KR102321571B1

KR102321571B1 - Plekhs1 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102321571B1
Application number: KR1020190142180A
Authority: KR
Inventors: 정찬권; 정승현; 정연준
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-11-03
Also published as: WO2021091130A1; KR20210055874A; US20220356533A1

Abstract

본 발명은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이 여부를 확인함으로써 전이성(원격 전이) 분화갑상선암으로 진단하는데에 필요한 정보를 제공할 수 있으며, PLEKHS1 프로모터 유전자 이외에 BRAF, TERT 프로모터, 3 종류의 RAS 및 TP53 유전자의 돌연변이 여부를 함께 확인함으로써 전이성 분화갑상선암 환자의 예후를 방사성요오드 치료 반응 및 생존 측면에서 3 개의 예후 그룹으로 분류 및 예측할 수 있다.

Description

PLEKHS1 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Biomarker composition for diagnosing or predicting prognosis of thyroid cancer comprising agent detecting mutation of PLEKHS1 gene}

본 발명은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다.

분화갑상선암(differentiated thyroid cancer)은 갑상선 소포세포(follicular cell)에서 기원하며 모든 갑상선암의 95% 이상을 차지한다. 분화갑상선암은 조직학적으로 유두암종(papillary thyroid carcinoma, PTC), 소포암종(follicular thyroid carcinoma, FTC) 및 저분화암종(poorly differentiated thyroid carcinoma, PDTC)으로 나뉜다. 분화갑상선암종의 대부분은 다른 종류의 암에 비해 예후가 매우 좋으나, 전체 환자의 1-9% 는 암 발견 당시부터 원격 전이(distant metastasis)를 동반하고 있으며, 7-23% 는 초기 치료 후 경과 관찰 중에 원격 전이가 발생한다. 원격 전이는 갑상선암으로 인해 사망하는 주된 원인이 되고 있는데, 원격 전이가 있는 환자는 5년과 10년에 갑상선암으로 인해 사망할 확률이 각각 65%와 75%에 이른다. 알려진 원격 전이의 요인으로는 측경부 림프절 전이, 특정한 조직학적 유형(키큰세포 변종, 원주세포 변종 및 hobnail 변종의 유두암종, 혈관침습형 소포암종, 광범위 침범 소포암종 또는 저분화암종), TERT 프로모터 돌연변이 또는 다중 발생 돌연변이 등이다. 그러나 이러한 병리학적 및 유전학적 인자만으로는 정확히 원격 전이의 위험을 예측할 수 없고, 개별 환자의 예후를 판정할 수는 없다.

분화갑상선암에서 암을 유발하는 유전자 돌연변이 중 가장 흔한 것은 BRAF 및 RAS 유전자의 체세포 돌연변이이다. 분화갑상선암이 더 안 좋은 유형의 암으로 진행하는 것은 TP53, PIK3CA, AKT1, TERT, 히스톤 메틸전달표소(histone methyltransferase) 유전자, 부정합 수선(mismatch repair) 유전자 또는 크로마틴 재배치 복합체(chromatin remodeling complex) 와 같은 암 유발 유전자 돌연변이가 축적되는 것과 관련성이 높다. 유전자의 프로모터 영역에서 발생하는 돌연변이는 cis-acting DNA-sequences에 대한 전사인자의 결합을 변형하거나 방해함으로써 유전자의 전사 능력을 조절할 수 있다. 예를 들면, TERT 프로모터 돌연변이는 TERT 유전자의 프로모터 활성과 전사 능력을 증가시킴으로써 텔로머라아제(telomerase)를 활성화시키는데, 분화갑상선암의 10-20% 에서 발생하며 원격 전이, 재발 및 사망률 증가와 관련성이 높다. 최근에는 전장게놈 시퀀싱을 통해 유전자 전사를 조절하는 돌연변이를 새롭게 찾아 내고 있으며, 그 예로 PLEKHS1, WDR74 및 SDHD 유전자의 전사 조절 영역에서 돌연변이가 암 발생에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 이런 유전자 돌연변이는 분화갑상선암 환자에서 치료반응성 평가와 같은 임상적 결과를 예측하는 마커로도 활용될 가능성이 있을 것이다. 그러나 이에 대한 연구는 아직까지 시행된 바가 없어 갑상선암의 분자병리학적 발전에도 불구하고 유전자 검사 결과는 분화갑상선암 환자의 임상 결과를 부분적으로만 예측할 수 있다. 따라서 갑상선암 환자의 예후 예측을 위한 유전자 마커의 개발에 대한 미충족 수요는 여전히 남아있다.

대한민국 특허출원 제10-2015-0010141호는 원발성 갑상선암 전이의 진단방법 및 이를 이용한 진단키트에 대한 것으로서, Slit-Robo 경로의 활성 저하가 갑상선암의 나쁜 예후와 관련있음을 근거로 Slit2를 새로운 바이오마커 및 새로운 분자 치료 표적으로 제공하고 있다.

그러나 PLEKHS1 유전자와 갑상선암, 특히 분화갑상선암의 진단 내지 예후와의 관련성에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 갑상선암을 진단 또는 이의 예후를 예측할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 예의 노력한 결과, PLEKHS1 유전자에 돌연변이가 발생하는 경우 원격 전이(distant metastasis) 분화갑상선암으로 진단할 수 있으며, 그 환자의 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도를 제공할 수 있다.

본 발명은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 내지 이를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 TERT 프로모터 유전자, TP53 유전자, STK11 유전자, BRAF 유전자 및 RAS 유전자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 예후는 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 대한 내성 또는 사망할 가능성인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 진단은 원격 전이(distant metastasis) 분화갑상선암으로의 진단인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 갑상선암은 유두암종(papillary thyroid carcinoma, PTC), 소포암종(follicular thyroid carcinoma, FTC) 및 저분화암종(poorly differentiated thyroid carcinoma, PDTC)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 22번 염색체의 장완(q) 소실의 유전자복제수변이(copy number variation)를 확인할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 22번 염색체의 장완(q) 소실은 22번 염색체의 q11.1 ~ q13.33 영역이 소실되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은

a) 1번 염색체의 장완(q) 획득;

b) 9번 염색체의 단완(p) 소실;

c) 9번 염색체의 장완(q) 소실; 및

d) 11번 염색체의 장완(q) 소실;

로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자복제수변이(copy number variation)를 확인할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기

a) 1번 염색체의 장완(q) 획득은 1번 염색체의 q12 ~ q44 영역을 획득;

b) 9번 염색체의 단완(p) 소실은 9번 염색체의 p24.3 ~ p11.2 영역이 소실;

c) 9번 염색체의 장완(q) 소실은 9번 염색체의 q12 ~ q34.3 영역이 소실; 및

d) 11번 염색체의 장완(q) 소실은 11번 염색체의 q11 ~ q25 영역이 소실;

인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, a) 개체에서 분리된 시료로부터 유전자를 수득하는 단계; 및

b) 상기 단계 a)의 유전자에서 PLEKHS1 프로모터 유전자, TERT 프로모터 유전자 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계;

c) 상기 단계 b)에서 돌연변이가 발견되지 않은 경우, BRAF 유전자 및 RAS 유전자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계;

를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 a)의 시료는 종양, 혈액, 소변 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b) 에서 돌연변이가 확인된 경우 개체가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타내고 사망할 가능성이 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)에서 돌연변이가 발생한 경우 개체가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타낼 것으로 판단하고,

돌연변이가 발견되지 않은 경우 개체가 좋은 예후를 나타낼 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계에서,

상기 단계 a)에서 분리한 유전자 중

a) 1번 염색체의 장완(q) 획득;

b) 9번 염색체의 장완(q) 소실;

c) 11번 염색체의 장완(q) 소실; 및

d) 22번 염색체의 장완(q) 소실;

로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자복제수변이(copy number variation)를 추가적으로 확인하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자복제수변이가 확인되는 경우 분화갑상선암 환자가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타내고 사망할 가능성이 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다.

본 발명의 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이 여부를 확인함으로써 전이성(원격 전이) 분화갑상선암으로 진단하는데에 필요한 정보를 제공할 수 있으며, PLEKHS1 프로모터 유전자 이외에 BRAF, TERT 프로모터, 3 종류의 RAS 및 TP53 유전자의 돌연변이 여부를 함께 확인함으로써 전이성 분화갑상선암 환자의 예후를 방사성요오드 치료 반응 및 생존 측면에서 3 개의 예후 그룹으로 분류 및 예측할 수 있다.

도 1은 분화갑상선암에서 반복적으로 발견되는 체세포 돌연변이와 유전자복제수변이를 나타낸다.
도 2는 원격 전이를 동반한 40명의 분화갑상선암환자에서 돌연변이 유전자별 및 암 종류별로 표시한 유전자복제수변이의 양상을 나타낸다.
도 3은 PLEKHS1, TERT, BRAF, RAS 및 STK11에 대한 돌연변이의 변이 대립 유전자 빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 암의 종류에 따라 계층화된 원격 전이를 가진 40 개의 분리된 갑상선 암에서의 복제수 변이를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 원격 전이를 동반한 분화갑상선암에서 반복적인 22q11.1-q13.33 유전자복제수 소실을 나타낸다.
도 6은 원격 전이가 있었던 47명의 분화갑상선암 환자에서 뼈 전이(A, Bone metastasis), TERT, PLEKHS1 또는 TP53 돌연변이 (B), 11q 염색체 소실(C)에 따른 암특이 생존율 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 원격 전이를 동반한 분화갑상선암 환자에서 BRAF, 3종류의 RAS, TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터, TP53 유전자에 대한 돌연변이 양상에 따라 방사성요오드 치료 반응과 암특이생존율에 대한 위험 계층화를 나타낸다. 이러한 유전자의 돌연변이가 전혀 없는 환자는 예후가 가장 좋은 군이다. TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터, TP53 유전자 중 어느 하나라도 돌연변이가 있으면 가장 예후가 나쁜 군이며, 상기 세가지 유전자에는 돌연변이가 없지만 BRAF 혹은 RAS 유전자에 돌연변이가 있으면 중간적인 예후를 보이는 군이다.
도 8a 및 도 8b는 Memorial Sloan Kettering Cancer Center에서 시행된 갑상선암 연구에서 84명의 저분화암종 환자와 33명의 역형성암종 환자의 유전자 돌연변이를 유형을 재분석한 후 이를 cBioPortal for Cancer Genomics(http://cbioportal.org)을 활용하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 ‘진단(diagnosis)’은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 바람직하게는 원격 전이 갑상선암 내지 이의 발병 위험성을 판단하는 것이다.

본 발명의 ‘예후(prognosis)’는 병세의 의학적 결과에 대한 전망 내지 예비적 평가를 말하는데, 예를 들면, 좋지 않은 또는 좋은 결과(예를 들면, 장기간 생존의 가능성)를 예측하는 것을 의미한다. 음성(나쁜) 예후 내지 좋지 않은 결과는 재발, 질병의 진행(예를 들면, 암 성장 내지 전이, 또는 약물 내지 치료에 대한 내성), 또는 사망할 가능성의 예측을 포함하고, 양성(좋은) 예후 또는 좋은 결과는 질병 완치(예를 들면, 질병이 없는 상태), 완화(예를 들면, 암의 퇴치) 또는 안정화의 예측을 포함한다. 예후의 예측(또는 예후의 진단)은 특히 갑상선암 환자의 방사성 요오드 치료 여부를 비롯하여 향후 갑상선암 치료에 대한 단서를 제시할 수 있다. 예후 예측은 갑상선암 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함한다.

원격 전이를 일으키는 분화갑상선암(전이성 분화갑상선암) 환자는 생존율이 낮은 것으로 알려져 있다. 이 환자의 절반 이상이 방사성 요오드(radioactive iodine, RAI) 치료에 내성을 보이며, 이는 좋지 않은 예후에 기여한다. 치료 과정 초기에 원격 전이 위험이 높은 환자를 식별하는 것이 중요하다. 전이성 분화갑상선암은 종종 TERT 프로모터 돌연변이를 갖지만, 전이성 분화갑상선암 환자의 절반 이상이 이 돌연변이를 갖지 않기 때문에 이들의 존재만으로는 원격 전이의 위험을 예측하기에는 충분하지 않다.

분화갑상선암의 일부는 전이 부위에서 방사성요오드치료에 내성을 보일 수 있으며, 저분화암종 또는 역형성암으로 진행될 수도 있다. 이러한 종양은 종종 TERT 프로모터와 WNT 신호 전달 경로, PI3K/AKT 경로, SWI/SNF 염색질 리모델링 컴플렉스, 히스톤 메틸전이효소, DNA 부정합 수선 및 종양 억제제를 포함한 다양한 유전자의 돌연변이를 가지고 있다. PI3K/AKT 경로에 영향을 미치는 돌연변이 중에서, PIK3CA 및 AKT1 돌연변이는 분화갑상선암의 종양 진행 및 원격 전이와 관련이 있다.

본 발명에서 분화갑상선암 전이의 잠재적 예후 인자로서 반복적으로 발생하는 PLEKHS1 프로모터 돌연변이(13%)를 최초로 제시하고 있다. PLEKHS1 프로모터 돌연변이는 TERT 프로모터 돌연변이가 없는 전이성 분화갑상선암의 14%(3/21)에서 발견되었다(도 1).

PLEKHS1(Pleckstrin homology domain containing S1) 유전자는 세포 내 신호 전달 역할을 할 수 있는 플레크스트린 상동성 도메인(pleckstrin homology domain)을 포함한다. PLEKHS1 프로모터 돌연변이의 인간 암에서의 임상적 의미 내지 종양 형성에 대한 역할에 대하여는 알려진 바 없다.

전이성 분화갑상선암을 관리하는 데 있어 가장 큰 과제는 적극적인 치료와 능동적 감시 사이의 균형을 찾는 것이다. 방사성요오드치료-내성 전이성 종양의 경우, 전이성 질환, 증상, 동반 질환 및 진행률의 정도에 따라 환자에게 추가 치료법을 맞춤화 해야 한다. 분화갑상선암에 대한 현재 미국갑상선학회 관리 지침에서, 강력한 증거의 부족으로 인해 방사성요오드치료-내성 또는 전이성 분화갑상선암 환자의 예후 목적으로 분자 검사가 권장되지 않는다.

본 발명자들은 전이성 분화갑상선암 환자를 세 가지 예후 그룹으로 분류 할 수 있는 유전자 분별자를 개발했다(좋은, 중간, 나쁜). 좋은 예후 그룹 환자는 매우 느리게 진행되는 질환을 보인 반면, 나쁜 예후 그룹 환자의 절반 이상은 10 년 이내에 진행성 질환으로 사망했다. 따라서 이 유전자 분별자는 임상 의사가 환자에게 전신 치료를 할지 말지를 결정할 수 있도록 하는 가이드가 될 수 있다. 또한 예후가 나쁜 그룹 환자는 초기에 전신 치료 요법을 시행 받음으로써 치료의 혜택을 받을 수 있다.

이에 본 발명자들은, 157개의 암 관련 주요 유전자의 코딩 영역과 코딩되지 않는 영역을 분석할 수 있는 표적심층염기서열분석(Targeted deep sequencing)을 시행함으로써 분화갑상선암에서 반복적으로 발생하는 체세포 돌연변이와 유전자복제수변이(copy number variation)을 확인하고자 하였다. 또한 원격 전이를 유발한 분화갑상선암의 치료반응을 포함한 임상적 결과를 예측할 수 있는 유전자 분별자를 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명은 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.

상기 PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이는 10번 염색체에 돌연변이가 발생하는 것을 의미한다. 구체적으로, 10번 염색체의 115,511,590 bp 또는 115,511,593 bp 위치의 시스테인(cysteine, C)이 트레오닌(threonine, T)으로 돌연변이(C590T 또는 C593T)가 발생하는 경우 갑상선암으로 진단 또는 그 예후를 예측하는데 활용할 수 있다.

상기 TERT 프로모터 유전자의 돌연변이는 5번 염색체에 돌연변이가 발생하는 것을 의미한다. 구체적으로, 5번 염색체의 TERT 유전자의 프로모터 핫스팟 부위로서 1,295,228 bp 또는 1,295,250 bp 위치의 시스테인(cysteine, C)이 트레오닌(threonine, T)으로 돌연변이(C228T 또는 C250T)가 발생하는 경우 갑상선암으로 진단 또는 그 예후를 예측하는데 활용할 수 있다.

상기 TP53 유전자의 돌연변이는 단완(p)의 237번 위치의 메티오닌(methionine, M)이 이소류신(isoleucine, I)으로 돌연변이(p.M237I)되거나, 단완의 220번 위치의 티로신(tyroine, Y)이 시스테인(cysteine, C)으로 돌연변이(p.Y220C)되거나, 단완의 글라이신(glycine, G)의 프레임 시프트(frame shift, fs) 돌연변이(p.G117fs)가 발생하는 경우 갑상선암으로 진단 또는 그 예후를 예측하는데 활용할 수 있다. 그러나 TP53 유전자는 종양억제유전자로서 393개의 아미노산으로 구성된 p53 단백질을 생성하며, 대부분의 TP53 돌연변이가 아미노산 102번 위치에서 292번 위치에 이르는 매우 넓은 부위를 코딩하는 유전자 영역에서 발생하는 만큼, 본 발명에서 밝힌 돌연변이의 특정 위치에만 국한되지는 않는다.

상기 STK11 유전자의 돌연변이는 단완(p)의 354번 위치의 페닐알라닌(phenylalanine, F)이 류신(leucine, L)으로 돌연변이(p.F354L)가 발생하는 경우 갑상선암으로 진단 또는 그 예후를 예측하는데 활용할 수 있다.

상기 BRAF 유전자의 돌연변이는 단완(p)의 600번 위치의 발린(valine, V)이 글루타믹산(glutamic acid, E)로 돌연변이(p.V600E)가 발생하는 경우 갑상선암으로 진단 또는 그 예후를 예측하는데 활용할 수 있다.

상기 RAS 유전자의 돌연변이는 핫스팟 코돈 61에서 발생할 수 있으며, 구체적으로 NRAS, HRAS 또는 KRAS 유전자의 코돈 61번 위치의 글루타민(glutamine, Q)이 아르기닌(arginine, R)으로 돌연변이(p.Q61R), 류신(leucine, L)으로 돌연변이(p.Q61L), 라이신(lysine, K)으로 돌연변이(p.Q61K)가 발생하는 경우, 또는 코돈 12번, 13번 위치의 글루타민(glutamine, Q)이 아르기닌(arginine, R)으로 돌연변이(p.Q12R, p.Q13R), 알라닌(alanine, A)으로 돌연변이(p.Q12A, p.Q13A), 시스테인(cysteine, C)으로 돌연변이(p.Q12C, p.Q13C), 아스파트산(aspartic acid, D)으로 돌연변이(p.Q12D, p.Q13D), 세린(serine, S)으로 돌연변이(p.Q12S, p.Q13S), 발린(valine, V)으로 돌연변이(p.Q12V, p.Q13V)가 발생하는 경우 갑상선암으로 진단 또는 그 예후를 예측하는데 활용할 수 있다.

상기 돌연변이를 검출할 수 있는 제제는 돌연변이된 유전자 부위를 증폭하여 검출하는데 필요한 제제를 의미하며, 해당 기술분야의 통상의 기술자 수준에서 유전자 증폭에 사용될 수 있는 제제들을 모두 포함하는 개념이다. 바람직하게는 중합효소연쇄반응(PCR)에 필요한 제제를 의미할 수 있으며, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 또는 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification) 일 수 있다.

상기 방사성 요오드 치료에 대한 내성은 개체에 방사성 요오드 치료시 정상군에 비해 낮은 효과를 나타내는 것을 의미한다. 구체적으로, 방사성 요오드 치료시 1) 적어도 한 곳 이상의 전이 병소에서 방사성 요오드를 섭취하지 않는 경우; 2) 병소가 방사성 요오드를 섭취함에 불구하고 그 병소의 크기가 지속적으로 증가하는 경우; 3) 원격 전이 병소가 방사성 요오드 치료 후 1년 이상 크기가 증가하는 인 경우; 또는 4) 방사성요오드 치료의 누적 용량이 600 mCi 이상된 후에도 지속되는 병변이 있는 경우; 중 어느 하나에 해당하는 경우 방사성 요오드 치료에 내성을 나타내는 것으로 볼 수 있다(실시예 <1-2>).

상기 사망할 가능성은 갑상선암의 원격전이로 진단받은 후 10년 이내(추적 관찰 기간)에 갑상선암으로 인해 사망할 가능성을 의미한다(실시예 <1-3>).

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 갑상선암은 분화갑상선암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 유두암종(papillary thyroid carcinoma, PTC), 소포암종(follicular thyroid carcinoma, FTC) 및 저분화암종(poorly differentiated thyroid carcinoma, PDTC)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 22번 염색체의 장완(q) 소실의 유전자복제수변이(copy number variation)를 확인할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 22번 염색체의 장완(q) 소실은 22번 염색체의 q11.1 ~ q13.33 영역이 소실되는 것일 수 있다.

상기 염색체는 인간의 염색체일 수 있다.

상기 유전자복제수변이는 기준 유전체(reference genome)과 비교하여 복제수의 변화를 보이는 DNA 조각으로서, 1kb 이상의 특정 염기서열이 결실(0n 또는 1n)되거나 획득(3n 또는 그 이상)되는 것인 유전자의 구조적 변이 중 하나이다.

상기 유전자복제수변이를 확인할 수 있는 제제는 해당 기술분야의 통상의 기술자 수준에서 유전자복제수변이 확인에 필요한 제제를 모두 포함할 수 있다.

염색체의 단완 또는 장완이 소실되는 경우 염색체의 길이가 짧아질 수 있다. 즉, 염색체의 단완 또는 장완이 소실되는 돌연변이가 발생하는 경우 야생형에 비하여 그 길이가 짧아지므로 염색체의 길이 확인을 통해 돌연변이 여부를 확인할 수 있다.

염색체의 단완 또는 장완이 획득되는 경우 염색체의 길이가 길어질 수 있다. 즉, 염색체의 단완 또는 장완이 획득되는 돌연변이가 발생하는 경우 야생형에 비하여 그 길이가 길어지므로 염색체의 길이 확인을 통해 돌연변이 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은

a) 1번 염색체의 장완(q) 획득;

b) 9번 염색체의 단완(p) 소실;

c) 9번 염색체의 장완(q) 소실; 및

d) 11번 염색체의 장완(q) 소실;

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기

인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 바이오마커 조성물을 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공할 수 있다.

상기 키트는 돌연변이가 발생할 수 있는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 내지 프로브 세트가 포함될 수 있다.

를 포함하는 갑상선암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유류를 모두 포함하는 개념이나, 바람직하게는 인간을 의미할 수 있으며, 보다 바람직하게는 갑상선암 환자를 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 a)의 시료는 종양, 혈액, 소변 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 종양일 수 있다.

상기 유전자는 DNA일 수 있다.

상기 PLEKHS1 프로모터 유전자, TERT 프로모터 유전자 또는 TP53 유전자의 돌연변이, 방사성 요오드 치료에 대한 내성 또는 사망할 가능성은 상기 바이오마커 조성물에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

돌연변이가 발견되지 않은 경우 개체가 좋은 예후를 나타낼 것으로 판단하는 것일 수 있다.

상기 방사성 요오드 치료에 대한 내성은 상기 바이오마커 조성물에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

상기 좋은 예후는 갑상선암 환자가 방사성 요오드 치료에 대한 내성을 띄지 않으면서 생존할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계에서,

상기 단계 a)에서 분리한 유전자 중

a) 1번 염색체의 장완(q) 획득;

b) 9번 염색체의 장완(q) 소실;

c) 11번 염색체의 장완(q) 소실; 및

d) 22번 염색체의 장완(q) 소실;

상기 염색체의 획득 내지 소실 또는 유전자복제수변이 는 상기 바이오마커에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자복제수변이가 확인되는 경우 분화갑상선암 환자가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타내고 사망할 가능성이 있는 것일 수 있다.

상기 유전자복제수변이, 방사성 요오드 치료에 대한 내성 또는 사망할 가능성은 상기 바이오마커에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

연구대상 환자의 특성

<1-1> 연구대상 환자 및 조직 샘플

2006년에서 2017년 사이에 서울성모병원에서 치료받은 47명의 분화갑상선암 환자를 대상으로 하여 37명의 유두암종, 8명의 소포암종, 2명의 저분화암종 환자를 포함하였다. 본 연구는 가톨릭대학교 서울성모병원 의학연구윤리심의위원회의 승인을 받아 진행되었다. 모든 병리 슬라이드는 내분비병리 전문 병리의사가 세계보건기구의 2017년 최신 진단 기준에 따라 분류하였다. 연구에 포함된 47명의 분화갑상선암 환자중에서 17명은 진단 당시에 이미 원격 전이가 발견되었으며 나머지 30명은 갑상선 수술 후 추적관찰기간 동안에 원격 전이를 일으켰다. 원격 전이는 30명은 수술검체에서 확인되었고, 나머지 17명은 조직검사가 불가하여 전신 스캔, 컴퓨터단층촬영, 자기공명영상 이미지 또는 양전자방출 단층촬영과 같은 영상 이미지를 통해 진단되었다. 원격 전이 특이 유전자의 임상적 유용성을 검증하기 위해 진단 당시에 원격 전이가 없었던 75명의 유두암종 환자를 추가로 포함하였다. 암병기는 미국암연합회(American Joint Committee on Cancer) 8판을 기준으로 설정하였다. 암병기와 치료방침은 내과, 외과, 영상의학과, 핵의학과, 병리과로 구성된 다학제 협진팀에서 결정하였다.

<1-2> 방사성요오드 치료에 대한 반응 평가

원격 전이를 동반한 47명의 환자 모두 방사성요오드 치료를 받았다. 방사성 요오드 치료에 대한 반응성은 전신 요오드 131 스캔, 혈청 다이로글로불린(thyroglobulin) 수치, 혹은 컴퓨터단층촬영, 자기공명영상 이미지 또는 양전자방출 단층촬영과 같은 영상 이미지를 종합적으로 분석하여 평가하였다. 방사성요오드 치료 결과는 반응성과 미반응성(저항성 또는 내성)으로 구분하였다. 방사성요오드 치료에 저항성을 보인 경우는 다음 중 어느 하나로 정의되었다: 1) 적어도 한 곳 이상의 전이 병소에서 방사성요오드를 섭취하지 않는 경우, 2) 병소가 방사성요오드를 섭취함에 불구하고 그 병소의 크기가 지속적으로 증가하는 경우, 3) 방사성요오드 치료 후 1년 이상 크기가 증가하는 원격 전이 병소 및 4) 방사성요오드 치료의 누적 용량이 600 mCi 이상된 후에도 지속되는 병변이 있는 경우.

<1-3> 원격 전이를 동반한 분화갑상선암환자의 일반적인 특성

상기 실시예 <1-1> 및 <1-2> 에 따라 분석한 원격 전이를 동반한 분화갑상선암환자의 일반적인 특성은 하기 [표 1]에 나타내었다.

PTC(papillary thyroid carcinoma)는 유두암종; FTC(follicular thyroid carcinoma)은 소포암종; PDTC(poorly differentiated thyroid carcinoma)은 저분화암종; 및 RAI(radioactive iodine)은 방사성 요오드; 를 의미한다.

특징	*BRAF* 돌연 변이 (n=24)	*p-값*	*RAS* 돌연 변이 (n=10)	*p-값*	*TERT* 프로모터 돌연변이 (n=26)	*p-값*	*PLEKHS1* 프로모터 돌연변이 (n=6)	*p-값*	*TP53* 돌연 변이 (n=3)	*p-값*
원격 전이 발생 나이 (중앙값)
원격 전이 발생 나이 (중앙값)	66	0.012	59	1.000	65	0.001	67	0.2784	72	0.1277
나이 그룹		0.013		1.000		0.001		1.000		1.000
< 45세 (n=11)	2(18%)		2(18%)		1(9%)		1(9%)		0	0.440
≥ 45세 (n=36)	22(61%)		8(22%)		25(69%)		5(14%)		3(8%)
성별		0.831		0.704		0.148		0.648		0.235
여성 (n=32)	16(50%)		6(19%)		20(63%)		5(16%)		1(3%)
남성 (n=15)	8(53%)		4(27%)		6(40%)		1(7%)		2(13%)
진단		<0.001		<0.001		0.142		0.675		0.110
PTC (n=37)	24(65%)		2(5%)		23(62%)		6(16%)		1(3%)
FTC (n=8)	0		7(88%)		3(37.5%)		0		2(25%)
PDTC (n=2)	0		1(50%)		0		0		0
조직학적 유형		0.292		0.286		0.251		0.379		0.567
비공격적(n=27)	12(44%)		4(15%)		13(48%)		2(7%)		1(4%)
공격적 (n =20)	12(60%)		6(30%)		13(65%)		4(20%)		2(10%)
원격 전이
폐 (n=44)	22(50%)	1.000	10(23%)	1.000	25(57%)	0.579	5(11%)	0.343	3(7%)	1.000
뼈 (n=18)	8(44%)	0.474	8(44%)	0.004	11(61%)	0.562	2(11%)	1.000	2(11%)	0.549
기타 (n=7)	4(57%)	1.000	2(29%)		2(29%)	0.217	2(29%)	0.214	0	1.000
RAI		0.308		0.724		0.147		0.022		0.234
효과적 (n=23)	10(44%)		4(17%)		10(44%)		0		0
내성 (n=24)	14(58%)		6(25%)		16(67%)		6(25%)		3(13%)
생존 상태		0.416		0.630		0.436		0.214		0.391
생존 (n=40)	19(48%)		8(20%)		21(53%)		4(10%)		2(5%)
사망 (n=7)	5(71%)		2(29%)		5(71%)		2(29%)		1(14%)

원격 전이를 동반한 분화갑상선암 환자 47명 중 37명은 유두암종을 가지고 있었으며, 구체적인 조직학적 유형에 따라 15명은 전형적인 유두암종, 10명은 키큰세포변종, 4명은 키큰세포를 일부에서만 보인 유형, 2명은 침습형 소포변이, 2명은 원주세포변종, 2명은 미만성경화변종, 1명은 침습적인 피막형성소포변종, 1명은 hobnail 변종을 보였다. 17명은 소포암종을 나머지 2명은 저분화암종을 가지고 있었다.

원격 전이가 가장 많이 발생한 장기는 폐였으며, 그 다음으로 뼈였다. 15명(32%)는 폐와 뼈 전이를 동시에 가지고 있었다. 20명은 공격적인 조직학적 유형(키큰세포변종의 유두암종 10명, 원주세포변종 2명, hobnai변종 1명, 광범위 혈관침범 피막형성 소포암종 5명, 저분화암종 2명)을 보였다. 누적 방사성요오드 치료 용량의 중앙값은 400 mCi(범위: 100 ~ 900 mCi)였다. 47명의 환자 중 24명(51%)는 방사성요오드 치료에 내성을 보였다. 추적관찰 기간의 중앙값 4.8(범위 1.6 ~ 11.9년) 이후, 7명은 암이 진행되어 사망하였고 나머지 40명은 관찰기간 내에 생존하였거나 추적 소실되었다.

환자의 유전자 돌연변이 프로파일 분석

<2-1> DNA 분리

10㎛ 두께의 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 활용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색 슬라이드를 활용하여 종양조직 구획을 설정한 후 미염색 조직 절편에서 종양 조직의 위치를 확인하였다. 현미경을 보면서 수술용 칼을 이용하여 종양 조직만 정교하게 절제하였다. 추출된 DNA의 양과 질은 ND-1000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 측정하였으며 DNA의 농도는 Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)장비에서 Qubit™ dsDNA HS assay kit를 이용하여 측정하였다.

<2-2> 표적심층염기서열분석(Targeted deep sequencing)

표적심층염기서열분석(Targeted deep sequencing)은 OncoChase cancer panel(ConnectaGen, Seoul, Korea)를 활용하여 분화갑상선암 47개의 조직을 대상으로 시행하였다. OncoChase cancer panel 은 157개의 암 유전자를 포함하고 있다(표 2). 구체적으로, Illumina HiSeq2000 platform을 이용하여 101 페어드 앤드 시퀀스 리드(101 paired-end sequence reads)를 생성하였다. 시퀀스 리드는 사람 표준 유전자(UCSC hg19)에 일치 시켰으며, 그 결과는 Qualimap을 이용하여 평가하였다.

157 개의 유전자
돌연변이 유전자	돌연변이 및 유전자복제수변이	유전자복제수변이
NRAS, DDR2, IDH1, ROS1, SMO, GNAQ, RET, HRAS, MAP2K1, IDH2, GNA11, MPL, DNMT3A, XPO1, NFE2L2, SF3B1, BHL, MYD88, RHOA, CSF1R, NPM1, EZH2, ABL1, PLEKHS1, WDR74, SDHD, PTPN11, POLE, FLT3, B2M, SPOP, SRC, GNAS, U2AF1, MAPK1, MED12, MAP4K3, MSH2, ZNF2, SHB, HNF1A, SLC7A8, HSF2BP, CHEK2, FOXL2, MAX, PPP2R1A, STAT3, PAX5	MTOR, JAK1, ALK, ERBB4, RAF1, CTNNB1, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FGFR4, ESR1, EGFR, MET, BRAF, FGFR1, MYC, JAK2, FGFR2, CCND1, KRAS, ERBB3, CDK4, ATK1, ERBB2, AMP2K2, JAK3, AR, ARID1A, MDM4, MLH1, KDR, FBXW7, TERT, APC, RAC1, CDKN2A, NOTCH1, PTEN, BRCA2, RB1, TSHR, CDH1, TP53, BRCA1, SMAD4, STK11, AURKA, ARAF, AKT3, BAP1, SOX2, TET2, PIK3R1, PDGFRB, RHEB, TSC1, HABP2, WT1, BIRC3, ATM, IGF1R, TSC2, NF1, EZH1, NDUFA13, ATK2, ASXL1, RUNX1, SMARCB1, NF2, APOBEC3B, EIF1AX, KDM6A, STAG2, KEAP1, GATA3, RAD51	MYCN, CDK6, MCL1, CD274, PDCD1LG2, MDM2, HS6ST3, RPPH1, NKX2-1, CCNE1, MYCL, ACVRL1, APEX1, ATP11B, BCL2L1, BCL9, BIRC2, CD44, CCND2, CDNK2A1, DCUN1D1, GAS6, IL6, MYO18A, NKX2-8, PNP, PPARG, RPS6KB1, TIAF1, ZNF217

<2-3> 체세포 변형 및 암유발 유전자 돌연변이 동정

단일염기서열변이(Single Nucleotide Variant, SNV)는 MuTect을 이용하여 분석하였고, 삽입-결손(indel)은 SomaticIndel Detector을 이용하여 분석하였다. ANNOVAR package를 이용하여 엑손 염기서열에 위치한 체세포 돌연변이를 선택하였고 기능성 변화를 관찰하였다. 신뢰성 있는 변이 콜링을 위해 다음의 변이는 제거하였다: 1) 종양에서 20회 이내의 리드 깊이(read depth), 2) 1000 Genomes Project 혹은 Exome Aggregation Consortium에서 참고할 수 있는 다형성의 빈도가 아시안에서 0.1% 이상인 경우, 3) 자체적으로 보유한 정상 한국인의 유전자 데이터베이스에서 대립유전자형빈도(minor allele frequency, MAF)가 0.1% 이상인 경우. 이와 같은 절차에 따라 변이 유전자를 제거한 후 남은 변이는 모두 체세포 돌연변이 후보로 간주 한 후 COSMIC 데이터베이스와 비교하여 30회 이상 중복되는 변이를 선정하였다

<2-4> 전이성 갑상선암 게놈의 표적심층염기서열분석 결과

원격 전이를 동반한 분화갑상선암환자 47명의 유전자돌연변이 프로파일은 157 가지의 암 관련 유전자의 표적심층염기서열법으로 분석하였다. 평균 염기서열 깊이는 게놈전체에 걸쳐 365.2X (범위: 104.0X ~ 1,064.2X)였다(표 3).

샘플_ID	시퀀싱 리드	매핑 리드 (%)	깊이 범위(평균)
MTHY01	1,234,379	1,220,039 (98.8%)	263.5
MTHY02	969,740	949,141 (97.9%)	172.2
MTHY03	1,136,436	1,110,295 (97.7%)	226.0
MTHY04	1,136,298	1,133,736 (99.8%)	320.3
MTHY05	5,345,568	5,324,386 (99.6%)	276.2
MTHY06	6,834,346	6,659,238 (97.4%)	284.6
MTHY07	4,567,764	4,544,756 (99.5%)	166.6
MTHY08	7,066,657	6,968,076 (98.6%)	506.7
MTHY09	6,593,316	6,575,547 (99.7%)	532.7
MTHY10	7,176,855	7,147,576 (99.6%)	473.6
MTHY11	7,003,918	6,936,988 (99.0%)	425.4
MTHY12	6,363,318	6,302,508 (99.0%)	327.7
MTHY13	5,562,761	5,528,727 (99.4%)	272.5
MTHY14	6,693,272	6,669,570 (99.7%)	483.5
MTHY15	4,639,528	4,609,061 (99.3%)	231.8
MTHY16	5,955,958	5,938,401 (99.7%)	430.0
MTHY17	7,203,994	7,175,082 (99.6%)	505.7
MTHY18	5,828,565	5,714,961 (98.1%)	297.5
MTHY19	8,536,959	8,505,742 (99.6%)	574.8
MTHY20	5,051,959	5,032,310 (99.6%)	331.2
MTHY21	7,706,484	7,686,496 (99.7%)	702.1
MTHY22	5,559,845	5,441,850 (97.9%)	284.2
MTHY23	5,812,076	5,771,019 (99.3%)	231.5
MTHY24	12,248,554	12,205,955 (99.7%)	874.1
MTHY25	8,227,847	8,177,699 (99.4%)	578.7
MTHY26	6,511,594	6,427,145 (98.7%)	194.8
MTHY27	7,687,089	7,600,913 (98.9%)	331.9
MTHY28	5,802,792	5,765,695 (99.4%)	295.8
MTHY29	7,559,034	7,460,946 (98.7%)	200.5
MTHY30	6,852,353	6,783,554 (99.0%)	125.4
MTHY31	4,704,611	4,667,408 (99.2%)	146.8
MTHY32	5,819,574	5,704,851 (98.0%)	159.0
MTHY33	5,090,963	5,070,051 (99.6%)	273.8
MTHY34	3,549,543	3,509,216 (98.9%)	104.0
MTHY35	3,966,836	3,774,090 (95.1%)	120.7
MTHY36	22,500,776	21,767,132 (96.7%)	172.2
MTHY37	18,584,333	18,577,774 (99.9%)	857.8
MTHY38	9,698,343	9,658,123 (99.6%)	427.9
MTHY39	16,075,669	15,717,320 (97.8%)	274.0
MTHY40	12,713,179	12,286,191 (96.6%)	220.7
MTHY41	23,440,449	23,282,804 (99.3%)	463.6
MTHY42	12,204,444	12,105,503 (99.2%)	503.4
MTHY43	13,568,319	13,386,065 (98.7%)	240.7
MTHY44	13,288,594	13,282,649 (99.9%)	636.8
MTHY45	14,362,238	14,143,106 (98.5%)	425.9
MTHY46	13,714,944	13,146,687 (95.9%)	153.2
MTHY47	13,620,199	13,589,937 (99.8%)	1064.2

[도 1]에서 나타나는 바와 같이, 총 171 개의 체세포 돌연변이(168 개의 SNV 및 3 개의 삽입-결실)가 확인되었고, 전이성 분화갑상선암(45/47, 96%)의 대부분은 적어도 하나의 표적 유전자에서 비-침묵 돌연변이를 가졌다. 돌연변이된 유전자 중 TERT 프로모터(55%), BRAF(51%), PLEKHS1 프로모터(13%), NRAS(11%) 및 STK11(11%)의 5 종 유전자의 돌연변이가 전이성 분화갑상선암의 10% 이상에서 검출되었다. TERT 프로모터 돌연변이는 가장 반복적인 사건으로 37 개의 유두암종 중 23개(62%) 및 8 개의 소포암종 중 3개(38%)에서 발견되었다.

또한, [도 2]에서 나타나는 바와 같이, TERT 프로모터 돌연변이 중에서 가장 일반적인 유형은 C228T(n=24, 51%), 그 다음으로 C250T(n=2, 4%)이다(도 2A). BRAF 돌연변이 중 p.V600E 가 가장 우세한 BRAF 돌연변이(도 2B)였으며 PTC에서만 발견되었다(n=24, PTC의 65%). PLEKHS1 프로모터 돌연변이는 6 명의(16%, 6/37) 유두암종 환자에서 검출되었고 유두암종에서만 확인되었다. 6 개의 PLEKHS1 프로모터 돌연변이는 모두 공지된 핫스팟 부위(C593T, n=4 및 G590A, n=2)에 위치하였다(도 2C). 6 명의 환자 중 3 명은 공존하는 BRAF 및 TERT 프로모터 돌연변이를 가졌고 2 명은 BRAF 돌연변이를 가졌으며, 1 명은 공존 돌연변이가 없었다. 모든 RAS 돌연변이는 핫스팟 코돈 61에서 검출되었다: 2 개의 유두암종에서 1 개의 NRAS p.Q61R 및 1 개의 HRAS p.Q61R; 7 개의 소포암종에서 3 개의 NRAS p.Q61R, 3 개의 HRAS p.Q61R 및 1 개의 KRAS p.Q61R; 하나의 저분화갑상선암종에서 하나의 NRAS p.Q61R(도 1). 5개의 STK11 돌연변이는 2 개의 유두암종, 2 개의 소포암종 및 1 개의 저분화암종에서 발견되었으며 모두 p.F354L 이었다(도 1). 상기 5 개의 유전자 외에도 TP53(n=3; p.M237I, p.Y220C, p.G117fs), PIK3CA(n=1; p.E545K), AKT1(n=1; p.E17K), EIF1AX(n=2; p.A113fs, c.338-1G>A) 또는 TSHR(n=1; p.A623V) 유전자 등의 돌연변이가 전이성 분화갑상선암에서 검출되었다.

돌연변이의 원격 전이 마커로서의 유효성 검증

디지털 PCR 장비를 이용하여 표적심층염기서열분석으로 검출된 PLEKHS1 유전자의 비-코딩 핫스팟(non-coding hotspot) 돌연변이를 검증하여 표적심층염기서열분석의 유효성을 검증하고자 하였다. 검증에 사용된 프라이머와 프로브는 하기 [표 4]와 같다.

타겟	적용 대상	프라이머(F, R) 또는 프로브(P) 서열	서열번호
PLEKHS1 G590A	디지털 PCR	F: CCAAGGCTGGGATGATCTAGAAG	1
		R: AGCATATCTGCAAAATTTTCCATTTCCA	2
		P: CTTTTTTGCAATT[G/A]AACAAT	3
PLEKHS1 C593T	디지털 PCR	F: GGCTGGGATGATCTAGAAGCTTTT	4
		R: AAGTGCCCATAACAGAAATACAGCATA	5
		P: ATTGAA[C/T]AATTGCAAAATTG	6
TERT	Sanger sequencing	F1: AGT GGA TTC GCG GGC ACA GA	7
		R1: CAG CGC TGC CTG AAA CTC	8
		F2: CAC CCG TCC TGC CCC TTC ACC TT	9
		R2: GGC TTC CCA CGT GCG CAG CAG GA	10
		F3: GTC CTG CCC CTT CAC CTT	11
		R3: CAG CGC TGC CTG AAA CTC	12
BRAF exon 15	Sanger sequencing	F: TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA	13
		R: GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A	14
NRAS codon 61	Sanger sequencing	F: CCC CTT ACC CTC CAC ACC	15
		R: GAG GTT AAT ATC CGC AAA TGA CTT	16
NRAS codon 12, 13	Sanger sequencing	F: CTTGCTGGTGTGAAATGACTG	17
		R: TCCGACAAGTGAGAGACAGG	18
HRAS codon 61	Sanger sequencing	F: GTC CTC CTG CAG GAT TCC TA	19
		R: CGG GGT TCA CCT GTA CT	20
HRAS codon 12, 13	Sanger sequencing	F: CTGAGGAGCGATGACGGAA	21
		R: AGGCTCACCTCTATAGTGGG	22
KRAS codon 61	Sanger sequencing	F1: GGTGCACTGTAATAATCCAGAC	23
		R1: TGATTTAGTATTATTTATGGC	24
		F2: TGAAGTAAAAGGTGCACTGTAATA	25
		R2: TAAACCCACCTATAATGGTGAA	26
KRAS codon 12, 13	Sanger sequencing	F: GGT GAG TTT GTA TTA AAA GGT ACT GG	27
		R: TCC TGC ACC AGT AAT ATG CA	28
STK11 exon1	Sanger sequencing	F: CCGTTGGCACCCGTGACCTA	29
		R: ACCATCAGCACCGTGACTGG	30
STK11 exon2	Sanger sequencing	F: GGGCGGATCACAAGGTCA	31
		R: AGGAGACGGGAAGAGGAGC	32
STK11 exon3	Sanger sequencing	F: TGTGCCCAGAGCAAGAGC	33
		R: GCAGAAGAATGGCGTGAACC	34
STK11 exon4&5	Sanger sequencing	F: AGGAGACGGGAAGAGGAGC	35
		R: TGAACCACCATCTGCCGTAT	36
STK11 exon6	Sanger sequencing	F: TGACTGACCACGCCTTTCTT	37
		R: TGAGGGACCTGGCAAACC	38
STK11 exon7	Sanger sequencing	F: CAGGGTCTGTCAGGGTTGTCC	39
		R: CCGTCCGCTGCTCTGTCTT	40
STK11 exon8	Sanger sequencing	F: ACTGCTTCTGGGCGTTTGC	41
		R: AGGTGGGCTGGAGGCTTT	42
STK11 exon9	Sanger sequencing	F: GGTTCTGTGCTGGCATTTCG	43
		R: GGCTCTGACGCTGGTGGAT	44
STK11 exon10a	Sanger sequencing	F: TGCCCAGGCTGACCTCTTC	45
		R: CGATGGCGTTTCTCGTGTTTT	46
STK11 exon10b	Sanger sequencing	F: GGATTTGAGCTGTGGCTGTGAG	47
		R: AACACCGTGACTGCCGACCT	48
TP53 Exon 2,3,4	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTGCCGAGCTGTCTCAGACAC	49
		R: CAGGAAACAGCTATGACCGAAATGCAGGGGGATACG	50
TP53 Exon 2,3	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGTGCTTGGGTTGTGGT	51
		R: CAG GAA ACA GCT ATG ACC CGG CAA GGG GGA CTG TA	52
TP53 Exon 4	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTGACTTCCTGAAAACAACG	53
		R: CAGGAAACAGCTATGACCCACACATTAAGTGGGTAAAC	54
TP53 Exon 5,6	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCTTTGCTGCCGTCTTC	55
		R: CAGGAAACAGCTATGACCTTGCACATCTCATGGGGTTA	56
TP53 Exon 7	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTGACCATCCTGGCTAACGG	57
		R: CAGGAAACAGCTATGACCCACAGGTTAAGAGGTCCCAAA	58
TP53 Exon 8,9	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTTTTGGGACCTCTTAACCTGT	59
		R: CAGGAAACAGCTATGACCCAGGCAAAGTCATAGAACCAT	60
TP53 Exon 10	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTCATGTTGCTTTTGTACCGTC	61
		R: CAGGAAACAGCTATGACCGGCAAGAATGTGGTTATAGGA	62
TP53 Exon 11	Sanger sequencing	F: TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGGAAGATTACGAGACT	63
		R: CAGGAAACAGCTATGACCTAAGCTGGTATGTCCTACTC	64
TP53_cDNA_1	Sanger sequencing	F: TCGGGCTGGGAGCGTGCTTT	65
		R: AGCTGCACAGGGCAGGTCTT	66
TP53_cDNA_2	Sanger sequencing	F: GGACAGCCAAGTCTGTGACT	67
		R: GGAGAGGAGCTGGTGTTGTT	68
TP53_cDNA_3	Sanger sequencing	F: CCATCCTCACCATCATCACA	69
		R: GCTGTCAGTGGGGAACAAGAA	70

디지털 PCR은 TaqMan Genotyping assay QuantStudio 3D digital PCR system(Life Technologies)을 이용하여 시행하였는데, 10 ng의 게놈 DNA를 TaqMan genotyping probe와 증폭하였다. 각 어세이마다 참고 및 돌연변이 대립유전자를 각각 VIC 와 FAM 염료로 표지하였다. Nanofluidic chip으로 표지한 후 원시 데이터는 Rare Mutation module of the QuantiStudio 3D AnalysisSuite Cloud Software를 이용하여 분석하였다. 표적심층염기서열법에 의해 확인된 PLEKHS1 프로모터 돌연변이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 디지털 PCR을 수행하였다.

그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이, PLEKHS1 프로모터 돌연변이의 대부분은(5/6) 낮은(범위: 2.6 - 6.8%) 변이 대립 유전자 빈도(variant allele frequencies, VAF)에서 발생했다. PLEKHS1 프로모터 돌연변이의 평균 VAF(중간값 4.0 %)는 전이성 분화갑상선암의 10 % 이상에서 검출된 다른 돌연변이보다 유의하게 낮았다. 디지털 PCR의 결과도 표적심층염기서열법의 결과와 유사하게 모든 돌연변이에 대해 유사한 VAF를 나타냈다(표 5).

샘플 ID	돌연변이	VAF
샘플 ID	돌연변이	표적심층염기서열분석	디지털 PCR
MTHY12	C593T	3.1%	3.7%
MTHY14	C593T	26.2%	21.9%
MTHY15	C593T	2.6%	3.9%
MTHY35	G590A	4.8%	5.9%
MTHY39	C593T	6.8%	4.1%
MTHY40	G590A	2.9%	2.0%

다음으로, 본 발명자들은 PLEKHS1 프로모터 돌연변이가 전이-특이적 사건인지 여부를 확인하기 위하여 원발성 종양에 대한 초기 수술시 원격 전이 없이 독립적인 유두암종 환자(n=75)와 PLEKHS1 프로모터 돌연변이에 대한 디지털 PCR을 수행 하였다. PLEKHS1 프로모터 돌연변이는 단 하나의 사례(1/75, 1.3%)에서만 발견되었으며, 그의 종양은 공격적인 조직학(hobnail 변종), 갑상선 확장 및 중앙 림프절 전이를 나타냈다. 초기 수술 이후 이 돌연변이 양성 사례의 4 년 병력을 검사한 결과 흉부 컴퓨터 단층 촬영에서 갑상선 절제술 3 년 후 양측 폐에서 여러 전이성 결절이 나타났으며 PLEKHS1 프로모터 돌연변이가 전이 관련 사건임을 뒷받침했다. 이 경우를 제외하고 다른 74개의 예에서 원격 전이는 관찰되지 않았다.

현재의 연구에서, PLEKHS1 프로모터 돌연변이의 대다수(5/6)는 낮은 VAF(범위: 2.6 ~ 6.8 %)를 보여서 PLEKHS1 프로모터 돌연변이의 획득이 종양 진행 동안 후일 이벤트일 수 있음을 시사한다.

전이성 갑상선암 유전자에서 복제수 변경

표적 심층 염기서열 분석 데이터를 사용하여, 40 개의 전이성 갑상선 암의 유전자복제수변이(copy number variation, CNV) 및 이형접합성 소실(loss of heterozygosity, LOH) 프로파일을 분석 하였다(도 4).

유전자 복제수 프로파일링은 표적심층염기서열분석의 데이터를 분석하여 산출하였다. NEXUS software v10(Biodiscovery, El Segundo, CA)에 있는 다중스케일 참조 모듈(multiscale reference module)과 SNPRank Segmentation statistical algorithm 을 이용하여 각 샘플의 유전자복제수변이를 분석하였다. 세그멘트는 log2 비율이 0.18 보다 클 때 획득(gain)으로, -0.018보다 작을 때를 소실(loss)로 구분하였다. 확인된 모든 유전자복제수변이는 수동으로 직접 확인하였다.

높은 배경 노이즈 수준으로 인해 7 건이 제외되었다. 확인된 103 개의 유전자복제수변이(표 6) 중 35 개의 유전자복제수변이가 반복적으로 나타났다(> 2 건)(표 7). 가장 높은 재발성(15/40, 37.5%) 유전자복제수변이는 NF2, EP300 및 CHEK2 유전자를 포함하는 35 Mb 크기의 22q11.1-q13.33 영역의 소실이었다(도 5a 및 도 5b). 32 개의 유두암종 중 12 개(38 %)와 7 개의 소포암종 중 3 개(43 %)가 이 소실을 가졌다. 9q12-q34.3의 반복적인 복제수 소실 및 1q12-q44의 획득은 유두암종에서만 검출되었고, 그 빈도는 각각 32개 유두암종의 31 %(n=10) 및 25 %(n=8) 이었다. 하기 [표 6]은 원격 전이를 동반한 분화갑상선암 40개에서 분석한 유전자복제수변이 결과를 나타낸다. 하기 [표 7]은 유전자복제수변이의 반복적인 구역을 나타낸다.

샘플ID	위치	사건	염색체 위치	암 유전자 조사
MTHY03	chr1:143,667,911 -249,250,621	획득	q21.1 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY03	chr5:0-45,048,530	획득	p15.33 - p12	IL7R, LIFR
MTHY03	chr5:49,448,731 -180,915,260	획득	q11.1 - q35.3	IL6ST, PIK3R1, APC, PDGFRB, CD74, ITK, EBF1, RANBP17, TLX3, NPM1, NSD1
MTHY03	chr4:0-50,400,000	소실	p16.3 - q11	FGFR3, WHSC1, SLC34A2, PHOX2B
MTHY03	chr9:66,971,216 -141,213,431	소실	q13 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY03	chr11:100,048,708 -135,006,516	소실	q22.1 - q25	BIRC3, ATM, DDX10, POU2AF1, SDHD, PAFAH1B2, PCSK7, MLL, DDX6, CBL, ARHGEF12, FLI1
MTHY03	chr16:46,391,627 -90,354,753	소실	q11.2 - q24.3	CYLD, HERPUD1, CDH11, CBFB, CDH1, MAF, CBFA2T3, FANCA
MTHY03	chr22:27,894,333 -51,304,566	소실	q12.1 - q13.33	MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY04	chr1:143,667,911 -249,250,621	획득	q21.1 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY05	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY07	chr1:142,563,911 -249,250,621	획득	q12 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY08	chr11:54,956,509 -68,722,608	소실	q11 - q13.3	MEN1
MTHY09	chr1:142,563,911 -249,250,621	획득	q12 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY09	chr9:65,605,116 -104,748,015	소실	q12 - q31.1	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3
MTHY09	chr11:89,781,008 -135,006,516	소실	q14.3 - q25	MAML2, BIRC3, ATM, DDX10, POU2AF1, SDHD, PAFAH1B2, PCSK7, MLL, DDX6, CBL, ARHGEF12, FLI1
MTHY09	chr16:81,090,226 -90,354,753	소실	q23.2 - q24.3	CBFA2T3, FANCA
MTHY10	chr11:68,722,608 -72,185,108	소실	q13.3 - q13.4	CCND1, NUMA1
MTHY10	chr9:0-47,174,615	소실	p24.3 - p11.2	JAK2, CD274, NFIB, MLLT3, FANCG, PAX5
MTHY10	chr9:65,605,116 -105,985,615	소실	q12 - q31.1	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3
MTHY10	chr11:106,203,508 -135,006,516	소실	q22.3 - q25	ATM, DDX10, POU2AF1, SDHD, PAFAH1B2, PCSK7, MLL, DDX6, CBL, ARHGEF12, FLI1
MTHY10	chr22:17,055,433 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY11	chr22:17,054,883 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY12	chr1:142,563,911 -249,250,621	획득	q12 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY12	chr9:65,605,116 -141,213,431	소실	q12 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY12	chr13:38,643,839 -70,914,139	소실	q13.3 - q21.33	LHFP, LCP1, RB1
MTHY13	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY14	chr16:2,494,626 -35,239,726	소실	p13.3 - p11.1	CREBBP, CIITA, SOCS1, TNFRSF17, ERCC4, MYH11, PALB2, IL21R, FUS
MTHY14	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY15	chr2:29,993,569 -53,684,636	소실	p23.2 - p16.2	ALK, EML4, MSH2, MSH6, FBXO11
MTHY15	chr2:222,034,436 -243,199,373	소실	q36.1 - q37.3	PAX3, ACSL3
MTHY15	chr9:98,425,215 -113,402,815	소실	q22.32 - q31.3	XPA, NR4A3, TAL2
MTHY16	chr10:0-13,570,723	소실	p15.3 - p13	GATA3
MTHY16	chr10:21,815,323 -39,140,823	소실	p12.31 - p11.1	MLLT10, KIF5B
MTHY16	chr10:73,957,123 -108,768,623	소실	q22.1 - q25.1	BMPR1A, FAM22A, PTEN, TLX1, NFKB2, SUFU
MTHY16	chr10:118,277,323 -135,534,747	소실	q25.3 - q26.3	FGFR2, DUX4
MTHY16	chr16:69,705,326 -90,354,753	소실	q22.1 - q24.3	MAF, CBFA2T3, FANCA
MTHY16	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY18	chr5:49,437,731 -180,915,260	획득	q11.1 - q35.3	IL6ST, PIK3R1, APC, PDGFRB, CD74, ITK, EBF1, RANBP17, TLX3, NPM1, NSD1
MTHY18	chr9:0-47,174,615	소실	p24.3 - p11.2	JAK2, CD274, NFIB, MLLT3, FANCG, PAX5
MTHY18	chr9:65,605,116 -141,213,431	소실	q12 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY18	chr16:46,391,327 -90,354,753	소실	q11.2 - q24.3	CYLD, HERPUD1, CDH11, CBFB, CDH1, MAF, CBFA2T3, FANCA
MTHY18	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY20	chr12:0-34,763,247	획득	p13.33 - p11.1	KDM5A, CCND2, ZNF384, ETV6, KRAS
MTHY20	chr12:37,886,848 -133,851,895	획득	q11 - q24.33	ARID2, MLL2, ATF1, HOXC13, HOXC11, NACA, DDIT3, CDK4, LRIG3, WIF1, HMGA2, MDM2, BTG1, ALDH2, PTPN11, BCL7A
MTHY20	chr14:19,064,221 -107,349,540	획득	q11.1 - q32.33	CCNB1IP1, TRA@, NKX2-1, NIN, KTN1, GPHN, TSHR, TRIP11, GOLGA5, DICER1, TCL6, TCL1A, BCL11B, AKT1, IGH@
MTHY20	chr17:0-22,257,405	획득	p13.3 - p11.1	YWHAE, USP6, TP53, PER1, GAS7, MAP2K4
MTHY20	chr17:25,281,306 -81,195,210	획득	q11.1 - q25.3	NF1, SUZ12, TAF15, MLLT6, LASP1, CDK12, ERBB2, RARA, BRCA1, ETV4, COL1A1, HLF, MSI2, CLTC, BRIP1, CD79B, DDX5, PRKAR1A, SRSF2, CANT1, ASPSCR1
MTHY20	chr1:0-121,483,410	소실	p36.33 - p11.2	TNFRSF14, PRDM16, RPL22, CAMTA1, SDHB, PAX7, MDS2, ARID1A, LCK, SFPQ, THRAP3, MYCL1, MPL, MUTYH, TAL1, CDKN2C, EPS15, JUN, JAK1, FUBP1, BCL10, RBM15, TRIM33, NRAS, FAM46C, NOTCH2
MTHY20	chr2:0-90,536,136	소실	p25.3 - p11.1	MYCN, C2orf44, NCOA1, DNMT3A, ALK, EML4, MSH2, MSH6, FBXO11, BCL11A, REL, XPO1, IGL@
MTHY20	chr2:95,533,037 -243,199,373	소실	q11.1 - q37.3	TTL, PAX8, ERCC3, CHN1, HOXD13, HOXD11, NFE2L2, PMS1, SF3B1, CREB1, IDH1, ATIC, FEV, PAX3, ACSL3
MTHY20	chr9:0-47,174,615	소실	p24.3 - p11.2	JAK2, CD274, NFIB, MLLT3, FANCG, PAX5
MTHY20	chr11:0-51,589,008	소실	p15.5 - p11.12	HRAS, CARS, NUP98, LMO1, FANCF, WT1, LMO2, EXT2, CREB3L1, DDB2
MTHY20	chr11:54,956,509 -135,006,516	소실	q11 - q25	MEN1, CCND1, NUMA1, PICALM, MAML2, BIRC3, ATM, DDX10, POU2AF1, SDHD, PAFAH1B2, PCSK7, MLL, DDX6, CBL, ARHGEF12, FLI1
MTHY20	chr15:22,525,346 -102,531,392	소실	q11.2 - q26.3	C15orf55, BUB1B, FLJ27352, TCF12, PML, NTRK3, IDH2, CRTC3, BLM
MTHY20	chr16:46,391,327 -90,354,753	소실	q11.2 - q24.3	CYLD, HERPUD1, CDH11, CBFB, CDH1, MAF, CBFA2T3, FANCA
MTHY20	chr22:17,054,883 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY21	chr1:0-67,810,810	소실	p36.33 - p31.3	TNFRSF14, PRDM16, RPL22, CAMTA1, SDHB, PAX7, MDS2, ARID1A, LCK, SFPQ, THRAP3, MYCL1, MPL, MUTYH, TAL1, CDKN2C, EPS15, JUN, JAK1
MTHY21	chr1:92,363,710 -121,483,410	소실	p22.1 - p11.2	RBM15, TRIM33, NRAS, FAM46C, NOTCH2
MTHY21	chr2:61,797,036 -90,536,136	소실	p15 - p11.1	IGL@
MTHY21	chr2:95,533,037 -149,082,436	소실	q11.1 - q23.1	TTL, PAX8, ERCC3
MTHY21	chr11:32,451,108 -51,589,008	소실	p13 - p11.12	WT1, LMO2, EXT2, CREB3L1, DDB2
MTHY21	chr11:54,956,509 -135,006,516	소실	q11 - q25	MEN1, CCND1, NUMA1, PICALM, MAML2, BIRC3, ATM, DDX10, POU2AF1, SDHD, PAFAH1B2, PCSK7, MLL, DDX6, CBL, ARHGEF12, FLI1
MTHY21	chr12:94,657,647 -133,851,895	소실	q22 - q24.33	ALDH2, PTPN11, BCL7A
MTHY21	chr19:10,968,341 -17,941,341	소실	p13.2 - p13.11	SMARCA4, LYL1, BRD4, TPM4, JAK3
MTHY21	chr19:0-9,735,741	소실	p13.3 - p13.2	FSTL3, STK11, TCF3, GNA11, SH3GL1, MLLT1
MTHY23	chr17:25,281,306 -81,195,210	획득	q11.1 - q25.3	NF1, SUZ12, TAF15, MLLT6, LASP1, CDK12, ERBB2, RARA, BRCA1, ETV4, COL1A1, HLF, MSI2, CLTC, BRIP1, CD79B, DDX5, PRKAR1A, SRSF2, CANT1, ASPSCR1
MTHY23	chr17:0-22,257,405	소실	p13.3 - p11.1	YWHAE, USP6, TP53, PER1, GAS7, MAP2K4
MTHY24	chr8:0-38,365,411	획득	p23.3 - p11.22	PCM1, WRN, WHSC1L1, FGFR1
MTHY24	chr20:0-17,930,910	소실	p13 - p11.23
MTHY24	chr22:17,055,433 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY25	chr10:0-39,140,823	소실	p15.3 - p11.1	GATA3, MLLT10, KIF5B
MTHY25	chr11:0-51,589,008	소실	p15.5 - p11.12	HRAS, CARS, NUP98, LMO1, FANCF, WT1, LMO2, EXT2, CREB3L1, DDB2
MTHY25	chr11:54,956,509 -135,006,516	소실	q11 - q25	MEN1, CCND1, NUMA1, PICALM, MAML2, BIRC3, ATM, DDX10, POU2AF1, SDHD, PAFAH1B2, PCSK7, MLL, DDX6, CBL, ARHGEF12, FLI1
MTHY25	chr18:0-15,351,224	소실	p11.32 - p11.21
MTHY26	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY27	chr13:19,168,940 -115,169,878	소실	q11 - q34	CDX2, FLT3, BRCA2, LHFP, LCP1, RB1, ERCC5
MTHY31	chr1:142,563,911 -249,250,621	획득	q12 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY31	chr9:65,605,116 -141,213,431	소실	q12 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY35	chr1:142,563,911 -249,250,621	획득	q12 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY35	chr9:0-47,174,615	소실	p24.3 - p11.2	JAK2, CD274, NFIB, MLLT3, FANCG, PAX5
MTHY35	chr9:65,605,116 -141,213,431	소실	q12 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY35	chr13:19,168,940 -115,169,878	소실	q11 - q34	CDX2, FLT3, BRCA2, LHFP, LCP1, RB1, ERCC5
MTHY35	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY37	chr9:38,783,815 -47,174,615	소실	p13.1 - p11.2
MTHY38	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY39	chr1:142,563,911 -249,250,621	획득	q12 - q44	PDE4DIP, BCL9, ARNT, TPM3, MUC1, PRCC, NTRK1, SDHC, FCGR2B, PBX1, ABL2, TPR, MDM4, ELK4, SLC45A3, H3F3A, FH
MTHY39	chr13:19,168,940 -49,589,739	소실	q11 - q14.2	CDX2, FLT3, BRCA2, LHFP, LCP1, RB1
MTHY39	chr18:0-15,351,224	소실	p11.32 - p11.21
MTHY39	chr18:18,516,325 -78,077,248	소실	q11.1 - q23	ZNF521, SS18, MALT1, BCL2
MTHY39	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY41	chr8:29,947,911 -43,831,311	획득	p12 - p11.1	WRN, WHSC1L1, FGFR1, HOOK3
MTHY41	chr8:46,845,512 -146,364,022	획득	q11.1 - q24.3	TCEA1, PLAG1, CHCHD7, NCOA2, HEY1, COX6C, EXT1, MYC, NDRG1, RECQL4
MTHY41	chr15:89,006,346 -99,436,239	획득	q25.3 - q26.3	IDH2, CRTC3, BLM
MTHY42	chr9:0-47,174,615	소실	p24.3 - p11.2	JAK2, CD274, NFIB, MLLT3, FANCG, PAX5
MTHY42	chr9:65,605,116 -141,213,431	소실	q12 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY42	chr22:16,205,534 -51,304,566	소실	q11.1 - q13.33	CLTCL1, BCR, SMARCB1, MN1, CHEK2, EWSR1, NF2, MYH9, PDGFB, MKL1, EP300
MTHY47	chr1:0-121,483,410	소실	p36.33 - p11.2	TNFRSF14, PRDM16, RPL22, CAMTA1, SDHB, PAX7, MDS2, ARID1A, LCK, SFPQ, THRAP3, MYCL1, MPL, MUTYH, TAL1, CDKN2C, EPS15, JUN, JAK1, FUBP1, BCL10, RBM15, TRIM33, NRAS, FAM46C, NOTCH2
MTHY47	chr9:65,605,116 -141,213,431	소실	q12 - q34.3	GNAQ, SYK, OMD, FANCC, XPA, NR4A3, TAL2, SET, FNBP1, ABL1, NUP214, TSC1, RALGDS, BRD3, NOTCH1
MTHY47	chr16:2,152,532 -35,239,726	소실	p13.3 - p11.1	CREBBP, CIITA, SOCS1, TNFRSF17, ERCC4, MYH11, PALB2, IL21R, FUS
MTHY47	chr18:0-15,351,224	소실	p11.32 - p11.21
MTHY47	chr18:18,516,325 -78,077,248	소실	q11.1 - q23	ZNF521, SS18, MALT1, BCL2
MTHY47	chr19:0-24,617,641	소실	p13.3 - p11	FSTL3, STK11, TCF3, GNA11, SH3GL1, MLLT1, DNM2, SMARCA4, LYL1, BRD4, TPM4, JAK3, ELL
MTHY47	chr19:27,736,742 -59,128,983	소실	q11 - q13.43	CCNE1, CEBPA, AKT2, CD79A, CIC, BCL3, CBLC, ERCC2, KLK2, PPP2R1A, ZNF331, TFPT

염색체 영역	염색체 위치	사건	빈도	PTC (n=32)	FTC (n=7)	PDTC (n=1)	유형
chr1:0-67,810,810	p36.33 - p31.3	소실	3	2	0	1	혼합
chr1:92,363,710-121,483,410	p22.1 - p11.2	소실	3	2	0	1	혼합
chr1:142,563,911-249,250,621	q12 - q44	획득	8	8	0	0	PTC-특이적
chr2:29,993,569-53,684,636	p23.2 - p16.2	소실	2	2	0	0	PTC-특이적
chr2:61,797,036-90,536,136	p15 - p11.1	소실	2	1	0	1	혼합
chr2:95,533,037-149,082,436	q11.1 - q23.1	소실	2	1	0	1	혼합
chr2:222,034,436-243,199,373	q36.1 - q37.3	소실	2	2	0	0	PTC-특이적
chr5:49,437,731-180,915,260	q11.1 - q35.3	획득	2	2	0	0	PTC-특이적
chr8:29,947,911-38,365,411	p12 - p11.22	획득	2	1	1	0	혼합
chr9:0-47,174,615	p24.3 - p11.2	소실	6	6	0	0	PTC-특이적
chr9:65,605,116-141,213,431	q12 - q34.3	소실	10	10	0	0	PTC-특이적
chr10:0-13,570,723	p15.3 - p13	소실	2	1	1	0	혼합
chr10:21,815,323-39,140,823	p12.31 - p11.1	소실	2	1	1	0	혼합
chr11:0-32,451,108	p15.5 - p13	소실	2	1	1	0	혼합
chr11:32,451,108-51,589,008	p13 - p11.12	소실	3	1	1	1	혼합
chr11:54,956,509-68,722,608	q11 - q13.3	소실	4	1	2	1	혼합
chr11:68,722,608-89,781,008	q13.3 - q14.3	소실	3	1	1	1	혼합
chr11:89,781,008-100,048,708	q14.3 - q22.1	소실	4	2	1	1	혼합
chr11:100,048,708-106,203,508	q22.1 - q22.3	소실	5	3	1	1	혼합
chr11:106,203,508-135,006,516	q22.3 - q25	소실	6	4	1	1	혼합
chr13:19,168,940-38,643,839	q11 - q13.3	소실	3	2	1	0	혼합
chr13:38,643,839-49,589,739	q13.3 - q14.2	소실	4	3	1	0	혼합
chr13:49,589,739-70,914,139	q14.2 - q21.33	소실	3	2	1	0	혼합
chr13:70,914,139-115,169,878	q21.33 - q34	소실	2	1	1	0	혼합
chr16:2,494,626-35,239,726	p13.3 - p11.1	소실	2	2	0	0	PTC-특이적
chr16:46,391,327-69,705,326	q11.2 - q22.1	소실	3	3	0	0	PTC-특이적
chr16:69,705,326-81,090,226	q22.1 - q23.2	소실	4	4	0	0	PTC-특이적
chr16:81,090,226-90,354,753	q23.2 - q24.3	소실	5	5	0	0	PTC-특이적
chr17:25,281,306-81,195,210	q11.1 - q25.3	획득	2	2	0	0	PTC-특이적
chr18:0-15,351,224	p11.32 - p11.21	소실	3	2	1	0	혼합
chr18:18,516,325-78,077,248	q11.1 - q23	소실	2	2	0	0	PTC-특이적
chr19:0-9,735,741	p13.3 - p13.2	소실	2	1	0	1	혼합
chr19:10,968,341-17,941,341	p13.2 - p13.11	소실	2	1	0	1	혼합
chr22:16,205,534-27,894,333	q11.1 - q12.1	소실	14	11	3	0	혼합
chr22:27,894,333-51,304,566	q12.1 - q13.33	소실	15	12	3	0	혼합

재발성 돌연변이와 유전자복제수변이변화의 임상 병리학적 중요성 확인

상기 [표 1]에서 나타나는 바와 같이, BRAF 및 TERT 프로모터 돌연변이는 45 세 이상의 환자에서 더 빈번하게 발견되었다(p = 0.013). RAS 돌연변이는 뼈 전이 환자에서 더 빈번하게 발견되었다(p = 0.004). PLEKHS1 프로모터 돌연변이는 방사성 요오드 치료 내성 사례에서 더 흔했다(p = 0.022). 유전자복제수변이에 관해, BRAF V600E 돌연변이는 1q 획득(p = 0.004) 및 9q 소실(p = 0.009)(표 8)의 경우에 상당히 흔하였다. 다른 돌연변이 또는 유전자복제수변이는 임상 병리학적 특성과 유의적인 연관성을 보이지 않았다. 하기 [표 8]은 원격 전이를 동반한 분화갑상선암에서 유전자복제수변이와 임상병리학적 변수와의 관련성을 나타낸다.

특징	1q 획득	*p-값*	9p 소실	*p-값*	9q 소실	*p-값*	11q 소실	*p-값*	22q 소실	*p-값*
빈도	8(20%)		6(15%)		10(25%)		7(18%)		15(38%)
원격 전이 나이		0.173		0.318		0.653		1.000		0.219
< 45세 (n=8)	0		0		1(13%)		1(13%)		1(13%)
≥ 45세 (n=32)	8(25%)		6(19%)		9(28%)		6(19%)		14(44%)
성별		0.653		0.307		1.000		0.338		0.060
여성 (n=30)	7(23%)		6(20%)		8(27%)		4(13%)		14(47%)
남성 (n=10)	1(10%)		0		2(20%)		3(30%)		1(10%)
진단		0.563		0.318		0.165		0.128		1.000
PTC (n=32)	8(25%)	0.173	6(19%)		10(31%)		4(13%)		12(38%)
Non-PTC (n=8)	0		0		0		3(38%)		3(38%)
조직학적 유형		0.430		1.000		0.300		1.000		0.412
비공격성(n=22)	3(14%)		3(14%)		4(18%)		4(18%)		7(32%)
공격성 (n =18)	5(28%)		3(17%)		6(33%)		3(17%)		8(44%)
원격 전이
폐 (n=37)	7(19%)	0.498	5(14%)	0.394	9(24%)	1.000	5(14%)	0.074	13(35%)	0.545
뼈 (n=16)	4(25%)	0.690	1(6%)	0.373	4(25%)	1.000	4(25%)	0.407	8(50%)	0.182
RAI		0.241		1.000		0.069		1.000		0.165
효과 (n=19)	2(11%)		3(16%)		2(11%)		3(16%)		5(26%)
내성 (n=21)	6(29%)		3(14%)		8(38%)		4(19%)		10(48%)
생존 상태		0.580		0.565		0.629		0.055		0.654
생존(n=34)	6(18%)		6(18%)		8(24%)		4(12%)		12(35%)
사망(n=6)	2(33%)		0		2(33%)		3(50%)		3(50%)
*BRAF* V600E		0.004		0.664		0.009		0.689		0.527
야생(n=19)	0		2(11%)		1(5%)		4(21%)		6(32%)
돌연변이(n=21)	8(38%)		4(19%)		9(43%)		3(14%)		9(43%)
*RAS* 돌연변이		0.173		0.318		0.165		1.000		0.444
야생(n=32)	8(25%)		6(19%)		10(32%)		6(19%)		11(34%)
돌연변이(n=8)	0		0		0		1(13%)		4(50%)

TCGA의 체세포 CNA 분석에 따르면 1q 획득은 키가 큰 세포 변형 유두암종 및 BRAF V600E 돌연변이에서 자주 발견되며 보다 공격적인 유두암종 형태와 관련이 있다. 22q의 소실은 유두암종의 소포변종에서 주로 발생하였다. TCGA 연구에서, 1q 획득 및 22q 소실은 각각 전이가 없는 250 명의 유두암종 환자의 13.6% 및 11.2%에서 발견되었다. 원격 전이가 있는 경우, 유두암종의 25%(8/32)에서 1q 획득이 확인되었으며 BRAF V600E가 풍부하지만 키가 큰 세포 변이체와는 관련이 없음을 발견했다. 22q의 소실은 유두암종의 38% (12/32)와 소포암종의 43% (3/7)에서 발견되었으며 여포 성장 패턴과 관련이 없다. MSKCC의 이전 연구에서 공격적인 분화갑상선암(35 저분화암종, 18 유두암종 및 4 개의 Hurthle 세포 암종) 환자 57 명 중 26% 및 14%에서 각각 1q 및 22q 소실이 발견되었다. 18 개의 유두암종 사례에서 1q 획득과 22q 소실은 각각 5 개(28 %)와 2 개(11%)로 확인되었다. 1q 획득과 22q 소실의 유병률의 차이와 본 발명을 포함한 다양한 연구들 간의 임상적 병리학적 특징은 제한된 수의 사례와 연구 설계의 차이로 인해 발생한다. 그러나 본 연구에서 1q 획득의 높은 빈도는 MSKCC에서 수행된 치명적인 유두암종 그룹에 대한 연구 결과와 일치했다. 이러한 결과는 1q 획득이 분화갑상선암에 대한 공격성을 부여하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

방사성요오드 치료 내성과 관련된 요인

단변량 분석에서, 방사성요오드치료 내성과 유의하게 관련된 임상적 요인은 45 세 이상의 연령(p=0.009) 및 골 전이(p<0.001)였다. 분화갑상선암 환자의 방사성요오드치료 반응의 예측 능력을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 재발성 돌연변이의 조합을 독립 변수로서 추가하였다. TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터 또는 TP53에 돌연변이가 존재하면 방사성요오드치료 저항성과 유의한 관련이 있었다(p=0.004). 성별 및 공격적인 조직학적 유형은 방사성요오드치료 저항성과 크게 관련이 없었다. 다변량 로지스틱 회귀 분석에서 TERT 프로모터 또는 PLEKHS1 프로모터 또는 TP53(보정 교차비 = 9.02, 95 % 신뢰구간 = 1.61 ~ 50.53, p = 0.012)는 여전히 유의했다.

전이성 분화갑상선암 환자에서 암 특이적 생존

방사성요오드치료 내성 환자는 생존율이 유의하게 악화되었다(p = 0.009). 골 전이(p = 0.015), TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터 또는 TP53 유전자 중 적어도 하나에서의 돌연변이(p = 0.019) 및 11 q 소실 유전자복제수변이(p = 0.014) 는 특히 나쁜 암-특이적 생존과 관련되어 있었다(도 6A-C). 원격 전이 진단(p = 0.072) 및 남성 성별(p = 0.072)에서 45 세 이상의 연령은 또한 암 특이적 생존이 악화되었지만 통계적으로 유의하지는 않았다. 공격적인 조직학적 유형과 암 특이적 생존 사이에는 관계가 없었다(데이터는 표시되지 않음).

전이성 분화갑상선암의 유전자 분류 및 위험 계층화

반복적으로 돌연변이된 유전자를 사용하여, 본 발명자들은 다음 원리에 기초하여 치료 반응 및 예후를 예측하기 위한 유전자 분별자를 개발하려고 시도했다; 1) 전체의 5% 이상에서 반복적으로 발생하는 돌연변이를 선정함, 2) 기본적인 분자병리학적 분류를 위한 BRAF 및 RAS와 같이 이미 문헌에 잘 보고 되어 있어 충분한 근거가 있는 돌연변이와 나쁜 예후와 관련성이 이미 밝혀져 있는 TERT 프로모터 및 TP53 돌연변이를 포함, 3) 나쁜 예후(원격 전이, 방사성요오드치료 내성, 질병-특이적 생존)와 관련된 것으로 본 발명에서 통계학적으로 밝힌 돌연변이를 포함. 상기 원칙에 근거하여, 7 개의 유전자 (BRAF, 3 종류의 RAS, TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터 및 TP53)가 선택되었다. 7개 샘플에서 유전자복제수변이 데이터가 누락되었기 때문에 11q의 소실은 선택되지 않았다. 임상 결과와 이들 유전자의 돌연변이 프로파일 사이의 관계를 분석함으로써 원격 전이를 가진 분화갑상선암 환자를 세 가지 예후 그룹으로 분류할 수 있는 새로운 유전자 분별자를 개발할 수 있었다(도 7):

1) 나쁜 예후 그룹: 전체 전이성 분화갑상선암 환자의 64%(30/47)가 나쁜 예후 그룹으로 분류되었으며, 환자는 BRAF 및 RAS의 돌연변이 상태에 관계없이 TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터 또는 TP53에서 하나 이상의 돌연변이를 보유하였다. 이 그룹에서 방사성요오드치료 내성율은 67%(20/30)였고, 추적 기간 동안 갑상선암으로 인한 사망률은 23%(7/30) 였다.

2) 중간 예후 그룹: 전체 전이성 분화갑상선암 환자의 21%(10/47)가 중간 예후 그룹으로 분류되었으며, 환자는 BRAF 또는 RAS 유전자의 돌연변이를 보유하였으나, TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터 또는 TP53 돌연변이는 갖지 않았다. 이 그룹은 방사성요오드치료 내성율은 40%(4/10)였으며, 갑상선암으로 인한 사망은 발생하지 않았다.

3) 좋은 예후 그룹: 전체 환자 중 15%(7/47)에 해당하였으며, 환자는 7 개의 주요 유전자에 돌연변이가 없다. 이 그룹의 모든 환자들은 방사성요오드 치료에 반응하였으며, 사망도 발생하지 않았다.

돌연변이 프로파일

Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC)의 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid carcinoma) 환자(n=33) 및 저분화 갑상선암(poorly differentiated thyroid carcinoma) 환자(n=84)의 암 게놈에 대한 cBioPortal(http://cbioportal.org)을 사용하여 유전자 돌연변이 유형을 분석하였다. TERT 프로모터, TP53 및 PIK3CA 유전자 돌연변이는 각각 50%, 25% 및 7% 로 나타났다. PIK3CA 돌연변이가 있었던 8개의 암종 중 7개는 TERT 프로모터 돌연변이를 동반하였고, 2개의 암종은 TERT 프로모터와 TP53 유전자에 돌연변이를 동반하였으며, AKT1 돌연변이는 발견되지 않았다. PIK3CA 돌연변이를 갖는 8 개의 암은 동시 TERT 프로모터 돌연변이를 보였다. 다른 유전자의 돌연변이 비율은 0 ~ 7 %로 낮게 나타났으며, TERT 프로모터 또는 TP53 돌연변이와 거의 동시에 나타났다(도 8a 및 도 8b). MD Anderson Cancer Center에서 수행된 다른 연구에서, PIK3CA 돌연변이는 원격 전이 또는 지속성/재발성 국소 질환이 있는 190 가지 진행된 분화갑상선암 사례 중 6 개에서 발견되었다. PIK3CA 돌연변이를 갖는 6 개의 종양 중 하나는 TP53 돌연변이와 함께 발견되었다.

본 발명에서 47 건 중 30 건(64%)은 TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터 또는 TP53 유전자 중 적어도 하나의 돌연변이를 가졌다. PIK3CA 돌연변이는 하나의 경우에 동시 PLEKHS1 프로모터 돌연변이와 함께 발견되었다. 진행된 갑상선암과 관련된 다른 흔하지 않은 돌연변이는 대부분 세 유전자의 돌연변이와 함께 발견되었다.

따라서, 본 발명의 TERT 프로모터, PLEKHS1 프로모터, 또는 TP53 돌연변이에 기초한 유전자 분별자가 분화갑상선암 환자의 치료 결과를 예측하는데 있어 PIK3CA 및 AKT1 돌연변이를 포함한 다른 재발성 유전자 돌연변이의 임상적 유용성을 향상시킬 수 있다고 판단된다.

[통계 분석]

유전자 결과 분석은 임상병리학적 데이터를 모르는 상태로 진행하였고, 임상병리학적 인자의 유용성 분석은 유전자 결과를 모르는 상태로 진행하였다. 임상병리학적 인자와 유전자 돌연변이 유형과의 관련성은 모수 검정은 hi-squared 검증으로, 비모수 검정은 Fisher's exact 검증으로 시행하였다. 임상병리학적 인자 및 돌연변이가 방사성요오드 치료 반응과의 관련성을 파악하기 위하여 로지스틱 회귀분석을 시행하였다. 질병 특이 생존 곡선은 Kaplan-Meier 방법으로 시행하였고, log-rank test를 이용하여 곡선간의 차이를 통계학적으로 검증하였다. 질병특이생존은 원격 전이진단 당시부터 갑상선암으로 사망한 시점 혹은 최종 추적관찰 시점까지로 정의하였다. 모든 통계학적 분석은 Prism(version 6.05, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)와 SPSS(version 21.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA)통계 프로그램을 사용하여 진행하였다. P 통계값이 0.05 미만인 경우에 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarker composition for diagnosing or predicting prognosis of thyroid cancer comprising agent detecting mutation of PLEKHS1 gene <130> 1065740 <160> 70 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLEKHS1 G590A_F <400> 1 ccaaggctgg gatgatctag aag 23 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLEKHS1 G590A_R <400> 2 agcatatctg caaaattttc catttcca 28 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLEKHS1 G590A_P <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is G or A. <400> 3 cttttttgca attnaacaat 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLEKHS1 C593T_F <400> 4 ggctgggatg atctagaagc tttt 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLEKHS1 C593T_R <400> 5 aagtgcccat aacagaaata cagcata 27 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLEKHS1 C593T_P <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or T. <400> 6 attgaanaat tgcaaaattg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TERT_F1 <400> 7 agtggattcg cgggcacaga 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TERT_R1 <400> 8 cagcgctgcc tgaaactc 18 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TERT_F2 <400> 9 cacccgtcct gccccttcac ctt 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TERT_R2 <400> 10 ggcttcccac gtgcgcagca gga 23 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TERT_F3 <400> 11 gtcctgcccc ttcacctt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TERT_R3 <400> 12 cagcgctgcc tgaaactc 18 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF exon 15_F <400> 13 tcataatgct tgctctgata gga 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF exon 15_R <400> 14 ggccaaaaat ttaatcagtg ga 22 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NRAS codon 61_F <400> 15 ccccttaccc tccacacc 18 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NRAS codon 61_R <400> 16 gaggttaata tccgcaaatg actt 24 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NRAS codon 12, 13_F <400> 17 cttgctggtg tgaaatgact g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NRAS codon 12, 13_R <400> 18 tccgacaagt gagagacagg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HRAS codon 61_F <400> 19 gtcctcctgc aggattccta 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HRAS codon 61_R <400> 20 cggggttcac ctgtact 17 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HRAS codon 12, 13_F <400> 21 ctgaggagcg atgacggaa 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HRAS codon 12, 13_R <400> 22 aggctcacct ctatagtggg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KRAS codon 61_F1 <400> 23 ggtgcactgt aataatccag ac 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KRAS codon 61_R1 <400> 24 tgatttagta ttatttatgg c 21 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KRAS codon 61_F2 <400> 25 tgaagtaaaa ggtgcactgt aata 24 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KRAS codon 61_R2 <400> 26 taaacccacc tataatggtg aa 22 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KRAS codon 12, 13_F <400> 27 ggtgagtttg tattaaaagg tactgg 26 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KRAS codon 12, 13_R <400> 28 tcctgcacca gtaatatgca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon1_F <400> 29 ccgttggcac ccgtgaccta 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon1_R <400> 30 accatcagca ccgtgactgg 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon2_F <400> 31 gggcggatca caaggtca 18 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon2_R <400> 32 aggagacggg aagaggagc 19 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon3_F <400> 33 tgtgcccaga gcaagagc 18 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon3_R <400> 34 gcagaagaat ggcgtgaacc 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon4&5_F <400> 35 aggagacggg aagaggagc 19 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon4&5_R <400> 36 tgaaccacca tctgccgtat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon6_F <400> 37 tgactgacca cgcctttctt 20 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon6_R <400> 38 tgagggacct ggcaaacc 18 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon7_F <400> 39 cagggtctgt cagggttgtc c 21 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon7_R <400> 40 ccgtccgctg ctctgtctt 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon8_F <400> 41 actgcttctg ggcgtttgc 19 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon8_R <400> 42 aggtgggctg gaggcttt 18 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon9_F <400> 43 ggttctgtgc tggcatttcg 20 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon9_R <400> 44 ggctctgacg ctggtggat 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon10a_F <400> 45 tgcccaggct gacctcttc 19 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon10a_R <400> 46 cgatggcgtt tctcgtgttt t 21 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon10b_F <400> 47 ggatttgagc tgtggctgtg ag 22 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> STK11 exon10b_R <400> 48 aacaccgtga ctgccgacct 20 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 2,3,4_F <400> 49 tgtaaaacga cggccagtgc cgagctgtct cagacac 37 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 2,3,4_R <400> 50 caggaaacag ctatgaccga aatgcagggg gatacg 36 <210> 51 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 2,3_F <400> 51 tgtaaaacga cggccagtgg agtgcttggg ttgtggt 37 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 2,3_R <400> 52 caggaaacag ctatgacccg gcaaggggga ctgta 35 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 4_F <400> 53 tgtaaaacga cggccagtga cttcctgaaa acaacg 36 <210> 54 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 4_R <400> 54 caggaaacag ctatgaccca cacattaagt gggtaaac 38 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 5,6_F <400> 55 tgtaaaacga cggccagttt tctttgctgc cgtcttc 37 <210> 56 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 5,6_R <400> 56 caggaaacag ctatgacctt gcacatctca tggggtta 38 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 7_F <400> 57 tgtaaaacga cggccagtga ccatcctggc taacgg 36 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 7_R <400> 58 caggaaacag ctatgaccca caggttaaga ggtcccaaa 39 <210> 59 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 8,9_F <400> 59 tgtaaaacga cggccagttt tgggacctct taacctgt 38 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 8,9_R <400> 60 caggaaacag ctatgaccca ggcaaagtca tagaaccat 39 <210> 61 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 10_F <400> 61 tgtaaaacga cggccagtca tgttgctttt gtaccgtc 38 <210> 62 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 10_R <400> 62 caggaaacag ctatgaccgg caagaatgtg gttatagga 39 <210> 63 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 11_F <400> 63 tgtaaaacga cggccagtaa gggaagatta cgagact 37 <210> 64 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53 Exon 11_R <400> 64 caggaaacag ctatgaccta agctggtatg tcctactc 38 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_cDNA_1_F <400> 65 tcgggctggg agcgtgcttt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_cDNA_1_R <400> 66 agctgcacag ggcaggtctt 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_cDNA_2_F <400> 67 ggacagccaa gtctgtgact 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_cDNA_2_R <400> 68 ggagaggagc tggtgttgtt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_cDNA_3_F <400> 69 ccatcctcac catcatcaca 20 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TP53_cDNA_3_R <400> 70 gctgtcagtg gggaacaaga a 21

Claims

PLEKHS1 프로모터 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 원격 전이(distant metastasis) 분화갑상선암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 TERT 프로모터 유전자, TP53 유전자, STK11 유전자, BRAF 유전자 및 RAS 유전자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 예후는 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 대한 내성 또는 사망할 가능성인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 원격 전이(distant metastasis) 분화갑상선암은 원격전이를 동반한 유두암종(papillary thyroid carcinoma, PTC), 소포암종(follicular thyroid carcinoma, FTC) 및 저분화암종(poorly differentiated thyroid carcinoma, PDTC)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 22번 염색체의 장완(q) 소실의 유전자복제수변이(copy number variation)를 확인할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제6항에 있어서, 상기 22번 염색체의 장완(q) 소실은 22번 염색체의 q11.1 ~ q13.33 영역이 소실되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은
a) 1번 염색체의 장완(q) 획득;
b) 9번 염색체의 단완(p) 소실;
c) 9번 염색체의 장완(q) 소실; 및
d) 11번 염색체의 장완(q) 소실;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자복제수변이(copy number variation)를 확인할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제8항에 있어서, 상기
a) 1번 염색체의 장완(q) 획득은 1번 염색체의 q12 ~ q44 영역을 획득;
b) 9번 염색체의 단완(p) 소실은 9번 염색체의 p24.3 ~ p11.2 영역이 소실;
c) 9번 염색체의 장완(q) 소실은 9번 염색체의 q12 ~ q34.3 영역이 소실; 및
d) 11번 염색체의 장완(q) 소실은 11번 염색체의 q11 ~ q25 영역이 소실;
인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
제1항의 바이오마커 조성물을 포함하는 원격 전이(distant metastasis) 분화갑상선암 진단 또는 예후 예측용 키트.
a) 개체에서 분리된 시료로부터 유전자를 수득하는 단계; 및
b) 상기 단계 a)의 유전자에서 PLEKHS1 프로모터 유전자, TERT 프로모터 유전자 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 돌연변이가 발견되지 않은 경우, BRAF 유전자 및 RAS 유전자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계;
를 포함하는 원격 전이(distant metastasis) 분화갑상선암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서,
상기 단계 b) 에서 돌연변이가 확인된 경우 개체가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타내고 사망할 가능성이 있는 것으로 판단하고,
상기 단계 c)에서 돌연변이가 발생한 경우 개체가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타낼 것으로 판단하며,
돌연변이가 발견되지 않은 경우 개체가 좋은 예후를 나타낼 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 a)의 시료는 종양, 혈액, 소변 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
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제11항에 있어서, 상기 b) 단계에서,
상기 단계 a)에서 분리한 유전자 중
a) 1번 염색체의 장완(q) 획득;
b) 9번 염색체의 장완(q) 소실;
c) 11번 염색체의 장완(q) 소실; 및
d) 22번 염색체의 장완(q) 소실;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자복제수변이(copy number variation)를 추가적으로 확인하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법으로서,
상기 유전자복제수변이가 확인되는 경우 분화갑상선암 환자가 방사성 요오드(radioactive iodine) 치료에 내성을 나타내고 사망할 가능성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
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