CN109423519A - 早期胰腺癌标记物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及早期胰腺癌标记物及其检测方法，本发明基于多种微小核糖核酸在早期胰腺癌细胞中的表达强度差异开发出可用于早期胰腺癌分子诊断和治疗的生物小分子。本发明的早期胰腺癌标记物具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标记物本身的不稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌诊断的有效手段。

Description

早期胰腺癌标记物及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人体体液中微小核糖核酸在早期胰腺癌中早期筛查及精准用药检测方法。
背景技术
胰腺癌是致死性恶性疾病，起病隐匿，早期诊断困难，目前尚无简便易行且有实用价值的检测方法。临床确诊者大多已属晚期，手术切除率为10％～20％，约75％患者在确诊后1年内死亡，5年生存率不足5％。而局限于胰腺的、直径≤2.0cm的小胰腺癌施行根治性手术治疗后，5年生存率可提高至19％～41％。显然，早期发现、早期诊断是有效治疗胰腺癌、改善预后的关键。
早期胰腺癌通常指肿块直径≤2.0cm，无淋巴结转移，无胰腺被膜和胰周浸润，无血管和邻近脏器侵犯的胰腺癌，分期属T1aN0M0。但是有学者认为，1.0cm～2.0cm的胰腺癌大多已发生了淋巴结转移，主张肿瘤直径≤1.0cm为早期胰腺癌的标准。除非病灶恰巧位于十二指肠乳头处，可以早期出现胆胰管梗阻症状以外，极少有临床症状。另有学者提出，早期胰腺癌和小胰腺癌的定义有所区别，后者主要是指肿瘤最大直径≤2.0cm，而无论有无淋巴结转移。因此，早期胰腺癌的诊断，应重点在于高危人群的筛查、分子生物学诊断和探索新的影像检查手段。
目前，由于恶性肿瘤如胰腺癌的发生缺乏临床早期表征，因此没有对胰腺癌的发生准确临床诊断指标，导致该疾病的发生率和死亡率在逐年上升，严重威胁人类健康。疾病分子检测是实现疾病临床快速诊断有效途径，但是，目前临床上广泛应用的检测指标如CA19-9、CA125等，其检测灵敏度低(<30％)和特异性差(<20％)，因此开发有效的可用于临床早期检测的方法对降低胰腺癌发病率和死亡率极其重要。
微小核糖核酸是小分子非编码核酸分子，研究表明，微小核糖核酸在转录水平上通过与目标基因mRNA结合，以调节目标基因的活性；因其功能差异，微小核糖核酸可分为三类分子，即对发育起调节作用的分子miRNA、致癌miRNA以及抑制癌症发生的微小核糖核酸分子。由于其功能上的差异，这类分子可以被开发成为有效的临床分子诊断手段和新抗癌药物或靶位点。大量研究表明，微小核糖核酸可以开发为用于恶性肿瘤早期诊断的有效手段。中国专利申请CN101942502A公开了36种可用于胰腺癌检测的标记物，但上述标记物在胰腺癌病人血浆中表达水平较低，临床检测灵敏度平均在80％，不能区分不同时期胰腺癌、胰腺炎和正常组织变化。同时，由于缺乏综合考虑个体化临床特点，有可能导致含有该标记物产品检测结果不能真实反映病人实际状况，造成漏诊和误诊。另外，造成现有技术检测结果不稳定的原因还在于临床取样和样本制备过程会导致分析物质量下降，干扰PCR反应，影响最终结果；多重定量PCR制备条件非常关键，不正确的探针和引物配对均会导致灵敏度下降。
近15年来，发明人通过参与美国NIH/NCI癌症研究所早期癌症诊断研究网络协会(EDRN)协作研究，发现有25种不同的微小核糖核酸在胰腺癌不同病理时期的差异表达。通过研究表明，这些微小核糖核酸在胰腺癌发生过程中的功能基本明了，即通过以下几条细胞信号通路来行驶其致癌和抑制癌症之功能，包括TGFβ通路、Wnt/β-catennin通路、MAPK/KRas通路、JAK/STAT通路以及PI3K/ALT通路。通过体外细胞学及回溯性研究进一步确定了这些微小核糖核酸可能用于早期胰腺癌诊断的有效组合。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明基于多种微小核糖核酸在早期胰腺癌细胞中的表达强度差异开发出可用于早期胰腺癌分子诊断和治疗的生物小分子。本发明提供多种早期胰腺癌标记物及其早期筛查以及精准用药检测方法。本发明所提供的微小核糖核酸组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾病并发症发生和复发的监测、疗效、药效及指导精准用药等方面评价。
为实现上述目的，本发明提供的胰腺癌标记物，包括以下在人体体液中稳定存在且可检测的微小核糖核酸：hsa-miR-143-5p*、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-221-5p*、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-23a-5p*、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-1-5p*、hsa-miR-24-2-5p*、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-15b-3p*、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-145-3p*、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181a-3p*、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-196a-3p*、has-miR-10b、has-miR-30c、has-miR-106b、has-miR-132、has-miR-155、has-miR-181b、has-miR-212和has-miR-34a中一种或两种以上。
进一步的，上述微小核糖核酸探针序列为：
本发明另一个目的请求保护上述微小核糖核酸的检测方法，首先利用回溯性实验、定量PCR芯片检测到正常胰腺组织、发炎组织及早期癌症等组织细胞内miRNA含量，并用临床测试回溯性样本验证，找到在早期胰腺癌细胞组织内差异表达的143种miRNAs；然后，对这些差异表达小分子RNA进一步验证，得到第二次验证的早期胰腺肿瘤细胞内54种miRNAs；再通过小范围临床前瞻性实验，找到具有临床可用性的34种miRNAs；最后通过临床中试，进一步验证找到有效的、可用于胰腺癌早期诊断或用药指导的25种癌变生物标记物miRNAs。
更为具体地包括以下步骤：
(1)采用Trizol方法或旋转柱洗脱法对miRNA抽提；
(2)将miRNA经过定量、质量控制分析、荧光标记、反转录、扩增、扫描图像、归一化分析、统计数据分析，找出具有极显著差异miRNAs；
(3)将选定的miRNAs用定量RT-PCR方法分析验证该分子内在表达量，并将选定的miRNAs分子在临床样品上进行内在表达验证，筛选出54种差异表达的miRNAs；
(4)将筛选的54种miRNAs再次进行小临床实验，进行定量PCR、理化特征分析、临床稳定性试验筛选出34种灵敏度和特异性高的miRNAs；
(5)将筛选的34种miRNAs进行中试临床实验，筛选出25种具有极显著差异的miRNAs。
优选的，所述步骤(1)具体为：选取受试者血浆、唾液、胰腺液、尿液、组织以及血液循环细胞等任一种，以1、2、3微克线虫微小核糖核酸(Cel-miR-39)作为内参，在选定的1毫升血浆内加入以上固定的Cel-miR-39。
进一步的，所述体液为血清/血浆、唾液、尿液或胰腺液，优选血清/血浆或唾液，更优选血清/血浆。
本发明另一个目的是请求保护用于检测早期胰腺癌癌标记物的探针组合。该探针组合包含所述miRNAs序列中一种或两种以上。
本发明第四个目的是请求保护提供上述早期胰腺癌标记物在试剂盒上的应用。该试剂盒包括上述用于检测早期胰腺癌标记物的miRNAs探针组合。
本发明miRNAs是在2300个不同人临床样品中精细选择的胰腺癌不同病理时期样品，包括panIN III期以内的早期样本(肿瘤大小<0.1mm)、I期(肿瘤大小<2.0mm)以及II期(肿瘤大小<2.0mm)以上病理组织及其对应的血清。通过多维定量PCR和二代测序方法发现并验证，发现54种差异表达的微小核糖核酸，通过小试(100个样本，前瞻性实验)以及中试(500个样本)，最后确定25种极显著差异表达微小核糖核酸。
本发明建立了多个组合联合检测，即，
1)has-miR-132、has-miR-10b、has-miR-30c、has-miR-143-3p、has-miR-145-5p；
2)hsa-miR-221-3p、hsa-miR-23a-5p*、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-1-5p*、hsa-miR-24-2-5p*；
3)has-miR-155、has-miR-181b、has-miR-212、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-106b。将多组合联合检测结果结合常规病理结果来综合判断检测准确性，检测精确度高(>95％)，而现有技术中仅采用单一检测指标(单个微小核糖核酸来判断，并且现有技术中的miRNAs并不是最灵敏的，缺乏综合考虑个体化临床特点，有可能导致产品检测结果不能真实反映病人实际状况。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明miRNAs可用于早期胰腺癌精准分子诊断，能区分早期胰腺癌变细胞与胰腺发炎类细胞。由于本发明的微小核糖核酸组合能准确反映出在早期胰腺癌细胞核炎症细胞内的表达水平差异，并通过多中心临床验证，确定了区分胰腺炎和胰腺癌标准；
(2)能准确区分胰腺癌与其他疾病。由于本发明微小核糖核酸在胰腺癌细胞核其他癌症如乳腺癌、口腔癌、肺癌以及直肠癌细胞内表达水平差异，通过临床验证，确定了在胰腺癌细胞内独特高表达的miRNAs分子以及诊断标准；
(3)能区分胰腺癌内在耐药和获得性耐药。由于miRNAs在内在耐药细胞系或获得性耐药细胞系内内源表达水平差异，这种差异表达的微小核糖核酸可作为区分耐药与否的生物标记物；
(4)能帮助判别胰腺癌药物治疗有效性。对于化疗、靶向治疗及免疫治疗，由于miRNAs在胰腺癌病人治疗前后血液内循环miRNA水平差异，这种差异表达的微小核糖核酸可作为区分耐药与否的生物标记物。
综上所述，本发明的早期胰腺癌标记物具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标记物本身的不稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌诊断的有效手段。
附图说明
图1为RNA不同提取方法得率分析；
图2为早期胰腺癌细胞内差异表达miRNAs分子；
图3为定量RT-PCR验证分析miRNAs内在差异表达量；
图4为miR-143-3p和miR-132在早期胰腺癌病人血清与胰腺癌及其癌旁组织中差异表达水平及其相关性分析；
图5为miRNAs分子在大临床样品内在表达验证；
图6A为不同样本来源miRNA稳定性的影响；
图6B为不同静置时间对miRNA稳定性的影响；
图6C为反复冻融对miRNA稳定性的影响；
图6D为妇女月经期对miRNA的影响；
图6E为年龄对血液循环miRNA的影响；
图6F为miRNA胰腺癌小样本临床实验灵敏度和特异性检测；
图7为miRNA胰腺癌临床中试灵敏度和特异性检测；
图8为miR-15b-5p与miR-212胰腺癌临床中试灵敏度和特异性检测；
图9为miR-181a-3p*与miR-181b胰腺癌临床中试灵敏度和特异性检测；
图10为不同miRNAs杀死胰腺肿瘤干细胞对比图；
图11为miR-34a抑制胰腺癌干细胞呈球性；
图12为miR-34a对不同生物标志物抑制作用；
图13为不同浓度miR-34a对胰腺癌干细胞生长的抑制作用；
图14为miR-34a对胰腺癌干细胞生长抑制是通过失活cMET激酶活性；
图15为CD44+/cMET+阳性群对吉西它滨、miR-34a的抗性测试；
图16为miR-34a抑制胰腺癌干细胞生长细胞表面标志物信使RNA表达；
图17为单独miR-34a用药及miR-34a与吉西它滨联合用药对小鼠胰腺癌肿瘤生长的抑制作用；
图18为miR-34a抑制胰腺肿瘤生长的信号传递途径；
图19为miRNA对胰腺癌细胞体内成肿瘤性影响，其中Φ表示未注射miRNA部位。
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
实施例1
根据美国癌症联合委员会(The American Joint Committee on Cancer(AJCC)tumor/node/metastasis(TNM)classification)分类法以及根据基因表达分类法，选取临床样本实验选材如下表。所有回溯性临床样品均来自于美国Creighton大学医学中心医院和内布拉斯加大学医学研究中心附属医院以及美国NIH癌症研究所样本库。样本选取根据以下标准：96个胰腺癌病人组织(其中45％为早期)、56个胰腺炎病人组织和56个胰腺癌病人癌旁组织(作为正常组织对照)，其中亚洲人占比11.2％；年龄、性别以及饮酒史均无明显统计差异，但是在吸烟史以及即吸烟有饮酒史方面由明显统计差异；所有用于验证差异表达miRNAs样本来源于美国NIH癌症研究所样本库，所选标准跟回溯性研究相同。
采用Trizol方法抽提miRNA：选取受试者血浆，以1、2、3微克线虫微小核糖核酸(Cel-miR-39)作为内参，在选定的临床样本1毫升血浆内加入以上固定的Cel-miR-39，对比提取前后Cel-miR-39的变化来测试提取方法的得率(微克)。比对结果如图1所示，可知采用Trizol方法得率更高。将抽提后的miRNA经过定量、质量控制分析(A260/A280比率：>2.0)、荧光标记、反转录、扩增后，将早期与中晚期胰腺癌病人样本中血浆miRNA的Ct表达值转换为与正常样本比较的倍数比，并将其归一化、聚类分析且绘制成图基因表达强弱的“热图”，通过生物统计数据分析找出极显著差异miRNA，并对差异表达miRNAs用定量PCR验证，控制FDR(假阳性率)小于2％。大范围搜寻差异表达miRNAs是通过荧光定量PCR实现的，并进一步通过二代测序法和定量荧光PCR验证所筛选的差异miRNAs的真实性。具体定量荧光PCR反应条件如下，即，1cycle 95℃10min；扩增40cycles95℃30s，48℃40s，60℃1min，退火1cycle40℃10s。与正常胰腺组织比较，早期癌变组织差异表达miRNA分子为143个，如图2所示早期胰腺癌细胞内差异表达miRNAs分子，其中红色为高表达miRNAs；绿色为低表达miRNAs。该图右方标注的文字为所检测的143个miRNA，该图证实了miRNA可区分正常人和胰腺癌患者，其中部分高表达miRNA还可以区分早期胰腺癌与中晚期胰腺癌患者。将选定miRNAs用定量RT-PCR方法分析验证该miRNA内在表达量，结果如图3所示。差异表达的miRNAs用定量荧光PCR法准确验证了其真实性，其中，不同颜色代表胰腺癌不同病理时期；a,b,c分别代表统计分析显著性不同的显著性水平。
将筛选得到的143种差异表达的miRNAs分子经过多次定量反转录法验证后，发现只有54种在早期胰腺癌组织细胞内显著差异表达，反转录法按以下参数设置，并RNA转化为cDNA:参数设置：16℃30min、42℃30min、85℃5min、4℃∞；反转录后的cDNA信息再通过定量荧光PCR反应检测miRNA信号。如图5所示。54种miRNAs中，根据平均变化倍数＞2且p＜0.05可进一步筛选具有高表达的胰腺癌分子标记物。
实施例2
1、前瞻性实验
(1)小临床实验(100人)：根据Creighton大学蛋白组代谢组学研究中心数据库，召集100人参与小临床实验(标准如下，表1)：
表1：胰腺癌临床样本特征及来源(前瞻性实验)(Creighton大学、UNMC联合胰腺癌研究中心癌症样本库及Susanzuman临床样本库，2012-2014)
临床设计如下：
a，双盲混合前瞻性研究法；b，病理辅助验证；c，病人特征确定；d，参试者(N＝100)比例：
白人群：65％
黑人群：20％
西语裔人群：12％
亚洲裔人群：3％
主要参考指标：年龄、吸烟、家族病史。
采血样、尿样及唾液，进行实验：定量PCR、理化特征分析、临床稳定性试验。
如图6A所示为不同样本来源miRNA稳定性，miRNA-143-3p、miR-143-5p*和miR-132，在正常人和胰腺癌病人的尿液、血浆、胰腺液和唾液中均有表达，但是在血浆中的稳定性更佳。
如图6B所示为不同静置时间对miR-132、miR-143-3p、miR-143-5p*和miR-106b稳定性的影响，该图表明常温下放置过夜的血清对miRNAs的稳定性没有影响。
如图6C所示为反复冻融对miR-132、miR-143-3p、miR-143-5p*和miR-106b稳定性的影响，该图表明反复冻融多达8次对miRNAs的稳定性没有影响。
如图6D所示为妇女月经期对miR-132和miR-143-5p*的影响，该图表明女性经期对miRNAs的稳定性没有影响。
如图6E所示为不同年龄其对血液循环miR-132、miR-143-3p、miR-143-5p*和miR-106b的影响，该图表明不同年龄跨度对miRNAs的稳定性没有显著性影响。
如图6F所示为miRNA检测胰腺癌灵敏度和特异性，设总面积为1，可以看出图6F左曲线下面积miR-132为1.0，miR-155为0.993，miR-143-5p*为0.822，可见miR-155和miR-132的灵敏度和特异性更佳。
与正常人比较，34个miRNAs显著性高于正常人，其检测灵敏度和特异性均在95％以上
(2)中试(～220人)：临床设计方法跟(1)小临床实验类似，即，a，双盲混合前瞻性研究法；b，病理辅助验证；c，病人特征确定；d，参试者(N＝220)比例：
白人群：60％
黑人群：21％
西语裔人群：11％
亚裔人群：8％
主要参考指标：年龄、吸烟、家族病史。
实验结果：中试实验结果如图7所示，与参试对照组比较，参试34个差异表达miRNAs中，25个有极显著差异，其检测有早期胰腺癌灵敏度均在95％以上，特异性为95％以上。
如图8所示为miR-212与miR-15b-5p灵敏度和特异性检测，说明与miR-212比较，miR-15b-5p是更为敏感的诊断胰腺癌生物标记物。
如图9所示为miR-181a-3p*与miR-181b灵敏度和特异性检测，二者均在95％以上，但与miR-181b比较，miR-181a-3p*是更为敏感的诊断胰腺癌生物标记物。
2、miRNAs生物学特征
1)miRNA诱导胰腺癌细胞凋亡，对miR-375、miR-34a、let-7i进行胰腺癌细胞凋亡测试，如图10所示，miR-34a具有显著的抗胰腺癌细胞效果，miRNA-34a可用于开发为新的抗胰腺肿瘤小分子药物。
2)miRNA-34a诱导胰腺癌干细胞呈球性(自我更新能力)，如图11所示，miRNA-34a抑制胰腺癌干细胞呈球性(即抑制胰腺肿瘤干细胞干性)。
3)miRNA-34a抑制胰腺癌干细胞表面生物标志物表达，如图12所示，miRNA-34a能显著抑制显示胰腺癌干细胞干性变化的生物标志物Snail,Zeb1及N-Cad基因表达；如图13所示，对胰腺癌干细胞的抑制有效作用浓度为20nM,这些结果说明miRNA-34a能显著抑制胰腺癌干细胞干性，有望开发为治疗胰腺肿瘤有效药物。
4)miRNA-34a明显抑制cMET激酶磷酸化。如图14所示，miRNA-34a明显抑制cMET信号通路实现对胰腺肿瘤生长的抑制作用。
5)miRNA-34a能显著地提高抗吉西它滨胰腺癌细胞治疗的敏感性。如图15所示，从抗吉西它滨药物胰腺癌细胞分离出来的胰腺肿瘤类癌症干细胞群CD44+/cMET+阳性群对吉西它滨有明显的抗性，但miR-34a能显著地提高这类细胞对治疗的敏感性，miR-34a显著优于一线用药吉西它滨，并能显著提高抗吉西它滨治疗的胰腺癌细胞灵敏度；如图16所示，分离出来的类干细胞群具有明显的干细胞表面标志物特性，即干细胞表面标志物信使RNA在这类细胞高表达；如图17所示，miRNA-34a不仅能显著抑制CD44+/cMET+阳性干细胞生长，而且能显著地抑制胰腺肿瘤体内快速生长。
6)miR-34a对胰腺肿瘤干细胞的抑制作用是通过抑制Notch等主要分子信号通路实现的。如图18所示，miR-34a能促进凋亡基因Bax高表达，而显著抑制控制癌细胞存活基因Survivin基因表达，并且，miR-34a显著抑制hes1和hes2以及notch1、notch2以及notch3基因的表达，这些结果说明miR-34a的抑制作用主要是通过抑制Notch信号通路实现的。
7)miR-34a抑制胰腺癌干细胞体内成瘤性。如图19所示，miR-34a基因稳定转入线病毒载体，成为荷载miR-34a腺病毒颗粒，稳定转染胰腺癌干细胞，注入小鼠胰腺部位，六周后发现，与未荷载miR-34a的对照比较，荷载miR-34a线病毒能显著抑制胰腺癌干细胞在体内的成瘤性。
以上临床前结果表明，miR-34a能被开发成为有效的抗胰腺癌新的小分子药物。
对比实施例
将本发明25种微小核糖核酸与现有技术CN101942502A公开的36种微小核糖核酸进行灵敏度、特异性的比较，比较结果如下表2所示：
表2本发明25种微小核糖核酸与现有的种微小核糖核酸灵敏度、特异性比较
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.早期胰腺癌标记物，其特征在于，包括以下在人体体液中稳定存在且可检测的微小核糖核酸：hsa-miR-143-5p*、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-221-5p*、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-23a-5p*、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-1-5p*、hsa-miR-24-2-5p*、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-15b-3p*、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-145-3p*、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181a-3p*、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-196a-3p*、has-miR-10b、has-miR-30c、has-miR-106b、has-miR-132、has-miR-155、has-miR-181b、has-miR-212和has-miR-34a中一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的早期胰腺癌标记物，其特征在于，包括用于三组联合检测的微小核糖核酸：
1)has-miR-132、has-miR-10b、has-miR-30c、has-miR-143-3p、has-miR-145-5p；
2)hsa-miR-221-3p、hsa-miR-23a-5p*、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-1-5p*、hsa-miR-24-2-5p*；
3)has-miR-155、has-miR-181b、has-miR-212、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-106b。
3.一种如权利要求1所述的早期胰腺癌标记物的检测方法，其特征在于，首先利用回溯性实验、定量PCR芯片检测到正常胰腺组织、发炎组织及早期癌症组织细胞内miRNA含量，并用临床测试回溯性样本验证，找到在早期胰腺癌细胞组织内差异表达的miRNAs；然后，对上述差异表达miRNAs进一步验证，得到第二次验证的早期胰腺肿瘤细胞内miRNAs；再通过小范围临床前瞻性实验，找到具有临床可用性的miRNAs；最后通过临床中试，进一步验证找到权利要求1所述的胰腺癌标记物miRNAs。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用Trizol方法或旋转柱洗脱法对miRNA抽提；
(2)将miRNA经过定量、质量控制分析、荧光标记、反转录、扩增、扫描图像、归一化分析、统计数据分析，找出具有极显著差异miRNAs；
(3)将选定的miRNAs用定量RT-PCR方法分析验证该分子内在表达量，并将选定的miRNAs分子在临床样品上进行内在表达验证，筛选出差异表达的miRNAs；
(4)将筛选的差异表达的miRNAs再次进行小临床实验，进行定量PCR、理化特征分析、临床稳定性试验筛选出灵敏度和特异性高的miRNAs；
(5)将筛选的灵敏度和特异性高的miRNAs进行中试临床实验，筛选出25种具有极显著差异的miRNAs。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述体液为血清/血浆、唾液、尿液或胰腺液。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：选取受试者血浆或唾液，以1、2、3微克线虫微小核糖核酸(Cel-miR-39)作为内参，在选定的1毫升血浆内加入以上固定的Cel-miR-39。
7.一种用于检测早期胰腺癌癌标记物的探针组合，该探针组合包含权利要求1所述miRNAs中一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述的探针组合，其特征在于，权利要求1所述miRNAs探针序列为：
序列号 miRNAs 探针序列 SEQ#1 hsa-miR-143-5p* TAATGGTCCAGCATAACCCTCG SEQ#2 hsa-miR-143-3p TACGCTCCCAGCATAACCCTCG SEQ#3 hsa-miR-221-5p* ACTGATTTCCAGCATAACCCTCG SEQ#4 hsa-miR-221-3p TTTCCCAGCATAACCCTCG SEQ#5 hsa-miR-23a-5p* CATTGATTTCCAGCATAACCCTCG SEQ#6 hsa-miR-23a-3p TCCCCAGCATAACCCTCG SEQ#7 hsa-miR-24-1-5p* TCAGTCCAGCATAACCCTCG SEQ#8 hsa-miR-24-2-5p* CTACACAGCCAGCATAACCCT SEQ#9 hsa-miR-24-3p TCAACAGCTCCTATGGACGACC SEQ#10 hsa-miR-15b-5p TACACTCCTATGGACGACCCTC SEQ#11 hsa-miR-15b-3p* TCTACTCCTATGGACGACCCTC SEQ#12 hsa-miR-145-5p TCCCTCTCCTATGGACGACC SEQ#13 hsa-miR-145-3p* TTCTCTCCTATGGACGACCCTC SEQ#14 hsa-miR-181a-5p TTATGAGTCTCCTATGGACGACCC SEQ#15 hsa-miR-181a-3p* TACCCTCCTATGGACGACCC SEQ#16 hsa-miR-196a-5p ACAATGGGCTCCTATGGACGACC SEQ#17 hsa-miR-196a-3p* TTGAGCCTATCACCGTTGTCC SEQ#18 hsa-miR-10b-5p CTGTGCCTATCACCGTTGTCC SEQ#19 hsa-miR-30c-5p TCAGCCCTATCACCGTTGTC SEQ#20 hsa-miR-106b-5p CCTAGATCCTATCACCGTTGTCCA SEQ#21 hsa-miR-132-5p* TACTCCTATCACCGTTGTCCAC SEQ#22 hsa-miR-155 TCCTGCTTGACTGTAGCCGA SEQ#23 hsa-miR-181b TCCTGCTTGACTGTAGCCGA SEQ#24 hsa-miR-212 TTACTCCTGCTTGACTGTAGCC SEQ#25 has-miR-34a TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT
9.一种如权利要求1所述早期胰腺癌标记物在试剂盒上的应用，其特征在于，该试剂盒包括用于检测早期胰腺癌标记物的miRNAs探针组合。
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