CN105018585B - 一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒。该试剂盒含有分别检测DPP4、SCG5和CA12基因的表达量的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID NO.1～6所示。本发明通过检测3个基因的表达(DPP4、SCG5和CA12)，通过贝叶斯模型平均法(BMA)对甲状腺良、恶性肿瘤进行分类，该基因组合具有较高的准确度(94.3％)，相较于基因芯片具有成本低廉、操作简便、易于规范化、临床可应用性强等特点。

Description

一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒。

背景技术

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，约占内分泌系统肿瘤的86.8％，且恶性甲状腺结节的发病率逐年上升，其上升幅度居于所有癌症之首。由于甲状腺结节大部分为良性病变，恶性结节仅占约5-7.7％，且良、恶性结节治疗方法及愈后不同，因此临床诊断的首要目的是术前确定甲状腺结节的良、恶性，制定合理的个性化治疗方案，以减少不必要的甲状腺切除手术所造成的患者额外的经济负担及术后并发症，合理配置医疗资源，提高患者生活质量。

目前临床用于诊断良、恶性甲状腺结节的方法主要有超声、计算机断层成像(CT)、核磁共振成像(MRI)及超声引导下的甲状腺细针穿刺细胞学检查等。细针穿刺细胞学检查是目前评估甲状腺结节最为准确、有效和经济的方法。但是大量研究表明，约15-30％的细针穿刺细胞学检查结果报告为“无法诊断”且即使复查细针穿刺细胞学检查也有20-58％的结果仍然报告为“无法诊断”。该部分病人在随后进行的甲状腺切除手术后，对切除组织进行病理分析，甲状腺结节的良性率仍占70～80％，也就是说大部分病人因无法得到较为准确的术前诊断而进行了不必要的探查性手术。这不仅增加了该部分病人术后各种并发症的风险，造成我国原本紧张的医疗资源的浪费，更增添了相当一部分病人额外的经济负担。此外，由于该诊断方法对于细针穿刺操作医师以及病理读片医师均有较高要求等，均限制其在良恶性甲状腺结节术前诊断中的常规应用。因此，临床需要更为简便、经济、准确的用于术前诊断良、恶性甲状腺结节的实验室检测方法。

随着生物信息学和基因芯片技术的发展，甲状腺细针穿刺物或组织样本通过基因表达芯片检测技术以及生物信息学分析以术前预测良、恶性甲状腺结节已具有较好的预测性能。Alexande等通过基因表达谱差异，鉴定出167个差异基因，并采用支持向量机的方法对细胞学鉴定结果可疑的细针穿刺样本进行预测，其预测敏感性可达92％。但通常良、恶性甲状腺结节间差异表达的基因至少有几十甚至上百个，且基因芯片平台测试具有成本高、操作复杂、实验数据可重复性差等特点。若将该技术应用与临床常规对于甲状腺结节良恶性的判别诊断，不仅大大增加了病人不必要的经济负担，且其较为复杂的实验步骤及芯片平台的建立不便于临床实验室日常检测工作的开展。因此，临床工作者急需简便、高效、易于标准化且有较好预测性能的甲状腺术前诊断试剂盒以协助良、恶性甲状腺结节的鉴别诊断。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对目前甲状腺肿瘤术前预测良恶性准确率较低的缺陷，提供一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒，该试剂盒即能以较高的准确度预测甲状腺肿瘤的良恶性。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒，它含有分别检测DPP4、SCG5和CA12基因的表达量的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

其中，所述的试剂盒较佳的还含有检测内参基因GAPDH表达量的引物，该引物的序列较佳的分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

其中，所述的试剂盒较佳的还含有PCR反应液。所述的PCR反应液更佳的含荧光染料SYBR Green、Taq酶、dNTP和镁离子。

其中，所述的引物可以是粉末，也可以是溶液。较佳的，所述的引物的浓度可以是5-15μM，更佳的是10μM。

其中，所述的试剂盒较佳的还含有抽提RNA的试剂。其为常规的抽提RNA的试剂。

其中，所述的试剂盒较佳的还含有反转录试剂。其为常规的反转录试剂。

其中，所述的试剂盒较佳的还含有双蒸水。

其中，所述的试剂盒较佳的还含有使用说明书。

本发明的一较佳实施例是：一种预测甲状腺肿瘤良恶性的荧光定量PCR试剂盒，其含有：

序列分别如SEQ ID NO.1-8所示的引物，和

含荧光染料SYBR Green、Taq酶、dNTP和镁离子的PCR反应液。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：与现有技术相比，首先相较于其他大量利用生物信息学以及基因表达谱分析甲状腺良、恶性肿瘤术前诊断的研究方法，本发明筛选出了一个3个基因的组合(DPP4、SCG5和CA12)，通过贝叶斯模型平均法(BMA)对甲状腺良、恶性肿瘤进行分类，该基因组合具有较高的预测性能，克服了临床常规对于甲状腺组织细针穿刺细胞学检测结果“无法诊断”以及结果判断时对于病理科医生经验技术较高且判读具有一定主观性等不足，且通过3个独立数据库以及甲状腺肿瘤标本实验验证，其预测性能具有较好的鲁棒性以及广泛适用性。其次，本发明提供了一种实时荧光定量PCR术前诊断良恶性甲状腺肿瘤检测试剂盒，由于该试剂盒仅通过荧光定量PCR方法检测3个基因相对于内参基因的表达量即能以较高的准确度(94.3％)预测甲状腺肿瘤的性质，其相较于基因芯片具有成本低廉、操作简便、易于规范化、临床可应用性强等特点。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

利用生物信息学方法，以机器学习理论为基础，通过对公共数据库(GeneExpression Omnibus,GEO)中良、恶性甲状腺肿瘤基因表达芯片独立数据集的筛选分析，利用迭代贝叶斯模型平均法(iterativeBMA)筛选少量基因组合，并在GEO数据库中另外3个独立数据集进行验证，最终建立以实时荧光定量PCR(QPCR)方法检测少量基因组合，通过贝叶斯平均模型以达到预测良恶性甲状腺肿瘤的目的。

⑴采用两步法进行肿瘤标志基因组合的筛选：芯片数据的线性模型(limma)+迭代贝叶斯模型平均法；

首先采用针对芯片数据的线性模型(limma)，以GEO公共数据库中GSE29315作为训练集，对其中71个良、恶性甲状腺肿瘤差异基因进行筛选。该方法属于监督分类的一种，根据表型协变量鉴定组间差异表达，并在鉴定差异表达基因前对表达值进行非特异性过滤，以提高差异表达基因的检出率和功效。通过limma方法，以在良、恶性组中表达差异至少相差2倍且两组之间差异P<0.01为标准，共找出GSE29315数据库中(共71个样本，其中40个良性，31个恶性肿瘤标本)有43个探针所对应的共37个基因其表达水平在良、恶性甲状腺肿瘤中存在显著差异。

但该方法所选择出的差异基因数量仍然较多，不便于临床常规检测。因此，采用iterativeBMA方法进一步筛选差异基因。该方法的优点有：1)通过计算所有可能模型的平均后验概率作为权重，充分考虑了模型的不确定性；2)高效的运算效率；3)是一种多变量特征选择方法，能同时考虑不同基因之间的相关性，以减少最终所选择出的肿瘤标志基因的数量。

通过两步法进行的肿瘤标志基因组合的筛选，本发明选择出基于三个基因的组合以预测甲状腺癌，这三个基因分别是DPP4(dipeptidyl-peptidase4),SCG5(secretograninV)和CA12(carbonic anhydrase XII)。

⑵对芯片数据处理以消除不同实验室间结果差异

由于不同实验室进行表达谱芯片检测时所采用的芯片平台以及表达芯片种类及批号不同，因此采取必要的方法对训练集和测试集中的芯片数据进行归一化处理，使得由训练集建立的预测模型在测试集中具有可验证性，是非常有必要的。通过以下公式，将训练集和测试集中基因芯片表达数据标准化至0-1之间：

N_调整＝(N–表达芯片中最小值)/(表达芯片中最大值–表达芯片中最小值)

N_调整：最终用于训练集以及测试集中进行计算的调整后基因表达量；

N：芯片数据集中该基因的原始表达量。

⑶三个基因组合在甲状腺良恶性肿瘤中预测效果的验证

DPP4、SCG5和CA12三个基因在甲状腺良恶性肿瘤中预测效果的验证：

首先，采用留一法对训练集(GSE29315)中71个组织芯片标本进行分类预测，输入变量即为调整后的DPP4、SCG5和CA12三个基因的表达量。通过贝叶斯模型平均法(BMA)所建立的模型，对于每个测试样本可以得出一个0-1之间的预测概率。本发明将0定义为恶性甲状腺肿瘤，1定义为良性甲状腺肿瘤。也就是说，对于每一个测试样本，如果计算出的预测概率<0.5，分类器会将其判定为恶性；相反若计算出的预测概率>0.5，分类器则将其判定为良性甲状腺肿瘤。最终，对于训练集(GSE29315)BMA分类器准确分类了40个良性标本中的36个以及31个恶性标本中的23个。其预测准确率达83.1％(敏感性85.2％，特异性81.8)。

其次，在公共数据库GEO中选择了3个独立的甲状腺癌基因芯片表达谱数据，以进一步对该3个基因的预测性能进行进一步验证。这3个独立数据库分别是：GSE33630(105个标本),GSE27155(99个标本)以及GSE3678(14个标本)。通过基于训练集所建立的模型，这3个独立数据集的预测结果如下：

GSE33630(标本数＝105)

敏感性：91.7％；特异性：77.8％；准确率：85.7％。

GSE27155(标本数＝99)

敏感性:79.5％；特异性:76.2％；准确率:78.8％。

GSE3678(标本数＝14)

敏感性:71.4％；特异性:100％；准确率:85.7％。

实施例2

1.1 标本收集

收集上海仁济医院2012年-2013年经门诊检查确诊的甲状腺结节肿瘤患者70例，其中女性48人(年龄20-67岁)，男性22人(年龄23-74岁)。这些患者经甲状腺手术切除后，一部分标本用于HE染色以进行临床病理学诊断(金标准)，另一部分保留至RNA保存液RNAlater(美国Invitrogen公司)中存放于-80℃。经临床病理科诊断，70例样本中有39例甲状腺良性肿瘤(20例滤泡性腺瘤，11例桥本甲状腺炎，8例结节性甲状腺增生)，31例恶性甲状腺肿瘤(29例乳头状甲状腺癌，1例滤泡状甲状腺癌，1例未分化癌)。抽提RNA采用TRIZOL方法(美国Invitrogen公司)，按照以下步骤进行：

(1)取100-150μg组织标本在低温下经组织研磨器研磨均匀后用焦碳酸二乙酯(DEPC)水洗涤2次；

(2)将1ml Trizole加到研磨均匀的样品中，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，室温静置3～5min。

(3)加200μL氯仿，上下颠倒十次，充分混匀，静置5min。

(4)用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，每1mL TRIzol起始量加入等体积异丙醇，混匀。

(5)-20℃沉淀30min。

(6)4℃12,000rcf离心10min，小心移出上清。

(7)沉淀中加入1mL75％乙醇(DEPC水配制、预冷)，4℃12,000rcf离心10min。

(8)去上清，打开盖子静置5～10min，稍微晾干，RNA略显透明，加入30～50μL去RNA酶水，充分溶解(可于55℃1,400rpm振荡温浴5min)。

(9)常温2～3,000rcf短促离心，收集RNA溶液于管底，定量。

(10)紫外分光光度计测定260、280nm波长的吸光度，评估RNA的质量和浓度，要求OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～1.8之间。

1.2 反转录PCR(RT–PCR)

采用美国thermo公司RevertAid RT试剂盒，进行反转录PCR。

在冰上配制RT反应液，采用25μl体系。

75℃5min,冰上退火5min，离心2～3s

42℃1h，70℃10min，冰上退火得cDNA。

1.3 荧光定量PCR

(1)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制需在冰上进行)，引物由invitrogen(上海)公司合成；QPCR反应试剂为Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒。引物序列如下：

DPP4：

上游引物：CTC CTT CTC TGA ACG CTC(SEQ ID NO.1)，

下游引物：TCA TCT GTG CCT TTG TTC(SEQ ID NO.2)；

SCG5：

上游引物：GAC TTC AGC ATT TGG GTC C(SEQ ID NO.3)，

下游引物：ATT TGG AGG GTC TGG GTA C(SEQ ID NO.4)；

CA12：

上游引物：TGC TCC TGC TGG TGA TCT(SEQ ID NO.5)，

下游引物：TGG AGG ATG TCA CTG TGC(SEQ ID NO.6)；

GAPDH：

上游引物：TGA CAA CTT TGG TAT CGT GGA AGG(SEQ ID NO.7)，

下游引物：AGG CAG GGA TGA TGT TCT GGA G(SEQ ID NO.8)。

(2)反应在ABI7500上进行，反应条件如下：

反应阶段1：50℃2min95℃10min；

反应阶段2：PCR反应95℃15s，60℃60s，40个循环；

溶解曲线阶段。

1.4 实验结果分析

每个循环结束后，由LightCycler系统软件采集荧光信号，监测每个循环的荧光量并计算出Ct值。以GAPDH基因作为内参基因，计算每一个标本中3个基因的2^-ΔCt×100(ΔCt＝Ct_目的基因–Ct _GAPDH)的值作为输入变量。经计算后70个样本基因表达量为：

经R语言(版本3.16.2)分析：

计算结果：

*注：0代表恶性肿瘤，1代表良性肿瘤。

该3个基因组合能较好地区分良恶性甲状腺肿瘤，其结果如下：

敏感性：93.5％；特异性：94.9％；准确率：94.3％。

“参考方法”是指手术后肿瘤组织病理学诊断结果，是判断肿瘤良恶性金标准。

在70个甲状腺肿瘤组织标本中进行DPP4、SCG5和CA12三个基因预测性能的验证。通过实时荧光定量PCR方法，检测DPP4、SCG5和CA12三个基因的表达量，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，计算2^-ΔCt×100(ΔCt＝Ct_目的基因–Ct_GAPDH)的值作为输入变量。QPCR的引物设计在跨两个外显子的接头区或跨内含子以避免提取RNA时残留基因组的干扰。由于QPCR表达值和芯片数据表达值的数据范围存在较大差异，因此采用留一法对BMA模型(参考文献：Hoeting J A,Madigan D,Raftery A E,et al.Bayesian modelaveraging:a tutorial[J].Statistical science,1999:382-401)进行重适应。通过QPCR检测该3个基因组合的表达量，以BMA模型计算预测概率，该70个肿瘤标本中准确预测出31个恶性标本中的29例，以及39例良性标本中的37例，其对甲状腺肿瘤预测的敏感性达93.5％，特异性94.96％，准确率94.3％。

对比例1

1.DPP4，SCG5和CA12三个基因组合与仅采用其中两个基因在甲状腺肿瘤预测中的差别

以敏感性、特异性及准确度比较DPP4，SCG5和CA12三个基因组合和其中任意两个基因组合对于甲状腺肿瘤的预测效果如下：

本比对例中，对于三个基因组合和其中任意两个基因组合在公共数据库中预测甲状腺肿瘤的比较方法参照实施例1，结果如下：

三个基因组合和其中任意两个基因组合在仁济医院70个甲状腺肿瘤标本中的预测结果比较参照实施例2，结果如下：

由于我国甲状腺结节患病率达到12.8％～18.6％且有逐年上升的趋势，因此恶性肿瘤其诊断敏感性的指标较特异性更为重要，即使预测敏感率有轻微地提高也可大大增加恶行肿瘤患者的检出率；其次，预测肿瘤的分子标志物及预测模型其鲁棒性，即抗干扰能力较为关键。即在不同实验平台，不同实验操作人员甚至不同检测方法中均有较高的预测性能。从以上对比结果可见DPP4，SCG5和CA12三个基因组合在敏感性及稳定性中均显著高于其中任两个基因组合。

2.DPP4，SCG5和CA12三个基因组合与目前公开发表预测良恶性甲状腺肿瘤分子标志物的比较

2.1 大多数文献中报道的甲状腺肿瘤预测模型均含有较多的分子标志基因，如：Alexander等(参见文献：Alexander E K,Kennedy G C,Baloch Z W,et al.Preoperativediagnosis of benign thyroid nodules with indeterminate cytology[J].NewEngland Journal of Medicine,2012,367(8):705-715.)在《新英格兰》杂志中发表利用167个分子标记物建立模型预测甲状腺肿瘤的良恶性，其预测敏感性92％，特异性52％。该方法与本发明建立的3个基因预测模型具有相似的敏感性，但特异性较低。另外，该报导采用了167个基因作为分子标记物，其检测费用远高于本发明3个基因的检测费用。

2.2 Prasad等(参见文献：Prasad N B,Kowalski J,Tsai H L,et al.Three-genemolecular diagnostic model for thyroid cancer[J].Thyroid,2012,22(3):275-284.)同样筛选出3个基因(HMGA2，MRC2，SFN)建立模型以预测甲状腺肿瘤的良恶性，但其预测敏感性仅80％，特异性100％。此外，该模型未在其他独立数据库中进行验证，无法证明该基因组合的稳定性。

实施例3 预测甲状腺肿瘤良恶性的荧光定量PCR试剂盒

制备一预测甲状腺肿瘤良恶性的荧光定量PCR试剂盒，它含有：

随机挑选100人构成测试组，其中包括未知是否患恶性甲状腺肿瘤病人、未知是否患良性甲状腺肿瘤病人。

经超声引导下取待检测对象的甲状腺结节细针穿刺样本，留至RNA保存液RNAlater中存放于-80℃。采用TRIZOL方法抽提RNA。

1.1 抽提RNA如实施例2采用TRIZOL方法。

1.2 反转录PCR(RT–PCR)

在冰上配制RT反应液，采用25μl体系。

以上总体积为11μl，37℃30min

42℃1h，70℃10min，冰上退火得cDNA。

1.3 荧光定量PCR

(1)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制需在冰上进行)，引物序列如下：

DPP4：

上游引物：CTC CTT CTC TGA ACG CTC，

下游引物：TCA TCT GTG CCT TTG TTC；

SCG5：

上游引物：GAC TTC AGC ATT TGG GTC C，

下游引物：ATT TGG AGG GTC TGG GTA C；

CA12：

上游引物：TGC TCC TGC TGG TGA TCT，

下游引物：TGG AGG ATG TCA CTG TGC；

GAPDH：

上游引物：TGA CAA CTT TGG TAT CGT GGA AGG，

下游引物：AGG CAG GGA TGA TGT TCT GGA G。

(2)反应在ABI7500上进行，反应条件如下：

反应阶段1：50℃2min95℃10min；

反应阶段2：PCR反应95℃15s，60℃60s，40cycle；

溶解曲线阶段。

1.4 如实施例2的分析方法，使用所述3个基因组合区分良恶性甲状腺肿瘤，并对病人的后续治疗进行随访，结果如下：

Claims (10)

1.一种预测甲状腺肿瘤良恶性的试剂盒，其特征在于，其含有分别检测DPP4、SCG5和CA12基因的表达量的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有检测内参基因GAPDH表达量的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，每条所述的引物的浓度为5-15μM。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每条所述的引物的浓度为10μM。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有PCR反应试剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂含荧光染料SYBRGreen、Taq酶、dNTP和镁离子。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有抽提RNA的试剂。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有反转录试剂。

9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有双蒸水。

10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有使用说明书。