CN101307361A - 一种Solexa技术鉴定肺癌病人血清中微小核糖核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种Solexa技术鉴定肺癌病人血清中微小核糖核酸的方法属于生物医药技术领域。具体涉及一种测定肺癌病人血清中微小核糖核酸表达的Solexa技术，以及Solexa技术在肺癌的早期诊断、疗效评价和药效评价等临床诊断和治疗方面的应用。本发明包括利用Solexa测序方法测定肺癌受试者的血清微小核糖核酸的含量。所述评价受试者的生理和/或病理状态具体是对受试者进行肺癌疾病的诊断；测定受试者给予待测物后的生理和/或病理状态。Solexa测序方法具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于肺癌普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高肺癌的临床检出率，成为肺癌早期诊断疾病的有效手段。
Description
一、技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体涉及一种测定肺癌病人血清中微小核糖核酸表达的Solexa技术，以及Solexa技术在肺癌的早期诊断、疗效评价和药效评价等临床诊断和治疗方面的应用。
二、背景技术
肺癌是人类最常见、发病率最高、死亡率最高、治疗效果较差的恶性肿瘤。由于肺癌发病早期无特异性的临床症状和表现，待就诊时，患者大多已属于晚期，临床治疗效果和中位生存期都令人不满意。肺癌总生存率在过去的20年中无明显提高，目前手术后5年生存率仅为14％。早期发现和诊断肺癌，对肺癌的治疗和预后有着非常重要的意义。随着肿瘤分子生物学研究的进展，越来越多的肺癌标记物及筛查手段应用于临床。
目前常用于肺癌早期诊断的标记物分子有癌胚抗原(CEA)，神经原特异性烯醇化酶(NSE)，糖链抗原2125(CA125)，端粒酶，细胞角蛋白，P53基因等。其中CEA是一种人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白，为非特异性肿瘤标记物，约有30％～70％的肺癌病人CEA水平升高。NSE是糖酵解途径中的关键酶，在肺癌特别是在小细胞肺癌(SCLC)中具有高水平及高阳性率，可反映疾病病程、病期、肿瘤负荷，帮助判定疗效，对监测肿瘤复发、转移也有重要意义。CA125是一种存在于胎儿体腔上皮中的一种糖原蛋白抗原，由于其浓度高低与肺癌TNM分期呈正相关，近年来CA125作为一独立的预后因子，是肺癌分期与预后判断的重要参考指标。端粒酶是目前公认的肿瘤标志物，在肺癌中端粒酶活性达80％以上。因此检测到端粒酶活性对肺癌的早期诊断有重要的临床价值。细胞角蛋白是肿瘤细胞发生溶解或坏死时释放入体液中的一种蛋白质，目前被认为是检测鳞癌最好的肿瘤标记物。细胞角蛋白测定对判断肺癌的分期及预后有重要价值，尤其对非小细胞肺癌中肺鳞癌的诊断、疗效及预后等有重要临床价值。P53基因是与人类恶性肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因，其编码产生P53蛋白，P53蛋白又参与了细胞周期调控、DNA修复、细胞分化和凋亡。P53基因突变率在小细胞肺癌(SCLC)中高达80％～90％，在非小细胞肺癌NSCLC中也达到50％以上。因此P53基因突变可作为一种理想的早期检测肺癌的指标。
尽管现在许多的肿瘤标志物被不断发现和应用，但是尚未在大批量人群进行随机对照试验研究，其单一检测应用的敏感度及特异度也未尽如人意，故目前临床上已经很少应用单一的肿瘤标志物进行肺癌的诊断与鉴别诊断，多指标联合检测已成为一种趋势。进一步研究已有的肺肿瘤标志物并进行优化组合、多元分析、综合评价、建立有效的联合检测以提高灵敏性和特异性，继续探索新的更灵敏、更特异的肺肿瘤标志物是今后肿瘤诊断学的研究方向。
微小核糖核酸，是一类长约19到23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动有关，如生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等。近来研究表明，人类中所发现的微小核糖核酸在肿瘤发生、发展过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用，能作为肿瘤早期诊断的新型标志物。本发明人已经开展了以微小核糖核酸作为疾病标志物的研究，例如选取恶性肿瘤发病率第4位的结肠癌作为研究对象，研究发现在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间，一些微小核糖核酸分子都存在着特异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建立起一种更敏感、更精确的早期确诊结肠癌的方法。
目前微小核糖核酸的检测方法主要有以下几种：①Northern blotting是现在检测微小核糖核酸表达最主要的手段，所有克隆和生物信息学分析得来的微小核糖核酸都需要经过Northern blotting来验证和确认。这种方法的缺点在于灵敏度较低且不能进行高通量的检测。②RT-PCR也被用来检测微小核糖核酸前体的表达水平，但微小核糖核酸前体的表达水平并不一定和成熟微小核糖核酸的表达水平一致。实时荧光定量PCR(real-time PCR)可以很精确的定量分析微小核糖核酸的表达，也经常用于验证预测的微小核糖核酸。③芯片技术(microarray)是一种更快、更广泛、更有前途的研究微小核糖核酸表达的方法。芯片技术固然以其高通量和并行处理的特点在基因信息分析中占据重要地位，但信息量大并不等于质量高。实际上，基因芯片的一个突出弱点就是其信息质量的稳定性和可重复性比较差，且无法实现定量检测。
Solexa测序技术最早由剑桥大学的两位化学家创立，利用“DNA簇”和“可逆性末端终结”核心技术，能够达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。具有高通量，高精度和大规模平行测序的特点的Solexa测序技术在RNA水平可以进行全基因组广谱基因表达研究和小分子RNA扫描，定量和鉴定。
由于微小核糖核酸分子是一类新型疾病标志物，本发明拟开展Solexa测序技术对肺癌病人血清中微小核糖核酸是否存在，能否被检测及其与疾病的相关性的研究，建立一种利用肺癌血清中稳定存在的微小核糖核酸及其特异性变化来进行肺癌早期诊断，鉴定和病程监控，恶性复发及预后、并发症发生的预测，药效判定，用药指南，个体化治疗，中药中有效成份筛选，病程分类等研究的新技术。
三、发明内容
本发明所要解决的问题是证明肺癌病人血清中微小核糖核酸的存在并分析鉴定其稳定性。
本发明涉及肺癌病人血清中微小核糖核酸的提取方法。
本发明涉及Solexa技术分析并鉴定人肺癌血清中微小核糖核酸分子表达谱。
本发明涉及一种评价肺癌病人生理/病理状态的方法，该方法包括测定肺癌病人血清微小核糖核酸，以及获得肺癌病人血清微小核糖核酸的表达谱。其中所述方法优选用于与正常血清微小核糖核酸进行比较，用于疾病的诊断、药物的筛选、治疗方案的评价。
用于实现本发明目的的技术方案为：取得肺癌病人的血清样本，通过Solexa方法分析并鉴定人肺癌血清中微小核糖核酸分子的存在。通过与肺癌血清微小核糖核酸的PCR产物进行序列比对，进一步验证血清微小核糖核酸分子的存在和序列的正确性。通过Solexa方法进一步得到肺癌血清中微小核糖核酸的分布和含量，筛选出在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸分子，来制备应用于检测肺癌发生等疾病诊断领域的试剂盒。
具体的血清微小核糖核酸的制备及分析如下：
(1)收集肺癌/正常受试者的血清样本；
(2)通过Trizol试剂提取血清/血细胞总RNA；
(3)进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；
(4)进行Solexa技术的准备实验，首先在17-27nt RNA分子两个末端加上接头(adapter)；
(5)利用Solexa芯片固定单链RNA分子：芯片表面连接有一层单链引物(Primer)，RNA片断成单链后通过芯片表面引物的碱基互补被一端“固定”在芯片上；
(6)引物扩增使得单链RNA成为双链；
(7)将双链RNA变性后成为单链，其一端“固定”在芯片上，另外一端(5’或3’)随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge)；
(8)上千万RNA单分子发生同样反应形成单链桥；
(9)单链桥以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增形成双链；(10)双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板，反复30轮扩增后每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆簇；
(11)利用“可逆性末端终结反应”，通过碱基合成来进行序列分析。四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列；
(12)数据分析与处理。
通过上述的Solexa方法分析在肺癌血清中微小核糖核酸的变化趋势和变化量及它们与肺癌发生的相关性。
本发明针对肺癌血清中微小核糖核酸的检测技术，可以快速地高通量地分析肺癌病人血清中微小核糖核酸的组成，并通过对其独特的一系列分子标记物变化范围及趋势的分析，可以应用于早期肺癌的诊断，并且对肺癌的分期具有指导意义。
利用Solexa测序技术对肺癌血清中微小核糖核酸进行检测的优越性：
(1)利用Solexa测序技术对肺癌血清微小核糖核酸的检测，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放(血液-20℃存放即可)等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，成为早期诊断疾病的有效手段。
(2)利用Solexa测序技术检测出的一类特异性的血清微小核糖核酸作为新的疾病标记物将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。
(3)利用Solexa测序技术对血清微小核糖核酸检测优势在于其检测的是一系列疾病相关标记物，它们或升高或降低经过反复实验具有统计学意义，因而能够克服病人个体之间的差异(即年龄、性别、种族、饮食和环境等)，而这正是单一疾病标记物所无法逾越的一个主要问题。
总之，Solexa技术测定的血清中一系列微小核糖核酸能应用于早期肺癌的诊断，这种新的血液中的疾病标记物不仅为人们在分子水平上全面了解疾病发生的机理提供了物质基础，也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步。基于血清微小核糖核酸Solexa测序技术的优越性，相信不久的将来，对重症疾病的血清微小核糖核酸诊断技术将会成为常规体检的一部分，而且微小核糖核酸相关的基因治疗也会广泛地应用，征服重症疾病将不再是梦想。
四、附图说明
图1为Solexa测序所得肺癌/正常血清的小分子RNA长度。
图2为肺癌血清与正常血清相比，微小核糖核酸的变化情况
图3为肺癌血清与正常血清相比微小核糖核酸变化的Pearson相关系数曲线肺癌血清与正常血清相比，R＝0.50705
五、具体实施方式
实施例1采用Solexa测序技术对肺癌病人血清样本进行测序并分析各个微小核糖核酸的表达量。具体步骤为：
(1)收集肺癌病人的血清样本。
(2)Trizol法(Invitrogen公司)提取上述病人100ml混合血清总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，用分光光度计进行定量(100ml血清通常能富集约10-20μg左右的总RNA)。
(3)应用10-20μg左右的肺癌病人血清总RNA，采用Solexa测序技术检测和分析RNA样品。具体方案为：
a.应用PAGE电泳，纯化得到长度小于30nt的RNA分子。在RNA分子的两个末端加上接头分子(adapter)。
b.采用Solexa芯片在固定一端RNA接头分子的同时，由于其芯片表面有能与另一端RNA接头分子互补的单链引物(Primer)，从而将RNA分子“固定”在芯片上，形成单链“桥”(bridge)。
c.然后进行“桥”式PCR反应使得单链RNA扩增成为双链。
d.将双链RNA分子变性成为单链。两单链RNA分子的一端分别“固定”在芯片上，另外一端(5’或3’)分别随机和附近芯片表面的引物互补而被“固定”住，形成两个单链“桥”(bridge)。
e.上千万个“种在”芯片表面的RNA分子发生上述相同反应。
f.形成的单链桥在芯片表面进行“桥”式PCR扩增反应，形成双链；双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应。每个RNA分子经过反复30轮扩增后(约1000倍扩增)，成为单克隆簇群。
g.采用“可逆性末端终结反应”进行单克隆RNA簇的序列分析。四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描并读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出每个碱基精确序列。
(4)利用生物信息学方法，对上述测得的肺癌病人血清小RNA分子表达谱进行分析，结果如表1所示：
表1：solexa测序所得的小分子RNA的归类
我们从表1可以看到血清中存在不同种类的小分子RNA，利用生物信息学方法，我们通过序列比对将所有小分子RNA进行了归类分析。从目前的数据来看，血清中至少存在上百种微小核糖核酸，占肺癌血清所有RNA分子的68.09％。由于血清中大分子RNA降解(包括rRNA、mRNA等的降解)，无形中增加了rRNA碎片和mRNA碎片在血清RNA分子中的比率。
Solexa测序结果所得的小分子RNA的长度分布如图1所示。大多数血清小分子RNA的长度是22nt，表明微小核糖核酸在小分子RNA中占大比重的趋势。此外，血清中小分子RNA的情况比较复杂，存在很多rRNA和mRNA的碎片，大小也正好是18-30bp。
具体的肺癌血清Solexa测序结果见表2(拷贝数值反映微小核糖核酸的表达量，其中拷贝数＝0表示血清中没有微小核糖核酸；拷贝数值越大，其对应的微小核糖核酸表达量越多)。
表2：肺癌血清中微小核糖核酸的Solexa测序结果
人类微小核糖核酸数据库的最新版本中包含的微小核糖核酸共有555个，如表2所示，在肺癌血清中共检测出199个，其中tag值在0-10之间的有57个，在10-100之间有78个，100-1000之间有32个，大于1000的有22个，未检测到的有356个。
实施例2肺癌病人血清中微小核糖核酸较正常生理状态的变化情况
用Solexa技术对正常人血清微小核糖核酸进行测序，所得结果如表3所示。
表3正常人血清Solexa测序结果
肺癌病人血清中检测到有199个微小核糖核酸(见表2)，正常人血清中有167个微小核糖核酸(见表3)。我们认为当微小核糖核酸的变化倍数大于5，且绝对值之差大于20个拷贝数，那么这个微小核糖核酸是显著变化的，否则视为不变化。根据此规则，我们比较了肺癌病人血清与正常人血清的微小核糖核酸，发现63个微小核糖核酸呈上升趋势，34个呈下降趋势，149个不变化。我们分析了发生肺癌时变化或不变化的血清微小核糖核酸所占比例，结果如图2所示。发生肺癌时血清中微小核糖核酸相对正常人血清发生了很大变化，Pearson相关系数的分析(见图3)证实了肺癌病人血清与正常人血清之间微小核糖核酸表达的巨大差异(R＝0.51)。因此，Solexa技术能筛选出在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一系列血清微小核糖核酸分子，并且这些微小核糖核酸分子可作为检测肺癌发生的分子标记用于早期诊断肺癌。
实施例3用于诊断肺癌的血清微小核糖核酸试剂盒的制作
用于诊断预测肺癌的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于Solexa测序技术，同时结合定量和半定量PCR技术。
通过Solexa测序的方法，首先测定正常人和肺癌病人血清微小核糖核酸表达谱，然后筛选在肺癌及正常生理状态下表达量和差异程度大的一系列血清微小核糖核酸，作为预测是否发生肺癌以及诊断病变程度的指标。表4显示与正常人血清相比，肺癌病人血清中显著变化的微小核糖核酸，可以筛选出一批血清微小核糖核酸作为诊断肺癌发生的分子标志物。
表4：肺癌血清与正常血清相比发生变化的微小核糖核酸
诊断肺癌的血清微小核糖核酸试剂盒包括一批血清微小核糖核酸的引物，Taq酶、dNTP等试剂。其中所述血清微小核糖核酸的引物选自肺癌血清与正常血清相比发生变化的微小核糖核酸中的一种或几种引物。
此试剂盒的使用方式为通过定量和半定量PCR技术的方法测定作为疾病标记物的一类血清微小核糖核酸表达量的变化程度，从而诊断肺癌发生与否和癌变程度。
此试剂盒的价值在于只需要肺癌血液而不需要其它组织样品。通过Solexa测序技术筛选在肺癌及正常生理状态下表达量和差异程度大的一系列血清微小核糖核酸，用定量和半定量PCR技术检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测肺癌发生的可能性或诊断肺癌的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，可以增加在早期发现肺癌的可能，帮助指导诊断和治疗。
Claims (3)
1、一种Solexa技术鉴定肺癌病人血清中微小核糖核酸的方法，其特征由以下步骤构成：
(1)收集正常受试者和肺癌受试者的血清样本；
(2)通过Trizol试剂提取血清总RNA；
(3)进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；
(4)进行Solexa技术的准备实验，在17-27nt RNA分子两个末端加上接头adapter；
(5)小RNA接头分子一端固定在Solexa芯片表面上，并进行“桥式”PCR扩增反应；
(6)利用可逆性末端终结反应，通过四种荧光碱基的合成进行测序；(6)数据分析与处理。
2、根据权利要求1方法所制备的用于诊断肺癌的血清微小核糖核酸试剂盒，其特征为：
(1)该试剂盒包含测定肺癌血清微小核糖核酸的工具，包括酶，dNTP及仪器。
(2)此试剂盒只需要肺癌病人血液而不需要其它组织样品；
(3)此试剂盒包含肺癌病人血清与正常人血清相比发生变化的微小核糖核酸中的一种或几种的引物；
(4)此试剂盒用定量或半定量PCR技术测定作为疾病标记物的一类血清微小核糖核酸表达量的变化程度，从而诊断肺癌发生与否和癌变程度。
3、权利要求1所述的Solexa技术或权利要求2所述的用于诊断肺癌病人血清微小核糖核酸试剂盒在诊断和鉴定肺癌中的应用。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010069129A1 (zh) * | 2008-12-15 | 2010-06-24 | 北京命码生科科技有限公司 | 非小细胞肺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 |
| WO2011003237A1 (zh) * | 2009-07-09 | 2011-01-13 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | 两个microRNA分子在肺癌预后及药物制备中的用途 |
| CN102140523A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-08-03 | 东南大学 | 高通量测序模板的原位复制及其增加阅读长度的测序方法 |
| WO2012037881A1 (zh) * | 2010-09-21 | 2012-03-29 | 深圳华大基因科技有限公司 | 核酸标签及其应用 |
| WO2012089630A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Fondazione Istituto Firc Di Oncologia Molecolare (Ifom) | A METHOD TO IDENTIFY ASYMPTOMATIC HIGH-RISK INDIVIDUALS WITH EARLY STAGE LUNG CANCER BY MEANS OF DETECTING miRNAs IN BIOLOGIC FLUIDS |
| CN102732520A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-17 | 浙江大学 | 一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法 |
| US9637793B2 (en) | 2009-12-24 | 2017-05-02 | Micromedmark Biotech Co., Ltd. | Pancreatic cancer markers, and detecting methods, kits, biochips thereof |
-
2008
- 2008-07-15 CN CNA200810123040XA patent/CN101307361A/zh active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010069129A1 (zh) * | 2008-12-15 | 2010-06-24 | 北京命码生科科技有限公司 | 非小细胞肺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 |
| US9388470B2 (en) | 2008-12-15 | 2016-07-12 | Micromedmark Biotech Co., Ltd. | Serum or plasma microRNA as biomarkers for non-small cell lung cancer |
| US10774386B2 (en) | 2008-12-15 | 2020-09-15 | Micromedmark Biotech Co., Ltd. | Serum or plasma microRNA as biomarkers for non-small cell lung cancer |
| WO2011003237A1 (zh) * | 2009-07-09 | 2011-01-13 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | 两个microRNA分子在肺癌预后及药物制备中的用途 |
| US9637793B2 (en) | 2009-12-24 | 2017-05-02 | Micromedmark Biotech Co., Ltd. | Pancreatic cancer markers, and detecting methods, kits, biochips thereof |
| WO2012037881A1 (zh) * | 2010-09-21 | 2012-03-29 | 深圳华大基因科技有限公司 | 核酸标签及其应用 |
| WO2012089630A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Fondazione Istituto Firc Di Oncologia Molecolare (Ifom) | A METHOD TO IDENTIFY ASYMPTOMATIC HIGH-RISK INDIVIDUALS WITH EARLY STAGE LUNG CANCER BY MEANS OF DETECTING miRNAs IN BIOLOGIC FLUIDS |
| CN102140523A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-08-03 | 东南大学 | 高通量测序模板的原位复制及其增加阅读长度的测序方法 |
| CN102140523B (zh) * | 2011-01-28 | 2013-08-07 | 东南大学 | 高通量测序模板的原位复制及其增加阅读长度的测序方法 |
| EP2505663A1 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-03 | IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare | A method to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer by means of detecting miRNAs in biologic fluids |
| CN102732520A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-17 | 浙江大学 | 一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法 |
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