CN110257377B

CN110257377B - 一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN110257377B
Application number: CN201910525518.XA
Authority: CN
Inventors: 于明军; 于诗嘉; 陈铎; 关俊宏
Original assignee: Shengjing Hospital of China Medical University
Current assignee: Shengjing Hospital of China Medical University
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2039-06-18
Also published as: CN110257377A

Abstract

一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用。本发明属于生物基因治疗领域，具体涉及一种抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用。该靶向抑制剂的核苷酸序列为：5’‑TGTACGAACTCGTCTCCAA‑3’（SEQ ID No.1）。本发明为了解决抑制脑胶质瘤的增殖迁移侵袭基因治疗问题，以RNAi技术为基础，通过人工合成linc00998靶向shRNA，可以靶向作用于linc00998基因，促进其降解，达到使linc00998基因表达降低的结果，为临床上治疗脑胶质瘤提供了新的思路。

Description

一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物基因治疗领域，具体而言，涉及一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用。

背景技术

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的45％。尽管随着目前针对脑胶质瘤的治疗方式较多，包括手术治疗、放疗、化疗、基因治疗，生物治疗、中医中药、免疫治疗等多种治疗手段，但脑胶质瘤患者的预后仍然不佳。近20年来，脑胶质瘤的发病率逐渐升高，但患者预后却没有明显改善。据统计，间变型脑胶质瘤经传统手术及术后辅助标准放化疗的中位生存期仅2-5年，而胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)的中位生存期仅12-14个月。(Wen P Y,et al.Malignant gliomas in adults[J].TheNew England journal of medicine,2008,359(5):492-507.)脑胶质瘤细胞具有增殖活跃，迁移侵袭能力强，与周围正常组织界限不清，手术常常难以完全切除，瘤细胞残留导致术后极易复发，因此如何抑制脑胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力对提高脑胶质瘤的治疗效果具有重要的理论意义和现实意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的不编码蛋白质的RNA分子。在基因水平，转录水平，转录后水平，翻译水平，翻译后水平等多个层面，lncRNA通过介导信号转导、作为分子阻断剂、与蛋白结合、提供中心平台等方式来发挥分子功能，并与肿瘤的发生、发展密切相关。如：文献报道长链非编码RNA OIP5-AS1在脑胶质瘤组织和细胞中表达上调，并可通过发挥竞争性内源性RNA作用与CEBPA竞争性结合miR-367-3p影响脑胶质瘤细胞的增殖，迁移侵袭等恶性生物学行为。(Xiaobai Liu,etal.PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA feedback loop regulates the biologicalbehavior of glioma cells[J].Theranostics,2018,8(4):1084-1105)linc00998位于7q31.1，有研究表明，linc00998在重度抑郁症患者中表达下调。(Ye N et al.Intergenicvariants may predispose to major depression disorder through regulation oflong non-coding RNA expression[J].Gene,2017,601:21-26.)但经文献检索，关于linc00998在脑胶质瘤中发挥的作用尚无报道。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术主要是通过与Dicer酶形成RNA沉默复合体，靶向结合目的分子进而使其降解的分子过程。小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一种具有茎环结构的RNA分子，在哺乳动物细胞内shRNA可被剪切形成小干扰RNA，靶向结合目的基因，导致靶基因沉默。

本发明旨在利用RNAi技术研制linc00998基因的抑制剂，为抑制脑胶质瘤细胞增殖，迁移及侵袭寻找新的分子作用靶点，在脑胶质瘤基因治疗领域发挥作用。

发明内容

本发明的目的是为解决脑胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭活跃问题，以RNAi技术为基础，通过人工合成linc00998靶向shRNA,可以靶向作用于linc00998基因,并促进其降解，使linc00998的表达降低，从而发挥抑制人脑胶质瘤的细胞增殖、迁移和侵袭能力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂，该抑制剂的核苷酸序列为：5’-TGTACGAACTCGTCTCCAA-3’(SEQ ID No.1)。

所述靶向抑制剂能够抑制linc00998基因表达的shRNA序列(二级结构图如图2所示)，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链：

F:5’-CCGGTGTACGAACTCGTCTCCAACTCGAGTTGGAGACGAGTTCGTACATTTTTG-3’(SEQ IDNo.2)；

反义链：

R:5’-AATTCAAAAATGTACGAACTCGTCTCCAACTCGAGTTGGAGACGAGTTCGTACA-3’(SEQ IDNo.3)。

所述转录shRNA序列的转录产物，序列为：

5’-UGUACGAACUCGUCUCCAACUCGAGUUGGAGACGAGUUCGUACAUU-3’(SEQ ID No.4)。

所述linc00998基因抑制剂能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭(见图4-6)。

所述linc00998基因抑制剂用于制备治疗人脑胶质瘤药物中的用途。

所述治疗人脑胶质瘤药物为含有治疗量的linc00998基因抑制剂和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。

所述抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂等。该抑制剂的优选剂型为注射制剂。

所述载体或赋形剂包括本领域公知的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。稀释剂包括但不限于粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、磷酸氢钙等；湿润剂包括水、乙醇、异丙醇等；粘合剂包括但不限于淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇等；崩解剂包括但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂包括但不限于滑石粉、二氧化硅、聚乙二醇等。

该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

1.本发明靶向抑制剂特异性强，序列高度保守，能够显著抑制linc00998的基因表达，从而能够抑制人脑胶质瘤的细胞增殖、迁移及侵袭。

2.该抑制剂制备技术可实现，linc00998基因抑制剂靶向治疗，针对性强，能显著降低传统治疗药物的耐药及副作用大等问题。

3.实验已证明在体外细胞学和体内动物两个水平上，该抑制剂治疗效果确切，无不良反应。

附图说明

图1为应用Real-time PCR检测linc00998基因的mRNA表达水平显著增高的柱状图。

图2为linc00998基因抑制剂的二级结构图。

图3为应用Real-time PCR检测应用linc00998基因抑制剂后，脑胶质瘤细胞中的linc00998表达水平显著下调的柱状图。

图4应用CCK-8法检测应用linc00998基因抑制剂后，显著抑制脑胶质瘤细胞活力的统计柱状图。

图5为Transwell细胞迁移实验检测应用linc00998基因抑制剂后，显著抑制脑胶质瘤细胞迁移的图片及统计柱状图。

图6为Transwell细胞侵袭实验检测应用linc00998基因抑制剂后，显著抑制脑胶质瘤细胞侵袭的图片及统计柱状图。

图7为建立裸鼠皮下移植瘤模型，应用linc00998基因抑制剂后，显著抑制移植瘤的生长的照片。

图8为建立裸鼠原位移植瘤模型，应用linc00998基因抑制剂后，荷瘤小鼠生存期分析图。

具体实施方式

一、脑胶质瘤细胞的培养和条件培养基的制备

人脑胶质瘤细胞系U87细胞购于中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。U87胶质瘤细胞使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。培养基置于37℃,5％CO₂恒温培养箱中培箱中，每2天更换一次培养液，约2-3天细胞可长至单层。

二、样本采集

1)首先准备好用于保存组织的冻存管，且用黑色油性记号笔在冻存管上标明样本编号、收集日期等信息；

2)术中切取脑胶质瘤组织(具有5年以上操作手术经验的神经外科医师操作)；

3)将切除的脑胶质瘤组织标本分成2份，其中1份进行病理组织学检查，另1份放入备好的高压过的冻存管中并拧紧，迅速投入液氮罐中冻存；

4)填写标本登记单,写明样本编号、分组、来源患者名称、病例号、样本收集日期及样本处理过程等信息；

5)待病理性质确诊后取出标本开展下一步研究。

三、Real-time PCR

1.Trizol法提取组织细胞中的总RNA。

①用冷PBS洗涤收集的细胞，加入1ml Trizol试剂吹打数次混匀，镜下观察细胞成油滴状(充分裂解)，后移入1.5ml EP管中，静置5分钟，使其充分裂解；②向样品中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡室温下静置3分钟；③于4℃12000g离心15分钟，取上层水相到新的EP管中，再加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；④4℃12000g离心15分钟后弃上清，加入1ml 75％乙醇；⑤4℃7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40μl DEPC水，样品冻存于-80℃冰箱长期保存。

2.染料一步法qRT-PCR检测linc00998的表达。

按照表1-1人工合成引物序列，根据表1-2所示加入相应的试剂，制成成总体积为20μl的PCR反应体系。设施PCR反应条件：42℃5min，95℃10S，随后[95℃3S，60℃30S]进行40个循环。测定CT值，以GAPDH为内参。

表1-1qPCR引物序列

表1-2PCR反应体系

3.qRT-PCR结果与计算。

各样品的linc00998基因和GAPDH基因分别进行qRT-PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品linc00998基因和GAPDH基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的linc00998基因浓度除以GAPDH基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。统计软件SPSS 22.0进行数据分析。以2^-△△Ct表示各样本的linc00998的相对表达量。数据符合正态分布时釆用两组独立样本的t检验，不符合正态分布时用两组独立样本的秩和检验，P<0.05时具有统计学意义。结果提示，linc00998在脑胶质瘤组织中表达明显上调。(图1所示)四、linc00998基因抑制剂的制备和应用

在Pubmed搜索linc00998基因序列，利用Thomo fisher公司在线软件设计linc00998基因的干扰序列，选定靶向人linc00998基因并特异性抑制linc00998基因表达的核苷酸序列如下：

5’-TGTACGAACTCGTCTCCAA-3’(SEQ ID No.1)。

在NCBI的同源序列比对分析nucleotide blast中输入TGTACGAACTCGTCTCCAA序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mRNA基因没有高度同源性，可作特异性干扰linc00998基因的特异性序列。

针对以上靶序列设计靶向人linc00998基因而抑制linc00998基因表达的shRNA模板序列如下，包括正义链和反义链，此shRNA序列为：

正义链：

反义链：

转录shRNA序列的转录产物，序列为：

5’-UGUACGAACUCGUCUCCAACUCGAGUUGGAGACGAGUUCGUACAUU-3’(SEQ ID No.4)。

将以上序列信息连接载体制备相应的质粒，作为linc00998基因抑制剂。linc00998基因抑制剂转染：sh-NC、sh-linc00998的质粒U6/GFP/Neo,使linc00998表达沉默，不含有linc00998序列或shRNA的空质粒为阴性对照；应用24孔培养板培养脑胶质瘤细胞，当细胞生长达到80％左右时进行转染；配置转染需要的质粒、Opti-

Ⅰ和LTX andPlus reagent(Life Technologies)转染试剂。A管：每个培养孔按照1μg质粒DNA溶解于50μlOpti-/>

Ⅰ+1μl p3000试剂，放置5min，B管：每个培养孔按照1μl LTX and Plus溶解于50μl Opti-/>

Ⅰ中；将A、B两管混匀后静置5min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100μL，再加入细胞培养液400μL，48h后进行后续实验。在后续实验中分为3组，分别是：不加任何处理的空白组；转染linc00998沉默空质粒的对照组；转染linc00998沉默质粒的抑制剂组。

应用Real-time PCR实验分别检测各组linc00998基因的表达水平，相对于空白组和对照组，应用linc00998基因的抑制剂后，脑胶质瘤细胞中的linc00998的mRNA表达水平显著下调(如图3所示)。

四、脑胶质瘤细胞增殖实验

U87胶质瘤细胞用胰蛋白酶消化，吹打混匀后制成单细胞悬液。计数细胞，以2000个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板。每组设3个复孔，每孔加入200ul细胞悬液。培养箱培养24h后加入10ul CCK-8试剂。2h后用酶标仪测定波长450nm时各孔光吸收值。对实验数据进行分析，计算出各组细胞的细胞活力。

实验结果可知，CCK-8细胞活力法检测细胞增殖能力变化，相对于空白组和对照组，应用linc00998基因抑制剂后，显著抑制了脑胶质瘤细胞的增殖能力(如图4所示)。

五、脑胶质瘤细胞的迁移实验

取24孔板，每孔加入500ul含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，放上直径为6.5mm孔径为8μm的聚碳酸酯小室；将细胞用胰酶消化后，使用无血清培养基进行吹打，细胞计数后，稀释成100/ul的细胞悬液，每个小室里加入100ul细胞悬液，37℃恒温培养箱中培养24小时；24小时后取出小室，PBS中轻洗，棉棒将上室面细胞擦涂净。配置固定液，甲醇∶冰乙酸＝3∶1；将小室放入固定液中，细胞固定30min；PBS洗净固定液后晾干小室，吉姆萨染料染色30min；PBS清洗小室两次，在倒置400×镜下观察，随机取3个视野进行细胞个数统计，计算获得细胞迁移能力数据。如图5所示，Transwell实验检测各组细胞迁移能力的变化，相对于空白组和对照组，应用linc00998基因抑制剂后，脑胶质瘤细胞迁移数目显著减少。

六、脑胶质瘤细胞的侵袭实验

将基质胶放置于冰水混合物中融化，在小室内面均匀铺上50μl浓度为500ng/μl的基质胶。放入37℃恒温箱中4小时使其凝固；上室铺细胞悬液，其他处理步骤和统计方法与迁移实验相同。随机取3个视野进行细胞个数统计，计算获得细胞侵袭能力数据。如图6所示，Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的变化，相对于空白组和对照组，应用linc00998基因抑制剂后，脑胶质瘤细胞侵袭数目显著减少。

七、裸鼠皮下移植瘤模型实验

本研究涉及动物实验均得到中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准。3周龄的BALB/c无胸腺裸鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司。将动物随机分为三组。实验分组如下：空白组、对照组和抑制剂组。所有动物实验均在购买后一周后，动物状态稳定后进行。

对于皮下移植瘤实验，5×10⁶个细胞注入4周龄的BALB/c无胸腺裸鼠右前肢皮下。继续饲养，监测裸鼠状态及种瘤部位变化，每5天测量瘤体积直至接种后45天。肿瘤体积通过下式计算：体积(立方毫米)＝长度×宽度²/2。

在裸鼠原位移植瘤实验中，细胞以5×10⁵个/只的密度通过立体定位注射于裸鼠右侧纹状体。每天记录存活裸鼠数量，使用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。

实验结果如图7所示，相对于空白组和对照组，应用linc00998基因抑制剂后，小鼠皮下移植瘤体积显著缩小。

实验结果如图8所示，相对于空白组和对照组，应用linc00998基因抑制剂后，原位移植瘤小鼠总体生存时间显著延长。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医科大学附属盛京医院

<120> 一种抑制人恶性脑胶质瘤的靶向linc00998基因的抑制剂及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtacgaactcgtctccaa 19

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccggtgtacgaactcgtctccaactcgagttggagacgagttcgtacatttttg 54

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattcaaaaatgtacgaactcgtctccaactcgagttggagacgagttcgtaca 54

<210> 4

<211> 46

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uguacgaacucgucuccaacucgaguuggagacgaguucguacauu 46

Claims

1.一种抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因抑制剂，其特征在于，所述靶向抑制剂为能够抑制linc00998基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链： F:5’-CCGGTGTACGAACTCGTCTCCAACTCGAGTTGGAGACGAGTTCGTACATTTTTG-3’（SEQ ID No.2）；反义链： R:5’-AATTCAAAAATGTACGAACTCGTCTCCAACTCGAGTTGGAGACGAGTTCGTACA-3’（SEQ ID No.3）。

2.根据权利要求1所述的抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因抑制剂，其特征在于，所述shRNA序列的转录产物，序列为：

5’-UGUACGAACUCGUCUCCAACUCGAGUUGGAGACGAGUUCGUACAUU-3’（SEQ ID No.4）。

3.根据权利要求1所述的抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因抑制剂，其特征在于，所述linc00998基因抑制剂能够抑制脑胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭。

4.如权利要求1所述的抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因抑制剂在制备治疗人脑胶质瘤药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因抑制剂在制备治疗人脑胶质瘤药物中的用途，其特征在于，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂型。

6.根据权利要求4所述的抑制脑胶质瘤的靶向linc00998基因抑制剂在制备治疗人脑胶质瘤药物中的用途，其特征在于，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂量。