个病理学评定的甲状腺结节样本（来自新鲜冷冻组织的RNA；8个恶性和4个良性）使用已鉴定的甲状腺恶性肿瘤基因表达特征和相伴分类算法进行评估。在这个限定大小的独立数据集中，恶性甲状腺结节样本成功地从良性结节样本中以92％的精确度和100％的特异性区分出来，如表格2所示。
表格2：预测结果
  精确度(%) 灵敏性 (%) 特异性 (%) PPV (%) NPV (%)
预测结果 91.7 87.5 100.0 100.0 80.0
将三对良性和恶性的甲状腺样本按不同比例混合，并使用该甲状腺恶性肿瘤基因表达特征和相伴分类算法进行分析。分析结果为各个样本提供了恶性肿瘤分数，并且以100%的精确度将含有少至25%恶性样本的混合样本于纯良性样本区分开，如图5所示。恶性的-分数>0.5(M)、良性的-分数＜0.5(B)。
实施例3:另外的小组开发
将20个参考基因板用涵盖正常和不同阶段的甲状腺肿瘤的6个甲状腺样本（OriGene，Rockville，MD）进行测试(数据未显示)。前10位的基因是基于其表达稳定性和良性组和癌症组之间的变化选定的。当收集了所有甲状腺样本的最终qPCR结果时，进一步分析了参考基因的表达。将具有良性组和恶性组之间的最小差异且最高表达稳定性的参考基因挑出。将5个基因选为参考基因：TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ。
随后将重复的基因选择和排序过程用随机森林(RF)进行重复。将靶基因依据其表达水平和相对表达范围差异预过滤。将不表达或表达极低的基因以及具有有限差异(<0.5 ΔCt，容易因qPCR变化而反向）的基因从完整的列表中去除。将189个基因的最终列表用于依据其在随机森林模型系统中的分类能力对它们的重要性进行排序。在接受者工作特征曲线（AUC）之下的面积用自展法评估。
最终将甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物用一组实时PCR测定靶标NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1进行了鉴定。使用包含Δ-Δ Ct方法和一组由TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ组成的参考基因确定了标准化表达水平。
该经训练的RF分类模型的性能还用12种甲状腺组织样本和20种人工混合样本进行测试。
表格3：
对于相关领域普通技术人员来说容易显而易见的是，在不偏离任何实施方案的范围的情况下可实施对本文所述方法和应用的其他合适的修改和适应。
应该理解的是虽然本文已经对某些实施方案进行了说明和描述，但是权利要求并不局限于所描述和所展示的部分的特定形式或安排。在本说明书中，已公开说明性的实施方案，尽管使用了特定术语，但是它们也仅以一般的和描述性的意义使用而不是出于限制的目的使用。鉴于以上所述的教导，实施方案的修改和改变是可能的。因此，应该理解的是，实施方案可按与具体描述不同的方式实施。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同各个出版物、专利或专利申请具体地和单独地指出通过引用并入一样。

Claims (13)

1. 一种实时定量聚合酶链反应(qPCR)阵列，其包括：
a.一种或多种选自以下的甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物：NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1；
b.一个或多个选自以下的参考基因：TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ；和
c.用于产生单一恶性肿瘤分数和可调整的截止阈值的相伴分类算法。
2. 权利要求1的qPCR阵列，包括3种或更多种甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物和3个或更多个参考基因。
3. 权利要求1的qPCR阵列，包括5种或更多种甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物和4个或更多个参考基因。
4. 权利要求1的qPCR阵列，包括甲状腺结节恶性肿瘤分类生物标志物NPC2、S100A11、SDC4、CD53、MET、GCSH和CHI3L1及参考基因TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ。
5. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中所述阵列中的NPC2用选自以下的基因替换：RXRG、CITED1、TGFA、GALE、KLK10、LRP4、CDH3、NAB2、HMGA2、DPP4、SDC4、TIPARP、S100A11、PSD3、LGALS3、RAB27A、ADORA1、TACSTD2、KLK11、DUSP4、TIMP1、PIAS3、CTSH、MRC2、SCEL、ABCC3、CHI3L1、TSC22D1、PROS1、QPCT、ODZ1、IGFBP6、RRAS、CAPN3、KRT19、SFN、ENDOD1、PLP2、PDLIM4、DOCK9、MAPK4、CDH16、KIT、MATN2、TLE1、ANK2、KIAA1467、COL9A3、TCFL5、TEAD4和SNTA1。
6. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中所述阵列中的S100A11用选自以下的基因替换：TIMP1、CHI3L1、SFN、LGALS3、MRC2、MVP、NPC2、DPP4、CYP1B1、TACSTD2、PROS1、FN1、RXRG、PDLIM4、DUSP6、CTSH、ABCC3、MTMR11、SDC4、IGFBP6、PLAUR、PIAS3、TIPARP、RRAS、ANXA1、QPCT、MAPK4、KIT、TLE1、KIAA1467、SNTA1、SORBS2和GPR125。
7. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中所述阵列中的SDC4用选自以下的基因替换：TACSTD2、MET、PDLIM4、SERPINA1、TIPARP、TGFA、TSC22D1、GALE、LGALS3、NPC2、CYP1B1、FN1、IL1RAP、KLK10、ZNF217、DUSP5、CTSH、ANXA1、CHI3L1、DPP4、MSN、RXRG、PROS1、SFN、BID、DUSP6、ENDOD1、DTX4、TIMP1、NRIP1、CD55、NAB2、PIAS3、S100A11、PRSS23、SCEL、LAMB3、CDH3、IGFBP6、CDC42EP1、HMGA2、ADORA1、SLC4A4、HGD、SORBS2、ELMO1、TFF3、TPO、KIT、ITPR1、MAPK4、FMOD、MT1F、FHL1、SLC39A14、TLE1、VEGFB、CDH16、SNTA1和ANK2。
8. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中所述阵列中的CD53用选自以下的基因替换：TMSB4X、SELL、CD86、CCR7、PLAUR、MYO7A、NFKBIE、S100B和ARHGEF5。
9. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中所述阵列中的MET用选自以下的基因替换：SDC4、TACSTD2、DTX4、IL1RAP、LGALS3、TGFA、GALE、KLK10、PARP4、HMGA2、PDLIM4、CHI3L1、SERPINA1、PROS1、TIPARP、FN1、ENDOD1、SLC39A14、HGD、ELMO1、TPO、SORBS2。
10. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中所述阵列中的CHI3L1用选自以下的基因替换：LGALS3、TIMP1、DPP4、PDLIM4、SFN、CYP1B1、ENDOD1、KRT19、CTSH、TACSTD2、PROS1、ANXA1、PLAUR、S100A11、FN1、DUSP5、PLAU、SERPINA1、TIPARP、KLK10、S100B、MVP、IGFBP6、RAB27A、CDH3、SDC4、IL1RAP、MRC2、ABCC3、BID、NPC2、ADORA1、SLPI、LAMB3、RXRG、DUSP6、GALE、CITED1、TGFA、SCEL、RRAS、MET、ZFP36L1、CD55、ZNF217、RUNX1、SELL、PLP2、MYO7A、KIT、ELMO1、KIAA1467、TPO、SORBS2、HGD、CDH16、ADIPOR2、MATN2、SLC4A4、FASTK、MT1F、MAPK4、PRPS1、SNTA1、HMGCR、ITPR1、PGF、HK1、MPPED2、DIO1、TRAPPC6A、PRUNE、NDUFA2、FHL1、ARHGEF5、FLRT1、TFF3, CSRP2、SLC39A14、TLE1、TMEM50B、POLD2、FARS2、BMP7、BDH1、FCGBP、TCFL5、PEG3、GPR125、PGD、HSPB11、COL9A3、FKBP4、BCAT2。
11. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中的相伴算法基于随机森林(RF)建模。
12. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列，其中的相伴算法基于支撑向量机(SVM)建模。
13. 权利要求1-4的任意之一的qPCR阵列,其中的相伴算法基于贝叶斯回归模型(BRM)建模。
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