CN111214481A - 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂 - Google Patents

一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN111214481A
CN111214481A CN201910885272.7A CN201910885272A CN111214481A CN 111214481 A CN111214481 A CN 111214481A CN 201910885272 A CN201910885272 A CN 201910885272A CN 111214481 A CN111214481 A CN 111214481A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agomir
mir
group
breast cancer
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910885272.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈念永
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by West China Hospital of Sichuan University filed Critical West China Hospital of Sichuan University
Priority to CN201910885272.7A priority Critical patent/CN111214481A/zh
Publication of CN111214481A publication Critical patent/CN111214481A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂，属于抗肿瘤制剂领域。本发明的制剂，它是以miR‑200c‑3p激动剂为活性成分，加上药学上可接受的载体制备而成。本发明的制剂对三阴乳腺癌的增殖、迁移、侵袭等具有十分明显的抑制效果，而且在体内显著抑制小鼠三阴乳腺癌移植瘤的生长，填补了三阴乳腺癌靶向性制剂的空白。

Description

一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂
技术领域
本发明属于抗肿瘤制剂领域。
背景技术
乳腺癌是起源于乳腺正常上皮的恶性肿瘤。全球范围内，乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，每年约有208万女性新发乳腺癌，近62万人死于此病，其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中均位居第一。我国乳腺癌发病率逐年增长，目前已超过肺癌，成为我国女性最常见的恶性肿瘤，每年新诊断的乳腺癌病人达27万，近7万人死于此病。临床上，根据乳腺癌组织雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)以及Ki67的表达状态分为不同的亚型，包括：管腔A(luminal A)型、管腔B(luminal B)型、HER2阳性型、正常样(normal-like)型和基底样(basal-like)型。三阴乳腺癌(triple-negative breastcancer，TNBC)是指ER、PR及HER2均呈低表达或不表达的乳腺癌，约占所有乳腺癌的15-20％，79％的三阴乳腺癌属于基底样型。。
相较于非三阴乳腺腺癌，三阴乳腺癌的发病年龄更早，增殖、侵袭和转移能力更强，容易发生远处转移、原位复发或治疗失败。目前三阴乳腺癌缺乏标准有效的治疗方案，由于其ER、PR以及HER2均为阴性，所以对以他莫昔芬为代表的内分泌治疗或者以曲妥珠单抗为代表的HER2靶向治疗均不敏感，临床上仍以含紫杉醇类、蒽环类或铂类的化疗方案为主。在当前的治疗模式下，三阴乳腺癌的预后远远差于非三阴乳腺癌。相较于非三阴乳腺癌93％的五年总生存率，三阴乳腺癌只有77％；非三阴乳腺癌的中位生存时间达到了6.0年，而三阴乳腺癌仅有4.2年。
miRNA激动剂是能够促进动植物体内特定RNA表达的物质，通常包括miRNA的模拟物miRNA mimics和miRNA agomir。miRNA mimics是针对miRNA的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA模拟物，而miRNA agomir是在化学合成的mimics上的基础上，经过特殊的化学修饰升级的产品，相比mimics更稳定，表达时间更长。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新型三阴乳腺癌的特异性靶向治疗制剂。
本发明的技术方案包括：
一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂，它是以miR-200c-3p激动剂为活性成分，加上药学上可接受的载体制备而成。
如前述的制剂，所述miR-200c-3p激动剂为miR-200c-3p agomir。
如前述的制剂，所述miR-200c-3p agomir的正义链的3’端碱基被胆固醇修饰，5’端两个碱基被硫代修饰，3’端4个碱基被硫代修饰，反义链全部碱基被甲基化修饰。
如前述的制剂，它是有效抑制三阴乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并显著抑制小鼠体内三阴乳腺癌移植瘤的生长，对三阴乳腺癌的治疗效果可媲美紫杉醇的制剂。
miR-200c-3p激动剂在制备治疗三阴乳腺癌的制剂中的用途。
如前述的用途，所述miR-200c-3p激动剂为miR-200c-3p agomir。
如前述的用途，所述miR-200c-3p agomir的正义链的3’端碱基被胆固醇修饰，5’端两个碱基被硫代修饰，3’端4个碱基被硫代修饰，反义链全部碱基被甲基化修饰。
如前述的用途，所述制剂可有效抑制癌三阴乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并能显著抑制小鼠三阴乳腺癌移植瘤的生长，对三阴乳腺癌的治疗效果可媲美紫杉醇的制剂。
本发明的制剂有效抑制三阴乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并显著抑制小鼠体内三阴乳腺癌移植瘤的生长，其对三阴乳腺癌的治疗效果可媲美紫杉醇。本发明的制剂理论上安全可靠，在实验中也未造成小鼠的任何不良反应。
三阴乳腺癌目前缺乏特异性靶向抗肿瘤制剂，而本发明填补了这一空白，具有十分良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1.不同浓度miR-200c-3p agomir以及紫杉醇处理后对MB-231细胞的增殖能力影响。BC是自然状态的MB-231细胞，NC-agomir 300nM是300nM浓度的阴性对照agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 100nM是100nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 200nM是200nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 300nM是300nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，Paclitaxel 20nM是20nM浓度紫杉醇处理后的MB-231细胞。Y轴是药物作用48小时后的光吸收值。*代表与BC组和NC-agomir 300nM组相比，P＜0.05；料代表与BC组和NC-agomir 300nM组相比，P＜0.01；***代表与BC组和NC-agomir 300nM组相比，P＜0.001；#代表与200c-agomir 100nM组相比，P＜0.05；##代表与200c-agomir 100nM组相比，P＜0.01；ΔΔ代表与200c-agomir200nM组相比，P＜0.01。
图2.不同浓度miR-200c-3p agomir以及紫杉醇处理后对MB-231细胞活力的影响(各种浓度miR-200c-3p agomir均不影响MB-231细胞的活性度；而20nM浓度紫杉醇影响细胞的活性度，导致一定细胞死亡)。BC是自然状态的MB-231细胞，NC-agomir 300nM是300nM浓度的阴性对照agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 100nM是100nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 200nM是200nM浓度的miR-200c-3pagomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 300nM是300nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，Paclitaxel 20nM是20nM浓度紫杉醇处理后的MB-231细胞。台盼蓝染色检测各组细胞活力，Y轴是活细胞数在总细胞数中所占百分比。***代表Paclitaxel 20nM组与其他5个组相比，P＜0.001。
图3.miR-200c-3p agomir以及紫杉醇处理后MB-231细胞的迁移能力(Transwell迁移实验)显著受到抑制，二者抑制作用相当。BC是自然状态的MB-231细胞，NC-agomir300nM是300nM浓度的阴性对照agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir 300nM是300nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，Paclitaxel 20nM是20nM浓度紫杉醇处理后的MB-231细胞。(A)苏木素染色后，100倍光学显微镜下的典型照片；(B)各组穿过微孔膜的细胞数量分析，**代表与BC组和NC-agomir 300nM组相比，P＜0.01；料*代表与BC组和NC-agomir 300nM组相比，P＜0.001。
图4.miR-200c-3p agomir以及紫杉醇处理后MB-231细胞的侵袭能力显著受到抑制，二者抑制作用相当。BC是自然状态的MB-231细胞，NC-agomir300nM是300nM浓度的阴性对照agomir处理后的MB-231细胞，200c-agomir300nM是300nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞，Paclitaxel 20nM是20nM浓度紫杉醇处理后的MB-231细胞。(A)苏木素染色后，100倍光学显微镜下的典型照片；(B)各组穿过基质胶和微孔膜的细胞数量分析，***代表与BC组和NC-agomir 300nM组相比，P＜0.001。
图5.miR-200c-3p agomir以及紫杉醇处理后MB-231细胞的miR-200c-3p表达水平。BC是自然状态的MB-231细胞，NC-agomir 300nM是300nM浓度的阴性对照agomir处理后的MB-231细胞，Paclitaxel 20nM是20nM浓度紫杉醇处理后的MB-231细胞，200c-agomir300nM是300nM浓度的miR-200c-3p agomir处理后的MB-231细胞。实时荧光定量PCR检测miR-200c-3p的表达，Y轴是miR-200c-3p相对表达量。料*代表与BC组、NC-agomir 300nM组和Paclitaxel 20nM组相比，P＜0.001。
图6.miR-200c-3p agomir或腺相关病毒(AAV)及紫杉醇显著抑制NOD/SCID小鼠体内移植肿瘤生长，抑制效应三者相当。PBS是注射PBS的小鼠(作为溶剂对照组)，NC-agomir是注射阴性对照agomir的小鼠，NC-AAV是注射阴性对照AAV的小鼠，Paclitaxel是注射紫杉醇的小鼠，200c-agomir是注射miR-200c-3p agomir的小鼠，200c-AAV是注射miR-200c-3pAAV的小鼠。Y轴是肿瘤体积(mm3)，X轴是种植细胞后的天数，↓是注射药物的时间点。***代表与PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组相比，P＜0.001。
图7.miR-200c-3p agomir或腺相关病毒(AAV)及紫杉醇显著抑制NOD/SCID小鼠体内移植肿瘤生长(活体小鼠种植细胞后第29天典型照片)。PBS是注射PBS的小鼠(作为溶剂对照组)，NC-agomir是注射阴性对照agomir的小鼠，NC-AAV是注射阴性对照AAV的小鼠，Paclitaxel是注射紫杉醇的小鼠，200c-agomir是注射miR-200c-3p agomir的小鼠，200c-AAV是注射miR-200c-3p AAV的小鼠。圆圈虚线所示为肿瘤区。
图8.miR-200c-3p agomir或腺相关病毒(AAV)及紫杉醇显著抑制NOD/SCID小鼠体内(三阴乳腺癌)移植肿瘤生长(不同治疗组小鼠肿瘤瘤体标本、肿瘤瘤体重量及抑制率，miR-200c-3p agomir或AAV及紫杉醇三者抑瘤率均达50％以上，其中miR-200c-3p agomir或AAV的抑瘤率可高达60％以上)。PBS是注射PBS的小鼠(作为溶剂对照组)，NC-agomir是注射阴性对照agomir的小鼠，NC-AAV是注射阴性对照AAV的小鼠，Paclitaxel是注射紫杉醇的小鼠，200c-agomir是注射miR-200c-3p agomir的小鼠，200c-AAV是注射miR-200c-3p AAV的小鼠。(A)各组小鼠肿瘤瘤体标本拍照；(B)各组小鼠肿瘤瘤体称重，Y轴是肿瘤重量(g)。(C)各组抑瘤率测定。*代表与PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组相比，P＜0.05；**代表与PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组相比，P＜0.01。
图9.miR-200c-3p agomir或腺相关病毒(AAV)及紫杉醇显著抑制NOD/SCID小鼠体内(三阴乳腺癌)移植肿瘤的小鼠肿瘤组织病理变化(HE染色)一瘤组织中癌细胞排列较为稀疏、核固缩细胞多、分裂象细胞少。(A)PBS组小鼠，左图为100倍光镜下照片，右图为左图黑色矩形框所对应区域的400倍光镜下照片；(B)NC-agomir组小鼠，左图为100倍光镜下照片，右图为左图黑色矩形框所对应区域的400倍光镜下照片；(C)NC-AAV组小鼠，左图为100倍光镜下照片，右图为左图黑色矩形框所对应区域的400倍光镜下照片；(D)Paclitaxel组小鼠，左图为100倍光镜下照片，右图为左图黑色矩形框所对应区域的400倍光镜下照片；(E)200c-agomir组小鼠，左图为100倍光镜下照片，右图为左图黑色矩形框所对应区域的400倍光镜下照片；(F)200c-AAV组小鼠，左图为100倍光镜下照片，右图为左图黑色矩形框所对应区域的400倍光镜下照片。黄色实线箭头所指为分裂象细胞；黄色虚线箭头所指为核固缩细胞。
图10.miR-200c-3p agomir或腺相关病毒(AAV)能有效提高小鼠肿瘤组织中miR-200c-3p表达水平。PBS是注射PBS小鼠组的肿瘤组织(作为溶剂对照组)，NC-agomir是注射阴性对照agomir小鼠组的肿瘤组织，NC-AAV是注射阴性对照AAV小鼠组的肿瘤组织，Paclitaxel是注射紫杉醇小鼠组的肿瘤组织，200c-agomir是注射miR-200c-3p agomir小鼠组的肿瘤组织，200c-AAV是注射miR-200c-3p AAV小鼠组的肿瘤组织。实时荧光定量PCR检测miR-200c-3p的表达，Y轴是miR-200c-3p相对表达量。料*代表与PBS组、NC-agomir组、NC-AAV组和Paclitaxel组相比，P＜0.001。
具体实施方式
实施例1本发明的miR-200c-3p agomir制备方法
根据miR-200c-3p的序列合成双链核酸，其正义链的3’端碱基进行胆固醇修饰，5’端两个碱基硫代修饰，3’端4个碱基硫代修饰，反义链全碱基甲基化修饰，得miR-200c-3pagomir。
其中，miR-200c-3p的序列是：
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA(SEQ ID N0.1)。
以下用实验例的方式进一步说明本发明的有益效果。实验例涉及材料如下：
1细胞株和实验小鼠
实验小鼠：5周龄，体重18克的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(non-obesediabetes/severe combined immune deficiency，NOD/SCID)雌鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
细胞株：三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，将载有CXCR6的慢病毒感染三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞，得到MDA-MB-231-CXCR6细胞(简称MB-231细胞)作为本实验三阴乳腺癌细胞株使用。
2主要实验设备和仪器
Figure BDA0002206320060000061
3主要实验试剂
Figure BDA0002206320060000062
Figure BDA0002206320060000071
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(产品目录号：CW0022)
Figure BDA0002206320060000072
Ultrapure RNA Kit超纯RNA提取试剂盒(产品目录号：CW0581)
Figure BDA0002206320060000073
SuperRTcDNA合成试剂盒(产品目录号：CW0741)
Figure BDA0002206320060000081
All-in-OneTMmiRNAqRT-PCR检测试剂盒(产品目录号：AOMD-Q050)
Figure BDA0002206320060000082
实验例1细胞实验
1 miR-200c-3p agomir增殖抑制实验
分别使用miR-200c-3p agomir(100～300nM)以及紫杉醇(20nM)处理MB-231细胞，给药48小时后，进行噻唑蓝(MTT)增殖实验，检测光吸收值(OD值)，OD值越低，表明细胞增殖受抑制越明显。
增殖实验步骤如下：
1)将处于对数生长期的MB-231细胞经过胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的培养液制成单细胞悬液。按照每孔5千个细胞的数量接种到96孔培养板内，每组设置5个复孔。
2)将96孔培养板放置于37℃，含有5％CO2的细胞培养箱内孵育24小时。
3)各组给予的具体药物浓度如下(各药物均使用含10％胎牛血清的培养液配制成相应浓度)：
a)空白对照组：不使用药物
b)阴性对照组：300nM阴性对照agomir(其agomir为随机序列)
c)阳性对照组：20nM紫杉醇
d)实验组1：100nM miR-200c-3p agomir
e)实验组2：200nM miR-200c-3p agomir
f)实验组3：300nM miR-200c-3p agomir
4)继续培养48小时后，每孔加入20ul的5mg/ml MTT，在37℃，含有5％CO2的细胞培养箱内孵育4小时。
5)弃掉培养液，向每孔中加入200ul的DMSO，在振荡器上振荡10分钟。
6)将96孔培养板放置于多功能酶标仪中，选取490nm的波长，检测每孔的光吸收值(OD值)。
噻唑蓝(MTT)增殖实验结果如图1所示，miR-200c-3p agomir及紫杉醇均抑制MB-231细胞的增殖；且随着miR-200c-3p agomir浓度增加，细胞的增殖能力受抑制程度加重，当miR-200c-3p agomir浓度增加到300nM时，达到了与紫杉醇一致的抑制效果。
4.细胞活性检测
进一步通过台盼蓝染色检测了各组的活细胞比例，明确200c-agomir对细胞有无直接致死作用。
结果显示，空白对照组、阴性对照组、200c-agomir 100nM组、200c-agomir 200nM组以及200c-agomir 300nM组的活细胞比例均超过了95％，各组间没有显著差异，说明miR-200c-3p agomir不影响细胞活力；紫杉醇组的活细胞比例只有(85±1.2)％，要明显低于其他各组(P＜0.001)(图2)。结合MTT实验结果可说明，miR-200c-3p agomir可以抑制MB-231细胞的增殖能力，但对细胞没有直接的致死作用，
5.miR-200c-3p agomir对细胞迁移的影响
通过Transwell迁移实验来反映miR-200c-3p agomir对细胞迁移的影响。实验步骤如下：
1)MB-231细胞分为四组，经相应的药物处理48小时，具体如下(各药物均使用含10％胎牛血清的培养液配制成相应浓度)：
a)空白对照组：不使用药物
b)阴性对照组：300nM阴性对照agomir(其agomir为随机序列)
c)阳性对照组：20nM紫杉醇
d)实验组：300nM miR-200c-3p agomir
2)各组细胞经过胰蛋白酶消化后，加入新鲜培养液终止消化。离心弃掉培养液，再使用PBS洗2次，用无血清的培养液重悬细胞制成单细胞悬液。
3)24孔培养板作为下室，向每孔内加入600ul的含10％胎牛血清的培养液。Transwell小室作为上室，加入200ul的含有1万个细胞的细胞悬液。
4)将Transwell小室按压于24孔培养板上，注意避免在下室培养液和上室之间形成气泡。
5)在37℃，含有5％CO2的细胞培养箱内培养24小时。
6)取出Transwell小室，用棉签轻柔擦拭上室面，用PBS缓慢地冲洗下室面。将Transwell小室浸入多聚甲醛中固定。室温环境下固定30分钟。
7)用PBS缓慢冲洗Transwell小室，以除去多聚甲醛。将小室晾干。
8)将Transwell小室浸入苏木素中染色4分钟。用PBS缓慢冲洗Transwell小室，以除去多余的苏木素染液。
9)将Transwell小室置于放大倍数为100倍的显微镜下拍照。随机取3个视野计数细胞个数，取平均值代表迁移细胞数。
实验结果显示，200c-agomir 300nM组的穿过微孔膜的细胞数量是96.50±8.380，明显少于空白对照组(穿过微孔膜的细胞数量是221.3±17.56)和阴性对照组(穿过微孔膜的细胞数量是206.6±24.23)(P＜0.001)；紫杉醇组的穿过微孔膜的细胞数量是100.6±11.44，同样明显少于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01)；而200c-agomir300nM组和紫杉醇组之间则没有明显差异(图3)。这验证了miR-200c-3pagomir可以抑制MB-231细胞的迁移，并且miR-200c-3p agomir对细胞迁移的抑制效果与紫杉醇相当。6.miR-200c-3pagomir对细胞侵袭能力影响
使用细胞体外Transwell侵袭实验测定miR-200c-3pagomir对MB-231细胞侵袭能力的影响。Transwell侵袭实验的方法如下：
1)将Matrigel基质胶按照1：8的比例稀释后，取50ul均匀的铺入Transwell小室内，然后将小室放置于37℃的恒温箱中4小时以使基质胶凝固。
2)Transwell侵袭实验每孔加十万个细胞。其余处理方法和Transwell迁移实验一致。
结果显示，200c-agomir 300nM组的穿过基质胶和微孔膜的细胞数量是38.65±5.793，明显少于空白对照组(穿过基质胶和微孔膜的细胞数量是77.08±4.028)和阴性对照组(穿过基质胶和微孔膜的细胞数量是74.35±3.682)(P＜0.001)；紫杉醇组的穿过基质胶和微孔膜的细胞数量是42.08±4.546，同样明显少于空白对照组和阴性对照组(P＜0.001)；而200c-agomir 300nM组和紫杉醇组之间则没有明显差异(图4)。这提示了miR-200c-3p agomir可以抑制MB-231细胞的侵袭，并且miR-200c-3p agomir对细胞侵袭的抑制效果与紫杉醇一致。
实验例2移植瘤抑制实验
为了进一步研究miR-200c-3p在体内三阴乳腺癌的作用效果，发明人在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)雌鼠体内建立移植瘤模型，并注射miR-200c-3p相关制剂以观察其对肿瘤生长的影响。其中，发明人分别使用了两种miR-200c-3p制剂，一个是miR-200c-3p agomir，另一个是表达miR-200c-3p的腺相关病毒(adeno-associatedvirus2/9，AAV2/9)。agomir是经过特殊化学修饰(3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代修饰，3’端4个硫代修饰，反义链全碱基甲基化修饰)后的microRNA，可以直接用于动物体内注射，模拟内源性成熟体microRNA；腺相关病毒是基因治疗的一种高效递送载体，可将目的基因导入体内以提高其表达水平。
发明人将MB-231细胞接种于NOD/SCID雌鼠的乳腺原位，2周后，雌鼠全部形成肿瘤。接下来，发明人将所有雌鼠随机分为6个组并注射相应药物，具体分组为：溶剂对照组(PBS组)、agomir阴性对照组(NC-agomir组，随机序列的agomir)、AAV阴性对照组(NC-AAV组，表达随机序列的腺相关病毒)、阳性对照组(紫杉醇组)、200c-agomir组以及200c-AAV组。
1.移植瘤体积和外观
发明人自种植细胞第8天开始，每3天使用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和最短经(b)，计算肿瘤体积(V)。V＝ab2/2。最后一次测量时间点为种植细胞后第29天(此为处死小鼠时间点)。绘制肿瘤生长曲线。
结果显示，药物处理组的肿瘤生长速度明显慢于对照组的生长速度；第29天时，200c-agomir组的肿瘤体积为536.7±162.4mm3，明显小于PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组(PBS组的肿瘤体积为1519.8±105.8mm3，NC-agomir组的肿瘤体积为1739.3±152.1mm3，NC-AAV组的肿瘤体积为1609.9±158.0mm3)(P＜0.001)；200c-AAV组的肿瘤体积为498.6±160.7mm3，也明显小于PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组(P＜0.001)；紫杉醇组的肿瘤体积为592.4±281.9mm3，同样明显小于PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组(P＜0.001)；而紫杉醇组、200c-agomir组和200c-AAV组之间则没有统计学差异(图6、图7)。此外，从第14天开始注射药物直到第29天处死所有小鼠的这段时间内，发明人观察到各组小鼠的活动、食欲和精神状态没有显著差异。以上结果提示，miR-200c-3p可以抑制小鼠三阴乳腺癌移植瘤的生长，通过agomir和AAV这两种载体形式体内投递miR-200c-3p的抑瘤效应是一致的，并且这两种载体都不会引起小鼠严重的致死性不良反应。
2.移植瘤重量和抑瘤率
发明人于种植细胞后29天处死小鼠，剥离肿瘤组织称重并计算抑瘤率。肿瘤生长抑制率＝(空白对照组平均瘤重-处理组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重x100％。
结果显示，200c-agomir组的肿瘤重量为0.6258±0.3201g，明显轻于PBS组(1.623±0.4156g)、NC-agomir组(1.765±0.5617g)和NC-AAV组(1.680±0.5126g)(P＜0.01)；200c-AAV组的肿瘤重量为0.5752±0.3222g，也明显小于PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组(P＜0.01)；紫杉醇组的肿瘤重量为0.6846±0.4495g，同样明显小于PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组(P＜0.05)；而紫杉醇组、200c-agomir组和200c-AAV组之间则没有统计学差异(图8A-B)。各组抑瘤率分别为：紫杉醇组57.82％，200c-agomir组61.44％，200c-AAV组64.56％(图8C)。结果提示，miR-200c-3p agomir显著抑制小鼠三阴乳腺癌移植瘤。
3.HE染色观察细胞分裂
将PBS组、NC-agomir组、NC-AAV组、紫杉醇组、200c-agomir组以及200c-AAV组的移植瘤组织进行了切片和HE染色后，通过光学显微镜观察发现，PBS组、NC-agomir组和NC-AAV组的肿瘤组织中细胞排列紧密，细胞核浆比大，可见较多的分裂象细胞；紫杉醇组、200c-agomir组和200c-AAV组的肿瘤组织中细胞排列较为稀疏，核固缩细胞多，分裂象细胞少(图9)。说明miR-200c-3p agomir或腺相关病毒(AAV)及紫杉醇在体内对三阴乳腺癌发挥了类同的抑癌作用。
4.肿瘤组织中miR-200c-3p的表达水平检测
为了研究在动物体内miR-200c-3p agomir及miR-200c-3p AAV是否也通过相同的机制来发挥抑瘤效应，发明人检测了动物瘤体组织标本中miR-200c-3p的表达情况。
如图10所示，miR-200c-3p agomir和miR-200c-3p AAV均提高了肿瘤组织中的miR-200c-3p的表达量。
综上，本发明的新型抗三阴乳腺癌肿瘤制剂有效抑制三阴乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭并显著抑制小鼠体内三阴乳腺癌移植瘤的生长，其对三阴乳腺癌的治疗效果达到紫杉醇的治疗效果。本发明的制剂理论上安全可靠，在实验中也未造成小鼠的不良反应。本发明能特异性、靶向性地治疗三阴乳腺癌，具有十分良好的临床应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂
<130> GY390-2019P017278CC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
uaauacugcc ggguaaugau gga 23

Claims (6)

1.一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂，其特征在于，它是以miR-200c-3p激动剂为活性成分，加上药学上可接受的载体制备而成。
2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述miR-200c-3p激动剂为miR-200c-3pagomir。
3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述miR-200c-3p agomir的正义链的3’端碱基被胆固醇修饰，5’端两个碱基被硫代修饰，3’端4个碱基被硫代修饰，反义链全部碱基被甲基化修饰。
4.miR-200c-3p激动剂在制备治疗三阴乳腺癌的制剂中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述miR-200c-3p激动剂为miR-200c-3pagomir。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述miR-200c-3p agomir的正义链的3’端碱基被胆固醇修饰，5’端两个碱基被硫代修饰，3’端4个碱基被硫代修饰，反义链全部碱基被甲基化修饰。
CN201910885272.7A 2019-09-18 2019-09-18 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂 Pending CN111214481A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910885272.7A CN111214481A (zh) 2019-09-18 2019-09-18 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910885272.7A CN111214481A (zh) 2019-09-18 2019-09-18 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111214481A true CN111214481A (zh) 2020-06-02

Family

ID=70810014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910885272.7A Pending CN111214481A (zh) 2019-09-18 2019-09-18 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111214481A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148538A (zh) * 2016-08-09 2016-11-23 山东大学 microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148538A (zh) * 2016-08-09 2016-11-23 山东大学 microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAN-DAN ZHANG等: "Phosphodiesterase 7B/microRNA-200c relationship regulates triple negative breast cancer cell growth", 《ONCOGENE》 *
阿波斯托利亚-玛蒂亚•钦巴瑞多等: "《癌症转化医学研究中的靶向治疗》", 30 June 2017 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012238525B2 (en) Medicament for liver regeneration and for treatment of liver failure
Chu et al. MiR-495 regulates proliferation and migration in NSCLC by targeting MTA3
CN110129447B (zh) Pqbp1在卵巢癌诊治中的应用
CN110244056B (zh) Znf521基因在制备肝癌治疗药物、诊断及预后评估试剂中的应用
CN110592222A (zh) Triml1作为肝癌的分子标记物的应用
CN104878098A (zh) 人stim1基因的用途及其相关药物
CN104995300B (zh) Rna活性和血管通透性的调节
CN111214481A (zh) 一种新型治疗三阴乳腺癌的制剂
JP6799861B2 (ja) 核酸分子
US9075064B2 (en) Method for decreasing radioresistance and growth, metastasis and infiltration of cancer cells through regulating expression or activity of TM4SF4 in non-small cell lung cancer
CN111617248B (zh) Rfpl1s-201在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用
CN110951880B (zh) 检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用
CN113855663A (zh) 冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途
CN110960546B (zh) MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用
CN113679735A (zh) Slc7a11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用
CN105837678B (zh) D型人m1叉头蛋白异构体及其编码基因
CN112516155A (zh) 一种三阴乳腺癌的基因治疗制剂
CN110079528B (zh) 靶向otud7b基因的小干扰rna在胶质瘤靶向治疗中的应用
Falavinha et al. Interleukin 21 Receptor Affects Adipogenesis of Human Adipose‐Derived Stem/Stromal Cells
CN110257377B (zh) 一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用
KR20200131290A (ko) 종양 전이의 약물 치료를 위한 표적 및 이의 응용
CN112206323B (zh) USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用
CN104368012B (zh) 人rpl34基因的用途及其相关药物
CN116617245B (zh) Utp11抑制剂及其在肿瘤抑制中的用途
CN109554364B (zh) 一种tsnax基因抑制剂及其在肿瘤中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200602

RJ01 Rejection of invention patent application after publication