CN101988059A - 胃癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用人体血清/血浆中稳定存在的21种特定微小核糖核酸作为胃癌的检测标记物以及检测该标记物的方法、相关试剂盒及生物芯片。能够用于胃癌的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价等方面，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胃癌普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高胃癌的临床检出率，成为早期诊断乳腺癌的有效手段。

Description

胃癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人血清/血浆中微小核糖核酸分子的分离、定性和定量分析，同时也涉及胃癌的各种临床指征。具体来说，本发明是一种利用胃癌病人血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为胃癌的检测标记物以及检测该标记物的方法、相关试剂盒及生物芯片，通过胃癌病人血清/血浆中微小核糖核酸的变化，在体外诊断胃癌与慢性胰腺炎，判断胃癌发病过程，预测胃癌并发症的发生和胃癌复发的几率、以及胃癌的预后，并分析药效和疗效。

背景技术

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。在胃的恶性肿瘤中，腺癌占95％。这也是最常见的消化道恶性肿瘤，乃至名列人类所有恶性肿瘤之前茅。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。

我国胃癌死亡率为25.2/10万(男性：32.8/10万，女性：17.0/10万)，占全部恶性肿瘤死亡的23.2％，占恶性肿瘤死亡的第一位。胃癌诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。同时辅助的检测手段还包括癌的免疫学反应、体内特殊化学成分的测定及酶反应等。血中如血清胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原I/II之比；CEA，CA19-9，CA125等癌胚抗原及单克隆抗体的检测都可以对胃癌的诊断提供参考，但这些检查假阳性与假阴性均较高，特异性不强。

尽管越来越多的疾病标记物已经被发现并应用于临床疾病的普查、诊断和疗效的监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足。例如，肿瘤标记物甲胎蛋白，乳酸脱氢酶，癌胚抗原等已被广泛应用于临床，但是这些疾病标记物还远远不能满足对癌症早期诊断的需要，其主要原因有两个方面：(1)上述疾病标记物的灵敏度和特异性相对较低，它们的检测结果还不能作为疾病确诊的指标；(2)疾病的早期诊断率应与治疗的效果呈现正相关，而上述任何一种疾病标记物还难以满足疾病早期诊断的这种要求。以癌症为例，由于存在着肿瘤分化类别特异性过强、肿瘤整体敏感性较低、送检标本难以反复采取、标本保存要求条件高等缺陷，同时价格昂贵，因此在现有条件下难以广泛推广应用现有的肿瘤标记物。而一些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本材料不足或人为经验不足等都将导致误诊。其它技术例如影像学虽然已被广泛应用于疾病的检查和诊断，但其在疾病程度的定性上仍存在着很大的局限性。因此目前非常有必要寻找能够弥补现有标记物的上述缺陷的新型、灵敏并且应用方便的疾病检测标记物。

微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖核酸的表达水平均有不同程度的下调(Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM et al.Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol 2008；141：672-675)；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化(Garofalo M，Quintavalle C，Di Leva G et al.MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.Oncogene 2008)。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联(Tryndyak VP，Ross SA，Beland FA，Pogribny IP.Down-regulation of the microRNAs miR-34a，miR-127，and miR-200b in rat l iver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet.Mol Carcinog.2008 Oct 21)。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生和发展之间存在着必然联系。

由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸或过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。

国内目前已有以微小核糖核酸作为疾病标记物的相关研究，如中国专利申请CN100999765A和CN101298630A，它们均选取占恶性肿瘤发病率第4位的结肠癌作为研究对象，经研究发现，在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间，一些微小核糖核酸分子都存在着特异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建立起一种更敏感、更精确的早期确诊结肠癌的方法。然而由于组织标本的取材不容易使这种方法在临床上的广泛应用受到了限制。

发明内容

为克服上述缺陷，本申请人将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中就可以收集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送营养并清除废物，因此血液能够反映出整个机体的生理病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。已知血清/血浆中存在着多种蛋白，如总蛋白、白蛋白、球蛋白等，多种脂质，如HDL胆固醇、三甘油脂等，多种糖质，色素，电解质和无机盐，多种酶，如淀粉酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、胆素脂酶、醛缩酶等，同时还汇集了来自全身组织器官的多种信号分子，如细胞因子，激素等。目前，对疾病的诊断仅仅局限于血清/血浆中的上述生化指标，尚无血清/血浆微小核糖核酸的报道。人们传统观念中认为血清/血浆中没有核糖核酸分子，即使有也会很快被核糖核酸酶降解为小分子片段而检测不到。但是，由于微小核糖核酸分子是由19至23个核苷酸单元组成，具有结构上的特殊性和相对稳定性，它们极有可能存在于血清/血浆中。本申请发明人之一张辰宇教授的前期研究已经证实，血清/血浆中稳定地存在微小核糖核酸，且每一种疾病有其特异性的变化图谱(Chen et al：Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res.2008 Oct；18(10)：997)。

为寻找胃癌检测标记物并对其进行准确检测，本发明人基于已有的研究成果，进行了以下几个方面的研究：

(1)研究胃癌发病过程中血清/血浆微小核糖核酸的特异性变化；

(2)通过用于检测血清/血浆微小核糖核酸的生物芯片和测序技术测定胃癌血清/血浆微小核糖核酸的变化；

(3)将筛选到的在胃癌及正常生理状态下表达差异程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸分子应用于血清/血浆微小核糖核酸检测技术，制备应用于胃癌诊断等领域的生物芯片和诊断试剂盒。

通过上述对血清/血浆微小核糖核酸与胃癌的相关性的研究，申请人提出了以血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为胃癌检测标记物，建立一种体外检测血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸的方法，通过检测特定微小核糖核酸的特异性变化来进行胃癌的早期诊断，疾病鉴定和病程监控，复发及预后、并发症发生的预测，同时可以进一步进行药效判定、用药指南、个体化治疗、中药有效成份筛选、种群分类等研究。

本发明的目的首先是提供一种胃癌检测标记物，所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体(Mature microRNA)中的任意一种或一种以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种)，优选任意两种或两种以上：

miR-20a，miR-34a，miR-25，miR-27a，miR-1，miR-92a，miR-223，miR-320，miR-375，miR-151-3p，miR-324-3p，miR-339-3p，miR-423-5p，miR-451，miR-486-5p，miR-629，miR-652，miR-320b，miR-320c，miR-1224和miR-1307。

上述可作为胃癌检测标记物的微小核糖核酸，优选以下miR-1，miR-20a，，miR-27a，miR-34a或miR-423-5p中的任意一种或一种以上。

上述血清/血浆可以来源于人体活体、组织、器官和/或尸体。

本发明的另一个目的是提供检测上述胃癌检测标记物的方法，通过该方法可以进一步评价人体胃癌的状态。

上述检测方法选自反转录聚合酶链式反应方法(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time PCR)、Northern印迹杂交方法(Northern blotting)、核糖核酸酶保护分析方法(RNase protection assay)、Solexa测序技术(Solexa sequencing technology)或生物芯片方法。

上述RT-PCR方法为优选方法，包括以下步骤：

1)提取受试者的血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以受试者的血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；

3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；

4)EB染色后在紫外灯下观察结果。

上述Real-time PCR方法为另一优选方法，包括以下步骤：

1)提取受试者的血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以受试者的血清/血浆样本作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2)用微小核糖核酸设计引物；

3)加入荧光探针进行PCR反应；

4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。

上述Northern blotting方法包括以下步骤：

1))提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；

2)进行变性PAGE电泳和膜转移实验；

3)制备同位素标记微小核糖核酸探针；

4)进行膜杂交反应；

5)同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。

上述RNase protection assay方法包括如下步骤：

1)进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；

2)提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；

3)将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；

4)加入RNase消化液进行反应；

5)进行电泳与放射自显影；

6)分析结果。

上述Solexa sequencing technology方法包括如下步骤：

1)提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；

2)进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；

3)将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端；

4)进行RT-PCR反应后并进行测序；

5)数据分析与处理。

上述生物芯片方法包括如下步骤：

1)将人体血清/血浆中全部一千多种微小核糖核酸成熟体库点阵并制备生物芯片；

2)提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；

3)通过柱分离来分离微小核糖核酸；

4)利用T4RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；

5)与生物芯片进行杂交反应；

6)数据检测与分析。

上述方法中所使用的血清/血浆来源于受试者活体、组织、器官和/或尸体。

本发明通过上述方法可以分析在胃癌患者血清/血浆中微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与胃癌的相关性。因此，以上检测受试者血清/血浆中21种特定微小核糖核酸的方法，可以进一步评价人体胃癌的状态，进而可以为人们提供一种预测、诊断、鉴别和/或评价胃癌的方法，该方法主要通过检测受试者血清/血浆中21种特定微小核糖核酸即所谓的胃癌检测标记物来实现。

本发明又一目的是提供上述胃癌检测标记物在制备、预测、诊断、鉴别和/或评价胃癌的试剂或工具中的应用，包括制备相应的试剂盒和生物芯片。

本发明还提供了一种用于检测胃癌标记物的微小核糖核酸探针组合，也即预测、诊断和/或评价胃癌的微小核糖核酸探针组合，所述探针组合包括以下核苷酸序列所示的探针中的任意一种或一种以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种)，优选任意两种或两种以上：

miR-20a，miR-34a，miR-25，miR-27a，miR-1，miR-92a，miR-223，miR-320，miR-375，miR-151-3p，miR-324-3p，miR-339-3p，miR-423-5p，miR-451，miR-486-5p，miR-629，miR-652，miR-320b，miR-320c，miR-1224和miR-1307。

上述可用于检测胃癌检测标记物的微小核糖核酸探针组合，也即预测、诊断和/或评价胃癌的微小核糖核酸探针组合中，优选包括以下核苷酸序列所示的探针中的任意一种或一种以上：

miRNA	对应的探针序列	序列编号
			miR-1	TACATACTTCTTTACATTCCA	SEQ ID NO.5
miR-20a	CTACCTGCACTATAAGCACTTTA	SEQ ID NO.1
			miR-27a	GCGGAACTTAGCCACTGTGAA	SEQ ID NO.4
miR-34a	AACAACCAGCTAAGACACTGCCA	SEQ ID NO.2
			miR-423-5p	AAAGTCTCGCTCTCTGCCCCTCA	SEQ ID NO.13

本发明还提供了一种用于检测胃癌检测标记物的试剂盒，也即预测、诊断、鉴别和/或评价胃癌的试剂盒，该试剂盒包括检测上述标记物的工具。优选地，其中所述工具包括上述用于检测胃癌标记物的微小核糖核酸探针组合；更优选地，所述工具还包括DNA聚合酶(PCR反应中用于催化DNA合成的酶)、脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP mixture)。

将筛选出来的与胃癌相关的特异性变化的微小核糖核酸引物或其相应的探针序列收集到PCR试剂盒(RT-PCR或Real-time PCR)中即可制备胃癌诊断试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测胃癌检测标记物的生物芯片，也即预测、诊断、鉴别和/或评价胃癌的生物芯片，该生物芯片包括检测上述标记物的元件。优选地，其中所述元件包括上述用于检测胃癌检测标记物的微小核糖核酸探针任意一种或一种以上的组合。

将筛选出来的与胃癌相关的特异性变化的微小核糖核酸的反向互补序列作为探针点在芯片，就制成了专门针对胃癌的血清/血浆微小核糖核酸检测生物芯片。

具体而言，在上述任何含有以上1种到21种微小核糖核酸标记物的组合、方法、试剂盒或生物芯片中，所述评价受试者的胃癌状态为测定受试者给予待测物后的胃癌状态，具体用于筛选待测物(用于治疗胃癌的药物)的预防和/或治疗胃癌的活性；所述评价受试者的胃癌状态为诊断和/或鉴别诊断受试者的疾病；所述评价受试者的胃癌状态为评价对受试者的疾病进行治疗的有效性；所述评价受试者的胃癌状态为对受试者发生胃癌进行预测，所述发生胃癌具体为胃癌并发症的发生和/或胃癌的复发。

目前对疾病进行临床诊断的传统生物化学及分子生物学技术还比较繁琐和粗糙。近年来发展起来的有可能用于疾病诊断的新型技术有基因芯片和蛋白质(抗体)芯片技术等。基因芯片所测量的mRNA水平变化并不能完全反映真正的蛋白质水平的改变。因为蛋白质的生物活性与转录后修饰如糖基化，磷酸化等密切相关。并且，对于许多疾病检测而言，基因芯片技术无法检测体液和血液中标记物分子。蛋白质(抗体)芯片技术和蛋白质组学技术也有其局限性。人体内特别是血清/血浆中含有数以万计的蛋白和多肽片断，它们浓度分布广，明确报道的蛋白很少，定量化的就更少了。在这数量庞大的蛋白质组中找寻与特定疾病有密切关联的蛋白质，并理解其在组织病变中的作用仍然是一项极其艰巨的工作，而且，缺乏完善的抗体资源将会是制约抗体芯片技术发展的一个瓶颈问题。血清/血浆微小核糖核酸检测技术，基于血清/血浆微小核糖核酸的生物芯片和诊断试剂盒巧妙地将血清/血浆微小核糖核酸的独特性质和常规分子生物学检测技术结合为一体，它们可以快速地高通量地分析胃癌血清/血浆中微小核糖核酸的组成，临床适用性极强。由于器官组织的生理状态变化会引起血清/血浆微小核糖核酸组成的改变，因此血清/血浆微小核糖核酸可以作为“疾病指纹”，实现胃癌的早期诊断。

综上所述，本发明具有如下优点：

(1)将筛选出的特定血清/血浆微小核糖核酸作为新型的胃癌标记物，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放(血清/血浆-20℃存放即可)等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，成为早期诊断疾病的有效手段。

(2)血清/血浆微小核糖核酸作为新的疾病标记物，将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率和实现疾病的早期诊疗。

(3)血清/血浆微小核糖核酸检测技术的优势在于，其检测的是一系列疾病相关标记物，因而能够克服病人个体之间的差异(即年龄、性别、种族、饮食和环境等)，而这正是单一疾病标记物所无法逾越的一个主要障碍。

总之，本发明可以进一步应用于早期确诊胃癌，这种新的血清/血浆胃癌标记物不仅为人们在分子水平上全面了解胃癌的机理提供了物质基础，也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步。基于血清/血浆微小核糖核酸的优越性，相信不久的将来，对重症疾病如癌症的血清/血浆微小核糖核酸诊断技术将会成为常规体检的一部分，而且微小核糖核酸相关的基因治疗也会广泛地应用，征服这些疾病不再是梦想。

附图说明

图1显示正常人血清中直接检测到的部分微小核糖核酸的RT-PCR结果。

图2显示提取正常人血清中RNA并检测其中微小核糖核酸的RT-PCR结果。

图3分别显示小鼠、大鼠、胎牛、小牛和马血清中直接检测到的部分稳定表达的微小核糖核酸RT-PCR结果。

图4A至4B显示糖尿病及骨肉瘤病人血清/血浆中微小核糖核酸的与正常人的表达差异

图5A至5B显示5种特异性血清/血浆微小核糖核酸在正常人群和胃癌患者聚类分析的结果示意图。

图6A至6B显示5种miRNA检测胃癌的灵敏性和特异性示意图。

具体实施方式

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。

实施例1血清/血浆中微小核糖核酸的RT-PCR实验

使用RT-PCR技术发现并证明人和动物血清/血浆中稳定存在各种微小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为：

(1)收集小鼠、大鼠、正常人及某些病人的血清/血浆；

(2)制备cDNA样品。该操作有两种方案，一种方案为将10μl血清/血浆直接进行逆转录反应，另一种为使用Trizol试剂(Invitrogen公司)先提取血清/血浆总RNA(10ml血清/血浆通常能富集约10μg左右的RNA)，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV buffer、2μl 10mMeach dNTP mixture(Takara公司)、0.5μl RNase Inhibitor(Takara公司)、2μl AMV(Takara公司)以及1.5μl基因特异性反向引物混和物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

(3)PCR及电泳观察。将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，0.2μl 10μM正向引物，0.2μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM each dNTP mixture(Takara公司)，2μl 10×PCR buffer，13.5μlH20，20μl体系进行PCR。PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。PCR产物取10μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察。

具体实验结果见图1。图1是以取自正常人的血清为研究对象，将血清直接进行RT-PCR的实验结果。选用人全部1000多种微小核糖核酸成熟体进行PCR反应，图1为其中的12种微小核糖核酸。它们分别是血细胞特异性的微小核糖核酸miR-181a、miR-181b、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150，来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-1、miR-133a、miR-206，来自脑组织的微小核糖核酸miR-9、miR-124a，以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a。从结果可以看出上述四种组织来源的微小核糖核酸在血液中都能检测到，并非全部1000多种微小核糖核酸成熟体在血清/血浆中都有高丰度表达，有些微小核糖核酸是很微量的，甚至不能正常检测到。

为了进一步验证血清/血浆中稳定存在这些微小核糖核酸，先提取正常人血清中的RNA，然后选用人全部1000多种微小核糖核酸成熟体进行PCR实验，结果如图2所示。图2的结果与图1的结果很吻合，PCR产物单一，表明这两种实验方法都能检测到人血清/血浆微小核糖核酸的表达和丰度，证明在人血清/血浆中稳定地存在多种组织来源微小核糖核酸。

在图1和图2中，U6是分子量为100bp的snRNA，作为微小核糖核酸实验的内参照分子，其余的12个代号分别代表血细胞特异性的微小核糖核酸miR-181a(181a)、miR-181b(181b)、miR-223(223)、miR-142-3p(142-3p)、miR-142-5p(142-5p)、miR-150(150)，来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-1(1)、miR-133a(133a)、miR-206(206)，来自脑组织的微小核糖核酸miR-9(9)、miR-124a(124a)，以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a(122a)。

此外，用同样的方法检测了小鼠、大鼠、胎牛、小牛和马血清中1000多种微小核糖核酸的表达和丰度，同样发现不同组织来源的微小核糖核酸在小鼠、大鼠、胎牛、小牛和马血清中有稳定表达，结果如图3所示。

实施例2血清/血浆中微小核糖核酸的real-time PCR实验

为了研究胃癌疾病过程中血清/血浆微小核糖核酸的特异变化，进行了血清/血浆微小核糖核酸的定量PCR实验。定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR一样，唯一不同是在PCR的时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism7300荧光定量PCR仪，反应条件为95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。数据处理方法为ΔΔCT法，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CT样品-CT内参。将病人血清/血浆样本与正常人血清/血浆样本直接进行逆转录反应，通过定量PCR反应比较其中所含微小核糖核酸的量。

选取骨肉瘤及糖尿病病人血清样品，同时用人全部1000多种微小核糖核酸成熟体进行PCR实验。结果如图4A和图4B所示。骨肉瘤和糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值分别有上调和下调，而且同一组织来源微小核糖核酸在不同疾病中变化程度不同，表明血清/血浆微小核糖核酸在不同疾病中有特异性变化，它们可以作为一类新的疾病诊断的标记物。

实施例3用于诊断胃癌的血清/血浆微小核糖核酸芯片

芯片操作流程为：

(1)提取血清/血浆中总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；

(2)微小核糖核酸的分离：取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNA Isolation Kit(Cat#.1560)分离微小核糖核酸；

(3)微小核糖核酸样品的荧光标记：利用T4 RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；

(4)杂交与清洗：将RNA溶于16μL杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt’s solution)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；

(5)芯片扫描：芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；

(6)数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。

将定量PCR技术和生物芯片技术双重验证的在胃癌及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸探针，用于制备生物芯片，方法同上。此芯片与传统芯片相比，制作工艺和操作流程没有很大改进，但是此芯片简化了探针库，由此将大大减少芯片的制作成本和生产时间，易于制备。同时也增加了芯片的针对性和实用性。将此芯片投入实践，仅仅需要病人的血清/血浆而不需要任何其它组织就可以在早期发现疾病，帮助指导诊断和治疗。

实施例4用于胃癌诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒

用于胃癌的诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价以及药物活性成分的筛选、药效评价的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量和半定量PCR技术和生物芯片技术。

首先通过测序的方法或PCR方法确定正常血清/血浆中有一个以上拷贝的微小核糖核酸。然后通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选在胃癌及正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸，作为预测是否发生胃癌以及诊断病变程度的指标。最后筛选出的对应胃癌的血清/血浆微小核糖核酸的数量为21种，这是在芯片探针库的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清/血浆微小核糖核酸引物、Taq酶、dNTP等试剂。

本实施例中所有检测样本均来自在医院确诊为胃癌患者及对等年龄和相同性别的正常人(对照)。

首先，采用Solexa测序的方法确定正常血清/血浆中有一个以上拷贝的微小核糖核酸，通过检测血清/血浆中miRNA的变化，筛选出与正常人(对照组)相比，胃癌患者血清样本中变化的miRNA。

然后，通过定量PCR技术和生物芯片技术，筛选出在疾病及正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清/血浆微小核糖核酸。依据平均变化倍数超过5并且拷贝数大于10，并且结合实验室前期研究结果，选定了21个miRNA检测指标，作为预测是否发生胃癌以及诊断病变程度的指标，具体结果见表1。

1选定的microRNA

结合实验室前期研究，和表1数据，选出表达上调的21种miRNA中，根据平均变化倍数＞2并且p值＜0.01的选择标准，进一步优选出5种miRNA作为胃癌检测的分子标记物，具体为miR-1，miR-20a，，miR-27a，miR-34a，和miR-423-5p。

具体结果见表2。

表2选定的5种miRNA

通过对上述5种miRNA进行聚类分析，再次表明它们在胃癌及正常对照血清样本之间的表达存在差异。上述5种血清/血浆中微小核糖核酸作为胃癌的特异性指纹在正常人群和胃癌患者中的变化特异性的分析结果见图5A-B。由该图可知，可以依据此5种miRNA组合明确区分胃癌样本和正常样本。

聚类分析具体的数据处理如下：对于训练集(图5A为22例胃癌患者和22个对照)，验证集(图5B为142例胃癌患者和105个对照)。分别将胃癌样本中血清miRNA的绝对表达值转换为与正常样本比照的倍数比，并将其归一化、聚类且绘制成图5A-B(采用cluster 3.0软件作图而成)，即该5种血清/血浆中微小核糖核酸作为胃癌的特异性指纹变化的分析结果。对图5A-B详细说明如下。

在图5A中，右方标注文字均为所检测的5个miRNA，上方标注文字分别为检测样本个体，HC代表正常人(n＝22)，集中在图左侧；gastric can代表胃癌病人(n＝22)，集中在图右侧。该图证实了通过5个miRNA表达水平的检测可以将正常人和胃癌患者区分。

在图5B中，右方标注文字均为所检测的5个miRNA，上方标注文字分别为检测样本个体，HC代表正常人(n＝105)：集中在图右侧；gastric can代表胃癌患者(n＝142)，集中在图左侧。该图进一步扩大样本检测，验证了通过5个miRNA表达水平的检测可以将正常人和胃癌患者区分。

对图5A和5B进行风险打分的分析，具体结果见表3。在表3中采用统计分析软件(SAS)进行统计分析，设定风险评分数值为2.55，若样本风险评分≥2.55，则划分为胃癌患者，若样本风险评分＜2.55，划分为正常人。

具体的统计方法如下：除了控制整个过程中的每一步变量，进一步在数据聚类前将所有的数据标准化为零均值和一个标准差。为了最小化缺失值的影响并辅助分层聚类和风险评分，采用K最近邻域法K-Nearest Neighbors(KNN，一种基于缺失数据归咎的方法(a method-based missing data imputation))估算了19至20区间的缺失值。例如，如果样本A中的miRNA有一个缺失值，会在样本A中发现同样表达的其他K个miRNA，然后找到包含与病例A中其他miRNA表达最相似的样本。可以从K个最接近的miRNA在样本A中的加权平均值估算出缺失值。在加权平均值中，每个miRNA的加权值以其与miRNA中表达的相似度计算。在这里设定K等于4，即使用4个近邻的miRNA进行估算。此外，由K最近邻域法KNN得出的估算结果对于目前研究结果的影响微乎其微。所有的标记物调用率都大于97.6％，且没有样本缺失多于两个及两个以上的标记物。

在此使用了cluster 3.0中带有完全关联模式的分层聚类。为了进行风险评分，将对照组中每个miRNA数值参考区间上限的95％设为t，作为对每个样本对应的miRNA表达水平进行编码的阈值。将每个miRNA的风险评分记为S，用计算公式表达为：

$s_{\mathrm{ij}}=\left\{\begin{array}{cc}0& \mathrm{if}{r}_{\mathrm{ij}}<t_j\\ 1& \mathrm{otherwise}\end{array}\right.$

其中，i表示第i个样本，

来表示第j个miRNA。考虑到每个miRNA评估胃癌风险的权重不同，根据对miRNA的表达水平的线性组合给每个病人建立了一个风险评分的函数。依据K个miRNA的相关资料，i样本的风险评分函数是：

${\mathrm{rsf}}_i={\mathrm{\&Sigma;}}_{j=1}^k{\mathrm{sign}}_j\&CenterDot;W_j\&CenterDot;s_{\mathrm{ij}}$

在上面的公式中，sij是对于样本i中miRNA

的风险评分。Ws是miRNA

的风险评分的权重。为了决定sign和Ws，将5个单变量逻辑斯蒂回归模型拟合应用于标有风险评分的各种疾病状况。用每个风险评分中的回归系数作为表示每个miRNA在风险评分函数中的权重，而回归系数中的sign则决定了风险评估函数中的sign。然后，使用频率表和ROC曲线来评价样本群体中的诊断效果。

表3患者与对照(正常人)的风险评分

表3中，*阳性预测率，**阴性预测率

miRNA检测胃癌灵敏性和特异性示意图见图6A-B，设总面积(即检测样本总体数)为一，可看出曲线下面积(即可信度)对应于图5A的训练集(图6A)，对应于图5B的验证集(图6B)分别达到0.879和0.831。

序列表

Claims (17)

1.一种胃癌检测标记物，其特征在于所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上：

miR-20a，miR-34a，miR-25，miR-27a，miR-1，miR-92a，miR-223，miR-320，miR-375，miR-151-3p，miR-324-3p，miR-339-3p，miR-423-5p，miR-451，miR-486-5p，miR-629，miR-652，miR-320b，miR-320c，miR-1224和miR-1307。

2.根据权利要求1所述胃癌检测标记物，其特征在于，所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意两种或两种以上：

miR-20a，miR-34a，miR-25，miR-27a，miR-1，miR-92a，miR-223，miR-320，miR-375，miR-151-3p，miR-324-3p，miR-339-3p，miR-423-5p，miR-451，miR-486-5p，miR-629，miR-652，miR-320b，miR-320c，miR-1224和miR-1307。

3.根据权利要求1或2所述的胃癌检测标记物，其特征在于所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上：

miR-1，miR-20a，，miR-27a，miR-34a，和miR-423-5p。

4.根据权利要求1或2所述的胃癌检测标记物，其特征在于所述血清/血浆来源于人体活体、组织、器官和/或尸体。

5.根据权利要求3所述的胃癌检测标记物，其特征在于所述血清/血浆来源于人体活体、组织、器官和/或尸体。

6.权利要求1至5任意一项所述标记物的检测方法，其特征在于选自反转录聚合酶链式反应方法、实时荧光定量聚合酶链式反应方法、Northern印迹杂交方法、核糖核酸酶保护分析方法、Solexa测序技术或生物芯片方法。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述反转录聚合酶链式反应方法包括以下步骤：

1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以受试者的血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；

3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；

4)EB染色后在紫外灯下观察结果。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述实时荧光定量聚合酶链式反应方法包括以下步骤：

1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者以受试者的血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

2)用微小核糖核酸设计引物；

3)加入荧光探针进行PCR反应；

4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。

9.一种预测、诊断和/或评价胃癌的方法，其特征在于，所述方法包括检测以下人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的任意一种或一种以上：

miR-20a，miR-34a，miR-25，miR-27a，miR-1，miR-92a，miR-223，miR-320，miR-375，miR-151-3p，miR-324-3p，miR-339-3p，miR-423-5p，miR-451，miR-486-5p，miR-629，miR-652，miR-320b，miR-320c，miR-1224和miR-1307。

10.权利要求1或2或3所述的检测标记物在制备预测、诊断、鉴别和/或评价胃癌的试剂或工具中的应用。

11.一种用于检测胃癌检测标记物的微小核糖核酸探针组合，其特征在于所述组合包括以下探针序列中的任意一种或一种以上：

  miRNA   对应的探针序列   序列编号   miR-20a   CTACCTGCACTATAAGCACTTTA   SEQ ID NO.1   miR-34a   AACAACCAGCTAAGACACTGCCA   SEQ ID NO.2   miR-25   TCAGACCGAGACAAGTGCAATG   SEQ ID NO.3   miR-27a   GCGGAACTTAGCCACTGTGAA   SEQ ID NO.4   miR-1   TACATACTTCTTTACATTCCA   SEQ ID NO.5   miR-92a   ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA   SEQ ID NO.6   miR-223   GGGGTATTTGACAAACTGACA   SEQ ID NO.7   miR-320   TTCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT   SEQ ID NO.8   miR-375   TCACGCGAGCCGAACGAACAAA   SEQ ID NO.9   miR-151-3p   CCTCAAGGAGCTTCAGTCTAG   SEQ ID NO.10   miR-324-3p   CCAGCAGCACCTGGGGCAGTGG   SEQ ID NO.11   miR-339-3p   CGGCTCTGTCGTCGAGGCGCTCA   SEQ ID NO.12   miR-423-5p   AAAGTCTCGCTCTCTGCCCCTCA   SEQ ID NO.13   miR-451   AAACTCAGTAATGGTAACGGTTT   SEQ ID NO.14   miR-486-5p   CTCGGGGCAGCTCAGTACAGGA   SEQ ID NO.15   miR-629   GCTGGGCTTACGTTGGGAGAAC   SEQ ID NO.16   miR-652   TGCACAACCCTAGTGGCGCCATT   SEQ ID NO.17   miR-320b   TTGCCCTCTCAACCCAGCTTTT   SEQ ID NO.18

  miR-320c   ACCCTCTCAACCCAGCTTTT   SEQ ID NO.19   miR-1224   CCACCTCCCGAGTCCTCAC   SEQ ID NO.20   miR-1307   CACGACCGACGCCACGCCGAGT   SEQ ID NO.21

12.根据权利要求11所述的探针组合，其特征在于所述组合包括以下核苷酸序列所示的探针中的任意一种或一种以上：

  miRNA   对应的探针序列   序列编号   miR-1   TACATACTTCTTTACATTCCA   SEQ ID NO.5   miR-20a   CTACCTGCACTATAAGCACTTTA   SEQ ID NO.1   miR-27a   GCGGAACTTAGCCACTGTGAA   SEQ ID NO.4   mi R-34a   AACAACCAGCTAAGACACTGCCA   SEQ ID NO.2   miR-423-5p AAAGTCTCGCTCTCTGCCCCTCA SEQ ID NO.13

13.一种用于检测胃癌标记物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1至3中任一项所述标记物的工具。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述工具包括权利要求11或12所述的探针组合。

15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述工具还包括DNA聚合酶和/或脱氧核糖核苷酸混合物。

16.一种用于检测胃癌检测标记物的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含检测权利要求1至3任意一项所述的标记物的元件。

17.根据权利要求16所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片的元件包括权利要求11或12所述的探针组合。

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