CN108559777A - 一种新型分子标记及其在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应用 - Google Patents

一种新型分子标记及其在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型分子标记及其在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应用，所述新型分子标记的RNA序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示。以本发明标记物为基础，构建肾透明细胞癌诊断的数学模型；该模型灵敏度高，特异性好，AUC可高达0.997，诊断效果良好。此外，这57个tRF片段也可以作为肾透明细胞癌分型及预测病人生存期的分子标记物；在测试数据中，根据tRFs表达，肾透明细胞癌肿瘤样本被聚类成3个亚型，通过生存曲线分析显示这些亚型的生存期存在显著差异；本发明公开的新型的tRF分子标记物具有良好的诊断指标的特性，可以有效用于肾透明细胞癌诊断、分型和预后，具有较高的临床使用和推广价值。

Description

一种新型分子标记及其在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后 的试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种新型分子标记及其在制备用于肾透明细胞 癌诊断和预后的试剂盒中的应用。
背景技术
肾癌(肾细胞癌)是泌尿系统肿瘤中致死率最高的一种，是起源于肾实质泌尿小管上皮 系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌，是最常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率约占全部肿瘤的2-3％。 根据组织学结构，肾癌可以被分为多个亚型，其中，肾透明细胞癌(kidneyclear cell renal carcinoma，KIRC)是肾癌中最常见的一种亚型，约占70-80％，每年全世界大约会有102,000 例患者因此而死亡。肾透明细胞癌是一种发展相对较慢的肿瘤，其早期症状常缺乏特异性， 很多肾透明细胞癌发现时多已属中晚期，且出现了远处转移。因此对于肾透明细胞癌的治疗 还是应注重早期发现早期诊断早期治疗。此外，肾透明细胞癌对化疗及放疗均不敏感，行手 术切除是惟一治愈的方法。然而，肾透明细胞癌组织学行为多变,预后有不确定性，近30％ 的患者术后肿瘤复发。因此，寻找敏感的肾透明细胞癌标记物用以早期发现肿瘤，并能判断 患者预后，早期发现复发，指导个体化治疗具有更重要的临床意义。近来，随着各组学技术 和生物信息学分析技术的飞速发展，能够检测和分析数以百计不同的生物分子表达包括DNA， RNA和蛋白质，使筛选出对肾透明细胞癌诊断和预后判断准确的生物分子标记物成为可能。
生物标记物是指能将机体的生理和疾病状态区分开来的生物分子，筛选到可用于疾病早 期发现、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。tRNA是一类生物体中非常 重要的非编码RNA，主要功能是转运氨基酸、参与蛋白合成。最近研究发现tRNA在各种逆境 下会发生降解，产生20-40bp的小RNA片段，称为tRNA-derived RNA fragments，简称tRF。 本研究团队最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的tRF表达谱，即指肿瘤细胞中某些tRF 的表达水平异常，而这种异常的特征性tRF可以成为用于肿瘤或疾病的诊断，病理分级，临 床分期，治疗与预后的生物标志物，显示了较好的临床应用前景。我们分析了TCGA数据库中 544例肾透明细胞癌测序数据，首次发现了肾透明细胞癌肿瘤组织中存在大量这种tRF片段， 该种新型的分子标记物将有望成为肾透明细胞癌诊断筛查及分型预后效果预测的重要手段。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新型分子标记及其在制备用于肾透明 细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种新型分子标记，它的RNA序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示。
进一步地，它通过以下方法获取：
(1)从GtRNAdb数据库中下载620个tRNA基因注释信息及其序列，在tRNA序列3′端添加“CCA”来获得新组成的CCA-tRNAs的注释和序列信息，然后以CCA-tRNAs序列的5′ 或者3′端作为起点，得到所有在15～30nt范围内的片段序列，进一步合并相同的序列后， 得到8681个来自CCA-tRNAs 5′端的片段序列和9285个来自CCA-tRNAs 3′端的片段序列； 利用bedtools工具获得这620个tRNA基因下游50nt的注释和序列信息，即tRNA前体注释 和序列信息，然后以tRNA前体序列的5′端为起点，得到所有在15～30nt范围内的片段序 列，进一步合并相同的序列后，最终得到15909个来自tRNA前体的片段序列；合计得到由 33875个候选的tRNA来源的短片段注释和序列信息构建成的数据库。
(2)在TCGA数据库中下载肾透明细胞癌肿瘤组织和相应的正常组织的miRNA-seq数 据，利用bwa把TCGA样本中的读长比对到步骤1所构建的CCA-tRNAs和tRNA前体的注 释中，然后计算每个候选的tRNA来源的小片段所对应的读长数目；采用RPM来量化每个候 选的tRNA来源的小片段的表达丰度，要求tRFs的表达量必须在10％的样本中大于1RPM； 在数据分析前，对所有tRFs的表达值(即RPM值)数据进行log2转换以及上四分位数方法 正规化。
(3)对肾透明细胞癌肿瘤组织及其相邻正常组织中tRFs进行t统计检验，运用Benjamini-Hochberg方法控制多重检验的假阳性；结果显示57个tRFs在肿瘤组织中异常表达， 这57个tRFs的RNA序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示。
本发明还提供了一种上述分子标记在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应 用。
本发明的有益效果是：以本发明标记物为基础，构建肾透明细胞癌诊断的数学模型；该 模型灵敏度高，特异性好，AUC可高达0.997，诊断效果良好。此外，这57个tRF片段也可 以作为肾透明细胞癌分型及预测病人生存期的分子标记物；在测试数据中，根据tRFs表达， 肾透明细胞癌肿瘤样本被聚类成3个亚型，这些亚型分别有自己本身特异的tRFs表达模式， 通过生存曲线分析显示这些亚型的生存期存在显著差异(P<0.001)。综上所述，本发明公开 的新型的tRF分子标记物具有良好的诊断指标的特性，可以有效用于肾透明细胞癌诊断、分 型和预后，具有较高的临床使用和推广价值。
附图说明
图1是本发明一个tRF片段在肾透明细胞癌肿瘤组织和正常组织差异表达图，其中，(a) 为正常样本和肿瘤样本中显著差异表达的tRF的火山图，(b)为一个tRF，即 M5-tRNA-Arg-TCT-5-1，在10对独立的肾透明细胞癌组织样本中的验证结果图(P＝2.0×10-3)。
图2是本发明一个评估tRF片段作为肾透明细胞癌诊断的分子标记物的具体实施流程图 和诊断效果图，其中，(a)为用于评价本发明鉴别的57个tRF分子标记在肾透明细胞癌诊断 效果的诊断流程图，(b)为本发明鉴别的57个tRF分子标记分别在4个构建的数学模型(随 机森林(RF)、支持向量机(SVM)、广义线性模型(GLM)和局部最小二乘(PLS))里的 受试者工作特征曲线图(简称ROC曲线)；
图3是本发明一个评估tRF片段作为肾透明细胞癌预后的分子标记物的肿瘤分型图和生 存曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
本发明分子标记的获取方法如下：
1、从GtRNAdb(http://gtrnadb.ucsc.edu/genomes/eukaryota/Hsapi19)数据库中下载620 个tRNA基因注释信息及其序列。通过在成熟tRNA序列3′端添加“CCA”来获得新组成的 CCA-tRNAs的注释和序列信息。然后以CCA-tRNAs序列的5′或者3′端作为起点，得到所有在15～30nt范围内的片段序列，进一步合并相同的序列后，最终得到8681个来自 CCA-tRNAs 5′端的片段序列和9285个来自CCA-tRNAs 3′端的片段序列。此外，我们利用bedtools工具获得这620个tRNA基因下游50nt的注释和序列信息，即tRNA前体注释和序 列信息。然后以tRNA前体序列的5′端为起点，得到所有在15～30nt范围内的片段序列， 进一步合并相同的序列后，最终得到15909个来自tRNA前体的片段序列。这样我们总共得 到由33875个候选的tRNA来源的短片段注释和序列信息构建成的数据库。
2、在TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载544例肾透明细胞癌肿瘤组 织和相应的71例正常组织的miRNA-seq数据。首先，我们利用bwa再次把TCGA样本中的 读长比对到我们前面所构建的CCA-tRNAs和tRNA前体的注释中，不允许有错配的碱基。然 后计算每个候选的tRNA来源的小片段所对应的读长数目。在miRNA的表达分析中，研究者 常使用RPM(Reads Per Million total mapped reads,公式为：单个miRNA读长数×106/比对到 参考基因组的总读长数)来校准miRNA的表达量。我们也采用RPM来量化每个候选的tRNA 来源的小片段的表达丰度。此外，为了得到可靠的tRNA来源的短片段,我门要求tRFs的表 达量必须在10％的样本中大于1RPM。在数据分析前，对所有tRFs的表达值(即RPM值) 数据进行log2转换以及上四分位数方法正规化(upper quartile normalization)。
3、为鉴定肿瘤组织中异常表达的tRFs，我们对肾透明细胞癌肿瘤组织及其相邻正常组织 中tRFs进行t统计检验。我们并且运用Benjamini-Hochberg方法控制多重检验的假阳性(FDR， false discovery rate)。结果显示57个tRFs在肿瘤组织中异常表达，这57个tRFs的RNA序 列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示；利用浙江大学附属第二医院肾透明细胞癌组织库， 我们实验验证了其中一个在肾透明细胞癌异常高表达的tRF5-1(P＝2.0×10-3)。
图1是本发明一个tRF片段在肾透明细胞癌肿瘤组织和正常组织差异表达图，其中，(a) 为正常样本和肿瘤样本中显著差异表达的tRF的火山图。从图中可以看出，17个tRF在肿瘤 中显著表达上升(图1(b)右侧)，40个tRF显著表达降低(图1(b)左侧)。(b)为一个tRF，即M5-tRNA-Arg-TCT-5-1，在10对独立的肾透明细胞癌组织样本中的验证结果(P＝2.0×10-3)。
4、随机将TCGA中544例肾透明细胞癌肿瘤样本分成训练组(80％)和检验组(20％)， 采用随机森林(RF)、支持向量机(SVM)、广义线性模型(GLM)和局部最小二乘(PLS)四种方法构建肾透明细胞癌诊断的数学模型，构建的模型的诊断肾透明细胞癌的敏感性和特 异性高达98.4-99.7％。
图2是本发明一个评估tRF片段作为肾透明细胞癌诊断的分子标记物的具体实施流程图 和诊断效果图，其中，(a)为用于评价我们鉴别的57个tRF分子标记在肾透明细胞癌诊断效 果的诊断流程图，(b)为我们鉴别的57个tRF分子标记分别在4个构建的数学模型(随机森 林(RF)、支持向量机(SVM)、广义线性模型(GLM)和局部最小二乘(PLS)里的受试者工作特征曲线图(简称ROC曲线)，用于评价他们对肾透明细胞癌诊断效果的敏感性和特 异性。
5、为研究肾透明细胞癌组织中tRFs表达的不同模式以及鉴定不同的亚型，我们对发现 的tRFs进行聚类分析。我们采用了非负矩阵分解聚类(Nonnegative matrixfactorization clustering)进行样本聚类分析，得到3个肾透明细胞癌肿瘤亚型，这些亚型分别有自己本身特 异的tRFs表达模式。当tRFs亚型选定后，采用Kaplan—Meier方法计算不同亚型的生存曲线， 并采用对数序(log rank)检验不同亚型中病人的生存期差异的显著性，结果显示这3个肾透 明细胞癌肿瘤亚型的生存期存在显著差异(P<0.001)。
图3是本发明一个评估tRF片段作为肾透明细胞癌预后的分子标记物的肿瘤分型图和生 存曲线图，从图中可以看出，3类亚型预后差异明显，其中2类亚型预后最好，其次是3类 亚型，1类亚型预后最差。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种新型分子标记及其在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应用
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Unknown)
<400> 45
gcguuggugg uauagugguu agcaua 26
<210> 46
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 46
gguaaaaugg cugagugaag cauu 24
<210> 47
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 47
gcauuggugg uucaguggua gaa 23
<210> 48
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 48
guuuccguag uguagugguu aucacg 26
<210> 49
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 49
ggccgcgugg ccuaauggau aaggc 25
<210> 50
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 50
guuaagaugg cagagcccgg 20
<210> 51
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 51
gucaggaugg ccgagcgguc uaaggc 26
<210> 52
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 52
gcauuggugg uucaguggua ga 22
<210> 53
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 53
gcguuggugg uauaguggug agc 23
<210> 54
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 54
gguaaaaugg cugagugaag cauuggacu 29
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 55
gguaaaaugg cugagugaag c 21
<210> 56
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 56
guuaagaugg cagag 15
<210> 57
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 57
guuaagaugg cagagcc 17

Claims (5)

1.一种新型分子标记，其特征在于，它的RNA序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示。
2.一种权利要求1所述新型分子标记，其特征在于，它通过以下方法获取：
(1)从GtRNAdb数据库中下载620个tRNA基因注释信息及其序列，在tRNA序列3′端添加“CCA”来获得新组成的CCA-tRNAs的注释和序列信息，然后以CCA-tRNAs序列的5′或者3′端作为起点，得到所有在15～30nt范围内的片段序列，进一步合并相同的序列后，得到8681个来自CCA-tRNAs 5′端的片段序列和9285个来自CCA-tRNAs 3′端的片段序列；利用bedtools工具获得这620个tRNA基因下游50nt的注释和序列信息，即tRNA前体注释和序列信息，然后以tRNA前体序列的5′端为起点，得到所有在15～30nt范围内的片段序列，进一步合并相同的序列后，最终得到15909个来自tRNA前体的片段序列；合计得到由33875个候选的tRNA来源的短片段注释和序列信息构建成的数据库；
(2)在TCGA数据库中下载肾透明细胞癌组织和相应的正常组织的miRNA-seq数据，利用bwa把TCGA样本中的读长比对到步骤(1)所构建的CCA-tRNAs和tRNA前体的注释中，然后计算每个候选的tRNA来源的小片段所对应的读长数目；采用RPM来量化每个候选的tRNA来源的小片段的表达丰度，要求tRFs的表达量必须在10％的样本中大于1RPM；在数据分析前，对所有tRFs的表达值(即RPM值)数据进行log2转换以及上四分位数方法正规化。
(3)对肾透明细胞癌组织及其相邻正常组织中tRFs进行t统计检验，运用Benjamini-Hochberg方法控制多重检验的假阳性；结果显示57个tRFs在肿瘤组织中异常高表达，这57个tRFs的RNA序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示。
3.一种权利要求1所述分子标记在制备用于肾透明细胞癌诊断和预后的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用非负矩阵分解聚类对这57个tRFs的RNA序列进行样本聚类分析，得到3个肾透明细胞癌肿瘤亚型，这些亚型分别有自己本身特异的tRFs表达模式；当tRFs亚型选定后，采用Kaplan—Meier方法计算不同亚型的生存曲线，并采用对数序检验不同亚型中病人的生存期差异的显著性，结果显示这3个肾透明细胞癌肿瘤亚型的生存期存在显著差异。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:57所示的57个tRFs为基础，构建肾透明细胞癌诊断的数学模型；该模型灵敏度高，特异性好，AUC可高达0.997，诊断效果良好。
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