CN107083433B

CN107083433B - lncRNA在肝癌诊疗中的应用

Info

Publication number: CN107083433B
Application number: CN201710405202.8A
Authority: CN
Inventors: 宋宏涛; 马翠; 任静
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-06-01
Filing date: 2017-06-01
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2037-06-01
Also published as: CN107083433A

Abstract

本发明公开了lncRNA在诊疗中的应用，具体的该lncRNA为ENSG00000267751。本发明首次发现ENSG00000267751的差异表达与肝癌的发生发展相关，在肝癌患者中，ENSG00000267751的表达上调，TCGA数据库交叉验证了这种差异表达，对ENSG00000267751进行ROC曲线分析，发现ENSG00000267751具有较高的AUC值，提示ENSG00000267751用于肝癌诊断具有较高的准确性和特异性。为了进一步验证ENSG00000267751在癌细胞生长中的作用，通过抑制剂降低ENSG00000267751的表达发现可以显著降低肝癌细胞的增殖和细胞形成克隆集落数，提示干预ENSG00000267751基因表达可能成为肝癌治疗的新途径。

Description

lncRNA在肝癌诊疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及lncRNA在肝癌诊疗中的应用，具体的涉及lncRNAENSG00000267751。

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于我国恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率位于肿瘤相关死亡率的第二位。目前，肝癌的治疗技术不断提升，如手术切除、肝移植、放化疗等，手术治疗是肝癌治疗的主要手段，但大多数肝癌患者确诊时已经处于肝癌晚期，失去了手术治疗的时机，而肝癌又缺乏其他有效的治疗手段，导致肝癌的5年生存率较低。因发病机制的复杂性与不确定性导致肝癌缺乏有效的早期诊断手段和治疗手段，目前尚不清楚肝癌发病的主要因素或重要因子，因而尚不能针对这些因素研发有效针对肝癌的治疗药物。系统的揭示肝癌的发病机制，明确肝癌细胞内各分子之间的调控关系，寻找在肝癌发病过程中起重要作用的致病因子，对肝癌患者的早期诊断和有效治疗肝癌药物的研发，丰富肝癌的治疗手段或者治疗方式，提高肝癌患者的预后有着极其重要的意义。

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。在细胞所包含的RNA中，lncRNA所占的比例远远超过了人们所熟知的mRNA，miRNA等，lncRNA所占的比例高达90％以上，而mRNA只占到2％左右。近年来研究表明，lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、转录后调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为研究的热点。越来越多的研究表明，lncRNA在肿瘤发生发展中起着举足轻重的作用，这无疑为揭示肿瘤发生发展的机制带来了新的希望。因此系统、深入的研究并阐明lncRNA在肝癌发生、发展中的作用及分子机制对肝癌的早期诊断、分子靶向药物的研发，治疗手段的改善，患者生存率的提高有着深远的意义。

基因芯片技术的应用对于研究各类分子的表达谱有着明显的优势，我们可以通过基因芯片筛技术快速、大规模、高通量的筛选出在疾病进展过程中差异表达基因。本发明通过1ncRNA基因芯片技术分析10对肝癌组织及其配对癌旁组织中lncRNA差异表达谱，初步筛选出肝癌组织与癌旁组织中差异表达的lncRNA，然后通过qRT-PCR的方法对基因芯片的结果进行验证，最终筛选出在肝癌发生、发展中起重要作用的lncRNA。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种诊断早期肝癌的产品，使患者在早期就得以治疗，进而提高生存率和生活质量。

本发明的目的之二，提供一种治疗手段和药物组合物，实现肝癌的精准分子治疗。

本发明的目的之三，提供一种筛选治疗肝癌的潜在药物的方法，所述潜在药物可以有效的降低ENSG00000267751的表达水平。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测ENSG00000267751基因表达水平的试剂在制备诊断早期肝癌产品中的用途。

进一步，所述ENSG00000267751在肝癌患者中表达上调。

进一步，所述试剂包括RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测用试剂。

其中，所述用RT-PCR诊断肝癌的试剂至少包括一对特异扩增ENSG00000267751基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肝癌的试剂至少包括一对特异扩增ENSG00000267751基因的引物；所述用原位杂交诊断肝癌的试剂包括：与ENSG00000267751基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肝癌的试剂包括与ENSG00000267751基因的核酸序列杂交的探针。

本发明提供了一种诊断早期肝癌的产品，所述产品包括芯片、核酸膜条、或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于ENSG00000267751的部分或全部序列；所述核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于ENSG00000267751的部分或全部序列；所述试剂盒包括可以检测ENSG00000267751表达水平的芯片、核酸膜条或PCR反应试剂。

固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针包括DNA、RNA、PNA、ZNA、LNA，及他们的组合，或其修饰之后的形式。该寡核苷酸探针也包括被修饰的寡核苷酸骨架。一些实例中，寡核苷酸探针至少包含连续的9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或者更多个与全长或部分靶标多核苷酸互补或者相同的核苷酸序列。一条寡核苷酸探针可能包含两段或更多段互补序列。一些实例中，寡核苷酸探针的5’或3’末端有活性基团，比如氨基，用于将该探针连接到基底材料上。

探针可通过多种方式连接到微阵列芯片的基底材料上。这些方式包括但不限于已列出来的方式：(1)基于光刻技术的原位合成，例如Affymetrix公司生产的高密度寡核苷酸阵列；(2)在玻璃、硅、尼龙或硝酸纤维上进行中低密度的点样或者印制；(3)屏蔽选择性合成；(4)在尼龙或硝酸纤维形成的杂交膜上打点杂交。寡核苷酸也可通过液相非共价键地固定到基底材料上，可利用微孔、微管道或毛细管等结构形成液相环境。

进一步，所述PCR反应试剂包括扩增ENSG00000267751的引物，所述扩增ENSG00000267751的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括ENSG00000267751基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的表达水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

本发明提供了一种ENSG00000267751基因的用途，用于制备预防或治疗肝癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括ENSG00000267751功能性表达的抑制剂，所述抑制剂能够抑制ENSG00000267751或涉及ENSG00000267751上游或下游途径的物质的表达。

进一步，所述抑制剂是针对ENSG00000267751的siRNA。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括ENSG00000267751功能性表达的抑制剂，所述抑制剂可以在DNA水平或RNA(即基因产物)水平上起作用。

进一步，所述药物组合物还包括与ENSG00000267751功能性表达的抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明提供了一种ENSG00000267751基因的用途，用于筛选预防或治疗肝癌的潜在物质。

进一步，筛选预防或治疗肝癌潜在物质的步骤包括：

候选物质处理表达或含有ENSG00000267751基因的体系；和

检测所述体系中ENSG00000267751基因的表达；

其中，若所述候选物质可降低ENSG00000267751基因的表达或活性(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上，更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肝癌的潜在物质。

进一步，上面所述的体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，siRNA可以包括部分纯化的RNA、相当纯的RNA、合成的RNA、或重组产生的RNA、以及通过添加、删除、替换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的经改变了的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料至例如siRNA的末端(一个或多个)或至siRNA的一个或多个内部核苷酸，包括使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰。

本发明在筛选有效的siRNA序列时，通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。在本发明的具体实施方式中，本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，结果检测出干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞实验而言抑制效率非常高。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于降低内源性的ENSG00000267751过表达，通过降低ENSG00000267751的表达，从而治疗因ENSG00000267751表达上调导致的肝癌。

在本发明中，可将抑制ENSG00000267751表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含抑制ENSG00000267751表达的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体、微囊等。

脂质体可由多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本发明的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。还可对用于本发明的脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

本发明的药物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。在人类中，该基因具有4个注释转录本(或剪接变体)：长721bp的AC009005.2-004(Ensembl中的转录本ID为ENST00000589457.2)、长625bp的AC009005.2-001(Ensembl中的转录本ID为ENST00000588908.5)、长509bp的AC009005.2-002(Ensembl中的转录本ID为ENST00000590292.5)、长469bp的AC009005.2-003(Ensembl中的转录本ID为ENST00000588290.3)。在具体的实施方案中，ENSG00000267751基因产物指长转录物。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4指定的cDNA序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少70％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少75％、80％、85％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

在本发明中，关于ENSG00000267751的“功能性表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于像ENSG00000267751的非蛋白编码基因，“功能性表达”可以在至少两个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括ENSG00000267751基因的启动子或调控区域的突变，如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。

第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译，例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

本发明的药物组合物可以按药剂学上有效的量进行给药，本发明的用语“药剂学上有效的量”指的是以可适用于医学治疗或预防的合理的受惠/危险比率足以治疗或预防疾病的量，可根据包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径及排出比率、治疗时间、与所使用的本发明的组合物配合或同时使用的药物的要素及其它医学领域中公知的要素来决定有效用量水平。本发明的药物组合物可作为单独的治疗剂进行给药，或是与其它治疗剂并用地进行给药，可以与以往的治疗剂依次地或同时地进行给药。此外，可单次或多次地进行给药。重要的是，需要对上述要素均加以考虑，并且以无副作用的最少的量可取得最大效果的量进行给药。

本发明中，术语“治疗”是指不以治愈为目的，而是减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。如果接受治疗有效量的治疗剂之后，患者成功地被“治疗”，患者显示出可观测到的和/或可度量的一种或多种特定疾病的迹象和症状的减少或消失。例如，癌细胞数目显著减少或癌细胞消失，减少肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减缓，及优选地停止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；使在一定程度上减少和/或减轻与特定癌症相关联的一种或多种症状的时间增加；减少的发病率和死亡率，以及改善生活质量。疾病的迹象或症状的减轻能够为患者感知。治疗可以实现完全反应—定义为癌症的所有迹象消失，或部分反应—肿瘤尺寸减小，优选减小的比例超过50％、更优选75％。如果患者感受到疾病稳定，患者也被视为得到治疗。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了一种与肝癌发生发展相关的lncRNA，通过检测该lncRNA的表达水平即可对早期肝癌进行检测，从而对早期肝癌患者进行治疗，提高患者的生存质量。

本发明提供了一种精准医疗手段和药物组合物，通过抑制患者中ENSG00000267751的表达水平，从而治疗肝癌患者。

附图说明

图1是利用QPCR检测ENSG00000267751在肝癌患者中的表达情况图；

图2是利用TCGA数据库交叉验证ENSG00000267751在肝癌患者中的差异表达图；

图3是ENSG00000267751在肝癌患者中的ROC曲线图；

图4是检测ENSG00000267751在肝癌细胞中的表达情况图；

图5是检测转染siRNA对肝癌细胞中ENSG00000267751的表达影响图；

图6是利用CCK8检测ENSG00000267751对细胞增殖的影响图；

图7是检测ENSG00000267751对细胞的克隆形成集落的影响图；

图8是检测ENSG00000267751对肝癌细胞凋亡的影响图；

图9是Transwell小室检测ENSG00000267751基因对肝癌细胞迁移和侵袭的影响图；其中，图A是ENSG00000267751基因对肝癌细胞迁移的影响图，图B是ENSG00000267751基因对肝癌细胞迁移的影响图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，具体步骤按说明书操作。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用Feature Extraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。差异基因筛选标准：FDR<0.01，abs(log₂FC)>1.5。

6、结果

与癌旁组织相比，ENSG00000267751在肝癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2QPCR测序验证ENSG00000267751基因的差异表达

1、对ENSG00000267751基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式收集肝癌组织和癌旁组织样本各60例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)QPCR扩增检验

引物设计：

ENSG00000267751基因的引物序列为：

正向引物：5’-ATGCTACTCTTCCCTTTG-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GTCCTCCTCATTGTCATC-3’(SEQ ID NO.6)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.8)

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，ENSG00000267751基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3分析ENSG00000267751在TCGA数据库中的表达情况

1、数据收集

从TCGA数据库中收集200例肝癌组织和50例癌旁组织的lncRNA表达谱数据，分析ENSG00000267751在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平；绘制箱形图。

2、ROC曲线分析

使用R语言中的pROC包分析ENSG00000267751的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。

3、结果

ENSG00000267751的表达水平如图2所示，相比对照组，ENSG00000267751在肝癌组织中表达显著上调。

ENSG00000267751的ROC曲线如图3所示，ENSG00000267751的AUC值高达0.8785，且具有较高的特异性和敏感性，说明ENSG00000267751应用于肝癌的诊断具有较高的准确性。

实施例4ENSG00000267751基因在肝癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

1)当细胞达80-90％融合时终止培养，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol缓慢摇动破碎细胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每个1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，摇晃15s，室温放置10min。4℃，12000rpm离心15min。

剩余操作步骤同组织中RNA提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、统计学方法

5、结果

结果如图4所示，与正常肝细胞系相比，ENSG00000267751基因在肝癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例5ENSG00000267751基因的沉默

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对ENSG00000267751基因的siRNA序列：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA1：

正义链为5’-ACAGAAUGGGAUCCAAAUGGG-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-CAUUUGGAUCCCAUUCUGUUU-3’(SEQ ID NO.12)；

siRNA2：

正义链为5’-UAGUAAAACAAUUAAGAUGAC-3’(SEQ ID NO.13)，

反义链为5’-CAUCUUAAUUGUUUUACUAUU-3’(SEQ ID NO.14)；

siRNA3：

正义链为5’-AGAACAAAGGGAAGAGUAGCA-3’(SEQ ID NO.15)，

反义链为5’-CUACUCUUCCCUUUGUUCUUG-3’(SEQ ID NO.16)

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h；

在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HepG2)阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA与ENSG00000267751基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测ENSG00000267751基因的表达水平

3.1细胞总RNA的提取

具体步骤同实施例4。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰ENSG00000267751基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图5显示，相比HepG2、转染空载siRNA-NC、siRNA1、siRNA3组，siRNA2组能够显著降低ENSG00000267751的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例6CCK8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、CCK8检测细胞增殖

1)将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞；

2)实验分三组，分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA1，每组设6个复孔；

3)分别在转染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔CCK8试剂；

4)2h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图6所示的结果显示：空白对照组同空载组无明显差异，而转染siRNA2组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明ENSG00000267751的表达能够促进肝癌细胞的生长。

实施例7软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO₂温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图7所示，与对照组相比，转染siRNA2的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

实施例8ENSG00000267751基因对肝癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测ENSG00000267751基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例4。

2、细胞转染步骤同实施例5。

3、步骤

1)将3m1 10×上样缓冲液用27m1蒸馏水稀释。

2)收集细胞样本并用预冷的PBS清洗。

3)将细胞加入lml 1×上样缓冲液，300g离心10min，吸出缓冲液。

4)再次加入lml 1×上样缓冲液，将细胞悬液中细胞浓度调整为1×10⁶个/ml。

5)将细胞悬液取出100μ1，加入EP管中。

6)将5μl的Annexin V FITC加入EP管中，混匀EP管中的液体，在室温下避光孵育10min。

7)向EP管中加入5μ1PI染液，在室温下避光5min。

8)在EP管中加入500μl的PBS溶液，轻轻混匀，1h内上流式细胞仪进行检测。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

结果如图8所示，实验组与对照组相比，细胞凋亡率无显著的变化(P<0.05)，该结果说明，ENSG00000267751对肝癌细胞的凋亡无明显的影响。

实施例9细胞迁移及侵袭实验

1、Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化，用PBS进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。

2、配置细胞悬液

细胞撤血清饥饿处理12-24h，对细胞进行消化处理，终止消化后进行离心，去除上层培养液。用PBS对沉淀细胞进行清洗，加入含有BSA的无血清培养基对其进行重悬。调整细胞的密度至5×l0⁵个/ml。

3、细胞接种

取细胞悬液200μ1(迁移实验为100μ1，侵袭实验为200μ1)加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μ1含FBS的1640培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。

4、染色

细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

5、结果

结果如图9所示，在肝癌细胞转染干扰RNA之后，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降，结果说明ENSG00000267751能够促进肝癌细胞的迁移及侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> lncRNA在肝癌诊疗中的应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 721

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

cgtgtgctct ggagattgca tcccacgcag gcagccccct tccgtacaag taaagtggtc 60

tcgctgagaa attttctaag tgctggtttc tctttgcggg accgactcgc cgcccccaaa 120

tatcccattt ggatcccatt ctgtttcagg agaggctggc ggttaccttt cttggggaga 180

cgcgtccgac tgcttcattg tgggggcctc aggagcggag gatcgggtcc cgcccgaggt 240

gacgcgtaaa cccagactct cagcaacgcg ggtaggaagg acccttgaag ttccgcggcg 300

accacgtcgg ctgaaaccag cagcccagga caagtggacc agccagcaag acccagacca 360

tccaaaccgg ctgatcctac gacaggaccc agatgccagt gaaagtgacc acagccctgc 420

tctagtcacc ccggaagctg accagtctac gcacggccga agcttcgtca aggaagtaaa 480

tgtagttaga aatcttaagc ccagtaattt tccttgtcat cttaattgtt ttactattaa 540

cctgtcgctt tgctcaaccc cctcctctgg gcaaacatct cttgtccatc ctaggtacaa 600

acatgctact cttccctttg ttcttgctgc tctcgctaga tctatgtcag aaggagggat 660

atgcggagag tttaatttaa ctaattgttg cctaaaaatc gatgacaatg aggaggacgt 720

c 721

<210> 2

<211> 625

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

tggagattgc atcccacgca ggcagccccc ttccgtacaa gagaggctgg cggttacctt 60

tcttggggag acgcgtccga ctgcttcatt gtgggggcct caggagcgga ggatcgggtc 120

ccgcccgagg tgacgcgtaa acccagactc tcagcaacgc gggtaggaag gacccttgaa 180

gttccgcggc gaccacggaa ctgtgccttc gatctccaca gtcggctgaa accagcagcc 240

caggacaagt ggaccagcca gcaagaccca gaccatccaa accggctgat cctacgacag 300

gacccagatg ccagtgaaag tgaccacagc cctgctctag tcaccccgga agctgaccag 360

tctacgcacg gccgaagctt cgtcaaggaa gtaaatgtag ttagaaatct taagcccagt 420

aattttcctt gtcatcttaa ttgttttact attaacctgt cgctttgctc aaccccctcc 480

tctgggcaaa catctcttgt ccatcctagg tacaaacatg ctactcttcc ctttgttctt 540

gctgctctcg ctagatctat gtcagaagga gggatatgcg gagagtttaa tttaactaat 600

tgttgcctaa aaatcgatga caatg 625

<210> 3

<211> 509

<212> DNA

<213> 人源

<400> 3

gagattgcat cccacgcagg cagccccctt ccgtacaaga gaggctggcg gttacctttc 60

ttggggagac gcgtccgact gcttcattgt gggggcctca ggagcggagg atcgggtccc 120

gcccgaggtg acgcgtaaac ccagactctc agcaacgcgg gtaggaagga cccttgaagt 180

tccgcggcga ccacgtcggc tgaaaccagc agcccaggac aagtggacca gccagcaaga 240

cccagaccat ccaaaccggc tgatcctacg acaggaccca gatgccagtg aaagtgacca 300

cagccctgct ctagtcaccc cggaagctga ccagtctacg cacggccgaa gcttcgtcaa 360

ggaagtaaat gtagttagaa atcttaagcc cagtaatttt ccttgtcatc ttaattgttt 420

tactattaac ctgtcgcttt gctcaacccc ctcctctggg caaacatctc ttgtccatcc 480

taggtacaaa catgctactc ttccctttg 509

<210> 4

<211> 469

<212> DNA

<213> 人源

<400> 4

tgtggctcac gtctgtactc ccagagcctt gggaggtcga ggcgggaaga tcgcttgagc 60

ccgggagctc gagaccagac gcggcaacat ggcgagacgc acatctctgc ctttaaaaat 120

gagaggctgg cggttacctt tcttggggag acgcgtccga ctgcttcatt gtgggggcct 180

caggagcgga ggatcgggtc ccgcccgagg tgacgcgtaa acccagactc tcagcaacgc 240

gggtaggaag gacccttgaa gttccgcggc gaccacgtcg gctgaaacca gcagcccagg 300

acaagtggac cagccagcaa gacccagacc atccaaaccg gctgatccta cgacaggacc 360

cagatgccag tgaaagtgac cacagccctg ctctagtcac cccggaagct gaccagtcta 420

cgcacggccg aagcttcgtc aaggaagtaa atgtagttag aaatcttaa 469

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgctactct tccctttg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcctcctca ttgtcatc 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

acagaauggg auccaaaugg g 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

cauuuggauc ccauucuguu u 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

uaguaaaaca auuaagauga c 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

caucuuaauu guuuuacuau u 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

agaacaaagg gaagaguagc a 21

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 16

cuacucuucc cuuuguucuu g 21

Claims

1.特异性检测ENSG00000267751基因表达水平的试剂在制备诊断早期肝癌产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ENSG00000267751在肝癌患者中表达上调。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包括RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测用试剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于， RT-PCR反应试剂包括扩增ENSG00000267751的引物，所述扩增ENSG00000267751的引物序列如SEQ ID NO.5~6所示。

5.一种ENSG00000267751基因的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗肝癌的药物组合物。

6.一种ENSG00000267751基因的用途，其特征在于，用于筛选治疗肝癌的潜在物质。