CN107435062A - 甄别肺部微小结节良恶性的外周血基因标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甄别肺部微小结节良恶性的外周血基因标志物，所述基因标志物包含：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的微小结节肺癌特征基因序列，该基因序列在微小结节肺癌患者与非微小结节肺癌患者的外周血中差异表达。本发明还公开了上述基因标志物在制备微小结节肺癌早期筛查产品中的用途。本发明的基因标志物，用于微小结节肺癌的早期筛查，敏感性高、特异性强，而且是以临床上最易采集的外周血为检测样本，采样方式无创、简便，检查依从性高，特别适于配合CT等影像学检查方式用于大规模人群的超早期肺癌筛查，应用前景广阔。

Description

甄别肺部微小结节良恶性的外周血基因标志物及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种甄别肺部微小结节良恶性的外周血基因标志物及其用途。
背景技术
肺癌是我国城市人口癌症死亡的首要原因，据2011年卫生部统计年鉴数据，2010年我国因肺癌死亡率为46.46人/10万人，居恶性肿瘤死亡率的第一位，几乎相当于肝癌、胃癌和大肠癌死亡率的总和。肺癌的预后与确诊时的临床分期密切相关，其中，对超早期的0期周围型原位肺癌的治疗效果最好，患者术后5年生存率高达90％；Ia期肺癌患者术后5年生存率为61％，而II-IV期的病人总的5年生存率则从34％下降到5％以下。因此提高肺癌治愈率、降低死亡率的关键是早期发现，特别是实现0期周围型原位肺癌的超早期发现对于提高肺癌治愈率具有重要的价值。
当前采用低剂量螺旋CT(LDCT)等高分辨影像学检查方法对高危人群进行检查是肺癌早期筛查的一种主要手段。在大规模的肺癌早期筛查实践中发现了大量的微小结节(micro-nodule，结节尺寸小于10mm)患者，这些微小结节可能是肺癌良性病变如炎症等，也可能是包含恶性癌细胞的微小结节肺癌(约占30％-40％)，其中，大多数微小结节肺癌都属于超早期的周围型原位肺癌(肿瘤TNM分期为0期)以及部分Ia期肺癌，如果能及早诊断可以取得很好的治疗效果。但是目前临床上对肺部微小结节良、恶性质的判断非常困难，这主要是由于微小结节的尺寸小于10mm，难以通过细针穿刺等方式进行活组织取样和病理检查，即使进行PET-CT检查，得到的结果诊断价值也非常有限。其它肺癌相关的血清肿瘤标志物检测，如癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)、细胞角蛋白19片段等，对于中晚期肺癌的辅助诊断有一定的参考价值，但是对早期肺癌，特别是对超早期的周围型原位肺癌(0期)和Ia期肺癌的诊断价值很小。此外，常规的肿瘤血清蛋白标志物通常检测灵敏度不高，如CEA、NSE对中晚期肺癌的检测灵敏度(阳性检出率)一般也仅为30％左右，而且血清蛋白标志物对肺癌检测的特异性也不好，肺炎等其它良性病变也会引起蛋白标志物浓度异常，导致假阳性的检测结果。因此，为了对CT影像学检查发现的微小结节的良、恶性进行准确鉴别，及早发现超早期的微小结节肺癌，需要一种可以准确甄别微小结节良恶性的检测技术和产品。
血液是人体最大的组织器官，而血细胞是为数不多的，可以同几乎所有组织细胞进行信息交流的细胞种类。如果体内组织器官发生损伤、炎症以及肿瘤等恶性疾病时，病变组织细胞周围的微环境会发生一系列的特异性改变。当血液流经各组织器官时，病变组织细胞的微环境与血细胞进行信息交换，而血细胞会直接或间接地响应这些改变，发生相应的基因表达变化，参与免疫系统等全身各系统的信息传递和交换。血细胞的这种基因表达变化远早于机体产生明显的体征变化，而且包含一些疾病特征性的基因表达变化。因此，通过紧密监测血细胞基因的表达谱，可以敏感地捕捉到体内肿瘤等恶性疾病早期发生的分子信息，筛选出疾病特征性的基因表达信号(标志物)，为疾病早期检测、监测提供可靠证据。而且外周血基因表达检测作为一种简便、无创性的检查方式，受检者易于接受，检查依从性高，对恶性肿瘤的早期筛查/诊断具有非常大的应用价值。
发明内容
本发明要解决目前临床上缺乏准确鉴别肺部微小结节良恶性的生物标志物的技术问题，提供一种甄别肺部微小结节良恶性的外周血基因标志物，该标志物可以比较准确的判别恶性微小结节，发现超早期的微小结节肺癌，具有较高的检测敏感性和特异性，而且仅需要采集2ml外周静脉血进行检测，检测过程简便，特别适于配合CT等影像学检查方式用于大规模人群的超早期肺癌筛查。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种包含多个多核苷酸或其片段的组合产品，所述多个多核苷酸在微小结节肺癌患者与非微小结节肺癌患者的外周血中差异表达，该多个多核苷酸的序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的ATP5C1、ALAS1、ANAPC16、UBE2E1、ATP6V1D和SRRM2这6个微小结节肺癌特征基因序列。
所述非微小结节肺癌患者包括良性微小结节患者及健康人。
在本发明的另一方面，提供了一种组合物，其包含用于检测在微小结节肺癌患者与非微小结节肺癌患者外周血中基因差异表达的引物和/或探针，所述基因的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列。
在本发明的另一方面，还提供了上述包含多个多核苷酸或其片段的组合产品的用途，用于制备鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品。
优选的，所述鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包括：用实时定量PCR、RNA测序或基因芯片检测微小结节肺癌的产品。
所述用实时定量PCR鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包含特异扩增SEQ ID NO.1～SEQID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列的引物。
所述用基因芯片检测鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包含：与SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示微小结节肺癌特征基因序列杂交的探针。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于鉴别诊断或筛查超早期肺癌的检测试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列的引物和/或探针。该试剂盒还包含特异性针对GAPDH内参基因序列的引物。
优选的，所述试剂盒还包含与PCR扩增片段特异性结合的荧光探针或非特异性结合的SYBR Green染料。
优选的，所述引物的序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.20所示(包括内参基因的引物)；所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.27所示(包括内参基因的探针)。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于鉴别诊断或筛查超早期肺癌的检测芯片，所述芯片包含与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列杂交的探针。
利用本发明的试剂盒或检测芯片，可以检测受检者外周血中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列的表达情况，然后根据表达上调或下调的信息，输入微小结节肺癌判别模型即可得出受检者的微小结节为恶性肺癌的风险值，从而实现对肺癌的早期筛查和诊断。
本发明的基因标志物，能甄别肺部微小结节的良、恶性，对超早期微小结节肺癌的检测敏感性高、特异性强，且由于是以临床上最易采集的外周血为检测样本，采样方式无创，检测方便，适用于肺癌的大规模人群筛查和早期诊断，促进肺癌早期发现，提高肺癌治愈率，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例2利用筛选出的6个微小结节肺癌特征基因组合(6-gene Panel)对微小结节肺癌(LungCa)、肺部良性结节(Benign)和健康对照(Control)样本进行甄别的箱线图(Box-whisker Plot)，以及微小结节肺癌判别模型对不同分组样本(Training Set和TestSet)和不同尺寸微小结节肺癌的预测结果列表图；
图2是本发明实施例2利用筛选出的6个微小结节特征基因和判别模型对微小结节肺癌诊断的ROC AUC图。
具体实施方式
针对目前临床上难以对肺部微小结节(结节尺寸小于10mm)进行良、恶性甄别的技术空白，本发明提供了一种用于无创性甄别肺部微小结节良、恶性的外周血基因标志物。本发明以外周血基因表达谱定量检测为基础，通过定量分析微小结节患者(包括肺部良性病变和微小结节肺癌患者，所有患者的结节尺寸均小于或等于10mm)、以及无肺部病变的健康人群的外周血总RNA的基因表达差异，基于逻辑回归统计学方法在外周血基因表达谱中筛选出6个恶性肺小结节(早期肺癌)特征性的差异表达基因(相比肺部良性病变和健康对照发生特异性的基因表达上调或下调)，即外周血中微小结节肺癌特征性的基因表达信号(生物标志物)，并且构建相应的微小结节肺癌预测模型。然后，采用荧光定量RT-PCR、基因表达谱芯片或RNA测序技术定量检测受检者外周血中该6个微小结节肺癌基因标志物的相对表达量，结合微小结节肺癌判别模型对肺部微小结节进行良恶性甄别，从而判别受检者是否患有微小结节肺癌，实现肺癌早期发现。
实施例1微小结节肺癌的外周血特征基因标志物筛选
肺癌特征基因的筛选包括以下步骤：
1)收集40例经手术和病理检查确诊为肺癌的恶性微小结节患者、16例良性微小结节患者(肺部良性病变)、以及28例无肺部病变的健康人的外周血样本。所有微小结节患者经CT检查确认结节尺寸均小于或等于10mm，每例样本采集2-3ml外周血。
2)采用PAXgene Blood RNA Kit抽提试剂盒提取上述样本的总RNA，用AgilentBioanalyzer2100生物分析仪检测RNA样本的片段完整度(RIN)，用Nano1000微量紫外分光光度仪检测RNA样本的纯度。所有RNA样本必须符合以下质控条件：RNA产率大于2微克，28S/18S峰的比值大于1，RIN值大于7，260nm/280nm的吸光度比值大于1.8。
3)采用Affymetrix Gene Profiling Array U133Plus2芯片(人类全基因表达谱芯片)检测上述外周血总RNA样本，获得样本的外周血基因表达谱数据，然后采用AffymetrixExpression Console软件中的MAS5方法对外周血基因表达谱数据进行归一化(Normalization)处理，消除表达谱芯片检测过程中可能产生的系统误差，获得可以统一比较的外周血基因表达谱数据。
4)剔除外周血基因表达谱中过高和过低的基因表达信号，选择在所有样本中均有适度表达(信号值在100-10000之间)的基因进行T检验分析，比较微小结节肺癌与良性结节、健康人群的外周血基因表达差异，将统计学P值小于0.05、基因表达倍数变化在1.1倍以上的基因作为候选基因进行后续分析。
5)分析上述侯选基因与微小结节肺癌的相关性，按基因与微小结节肺癌的相关性系数高低进行排序，挑选出一组与微小结节肺癌具有高度相关性的基因队列(基因队列I)；此外，将剩余基因与队列I中的基因进行相关性分析，挑选出与基因队列I具有高度相关性的另一组基因队列(基因队列II)。然后将基因队列I和基因队列II中的基因两两配对，组成一系列侯选基因组合。
6)用逻辑回归统计分析方法评估每种侯选基因组合对微小结节肺癌的甄别作用，计算每种侯选基因组合的受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)和曲线下面积值(Area Under Curve，AUC)，筛选出对微小结节肺癌具有良好甄别能力的一系列基因组合。
7)利用实时荧光定量PCR方法对筛选出的系列基因组合进行验证，保留在定量PCR和基因表达谱芯片检测中表达变化一致的基因作为微小结节肺癌的外周血特征基因，筛选出ATP5C1、ALAS1、ANAPC16、UBE2E1、ATP6V1D和SRRM2等6个微小结节肺癌特征基因，该6个微小结节肺癌特征基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。
8)用逻辑回归统计分析方法评估上述6个基因构成的基因组合对微小结节肺癌的诊断作用，计算该基因组合的ROC AUC，建立以下所示的微小结节肺癌判别模型：
其中，P为患微小结节肺癌(恶性肺小结节)的风险值；b0至b6分别为相应的逻辑回归模型参数；ΔCt1至ΔCt6分别为6个微小结节肺癌基因标志物与内参基因的定量PCR循环数Ct值的差值；X为逻辑回归对数似然比(log likelihood ratio)。
实施例2利用筛选出的微小结节肺癌特征基因标志物检测微小结节肺癌
1.方法步骤：
1)待检测样本外周血样品的收集：使用QIAGEN公司的BD PAXgeneRNA采血管收集病人外周血样品；
2)待检测样本外周血样品中总RNA的提取纯化：使用QIAGEN公司的PAXgeneBlood RNAKit提取纯化外周血中的总RNA，并用Agilent BioAnalyzer 2100型微量电泳分析仪鉴定提取的总RNA片段完整性和产量。用Nano1000微量紫外分光光度仪检测RNA样本的纯度；
3)反转录反应：使用Life Techonolgy公司的High-Capacity cDNA Reverse Transcriptionkit反转录试剂盒，使用总RNA为模板，以Olig(dT)为逆转录引物，进行逆转录反应合成cDNA。
4)荧光定量RT-PCR检测：根据6个基因标志物(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)及内参基因GAPDH的相关序列，设计特异性引物SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.20(其中，引物SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8用于特异性扩增SEQ ID NO.1所示的ATP5C1基因标志物，引物SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10用于特异性扩增SEQ ID NO.2所示的ALAS1基因标志物，引物SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12用于特异性扩增SEQ ID NO.3所示的ANAPC16基因标志物，引物SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14用于特异性扩增SEQ ID NO.4所示的UBE2E1基因标志物，引物SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16用于特异性扩增SEQ ID NO.5所示的ATP6V1D基因标志物，引物SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18用于特异性扩增SEQ ID NO.6所示的SRRM2基因标志物，引物SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20用于特异性扩增内参基因GAPDH)，以该SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.20为引物，以SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.27为荧光探针(其中SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.26分别为SEQID NO.1～SEQ ID NO.6特征基因序列的探针序列，SEQ ID NO.27是内参基因GAPDH的探针序列)或者采用可与PCR扩增片段非特异性结合的SYBR Green染料，利用反转录获得的cDNA作为扩增模板，进行实时荧光定量RT-PCR反应，利用GAPDH基因作为内参基因，获得该6个基因标志物在外周血样本中的mRNA相对含量。下述表1所列为荧光定量PCR反应体系。
表1荧光定量PCR反应体系
试剂 浓度 体积
微小结节肺癌特征基因引物 800nM 2μL
微小结节肺癌特征基因荧光探针 200nM 0.5μL
内参基因GAPDH引物 800nM 2μL
内参基因GAPDH荧光探针 200nM 0.5μL
2X PCR MasterMix 12.5μL
cDNA模板 2.67ng/μL 7.5μL
总计 25μL
5)待检测样本结果的诊断：根据实时荧光定量PCR检测的ATP5C1、ALAS1、ANAPC16、UBE2E1、ATP6V1D和SRRM2这6个基因标志物在外周血样本中的mRNA相对含量，通过实施例1建立的微小结节肺癌判别模型，计算样本的逻辑回归对数似然比X值，X值≥0的检测结果判定为阳性，即恶性肺小结节(微小结节肺癌)；X值<0的检测结果判定为阴性，即良性微小结节。
2.结果
共采集了72例恶性微小结节肺癌、42例良性微小结节(包括肺炎、肺间质纤维组织增生等肺部良性病变)、34例健康人(Control)的外周血样本，用荧光定量RT-PCR检测了外周血中微小结节肺癌6个基因标志物以及内参基因GAPDH的相对表达量，计算每个样本的逻辑回归对数似然比X值，X值≥0的视为阳性检测结果，反之视为阴性检测结果。将检测结果与病理检测结果比较，得出本发明6个基因标志物可以较好的甄别恶性肺小结节(微小结节肺癌)和良性微小结节，对微小结节肺癌检测的灵敏度、特异性均超过70％，具体检测结果见图1-2和下表2、表3所示。
表2对恶性微小结节(微小结节肺癌)预测的灵敏度、特异性和ROC AUC值
表3对不同尺寸微小结节肺癌的预测准确性
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.包含多个多核苷酸或其片段的组合产品，所述多个多核苷酸在微小结节肺癌患者与非微小结节肺癌患者的外周血中差异表达，该多个多核苷酸的序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的微小结节肺癌特征基因序列。
2.组合物，其包含用于检测在微小结节肺癌患者与非微小结节肺癌患者外周血中基因差异表达的引物和/或探针，所述基因的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列。
3.权利要求1所述包含多个多核苷酸或其片段的组合产品的用途，用于制备鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包括：用实时定量PCR、RNA测序或基因芯片检测微小结节肺癌的产品。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包含特异扩增SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列的引物。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包含：与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列杂交的探针。
7.一种用于鉴别诊断或筛查超早期肺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列的引物和/或探针。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物的序列包括SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的序列包括SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列。
10.一种用于鉴别诊断或筛查超早期肺癌的检测芯片，其特征在于，所述芯片包含与SEQID NO.1～SEQ ID NO.6所示微小结节肺癌特征基因序列杂交的探针。
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