CN101815792A - 肿瘤特异性dna序列的特异性扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于癌症检测和诊断的方法。本发明提供选择性扩增得自受试者的低甲基化肿瘤DNA序列以检测癌症的方法。此方法利用差异甲基化，以允许从含有高比例正常宿主DNA的DNA混合物中选择性扩增肿瘤特异性序列。本发明还提供使用所扩增的肿瘤DNA序列评估甲基化的方法。

Description

肿瘤特异性DNA序列的特异性扩增
技术领域
本发明包括用于癌症检测和诊断的方法。
背景技术
用于癌症筛选的现有方法是昂贵且很大程度上无效的，因此，大多数癌症是在晚期且难以治疗的阶段检测到的。对于卵巢癌尤其如此。因此，对用于癌症筛选的新方法的需要已得到广泛认同。大量近期的出版物已证明了癌症患者的体液中循环核酸(circulating nucleic acid，CNA)的存在，并且已考虑了使用can进行癌症检测、跟踪和预后的多种策略(综述于(Fleischhacker和Schmidt 2007))。最简单的方法是比较癌症患者和对照之间的CNA总量。此类研究一般发现癌症患者比无癌症对照具有更多的CNA，但是还不能显示肿瘤大小、所处阶段或类型与总CNA浓度之间的良好相关性。简单的定量由于以下事实而进一步复杂化：许多其它病况例如慢性炎症和慢性阻塞性肺病(COPD)伴有CNA水平的提高。
使用CNA的更有前景的方法是检测癌症特异性序列的变化。已在胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌和卵巢癌患者的CNA中鉴定出K-RAS和/或P53的获得性突变(Fleischhacker和Schmidt 2007)。几位作者已考虑到使用已知癌症突变的检测作为用于癌症筛选的方法的可能性。在一项此类研究中，作者发现筛选接受结肠镜检之患者的CNA中的K-RAS突变可用于预测哪些人将具有结肠恶性肿瘤(Kopreski，Benko等人2000)。其它研究提供了相矛盾的结果，这表明没有单一的突变能提供有力的癌症检测(Yakubovskaya，Spiegelman等人1995；Trombino，Neri等人2005)。
已考虑的另一种途径是分析微卫星的不稳定性，其提供了找到癌症相关的序列变化而无需靶向特异性的已知突变的途径。几项研究已显示甚至在乳腺癌和肺癌的早期，循环DNA中就存在微卫星变化(Chen，Bonnefoi等人1999；Sozzi，Musso等人1999；Sozzi，Conte等人2001)。
DNA序列的表观遗传变化提供了从CNA样本中特异性扩增癌症DNA的第三种途径。迄今，超过40种出版物已报道了在各种癌症患者的血液和体液的CNA中检测癌症相关之甲基化改变的工作(Fleischhacker和Schmidt 2007)。在几乎所有此类研究中，通过使用甲基化特异性PCR，查询到在癌症中经常被过度甲基化的一种或多种CpG岛(Herman，Graff等人1996)，并且大多数研究报道了一定程度的成功。取决于分析了哪种CpG，几乎始终可以在一定比例的患有给定类型癌症的受试者中检测到癌症相关变化。一般而言，可从此项工作得出结论，虽然特定基因座的甲基化改变经常存在于癌症患者的CNA中，但是没有特定的基因座确保成为有效检验的基础。在一篇癌症表观遗传学的综述中，作者提出，大规模分析CNA中的甲基化将能解决仅检查一种或几种基因座的问题，并推断基于微阵列的甲基化分析方法有极大希望用于癌症检测(Laird 2005)。为了实现大规模检测CNA中癌症相关的甲基化变化，甲基化特异性DNA扩增的方法以及检测甲基化差异的微阵列技术是必需的。
由于肿瘤DNA可从患有各种不同类型癌症(包括卵巢癌)的受试者的无细胞血浆中常规回收，它提供了评估恶性肿瘤存在的有吸引力的方法。然而，使用循环DNA进行癌症检测受到两个主要问题的制约。第一，循环DNA(或“CNA”)总是被大量的正常宿主DNA污染。因此，特异性扩增肿瘤DNA的方法一般依赖于预先了解肿瘤和正常之间的基因组差异，例如癌症特异性突变或甲基化改变。这一制约严重限制了可扩增的基因座的数量。第二，肿瘤是高度多样化的，所以仅检测一种或几种肿瘤特异性基因组改变不太可能提供用于癌症检测的有力方法。本发明通过允许在低甲基化肿瘤DNA与正常宿主DNA混合时对低甲基化肿瘤DNA进行总体但高度选择性的差异扩增并同时评估大量(＞105)基因座的甲基化，提供了对这两个问题的解决方案。因此，本发明提供了通过高通量分析循环DNA的甲基化进行癌症筛选的新方法。
发明概述
本发明涉及用于癌症(尤其是卵巢癌)的诊断评估和预后的方法。本发明提供选择性扩增来自受试者血清或血浆的低甲基化DNA的方法，该方法包括：用甲基化敏感性酶消化DNA；将消化的DNA与接头连接；对消化的DNA进行接头介导的PCR扩增，以获得PCR产物；纯化该PCR产物；并扩增经纯化的PCR产物。在一个实施方案中，所述纯化PCR产物的扩增是通过以下实现的：环化经扩增的PCR产物；并对闭合的环状分子进行等温滚环扩增以选择性扩增低甲基化DNA，从而产生DNA样品的甲基化敏感性展示。
在一个实施方案中，本发明提供用于选择性扩增来自受试者血清或血浆的低甲基化DNA的方法，该方法包括：用甲基化敏感性酶消化DNA；将消化的DNA与接头连接；对消化的DNA进行接头介导的PCR扩增，以获得PCR产物；除去扩增产物中的接头和引物DNA；环化经扩增的PCR产物；用第二限制酶消化所述DNA，所述第二限制酶在添加所述接头的位点处消化所述DNA；除去消化的DNA中的接头；使消化的DNA自身连接以形成闭合的环状分子；对所述环化分子进行外切核酸酶消化，以将任何未环化的DNA还原成单核苷酸；并对所述闭合的环状分子进行等温滚环扩增以选择性扩增低甲基化DNA，从而产生DNA样品的甲基化敏感性展示。
通过以上方法制备的DNA然后可与定制的寡核苷酸微阵列杂交。在一个实施方案中，所述阵列上的寡核苷酸对应于理论上可在使用甲基化敏感性酶的第一消化步骤中产生的DNA限制片段之一或其部分。每个阵列地址的信号强度取决于对应于该地址的探针(经标记的DNA)的量。因此，信号强度高的阵列地址是相对更低甲基化的。通过比较正常对照与癌症患者的微阵列数据，获得典型的癌症甲基化图谱。将从癌症状态未知的受试者获得的样品的甲基化/微阵列结果与正常数据的机体进行比较。与正常的偏差指示有癌症。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于选择性扩增得自受试者样品之肿瘤DNA的方法。本发明的方法包括：(i)用甲基化特异性酶消化从受试者样品中分离的DNA；(ii)将接头连接于消化的DNA的末端；(iii)对所述消化的DNA进行接头介导的PCR扩增；(iv)纯化所述PCR产物，(v)用限制酶消化经纯化的PCR产物，所述限制酶识别部分或全部包含于所述接头内的限制位点；(vi)环化所述纯化的PCR产物；和(vii)对步骤(vi)的产物进行等温滚环扩增来选择性扩增肿瘤DNA，以产生肿瘤DNA的甲基化敏感性展示。在另一实施方案中，所述接头介导的PCR中使用的PCR引物与在所述PCR产物后续纯化中有用的部分缀合。在一个实施方案中，所述PCR引物与生物素缀合。在另一实施方案中，所述PCR产物通过使所述部分与支持物结合而纯化。在一个实施方案中，所述接头介导的PCR引物是生物素化的，并且所得的PCR产物使用连接于支持物(例如，琼脂糖、琼脂糖凝胶(Sepharose)或磁珠)的生物素结合蛋白(例如，亲和素或链霉亲和素)进行纯化。在一个实施方案中，所述PCR产物通过用限制酶切割而从所述支持物释放，所述限制酶识别由所述接头与用甲基化敏感性酶消化之DNA的连接形成的限制位点。在一个实施方案中，所述接头用MluI切割。
在本发明的另一具体实施方案中，提供了用于选择性扩增得自受试者样品之肿瘤DNA的方法。本发明的方法包括(i)用甲基化特异性酶消化从受试者样品分离的DNA；(ii)将接头连接于消化的DNA的末端；(iii)对所述消化的DNA进行接头介导的PCR扩增以获得扩增的PCR产物；(iv)用限制酶消化所述扩增的PCR产物，所述限制酶在添加所述接头的位点处切割所述DNA；(v)将被切下的接头从所述PCR产物中除去；(vi)环化所述PCR产物；(vii)对环化的PCR产物进行核酸外切酶消化，以消化剩余的线性DNA分子；和(viii)对步骤(vii)的产物进行等温滚环扩增来选择性扩增肿瘤DNA，以产生肿瘤DNA的甲基化敏感性展示。
本发明还提供用于鉴定肿瘤特异性低甲基化DNA区域的方法，该方法包括：(i)使用上文所述的方法分别从肿瘤DNA和正常DNA产生甲基化敏感性展示；(ii)标记所述肿瘤DNA和对照DNA以产生经标记的肿瘤DNA探针和经标记的正常DNA探针；(iii)将所述经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于给定甲基化敏感性酶的预测限制片段或其部分；(iv)比较正常来源的探针和肿瘤来源的探针的相对强度，以鉴定检测差异量之肿瘤DNA探针的寡核苷酸；(v)鉴定步骤(iv)中对应于肿瘤特异性低甲基化区域的杂交寡核苷酸。在一个实施方案中，两种展示用不同的标记物(例如，不同的荧光染料)标记并与同一阵列杂交。在另一实施方案中，所述经标记的探针与单独的微阵列杂交。
本发明还提供了用于检测受试者中的癌症的方法。该方法包括使用上文所述的方法产生得自患者之样品的甲基化敏感性展示，然后标记所述DNA以产生经标记的肿瘤DNA探针。将所述经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于甲基化特异性酶的预测限制片段或其部分。此类杂交将导致产生肿瘤DNA的甲基化图谱，其中所述图谱包含多种基因座的甲基化状态。然后将受试者样品的甲基化图谱与通过相同技术产生的正常对照的甲基化图谱进行比较，以确定受试者样品的甲基化图谱是否指示存在肿瘤。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤DNA探针和正常DNA探针用两种不同的标记物标记，并且经标记的探针与一个阵列进行杂交。
在本发明的一个实施方案中，本发明方法中待使用的受试者DNA样品得自血浆或血清。在本发明的又一实施方案中，所述甲基化特异性酶是HpyCh4-IV、ClaI、AclI或BstBI。在一个实施方案中，所述甲基化特异性酶是HpyCh4-IV。在本发明的另一实施方案中，所述接头介导的PCR扩增执行约5至约15个循环。在本发明的另一实施方案中，所述接头介导的PCR扩增执行约10个循环。在本发明的一个实施方案中，Bal-31外切核酸酶消化在所述环化步骤之后进行。
本发明的一个实施方案提供试剂盒，该试剂盒包含施行本发明方法所必需的试剂以及说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于检测和鉴定肿瘤DNA中低甲基化区域的试剂和说明书。在另一实施方案中，所述试剂盒提供用于通过本发明的方法筛选存在肿瘤之患者的试剂和说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒包含甲基化敏感性酶、接头DNA、用于接头介导之PCR的PCR引物、用于将接头从PCR产物中除去的限制酶、用于检测肿瘤相关的低甲基化区域的微阵列和施行该方法的说明书。
一个实施方案提供用于检测低甲基化区域的微阵列，其中所述微阵列包含通过以下方式选择的寡核苷酸：(a)将基因组分解为区段，所述区段的边界为相关甲基化敏感性限制酶的两个位点(对于HpyCh4-IV来说是ACGT)并且长度低于500碱基对；(b)利用算法分析这些片段的序列，目标是找到用于在微阵列上展示的合适序列。例如，适当的寡核苷酸将具有一种或多种下列特性：(i)大于约40个核苷酸的独特序列，或大于约60个核苷酸的独特序列；(ii)约40％至约60％的GC，并且(iii)不应含有显著的重复或简单序列，例如连串的大于约15个单一碱基。在一个实施方案中，所述微阵列包含在检测肿瘤相关的低甲基化DNA中有用的这些寡核苷酸的子集。在一个实施方案中，寡核苷酸的该子集是通过以下方法鉴定的：(i)使用上文所述的方法分别产生肿瘤DNA和正常DNA的甲基化敏感性展示；(ii)标记所述肿瘤DNA和对照DNA以产生经标记的肿瘤DNA探针和经标记的正常DNA探针；(iii)将所述经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于给定甲基化敏感性酶的预测限制片段或其部分；(iv)比较正常来源之探针和肿瘤来源之探针的相对强度，以鉴定检测差异量之肿瘤DNA探针的寡核苷酸；(v)鉴定步骤(iv)的对应于肿瘤特异性低甲基化区域的杂交寡核苷酸；和(vi)比较来自多个患者的肿瘤特异性低甲基化区域以确定可用于检测患者中肿瘤的寡核苷酸的子集。
附图说明
图1.来自患有卵巢癌的受试者和正常对照的血浆DNA的甲基化微阵列比较。显示了含有112个区段的染色体21的～120kb区域。正强度比值指示来自癌症样品的相关信号更多，而负比值指示来自正常样品的相关信号增多。边界非常尖锐的高对比度信号簇是显著的，并且几乎毫无疑问地反映了两种样品的内在差异。
具体实施方式
本发明提供了选择性扩增得自受试者的低甲基化肿瘤DNA序列用以检测癌症的方法。该方法利用差异甲基化，以允许从含有高比例正常宿主DNA的DNA混合物中选择性扩增肿瘤特异性序列。本发明还提供了使用扩增的肿瘤DNA序列评估甲基化的方法。
肿瘤DNA和非肿瘤DNA的甲基化差异
如上文所讨论地，本发明依赖于肿瘤DNA和对照DNA之间的甲基化差异。对照DNA理解为是来自正常(无癌症)个体。DNA甲基化是通过改变基因表达来影响细胞功能的表观遗传学事件，其是指由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化的向CpG二核苷酸中胞嘧啶的5-碳共价添加甲基基团。
本发明的方法提供利用肿瘤DNA和非肿瘤DNA之间的甲基化差异，从得自受试者的DNA样品选择性扩增低甲基化肿瘤DNA。如先前指出地，一般而言，所述方法包括以下步骤：从受试者中分离DNA；对所述分离的DNA进行接头介导的PCR；环化所述扩增的PCR产物；外切核酸酶消化；以及最后的等温滚环扩增。该方法产生肿瘤DNA的甲基化敏感性展示，即基于肿瘤DNA和非肿瘤患者DNA之间甲基化差异而扩增复制肿瘤DNA。
本文所述的方法可应用于得自受试者之细胞或细胞材料的DNA样品。可使用本领域已知的采集或分离所需细胞或材料的任何方法。在一个实施方案中，循环核酸(CNA)得自受试者的血清或血浆。
接头介导的PCR
一般地，接头介导的PCR开始于用限制酶消化DNA并将双链接头连接于经消化的末端。然后用对应于所述接头的引物进行PCR，并扩增出长达约1.5kb的片段。(参见Saunders，Glover等人1989；Lisitsyn，Leach等人1994)。使用该技术，已可以从单个细胞扩增DNA并随后通过使用扩增产物进行比较杂交来检测非整倍性。(Klein，Schmidt-Kittler等人1999)。在另一项研究中，通过将扩增展示用作针对BAC微阵列的杂交探针，它们被用于检测单一基因组拷贝数变化。(Guillaud-Bataille，Valent等人2004)。
在该方法中，限制酶的消化频率决定了所得到的扩增产物的复杂度。通过选择稀有切割的酶，可将扩增展示的复杂度降低至起始基因组DNA的一小部分，使后续的杂交步骤更加容易进行。该技术在希望进行两个复杂基因组来源之间的比较杂交时特别有用。一个显著的实例就是称为“ROMA”(Representational Oligonucleotide Microarray Analysis，展示性寡核苷酸微阵列分析)的技术，其有助于揭示人类中的基因组拷贝数高度变异。(Lucito，Healy等人2003；Sebat，Lakshmi等人2004；Jobanputra，Sebat等人2005)Lucito，R.等人，Genome Res.13：2291-305(2003)；Sebat，J.等人，Science 305：525-8(2004)；Jobanputra，V.等人，Genet Med 7：111-8(2005)。
因此，在本发明的接头介导的PCR步骤中，获得DNA样品并将其用CpG甲基化敏感性酶消化，以形成具有经消化末端的经消化DNA。在一个实施方案中，所述DNA样品是混合的，包含宿主DNA和肿瘤DNA。
通过在接头连接之前使用CpG甲基化敏感性限制酶切割DNA，促进了边界为非甲基化位点之片段的扩增。在存在来自两种不同来源之DNA的混合物(其中一种比另一种甲基化程度低)时，用甲基化敏感性酶消化然后进行接头连接和扩增允许选择性扩增由差异甲基化位点限定的片段。该想法已与“展示差异分析”联合使用以检测正常组织和癌组织之间的甲基化差异。(参见Ushijima，Morimura等人1997；Kaneda，Takai等人2003)。甲基化敏感性酶是本领域已知的，并且包括但不限于HpyCh4-IV、ClaI、AclI和BstBI。
在如上文所讨论地用甲基化特异性酶消化从混合样品获得的DNA之后，将所述DNA与接头连接。在一个实施方案中，所述接头具有内置的限制位点或限制位点的部分，其将稍后用于提供扩增经纯化的PCR产物所必需的相容性粘性末端，例如可用于滚环扩增的环化步骤的粘性末端。优选在消化后产生粘性末端的限制酶位点。例如，MluI提供粘性末端。
连接所述接头之后，所得的DNA使用与所述接头内的位点结合的引物进行扩增。然后进行PCR扩增。循环数可有所变化。在一个实施方案中，循环数将产生经消化片段的大小选择性展示。在本发明的一个实施方案中，进行约5至约15个扩增循环。在一个实施方案中，进行约8至约14个扩增循环。在一个实施方案中，进行约10个扩增循环。在一个实施方案中，所述PCR引物中的一种或多种与可用于后续纯化步骤中的部分相缀合。在一个实施方案中，所述部分是生物素。
接头介导的PCR产物的纯化
接头介导的PCR所使用的引物可包含对纯化PCR产物有用的部分。在一个实施方案中，所述PCR引物是生物素化的，并使用连接于支持物的生物素结合蛋白分离PCR产物。生物素结合蛋白包括例如亲和素、链霉亲和素和中性链亲和素(NeutrAvidin)。在一个实施方案中，所述生物素结合蛋白是链霉亲和素。在一个实施方案中，所述支持物是琼脂糖、琼脂糖凝胶或磁珠。在一个实施方案中，用于接头介导的PCR的PCR引物是生物素化的，并且所得PCR产物使用与磁珠连接的链霉亲和素进行纯化。然后可洗去不与支持物结合的其它组分。然后使用限制内切核酸酶从所述支持物上释放扩增的PCR产物，所述限制内切核酸酶识别部分或全部包含于所述接头内的限制位点。在一个实施方案中，所述限制酶是MluI。
MluI的识别序列(ACGCGT)与甲基化敏感性限制酶HpyCh4-IV的识别序列(ACGT)重叠，从而当用HpyCh4-IV切割DNA并随后将其连接于5’端包含序列CGCGT的接头时，形成了MluI的限制位点。接头介导的PCR和经由例如生物素的部分将PCR产物与支持物连接后，当使用MluI从接头和支持物释放PCR产物时，非特异性扩增产物将很大程度上保持与接头和支持物结合，这是因为它们不包含完整的MluI识别序列。因此，可从非特异性扩增产物中纯化接头介导之PCR的特异性产物，所述非特异性扩增产物保持与支持物结合。
在本发明的另一实施方案中，在进行扩增循环之后，然后用将所述接头切下的酶消化经扩增的产物。例如，如果接头引入了MluI位点，则对所述产物进行MluI酶消化。在消化切除接头之后，低分子量DNA(接头和引物DNA)被除去。可使用除去低分子量DNA的任何合适方法，例如琼脂糖凝胶纯化或柱纯化。同样，HpyCh4-IV和MluI的组合与如上文所述的合适接头序列的使用确保了非特异性扩增产物不从接头上释放，并因此不可用于后续的扩增步骤。
经纯化PCR产物的扩增
接头介导的PCR产物一经从接头切割和纯化后，稀释经纯化的DNA。然后用T4DNA连接酶过夜处理该DNA，以允许通过连接由先前酶消化形成的粘性末端来进行环化。通过在非常稀的溶液(例如，于1×连接缓冲液中的0.5ml)中进行消化和连接，强烈地促进了具有相容性粘性末端之分子的分子内自身连接(环化)。已解链并部分地再退火多次(在PCR扩增过程中)的原始起始DNA被消化和环化的效率则非常低。此外，缺乏适当末端的非特异性扩增产物也极其不可能形成共价闭合环。
然后将所述连接物用作等温滚环扩增的模板。等温滚环扩增是本领域已知的，并且一般是使用外切核酸酶抗性随机引物和具有极大加工能力的DNA聚合酶进行的环状DNA单循环扩增。可使用任何等温滚环扩增程序。一种常见的试剂盒可从Amersham获得并根据生产商的建议使用。滚环扩增导致形成由环状模板的多个拷贝组成的串联结构。
在一个实施方案中，从接头释放经纯化的PCR产物之后，进一步使用另外的连接物介导之PCR步骤来扩增所述产物。
外切核酸酶消化
沉淀环状DNA(使用本领域常见的方法)并将其重悬于合适的缓冲液(例如水)之后，可通过用外切核酸酶进行充分的消化来处理连接混合物以除去非特异性PCR产物，所述外切核酸酶攻击单链DNA和双链DNA的末端(例如核酸酶Bal-31)。连接生成的环状分子对消化具有抗性，但充分的消化将把任何线性分子还原成单核苷酸。因此使用此消化来消除起始基因组DNA以及非特异性扩增的产物。或者，可使用外切核酸酶的混合物来替代单一种外切核酸酶(例如Bal-31)。例如，一种酶攻击单链DNA(绿豆外切核酸酶)，而另一种酶攻击双链DNA(λ外切核酸酶)，并且其中任一种酶都不具有内切核酸酶活性，而且也不在切口处切割双链DNA。术语“充分消化”意指使用足量的酶以使其不成为限制，并且消化所允许的时间足够长而不成为限制。例如，在一个实施方案中，使用2单位的Bal-31核酸酶消化混合物，并使之进行45分钟。所述“单位”在功能上定义为在40ng/μl溶液中在10分钟内消化400个碱基的线性DNA所需的酶量。
阵列设计
本发明还提供了寡核苷酸微阵列用于鉴定基因组的肿瘤特异性低甲基化区域的用途。在一个具体实施方案中，所述方法包括：(i)使用上文所述的方法分别从受试者和正常对照的无细胞血浆DNA产生甲基化敏感性展示；(ii)标记肿瘤DNA和对照DNA以产生经标记的肿瘤DNA探针和经标记的正常DNA探针；(iii)将所述经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于给定甲基化敏感性酶的预测限制片段或其部分；(iv)比较正常来源之探针和肿瘤来源之探针的相对强度，以鉴定检测差异量之肿瘤DNA探针的寡核苷酸；(v)鉴定步骤(iv)的对应于肿瘤特异性低甲基化区域的杂交寡核苷酸。
本发明还提供了通过使用微阵列检测受试者中的癌症的方法。该方法包括使用上文所述方法选择性扩增得自受试者样品和正常对照的DNA，然后标记所述扩增的DNA以产生经标记的DNA探针，其中所述受试者来源的探针和正常对照来源的探针具有不同的标记(例如，不同的荧光染料)。将经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于甲基化特异性酶的预测限制片段。分析该阵列数据以确定杂交探针的相对信号强度并确定从癌症受试者与正常对照中优先扩增了哪些区段。这样的分析将导致产生肿瘤DNA的甲基化图谱，其中所述图谱包含多个基因座的甲基化状态。然后将受试者样品的甲基化图谱与通过相同技术产生的正常对照的甲基化图谱进行比较，以确定受试者样品的甲基化图谱是否指示肿瘤的存在。在一个实施方案中，所述受试者探针和对照探针与两个单独的阵列杂交。
用于本发明实践的阵列可使用本领域技术人员公知的方法产生。在本发明的一个实施方案中，所述阵列将包含通过用选择性扩增步骤中使用的甲基化敏感性酶酶促消化基因组DNA产生的核酸片段。在另一实施方案中，所述阵列上的寡核苷酸对应于可通过甲基化敏感性限制酶产生的核酸片段或其部分(即，如果DNA完全未甲基化时所可能产生的片段)的全部或子集。在一个实施方案中，微阵列上的寡核苷酸可以本领域已知的任何方式(例如原位合成(在微阵列载玻片上)或点样在微阵列载玻片上)来制备。
早期研究已显示甲基化差异在基因组中富含基因的部分显著地更常见。因此，为了使发现甲基化差异的可能性最大化，可在本发明实践中使用靶向基因组中具有高基因含量的区域的阵列设计。
例如，在本发明的一个非限制性实施方案中，每条染色体可分为106bp的箱(bin)，其从一个端粒开始并延伸至另一端粒。然后将使用来自UCSC浏览器的信息确定这些～3000个序列箱每一个中已知或预测基因的外显子占总序列的百分比，并根据该统计对所有箱进行排位。然后将选择具有最高外显子含量的那些箱用于在阵列中展示。富含基因的106bp区段各含有符合包含于阵列中之大小标准的约2000个HpyCh4-IV片段，并且由于在标准的385K阵列中可展示约120,000个此类片段，因此所述阵列将展示约60个这样的序列箱，或者说约60×106个碱基，其对应于基因组DNA的约2％。
为了提供有力的杂交数据，每种基因组HpyCh4-IV片段可通过与这些片段杂交的不同寡核苷酸展示在阵列上。如果可能，每种基因组片段在阵列上包括3种不同的寡核苷酸通常是有益的。可使用商业服务机构来筛选完整人类基因组序列中所有可能的“长聚体”(longmer)寡核苷酸，其符合包含于基因组微阵列中的一系列标准。合适的区段是独特的，没有连串的简单序列，并具有适当的预测解链温度。可向商业服务机构提供如上文所定义的200,000种片段套系，他们将确定哪些片段包含他们先前建立的合适寡核苷酸的至少3种。由于目前的阵列具有用于385K寡核苷酸的空间(例如，NimbleGen阵列)，并由于每种HypCh4-IV片段将由3种寡核苷酸展示，因此一个阵列足以展示约125K片段。为了确定背景杂交，每个阵列中包括了一系列4000种随机序列寡核苷酸。
阵列杂交
阵列杂交可由商业服务机构根据他们的标准方案来进行。在本发明的一个实施方案中，使用两种颜色“比较”来进行杂交，其中“测试”DNA用一种荧光染料标记，而“对照”DNA用第二荧光染料标记。该方法最大限度地减少了假象和一致性问题，这是因为完全相同的实验条件应用于“测试”样品和“对照”样品。如上文所讨论地，每次杂交的对照将是不同的正常受试者。应当理解，因为数据是通过比较杂交产生的，所以数据分析不受实验设计该方面的限制。与每个阵列地址相关的归一化强度可在所有杂交间进行比较，使得例如建立一组阵列地址成为可能，所述阵列地址不可能在任何正常个体中造成高于阈值的信号。
微阵列检测可通过本领域已知的任何方法进行。DNA样品(即，甲基化敏感性展示)可用标记物标记，所述标记物可用于在微阵列上进行检测，包括但不限于荧光标记物、发光标记物、金粒标记物和电化学标记物。
数据分析
与微阵列的比较杂交已广泛用于产生基因表达图谱以及鉴定基因组拷贝数变化，有大量用于此类微阵列数据的数据分析方法。在本发明中，数据可用于评估癌症特异性差异甲基化的基因组分布以及评估微阵列数据集之间相对信号强度的整体差异。
例如，用于评估基因组拷贝数改变的已有生物信息学方法可用于数据分析，包括“设定阈值”(Vissers，de Vries等人2003)、隐马尔科夫模型(Sebat，Lakshmi等人2004)、使用基因组位置的等级聚类(Wang，Kim等人2005)以及最近的一项称为“最大后验概率(maximum-a-posteriori)”或“MAP”的技术(Daruwala，Rudra等人2004)。尽管这些方法已开发用于检测拷贝数变化而不是甲基化差异，但是总的问题是相似的，并且所述方法容易适应于我们的阵列产生的数据类型。
一经分析各数据集中差异信号的可靠聚类存在后，就可进行旨在区分癌症与正常的数据集之间的比较。几项已发表的研究已具体地解决了在微阵列/甲基化数据情况下此类比较的问题。例如，在一项涉及由8000个CpG岛基因座固定的载玻片组成的小规模微阵列测定研究中，等级聚类能够鉴定两个不同组的卵巢肿瘤，并且这与临床参数相关(Wei，Chen等人2002)。在后续的出版物中(Wei，Balch等人2006)，同一研究组报道了通过使用以下技术对该分析进行了扩展：微阵列的显著性分析(Significance Analysisof Microarrays，SAM)(Tusher，Tibshirani等人2001)和微阵列的预测分析(Prediction Analysis of Microarray，PAM)(Tibshirani，Hastie等人2002)以及用于解读关于肿瘤甲基化微阵列数据的其它生物信息学技术。总体而言，存在许多用于评估不同微阵列数据集之间相似性的方法，这些方法是本领域技术人员公知的。
本文引用的所有参考文献均以其整体并入本文。
实施例
实施例1.肿瘤相关低甲基化区域的鉴定
为了测试患有卵巢肿瘤的受试者的CNA甲基化图谱是否与正常对照的不同，冷冻的血清样品从由于怀疑患有卵巢癌而在探查性手术之前抽取血液的女性获得。从未患癌症的女性获得类似的样品。通过标准方法从1ml无细胞血清中制备DNA，对全部得到的样品进行如上文所述的甲基化敏感性扩增。将这样一对样品提交给NimbleGen以与阵列杂交，所述阵列先前已用于分析滋养层甲基化。
数据表明两种扩增(癌症和正常)都导致来自～5％的阵列地址的可测量信号(定义为高于背景＞3sd)。另外，在这些情形的～70％中，信号的log2-比值小于|1.5|，表明即使从癌症以及正常二者中都扩增出了区段，但是几乎没有或没有差异扩增。该数据表明在扩增血清DNA和使用扩增展示获得微阵列信号两方面均取得了成功。应当注意，预计非特异性扩增会造成分散的或随机分布的杂交信号，但并未观察到。此外，差异扩增区域明显成簇出现。图1显示来自染色体21上的小区域的数据，其包含癌症样本的高对比度信号的簇。注意到，至少40个相邻区段是差异扩增的，并且log2-比值高达5，这表示32倍的差异扩增。这极不可能是由于实验假象造成的，因此最有可能代表检测原始样品之间的真实甲基化差异。这是信号强度的log2比值大于2的约50个簇(＞3个相邻区段)中的一个。
下列实施例中描述的实验旨在代表本发明可能的实施方案。应当理解，所述材料和量不限制本发明的范围。
实施例2.比较图谱(Comparison Panel)的开发
为了促进使用本发明方法的检测和诊断，可比较正常群体和特定癌症患者群体以开发与特定类型癌症相关的甲基化图谱。本发明的方法可用于生成这样的甲基化图谱。
使用标准方法从已知的癌症患者和正常对照的血清或血浆中分离DNA(Johnson，K.L.等人，Clin.Chem.50：516-21(2004))。简言之，将10ml患者血液离心两次以除去细胞。使所得血浆经过DNA结合膜。将DNA从所述膜移下，并用HpyCh4-IV消化所得的DNA。
将DNA接头退火并与消化的DNA连接。将所述接头设计为当与用HpyCh4-IV消化的DNA连接时形成MluI限制位点。接头介导的PCR根据Guillaud-Bataille，M.等人Nucleic Acids Res.32e112(2004)所述来进行，其中进行10个PCR循环，并利用生物素化的引物。
PCR之后，利用链霉亲和素包被的磁珠来纯化产物。在PCR产物与所述珠结合并洗涤之后，将它们用MluI消化以从扩增的DNA中除去接头序列(和珠)。通过稀释所述DNA以促进分子内连接并用T4 DNA连接酶处理来环化经扩增的DNA。
然后，使用商业试剂盒(例如，Amersham)并遵守生产商的说明将连接产物用作等温滚环扩增的模板。
然后，可对通过以上方法制备的DNA进行标记并与定制的寡核苷酸微阵列杂交。阵列上的每种寡核苷酸对应于理论上可在使用甲基化敏感性酶的第一消化步骤中产生的DNA限制片段之一。使用两种颜色“比较”来进行杂交，其中“测试”DNA用一种荧光染料(例如，Cy3)标记，而“对照”DNA用第二荧光染料(例如，Cy5)标记。每次杂交的对照将是不同的正常受试者。
每个阵列地址的信号强度取决于对应于该地址的探针的量。因此，信号强度高的阵列地址是相对低甲基化的。通过比较正常对照的微阵列数据与肿瘤患者的微阵列数据，可根据经验得出该肿瘤类型的典型甲基化图谱。通过比较已知癌症受试者与非癌症受试者所鉴定的甲基化差异将用于形成标准，该标准经预测性地应用而得以验证。该方法可用于形成多种肿瘤的甲基化图谱，所述肿瘤包括但不限于卵巢肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤和乳腺肿瘤。
实施例3.制备用于检测低甲基化肿瘤相关DNA的微阵列。
将基因组分解为区段，所述区段的边界是相关甲基化敏感性限制酶的两个位点(对于HpyCh4-IV来说是ACGT)，并且其长度小于500个碱基对。这提供了可从血清或血浆DNA样品扩增的一系列DNA区段。使用算法来分析这些片段的序列，目标是找到用于在微阵列上展示的合适序列。例如，适当的寡核苷酸将具有一种或多种下列特性：(i)大于约40个核苷酸的独特序列，或大于约60个核苷酸的独特序列；(ii)约40％至约60％的GC，并且(iii)不应含有显著的重复或简单序列，例如连串的大于约15个单一碱基。阵列包含以这种方式选择的寡核苷酸，其中阵列上的每个寡核苷酸代表可通过本发明方法扩增的一种基因组区段。此类阵列可用于使用本发明的方法检测肿瘤相关的低甲基化区域、形成肿瘤的甲基化图谱和筛选肿瘤。
一旦使用上述的微阵列来鉴定低甲基化的肿瘤相关DNA区域(在一般性肿瘤中或者在一种或多种特定肿瘤类型中)，即可产生包含设计用来检测那些DNA区域(通常与一般性肿瘤或与一种或多种类型的肿瘤相关)之寡核苷酸的微阵列，其用于使用实施例4的方法检测所述基因座处的肿瘤相关甲基化差异。
实施例4.使用本发明诊断癌症的方法
使用标准方法从患者血清或血浆分离DNA(Johnson，K.L.等人，Clin.Chem.50：516-21(2004))。简言之，将10ml患者血液离心两次以除去细胞。使所得血浆经过DNA结合膜。将DNA从所述膜上移下，并用HpyCh4-IV消化所得到的DNA。
将DNA接头退火并与消化的DNA连接。将所述接头设计为当与用HpyCh4-IV消化的DNA连接时形成MluI限制位点。接头介导的PCR根据Guillaud-Bataille，M.等人Nucleic Acids Res.32e112(2004)所述来进行，其中进行10个PCR循环，并且引物被生物素化。
PCR之后，利用链霉亲和素包被的磁珠来纯化产物。在PCR产物与所述珠结合并洗涤之后，将它们用MluI消化以从扩增的DNA中除去接头序列(和珠)。通过稀释所述DNA以促进分子内连接并用T4DNA连接酶处理来环化经扩增的DNA。
连接后，使用商业试剂盒(例如，Amersham)并遵守生产商的说明，将它们用作等温滚环扩增的模板。
对通过以上方法制备的DNA进行标记，并与定制的寡核苷酸微阵列杂交。使用两种颜色“比较”来进行杂交，其中患者DNA用一种荧光染料标记，而对照DNA用第二荧光染料标记。阵列上的每种寡核苷酸对应于理论上可在使用甲基化敏感性酶的第一消化步骤中产生的DNA限制片段。每个阵列地址的信号强度取决于对应于该地址的探针的量。因此，信号强度高的阵列地址是相对低甲基化的。将从癌症状态未知的受试者获得的样品的甲基化/微阵列结果与实施例2中得到的正常和癌症数据的主体进行比较。与正常的偏差指示有癌症。比较微阵列数据的方法是本领域已知的。
得到阳性结果后，可通过适当的筛选例如MRI对患者进行筛选，以证实所述癌症诊断。
这些方法适用于检测多种肿瘤类型，包括但不限于卵巢肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤和乳腺肿瘤。另外，该方法可用作一般性筛选测试。
参考文献
Chen，X，H Bonnefoi，et al(1999)″Detecting tumor-related alterations in plasma orserum DNA of patients diagnosed with breast cancer″Clin Cancer Res 5(9)2297-303
Daruwala，R S，A Rudra，et al(2004)″A versatile statistical analysis algorithm todetect genome copy number variation″Proc Natl Acad Sci USA 101(46)16292-7
Fleischhacker，M and B Schmidt(2007)″Circulating nucleic acids(CNAs)and cancer-A survey″Biochim Biophys Acta 1775(1)181-232
Guillaud-Bataillc，M，A Valcnt，et al(2004)″Detecting singlc DNA copy numbervariations in complex genomes using one nanogram of starting DNA and BAC-array CGH″Nucleic Acids Res32(13)e112
Herman，J G，J R Graff，et al(1996)″Methylation-specific PCR a novel PCR assayfor methylation status of CpG islands ″Proc Natl Acad Sci USA 93(18)9821-6Jobanputra，V，J Sebat，et al(2005)″Application of ROMA(representationaloligonucleotide microarray analysis)to patients with cytogenetic rearrangements″Genet Med 7(2)111-8
Kaneda，A，D Takai，et al(2003)″Methylation-sensitive representational differenceanalysis and its applicationto cancer research″Ann NY Acad Sci 983 131-41
Klein，C A，O Schmidt-Kittler，et al(1999)″Comparative genomic hybridization，lossof heterozygosity，and DNA sequence analysis of single cells″Proc Natl Acad Sci USA96(8)4494-9
Kopreski，MS，FA Benko，et al(2000)″Somatic mutation screening identification ofindividuals harboring K-ras mutations with the use of plasma DNA″J Natl Cancer Inst92(11)918-23
Laird，PW(2005)″Canccr epigenctics″Hum Mol Genct 14 Spec No 1 R65-76
Lisitsyn，NA，FS Leach，et al(1994)″Detection of genetic loss in tumors byrepresentational difference analysis″Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59 585-7
Lucito，R，J Healy，et al(2003)″Representational oligonucleotide microarray analysis ahigh-resolution method to detect genome copy number variation″Genome Res13(10)2291-305
Saunders，RD，DM Glover，et al(1989)″PCR amplification of DNA microdissectedfrom a single polytene chromosome band a comparison with conventionalmicrocloning″Nucleic Acids Res 17(22)9027-37
Sebat，J，B Lakshmi，et al(2004)″Large-scale copy number polymorphism in thehuman genome″Science 305(5683)525-8
Sozzi，G，D Conte，et al(2001)″Analysis of circulating tumor DNA in plasma atdiagnosis and during follow-up of lung cancer patients″Cancer Res 61(12)4675-8
Sozzi，G，K Musso，et al(1999)″Detection of microsatellite alterations in plasma DNAof non-small cell lung cancer patients a prospect for early diagnosis″Clin Cancer Res 5(10)2689-92
Tibshirani，R，T Hastie，et al(2002)″Diagnosis of multiple cancer types by shrunkenccntroids of gene cxpression″Proc Natl Acad Sci USA 99(10)6567-72
Trombino，S，M Neri，et al(2005)″Mutations in K-ras codon 12detected in plasmaDNA are not an indicator of disease in patients with non-small cell lung cancer″Clin Chem 51(7)1313-4
Tusher，V G，R Tibshirani，et al(2001)″Significance analysis of microarrays applied tothe ionizing radiation response″Proc Natl Acad Sci USA 98(9)5116-21
Ushijima，T，K Morimura，et al(1997)″Establishment of methylation-sensitive-rcpresentational differencc analysis and isolation of hypo-and hypermethylatedgenomic fragments in mouse liver tumors″Proc Natl Acad Sci USA 94(6)2284-9
Vissers，LEBB de Vries，et al(2003)″Array-based comparative genomichybridization for the genomewide detection of submicroscopic chromosomalabnormalities″Am J Hum Genet 73(6)1261-70
Wang，P，Y Kim，et al(2005)″A method for calling gains and losses in array CGHdata″Biostatistics 6(1) 45-58
Wei，S H，C Balch，et al(2006)″Prognostic DNA methylation biomarkers in ovariancancer″Clin Cancer Res 12(9)2788-94
Wei，S H，C M Chen，et al(2002)″Methylation microarray analysis of late-stageovarian carcinomas distinguishes progression-free survival in patients andidentifies candidate epigenetic markers″Clin Cancer Res 8(7)2246-52
Yakubovskaya，M S，V Spiegelman，et al(1995)″High frequency of K-ras mutations innormal appearing lung tissues and sputum of patients with lung cancer″Int J Cancer 63(6)810-4

Claims (35)

1.用于产生来自患者样品的低甲基化肿瘤DNA甲基化敏感性展示的方法，该方法包括
a)从患者样品中分离DNA；
b)用甲基化特异性酶消化所述DNA；
c)将消化的DNA与接头连接；
d)对连接的DNA进行接头介导的PCR扩增以获得PCR产物；
e)环化所述PCR产物；
f)扩增经环化的PCR产物以产生所述患者DNA的甲基化敏感性展示。
2.权利要求1的方法，其中所述患者样品是血浆或血清。
3.权利要求1的方法，其中所述甲基化特异性酶是HpyCh4-IV、ClaI、AclI或BstBI。
4.权利要求1的方法，其中所述甲基化特异性酶是HpyCh4-IV。
5.权利要求1的方法，其中所述接头介导的PCR扩增进行约5至约15个循环。
6.权利要求1述的方法，其中所述接头介导的PCR扩增进行约10个循环。
7.权利要求1的方法，其中(d)的PCR产物通过沉淀来纯化。
8.权利要求1的方法，其中所述PCR扩增使用生物素化的PCR引物来进行，所述PCR产物利用连接于支持物的生物素结合蛋白进行纯化。
9.权利要求8的方法，其中所述生物素结合蛋白是链霉亲和素。
10.权利要求8的方法，其中所述支持物选自琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。
11.权利要求8的方法，其中使用识别位点部分或全部包含于所述接头序列内的限制酶从所述支持物切下所述PCR产物。
12.权利要求1的方法，其中所述环化的PCR产物是通过滚环扩增进行扩增的。
13.权利要求1的方法，其中所述肿瘤选自卵巢肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤或乳腺肿瘤。
14.权利要求13的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
15.用于产生来自患者样品的低甲基化肿瘤DNA甲基化敏感性展示的方法，该方法包括
a)从患者样品中分离DNA；
b)用HpyCh4-IV消化所述DNA；
c)将消化的DNA与接头连接，从而通过所述接头与经消化DNA的连接产生MluI识别位点；
d)对消化的DNA进行接头介导之PCR扩增以获得PCR产物，其中使用生物素化的引物；
e)使用连接于支持物的生物素结合蛋白纯化经扩增的PCR产物；
f)用MluI消化所述PCR产物；
g)环化经消化的DNA；以及
h)进行滚环扩增以产生所述患者DNA的甲基化敏感性展示。
16.权利要求15的方法，其中所述肿瘤选自卵巢肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤或乳腺肿瘤。
17.权利要求16的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
18.用于鉴定肿瘤特异性低甲基化DNA区域的方法，该方法包括：
a)使用权利要求1-17中任一项所述的方法分别产生肿瘤DNA和正常DNA的甲基化敏感性展示；
b)标记所述肿瘤DNA和所述对照DNA以产生经标记的肿瘤DNA探针和经标记的对照DNA探针；
c)将所述经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于给定甲基化敏感性酶的预测限制片段或其部分；
d)比较来自正常来源之探针和肿瘤来源之探针的信号的相对强度，以鉴定检测差异量之肿瘤DNA探针的寡核苷酸；
e)鉴定步骤d的对应于肿瘤特异性低甲基化区域的杂交寡核苷酸。
19.权利要求18的方法，其中所述肿瘤DNA探针和所述正常DNA探针用两种不同的标记物标记，并且其中经标记探针与同一阵列进行杂交。
20.权利要求18的方法，其中所述DNA样品来自血浆或血清。
21.用于检测受试者中肿瘤存在的方法，该方法包括：
a)使用权利要求1-17中任一项所述的方法产生患者DNA的甲基化敏感性展示；
b)比较在步骤a)的甲基化敏感性展示中扩增DNA的量与通过相同方法产生的正常DNA甲基化敏感性展示中DNA的量；以及
c)将步骤a)的甲基化敏感性展示中扩增DNA的量相对于正常DNA甲基化敏感性展示的增加鉴定为肿瘤存在的指示。
22.权利要求21的方法，其中所述患者DNA展示和所述正常DNA展示被标记并与一个或多个寡核苷酸微阵列杂交。
23.权利要求21的方法，其中所述肿瘤选自卵巢肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤或乳腺肿瘤。
24.权利要求23的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
25.制备用于检测肿瘤DNA和正常DNA混合样品中的低甲基化肿瘤DNA之微阵列的方法，该方法包括：
a)根据权利要求18鉴定肿瘤特异性低甲基化DNA区域；
b)选择肿瘤特异性低甲基化DNA区域以及与所述肿瘤特异性低甲基化DNA区域杂交的至少一种寡核苷酸；以及
c)制备包含所选择寡核苷酸的微阵列。
26.权利要求25的方法，其中所述肿瘤特异性低甲基化DNA区域被选择为在多种肿瘤样品中是低甲基化的。
27.权利要求26的方法，其中所述多种肿瘤样品是来自患有同一类型肿瘤之受试者的样品。
28.权利要求26的方法，其中所述多种肿瘤样品是来自患有不同类型肿瘤之受试者的样品。
29.权利要求25的方法，其中在步骤(b)中选择与所述肿瘤特异性低甲基化DNA区域杂交的两种或更多种不同的寡核苷酸。
30.权利要求25的方法，其中在步骤(b)中选择多种肿瘤特异性低甲基化DNA区域。
31.权利要求25的方法，其中所述微阵列还包含与肿瘤DNA中的非低甲基化DNA区域杂交的一种或多种寡核苷酸对照。
32.权利要求25的制备微阵列的方法，其中所述寡核苷酸被选择用以检测肿瘤中低甲基化的基因座，所述肿瘤选自卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤或这些肿瘤类型的任何组合。
33.权利要求25的制备微阵列的方法，其中所述寡核苷酸被选择用以检测卵巢肿瘤中低甲基化的基因座。
34.微阵列，其通过权利要求25至33中任一项的方法制备。
35.制备用于检测肿瘤DNA和正常DNA之间甲基化差异的微阵列的方法，该方法包括：
a)从患者样品中分离DNA，其中所述患者已被诊断为患有肿瘤；
b)用甲基化特异性酶消化所述DNA；
c)将消化的DNA与接头连接；
d)对所述消化的DNA进行接头介导的PCR扩增，以获得扩增的PCR产物；
e)从所述扩增产物中除去接头和引物DNA；
f)环化所述扩增的PCR产物；
g)对步骤f的产物进行等温滚环扩增以选择性扩增肿瘤DNA，从而产生肿瘤DNA的甲基化敏感性展示；
h)标记所述肿瘤DNA以产生经标记的肿瘤DNA探针；
i)将所述经标记的DNA探针与寡核苷酸阵列杂交，其中所述寡核苷酸阵列对应于所述甲基化特异性酶的预测限制片段；
j)产生所述肿瘤DNA的甲基化图谱，其中所述图谱包含多个基因座的甲基化状态；
k)比较多种正常样品和患者样品的甲基化图谱，以鉴定肿瘤DNA中低甲基化的基因座；以及
l)产生包含设计用以检测肿瘤DNA中低甲基化基因座之寡核苷酸的微阵列。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016095736A1 (zh) * 2014-12-18 2016-06-23 深圳华大基因研究院 一种基于多重pcr的目标区域富集方法和试剂

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9447467B2 (en) 2009-04-21 2016-09-20 Genetic Technologies Limited Methods for obtaining fetal genetic material
WO2011044620A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Genetic Technologies Limited Epigenetic dna enrichment
US20130065776A1 (en) * 2009-12-04 2013-03-14 Qiagen Gmbh Selective enrichment of non-methylated nucleic acids
WO2011082386A1 (en) * 2009-12-31 2011-07-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Specific amplification of fetal dna sequences from a mixed, fetal-maternal source
US9732390B2 (en) * 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
US10706957B2 (en) 2012-09-20 2020-07-07 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of tumor from plasma
BR112015023398A8 (pt) 2013-03-15 2022-08-23 Theranos Inc Métodos para amplificar ácidos nucléicos
US10174383B2 (en) 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample
CA2960859A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Theranos, Inc. Hybrid multi-step nucleic acid amplification
WO2017212428A1 (en) * 2016-06-07 2017-12-14 The Regents Of The University Of California Cell-free dna methylation patterns for disease and condition analysis
US10822648B1 (en) 2016-07-29 2020-11-03 Labrador Diagnostics Llc Hybrid multi-step nucleic acid amplification
US11396679B2 (en) 2019-05-31 2022-07-26 Universal Diagnostics, S.L. Detection of colorectal cancer
US11001898B2 (en) 2019-05-31 2021-05-11 Universal Diagnostics, S.L. Detection of colorectal cancer
WO2020254364A1 (en) 2019-06-17 2020-12-24 Vib Vzw Predicting chronic allograft injury through age-related dna methylation
GB201908624D0 (en) 2019-06-17 2019-07-31 Vib Vzw Predicting age using dna methylation signatures
US11898199B2 (en) 2019-11-11 2024-02-13 Universal Diagnostics, S.A. Detection of colorectal cancer and/or advanced adenomas
WO2021130356A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 Vib Vzw Disease detection in liquid biopsies
WO2022002424A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Universal Diagnostics, S.L. Systems and methods for detection of multiple cancer types
WO2024090805A1 (ko) * 2022-10-27 2024-05-02 이원다이애그노믹스(주) 폐암 진단용 메틸화 마커 및 이의 조합

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002086163A1 (en) * 2001-04-20 2002-10-31 Karolinska Innovations Ab Methods for high throughput genome analysis using restriction site tagged microarrays
US20060172294A1 (en) * 2002-06-06 2006-08-03 Arturas Petronis Detection of epigenetic abnormalities and diagnostic method based thereon
US7459274B2 (en) * 2004-03-02 2008-12-02 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation by whole genome amplification
US7932027B2 (en) * 2005-02-16 2011-04-26 Epigenomics Ag Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid
US20060292585A1 (en) * 2005-06-24 2006-12-28 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016095736A1 (zh) * 2014-12-18 2016-06-23 深圳华大基因研究院 一种基于多重pcr的目标区域富集方法和试剂
CN107002080A (zh) * 2014-12-18 2017-08-01 深圳华大基因研究院 一种基于多重pcr的目标区域富集方法和试剂
US10435736B2 (en) 2014-12-18 2019-10-08 Mgi Tech Co., Ltd. Target region enrichment method based on multiplex PCR, and reagent
CN107002080B (zh) * 2014-12-18 2020-11-06 深圳华大智造科技股份有限公司 一种基于多重pcr的目标区域富集方法和试剂

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