CN106148538B - microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用 - Google Patents

microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。microRNA标志物组，由miR‑638，miR‑451a，miR‑23a‑3p，miR‑214‑3p和miR‑200c‑3p构成。本发明首次采用新辅助化疗的临床样本进行microarray分析，发明人通过筛选获得了具有5个miRNA标志物的microRNA标志物组；针对上述5个miRNA标志物的检测结果与已经建立的风险公式进行比较，可以很好地区分化疗效果的好坏，极大提高预测的准确性。

Description

microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒 中的应用
技术领域
本发明涉及一种microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用，属于基因检测技术领域。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在妇女恶性肿瘤发病中仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要因素，而且有发病率逐渐上升及年轻化的趋势，成为严重威胁女性健康的重要杀手之一。近几年来，乳腺癌的新辅助化疗越来越广泛地应用于临床，但是由于肿瘤的高度异质性，组织学类型、TNM分期均相同的肿瘤对同一治疗方案的疗效并不一致。有效的化疗能够降低肿瘤分期、提高手术切除率、消灭微小转移灶减少远处转移。如果化疗效果不佳，甚至化疗期间肿瘤进展，不仅浪费了财力，也可能会使患者失去最佳治疗机会，造成严重的后果，所以新辅助化疗效果的预测显得尤为重要。
使用生物分子标志物指导乳腺癌化疗一直受到人们的关注。已有研究显示MDR1、BCRP、MRP等耐药相关基因过表达的患者容易产生化疗耐药性。但是单一或少数几个指标用于指导肿瘤化疗的偏差较大。近年来，应用基因芯片检测化疗前肿瘤标本来预测肿瘤的化疗效果逐渐受到研究人员的关注。有研究使用基因芯片显示乳腺癌标本中92个基因的表达有助于预测初次化疗的反应(Lancet.2003；362:362-9)。miRNA芯片是低密度芯片，可同时检测一个标本中几百至几千种人类miRNA的表达，尽管其检测量远低于基因芯片(mRNA芯片、cDNA芯片)，但有趣的是，miRNA芯片在预测患者的预后、确定肿瘤分类或来源方面却更准确(参见Lancet Oncol.2010；11:136-46.和JAMA.2008；299:425-36.)。因此结合miRNA芯片所示的表达情况，构建乳腺癌耐药miRNA表达谱，在预测肿瘤化疗反应方面具有重要的临床指导和应用价值。
miRNA(micoRNA，微小RNA)是一类广泛存在的小单链RNA，长度为18-25个核苷酸。它由DNA转录产生，不翻译为蛋白质，是一类能够发挥调控作用的非编码基因。miRNA通过与靶基因mRNA的3’-UTR区部分互补而抑制基因表达。某些情况下，miRNA结合形成的dsRNA可触发类似RNA干扰的机制降解mRNA；或者，并不降解靶基因mRNA而是阻断其蛋白质翻译，如此，负向调控靶基因的表达。随着miRNA研究的不断深入，近年来有很多涉及miRNA参与调控肿瘤化疗耐药的相关研究，某些在瘤组织中表达异常的miRNA被证实与化疗耐药或提高药物敏感性相关。例如Zhu等发现miR-27和miR-451能够通过上调乳腺癌细胞中耐药基因MDR-1的表达，从而降低阿霉素对乳腺癌细胞的生长抑制作用。而miR-30c可通过调控YWHAZ增强乳腺癌细胞MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性。
目前，虽然miRNA在肿瘤耐药方面已有部分研究，但到目前为止，miRNA表达谱在预测乳腺癌化疗耐药性的应用报道非常少。主要是由于目前对肿瘤耐药方面的原理尚未完全研究清楚，因此在如何筛选主要评价的标志物方面导致困难，且由于乳腺癌化疗前后的肿瘤标本不易于观察评价乳腺癌细胞对化疗的敏感性，导致筛选标志物后对其作用效果难于评价。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。该microRNA标志物组可用于乳腺癌化疗耐药的预测、检测或筛查；通过实时定量PCR检测乳腺癌标本中标志物组中所涉及的5个miRNA(miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p)的表达状况，用于评判乳腺癌患者的化疗效果。
本发明技术方案如下：
microRNA标志物组，由miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p构成，miR-638的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述microRNA标志物组在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。
一种评价乳腺癌化疗敏感性的试剂盒，包括：
上述microRNA标志物组；
以及microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物。
上述microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物均可采用本领域常规市售试剂，如microRNA快速提取试剂可采用Bioteke公司销售的货号RP5301的试剂；反转录试剂(包括反应缓冲液，DNA聚合酶，反转录酶复合物，去离子水)可采用TaKaRa公司销售的货号RR066A的试剂；实时定量PCR试剂(包括反应缓冲液，qPCR复合物，去离子水)可采用GeneCopoeia公司销售的货号AOMD-Q020的试剂；人RNU6B miRNA引物可采用GeneCopoeia公司销售的货号HmiRQP9001的试剂。
microRNA标志物组中各microRNA标志物的筛选过程：
本发明通过miRNA microarray(miRNA表达谱芯片，可同时检测2019个miRNA的表达情况)选择耐药组(MP 1级)和敏感组(MP 5级)各10例乳腺癌化疗前原发灶标本进行分析，结果共发现29个miRNA差异表达的miRNA。发明人根据经验结合差异倍数及P值，挑选了15个miRNA进一步通过实时定量PCR在190例临床标本中验证。结果发现6个miRNA标志物：miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-638和miR-451a在耐药组和敏感组中存在差异表达，且与芯片结果相符；
通过进一步研究发现miR-23b-3p在ROC曲线(受试者工作特性曲线)分析中无统计学意义，发明人将5个miRNA标志物：miR-23a-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-638和miR-451a通过Logistic回归构建了风险公式。该耐药表达谱公式可以很好地区分化疗效果的好坏，而且风险数值越高的患者其化疗效果越差；而且比传统的检测单一miRNA指标以及随机组合的5个miRNA具有更高的准确性和特异性。
有益效果
1、本发明首次采用新辅助化疗的临床样本进行microarray分析，发明人通过筛选获得了具有5个miRNA标志物的microRNA标志物组；针对上述5个miRNA标志物的检测结果与已经建立的风险公式进行比较，可以很好地区分化疗效果的好坏，极大提高预测的准确性；
2、本发明通过对所述microRNA标志物组研制相对应的检测试剂盒，用于乳腺癌患者化疗耐药效果的预测，提供个性化治疗方案，具有重要的临床意义和很大的开发价值。
附图说明
图1、采用qRT-PCR方法在初筛(60例)、验证(59例)、独立(71例)和总体(190例)样本中检测了15个miRNA的表达结果柱状图；
其中，图1A为23a-3p的表达结果柱状图；图1B为23b-3p的表达结果柱状图；图1C为miR-638的表达结果柱状图；图1D为200c-3p的表达结果柱状图；图1E为miR-214-3p的表达结果柱状图；图1F为miR-451a的表达结果柱状图；
图2、miR-4454，miR-4707-5p，miR-5100，miR-4286，miR-182-5p，miR-3656，miR-3940，miR-16-5p，miR-4488的表达结果图谱；
其中，图2A为miR-4454的表达结果图谱；图2B为miR-4707-5p的表达结果图谱；图2C为miR-5100的表达结果图谱；图2D为miR-4286的表达结果图谱；图2E为miR-182-5p的表达结果图谱；图2F为miR-3656的表达结果图谱；图2G为miR-3940的表达结果图谱；图2H为miR-16-5p的表达结果图谱；图2I为miR-4488的表达结果图谱；
图3、miR-23a-3p，miR-638，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-451a及这5个miRNA组成的标志物在初筛(60例)、验证(59例)、独立(71例)样本中的ROC曲线分析图；
其中，图3A为初筛样本；图3B为验证样本；图3C为独立样本；
图4、miR-23b-3p在初筛(60例)样本中的ROC曲线分析图；
图5、miR-23b-3p，miR-23a-3p，miR-638，miR-200c-3p，miR-451a及这5个miRNA组成的表达谱在初筛(60例)、验证(59例)、独立(71例)样本中进行ROC曲线分析图；
其中，图5A为初筛样本；图5B为验证样本；图5C为独立样本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
1.2009-2013年共190例乳腺癌组织标本(化疗前乳腺癌穿刺标本和化疗后乳腺癌手术切除标本，呈配对关系)，其中119例来自山东大学齐鲁医院(随机分成两组：初筛和验证样本)，为排除地域的差异，另外71例来自聊城市人民医院的乳腺癌患者。根据新辅助化疗化疗效果，将190例病人进行MP(Miller Payne)治疗反应评价分级，其中1、2级化疗效果较差(即化疗无反应或化疗后肿瘤细胞减少小于30％)，称为化疗耐药组；3、4、5级化疗效果较好(化疗后肿瘤细胞分别减少30-90％，90％以上及完全消失)，称为化疗敏感组。本研究中乳腺癌患者临床参数，如表1所示。
表1:初筛、验证和独立中各临床样本的参数信息
2.Microarray芯片委托联川生物(LC Sciences)公司进行。
微阵列实验使用4～8μg总RNA样品。使用Poly(A)聚合酶在总RNA 3'端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接(ligation)用于后续的荧光标记。杂交反应利用微循环泵(Atactic Technologies)的循环作用在μParaflo微流体芯片上过夜进行。在微流体芯片上，每条检测探针都是由一个化学修饰核苷酸编码段(与目标microRNA互补(来源于miRBase，http://www.mirbase.org/)和一个由聚乙二醇组成的间隔段(扩大编码段与基质的间距)组成。检测探针均使用PGR(photogenerated reagent)化学法进行原位合成。杂交解链温度是通过化学修饰检测探针进行平衡。杂交使用含有质量浓度为25％甲酰胺的100μL 6×SSPE缓冲液(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8)，杂交温度为34℃。
RNA与探针杂交后，与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。利用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)进行图像数字化转换。数据分析首先是减除背景值，然后使用LOWESS过滤(Locally-Weighted Regression)进行信号归一化。10例耐药组(C)和10例敏感组(H)乳腺癌标本的芯片结果如表2所示。
表2：在乳腺癌耐药及敏感组织中差异表达的miRNA
由表2的结果可以看出miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-638，miR-200c-3p，miR-214-3p和miR-451a的差异表达。
实施例2
1.乳腺癌标本组织中miRNA的提取：采用Bioteke公司的石蜡包埋组织中miRNA的提取试剂盒。
(1)组织切片：将乳腺癌标本的蜡块切成4μm的薄片10张；
(2)切片脱蜡脱水：组织切片置入65℃恒温箱1小时融蜡，而后浸泡于二甲苯75％、85％、95％及100％乙醇；
(3)切片核染色：将切片置于新配制的苏木素溶液中40-60s，轻柔冲洗并晾干；
(4)组织挑取：于显微镜下操作1ml注射器用其针尖将切片中癌组织部分轻轻刮下，置于240μl PTL溶液和10μl蛋白酶K的混合液中混匀；
(5)miRNA提取：
1)55℃和80℃水浴各10min。
2)加入裂解液MRL(购自Bioteke公司)750μl混匀，并室温放置3min。
3)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡10秒，室温静置2min。
4)低温高速离心机12000rmp离心10min后，将水相小心吸出，加入其体积的0.6倍的体积百分比浓度为70％的乙醇，混匀后转入RA型吸附柱(购自Bioteke公司)；
5)12000rmp离心45s，取柱下滤液，加入约其体积2/3的无水乙醇，颠倒混匀，转至RB型吸附柱(购自Bioteke公司)中，10000rmp、4℃离心30s，弃滤液；
6)加入漂洗液RW(购自Bioteke公司)750μl，12000rmp、4℃离心1min，弃滤液，重复一遍操作；
7)将RB型吸附柱放回收集管中，12000rmp、4℃离心2min，静置15min；
8)向RB型吸附柱加入20～40μl RNase free water(购自Bioteke公司)，室温放置3min，12000rmp、4℃离心1min，收集EP管中得到的microRNA，测浓度后保存于-80℃冰箱。
2.qRT-PCR检测：采用All-in-oneTM miRNA qRT-PCR检测试剂盒(购自GeneCopoeia公司)。miRNA的通用下游引物序列：CAGTGCGTGTCGTGGAG和人内参U6引物(由GeneCopoeia公司设计合成)。
RT反应条件：37℃1h；85℃5min。体系如下：
(2)据芯片结果挑选出6种miRNAs(miR-23a-3p，miR-23b-3p,miR-638，miR-200c-3p，miR-214-3p和miR-451a)进行PCR验证，其序列信息如表3所示：
表3
序号 miRNAs名称 序列
1 miR-23a-3p AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC
2 miR-23b-3p AUCACAUUGCCAGGGAUUACC
3 miR-200c-3p UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA
4 miR-214-3p ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU
5 miR-638 AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU
6 miR-451a AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
表4：相关miRNAs的引物信息
表4
miRNAs名称 上游引物序列
miR-23a-3p GCCAGGGATTTCCAAAA
miR-23b-3p TGCCAGGGATTACCAAA
miR-200c-3p TGCCGGGTAATGATGGAA
miR-214-3p CAGGCACAGACAGGCAGTAA
miR-638 GGGCGGGTGGCGGCCTAAA
miR-451a AAACCGTTACCATTACTGAGTTAA
PCR反应(总体系20μL)：
反应条件：预变性95℃10min；95℃10sec，60℃20sec，72℃10sec共40个循环。
(6)数据处理：记录各样本平均CT值，按公式△CT＝CT(miRNA)-CT(U6)和2-△CT计算每个样本中miRNA的相对表达量。使用t检验分析，以P<0.05认为有统计学意义。
(7)实验结果：在60例初筛样本中，与敏感组相比，miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-200c-3p和miR-214-3p在耐药组中表达上调，miR-638和miR-451a在耐药组中表达下调。随后在59例验证和71例独立样本中也分别均进行了qPCR检测，并综合分析了190例总体样本中6种miRNA的表达情况，实验结果较为一致，如图1所示。
此外，发明人检测了9个miRNA标记物miR-4454，miR-4707-5p，miR-5100，miR-4286，miR-182-5p，miR-3656，miR-3940，miR-16-5p，miR-4488的表达，结果显示其表达情况或与芯片结果不符，或不具有统计学差异，如图2所示。
实施例3
利用GraphPad Prism 5软件对6种miRNA区分化疗效果的特异性和灵敏性进行了受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析。在60例初筛中，结果显示miR-23a-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p miR-638和miR-451a(曲线下面积AUC＝0.656、0.727、0.660、0.658、0.729，P均<0.05)，具有较好的区分化疗效果的特异性和灵敏性，如图3A；而miR-23b-3p的分析结果显示其AUC＝0.638(P>0.05)，差异没有显著统计学意义，如图4所示。
因此，去掉miR-23b-3p后，将其余5个指标采用Logistic回归模型构建了化疗耐药的风险公式：
Risk score＝(0.782×expression of miR-23a-3p)-(3.968×expression ofmiR-638)+(0.361×expression of miR-200c-3p)+(5.848×expression of miR-214-3p)-(2.598×expression of miR-451a)+0.562。
根据该公式，发明人将初筛中的每例患者的风险系数计算出来，并根据其系数的中位数作为截点，将初筛中的病例分成高风险组和低风险组。高风险的乳腺癌患者比低风险的患者更易于产生耐药。而后再对高风险组和低风险组进行ROC曲线分析，结果显示以这5种miRNA形成的标志物组具有较好的区分乳腺癌化疗效果的特异性和灵敏性(AUC＝0.890，P＝0.000)。随后以相同的中位数为截点在验证样本中进行了分析，结论发现高风险的乳腺癌患者发生耐药的风险明显增加(AUC＝0.839；P＝0.000；图3B)。为了排除地域所造成的样本差异，在71例独立样本中也进行了验证(图3C)。结果显示以这5种miRNA形成的标志物组比单一miRNA预测乳腺癌化疗效果的准确性更好。
实施例4
一种评价乳腺癌化疗敏感性的试剂盒，包括：
上述microRNA标志物组；
以及microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物。
上述microRNA快速提取试剂采用Bioteke公司销售的货号RP5301的试剂；反转录试剂(包括反应缓冲液，DNA聚合酶，反转录酶复合物，去离子水)采用TaKaRa公司销售的货号RR066A的试剂；实时定量PCR试剂(包括反应缓冲液，qPCR复合物，去离子水)采用GeneCopoeia公司销售的货号AOMD-Q020的试剂；人RNU6B miRNA引物采用GeneCopoeia公司销售的货号HmiRQP9001的试剂。
所述microRNA标志物组，由miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p构成，miR-638的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
对比例
如实施例4所述的评价乳腺癌化疗敏感性的试剂盒，不同之处在于：
所述microRNA标志物组，由miR-23b-3p，miR-23a-3p，miR-638，miR-200c-3p和miR-451a构成，miR-638的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，miR-23b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实验例
采用实施例4及对比例的试剂盒同时检测了初筛(60例)、验证(59例)、独立(71例)样本中miRNA的表达情况。综合对比例中的5个miRNA，采用Logistic回归模型构建了化疗耐药的风险公式：
Risk score＝(0.781×expression of miR-23a-3p)+(1.606×expression ofmiR-23a-3p)-(3.534×expression of miR-638)+(0.414×expression of miR-200c-3p)-(2.746×expression of miR-451a)+0.655。
根据该公式，计算每例患者的风险系数，进行ROC曲线分析，结果显示在三批样本中，以对比例这5种miRNA形成的标志物组具有虽然较好的区分乳腺癌化疗效果的特异性和灵敏性；但相比于实施例4构成的模型，曲线下面积较小，预测效力较弱，如图5所示。提示实施例4的标志物组预测价值要优于对比例。

Claims (4)

1.一种评价乳腺癌化疗敏感性的试剂盒，其特征在于，包括：
microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物；
所述实时定量PCR试剂包含分别用于扩增miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p的特异性上游引物以及GeneCopoeia公司销售的货号AOMD-Q020的实时定量PCR试剂，所述特异性上游引物的核苷酸序列如下：
miR-23a-3p：GCCAGGGATTTCCAAAA；
miR-200c-3p：TGCCGGGTAATGATGGAA；
miR-214-3p：CAGGCACAGACAGGCAGTAA；
miR-638：GGGCGGGTGGCGGCCTAAA；
miR-451a：AAACCGTTACCATTACTGAGTTAA。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述microRNA快速提取试剂为Bioteke公司销售的货号RP5301的microRNA快速提取试剂。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂为TaKaRa公司销售的货号RR066A的反转录试剂。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人RNU6B miRNA引物为GeneCopoeia公司销售的货号HmiRQP9001的人RNU6B miRNA引物。
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