CN111378755A

CN111378755A - 一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物及其应用

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Publication number: CN111378755A
Application number: CN202010331330.4A
Authority: CN
Inventors: 唐博; 苏辉昭; 张易; 王焱; 舒格格
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明公开了一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物及其应用，属于生物医药技术领域。所述lncRNA生物标志物为ENST00000505348.1基因，所述ENST00000505348.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种诊断肝癌的产品、一种预防或治疗肝癌的药物组合物。本发明首次发现了ENST00000505348.1基因的差异表达与肝癌的发生发展相关，可以作为lncRNA生物标志物用于肝癌的检测，该lncRNA生物标志物对于人肝癌具有较高的灵敏度和特异性，可以用来预防或治疗肝癌。

Description

一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

肝癌是全球高发的恶性肿瘤之一。在世界范围内，每年新发病例超过100万。我国是肝癌的高发地区，肝癌病因复杂，涉及饮食、环境、病毒感染等多种因素。近年来，尽管不断有与肝癌相关的癌基因、抑癌基因以及相关肿瘤信号通路等被发现和证实，但其发病机制尚未完全清楚。目前，对肝癌相关分子及其调控、干预机制的研究是肝癌研究的热点。

肝癌早期症状多缺乏特异性，早期病例仅占肝癌手术病例的10％-20％，大约2/3的患者在确诊时已处于中晚期或出现转移，限制了其作为肝癌筛查的临床应用。CT和磁共振等影像学检查已广泛应用于肝癌诊断，但早期肝癌和癌前病变的影像学表现常缺乏特异性，故影像学检查在发现早期肝癌及微小病灶方面有一定的局限性因此，寻找新的生物学靶标用于肝癌的癌变监测和干预，成为肝癌防治迫切需要解决的问题。

人类基因组DNA转录生成大量的RNA分子，除蛋白编码基因转录所生成的mRNA外，大多数为不具备蛋白质编码能力的非编码RNA分子，约占65％。lncRNA是一类内源性、片段长度大于200个核苷酸、缺少完整特异的开放阅读框而无编码蛋白质能力的RNA分子，多数由RNA聚合酶II转录并经可变剪切生成，其表达具有组织特异性和时空特异性。lncRNA最初被认为是基因组转录的“噪声”，是RNA聚合酶II作用的副产物，不具有生物学功能。但随后的证据显示，lncRNA参与了基因组印记、染色质修饰、X染色体沉默、核浆运输、转录调控等多种重要的生理过程，能够在染色质水平、转录及转录后水平等多个层面调节基因表达，作用范围非常广泛。

近年来通过对肿瘤组织和正常组织的对比研究，发现lncRNA在包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀肤癌、肝癌、肝癌在内的多种恶性肿瘤中均存在表达异常。肝癌作为一种常见的消化道肿瘤，其发生发展过程中lncRNA的作用越来越受到人们的重视。寻找肝癌早期lncRNA分子标志物、进一步了解lncRNA在肝癌病变早期的生物学功能具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物。本发明首次发现了ENST00000505348.1基因的差异表达与肝癌的发生发展相关，可以作为lncRNA生物标志物用于肝癌的检测，该lncRNA生物标志物对于人肝癌具有较高的灵敏度和特异性，可以用来预防或治疗肝癌。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物，所述lncRNA生物标志物为ENST00000505348.1基因，所述ENST00000505348.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

ENST00000505348.1基因的介绍：

本发明的长链非编码RNA的命名为lnc-COX7C-5，位于第5号染色体上，EnsemblGene ID为ENSG00000248195，lnc-COX7C-5的转录本序列是具有785bp的长度，相应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的肝癌诊断用lncRNA生物标志物的有益效果是：

本发明首次发现了ENST00000505348.1基因的差异表达与肝癌的发生发展相关，可以作为lncRNA生物标志物用于肝癌的检测，该lncRNA生物标志物对于人肝癌具有较高的灵敏度和特异性，可以用来预防或治疗肝癌。

术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1指定的核苷酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如通过斑点印迹)。基因组DNA(例如来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA。

本发明的目的之二，是提供一种诊断肝癌的产品。本发明的诊断肝癌的产品，能够通过检测样本中ENST00000505348.1基因的表达水平来诊断患者是否患有肝癌，ENST00000505348.1基因在肝癌患者中表达上调。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种诊断肝癌的产品，所述产品为芯片、制剂和试剂盒中的任意一种，所述产品能够测定样本中上述的ENST00000505348.1基因的表达水平。

本发明的诊断肝癌的产品的有益效果是：

本发明的诊断肝癌的产品，能够通过检测样本中ENST00000505348.1基因的表达水平来诊断患者是否患有肝癌，ENST00000505348.1基因在肝癌患者中表达上调。

术语“诊断”，是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。

术语“样本”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于ENST00000505348.1基因的部分或全部序列。

采用上述进一步的有益效果是：可根据本发明所述的ENST00000505348.1基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的可将阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括但不限于溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。

术语“严格性”用于指代进行核酸杂交所处的条件：温度、离子强度和其他化合物(诸如有机溶剂)的存在。在“低严格条件”下，所关注的核酸序列将与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列、密切相关的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)以及只有部分同源性的序列(例如，具有50-90％同源性的序列)杂交。在“中等严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列和密切相关的序列(例如，90％或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列和(取决于诸如温度的条件)具有单个碱基错配的序列杂交。换句话讲，在高严格性条件下，可升高温度以排除与具有单个碱基错配的序列杂交。

本发明中针对ENST00000505348.1基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

本发明所述芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的芯片。

进一步，所述制剂或所述试剂盒包括ENST00000505348.1基因的特异性引物和探针。

更进一步，所述ENST00000505348.1基因的特异性引物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物和括如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

正向引物：5'-gcagtgcaggttaattcaatgcc-3'(SEQ ID NO.2)；

反向引物：5'-ttactggttgccgttgtggc-3'(SEQ ID NO.3)。

更进一步，所述制剂或试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

更进一步，所述阴性对照品为DNase-free和RNase-free的纯水。

更进一步，所述制剂或所述试剂盒中还包括用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

更进一步，所述制剂或所述试剂盒中还包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色所需的试剂，包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液和洗液。

更进一步，所述制剂或所述试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

更进一步，所述试剂盒还包含其它辅助试剂，所述辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述试剂例如(但不限于)：荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。

本发明的目的之三，是提供一种预防或治疗肝癌的药物组合物。本发明的预防或治疗肝癌的药物组合物，可以抑制ENST00000505348.1基因的表达，预防或肝癌的发生和恶性程度。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种预防或治疗肝癌的药物组合物，包括有效量的上述ENST00000505348.1基因和/或其表达产物的抑制剂。

本发明的预防或治疗肝癌的药物组合物的有益效果是：

本发明的预防或治疗肝癌的药物组合物，可以抑制ENST00000505348.1基因的表达，预防或肝癌的发生和恶性程度。

术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

本发明所述抑制剂是指任何可抑制ENST00000505348.1基因或表达产物稳定性、下调ENST00000505348.1基因的表达、降低ENST00000505348.1基因的有效作用时间或抑制ENST00000505348.1基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于抑制ENST00000505348.1基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗肝癌。

上述抑制剂选自：以ENST00000505348.1基因或其转录本为靶序列、且能够抑制ENST00000505348.1基因表达或基因转录的干扰分子，包括shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

本发明的药物组合物以单独的组合物或者与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

更进一步，所述siRNA包括如SEQ ID NO.6所示的正向和如SEQ ID NO.7所示的反向组成的序列对、如SEQ ID NO.8所示的正向和如SEQ ID NO.9所示的反向组成的序列对、如SEQ ID NO.10所示的正向和如SEQ ID NO.11所示的反向组成的序列对中的任意一种。

更进一步，所述siRNA还包括阴性对照siRNA-NC，所述siRNA-NC包括如SEQ IDNO.12所示的正向和如SEQ ID NO.13所示的反向组成的序列对。

在本发明中，siRNA可以包括部分纯化的RNA、相当纯的RNA、合成的RNA、或重组产生的RNA、以及通过添加、删除、替换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的经改变了的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料至例如siRNA的末端(一个或多个)或至siRNA的一个或多个内部核苷酸，包括使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰。

本发明在筛选有效的siRNA序列时，通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。在本发明的具体实施方式中，本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，结果检测出干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.11所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞实验而言抑制效率非常高。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成双链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

进一步，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其它药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明所述的“药学上可接受的载体”，指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

本发明中，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入和缓释给予。优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将ENST00000505348.1基因的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ENST00000505348.1基因的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述ENST00000505348.1基因的抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述因素包括但不限于：所述ENST00000505348.1基因的抑制剂的药代动力学参数(例如生物利用率、代谢、半衰期等)；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其它崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于降低内源性的ENST00000505348.1基因过表达，通过降低ENST00000505348.1基因的表达，从而治疗因ENST00000505348.1基因表达上调导致的肝癌。

在本发明中，可将抑制ENST00000505348.1基因表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含抑制ENST00000505348.1基因表达的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体、微囊等。

脂质体可由多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本发明的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。还可对用于本发明的脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

本发明的药物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

附图说明

图1是本发明的实施例2中，利用QPCR检测ENST00000505348.1基因在肝癌组织中的表达情况图。

图2是本发明的实施例3中，利用QPCR检测ENST00000505348.1基因在肝癌细胞中的表达情况图。

图3是本发明的实施例4中，利用QPCR检测ENST00000505348.1基因干扰RNA对肝癌细胞中该基因表达水平的影响图。

图4是本发明的实施例5中，利用CCK8检测ENST00000505348.1基因对肝癌细胞增殖的影响图。

具体实施方式

以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集8例肝癌癌旁组织和肝癌组织样本全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，所有的患者均已知情同意，并取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA提取

(1)从-80℃超低温冰箱中取出临床标本，置于冰上解冻。称取约20mg组织放置于2mL离心管中，置于冰上加入1mL Trizol。使用手持式自动均浆机将组织充分匀浆至无固体，室温静置10min。

(2)13000rpm、4℃离心10min。

(3)用移液器小心地吸取上清液转移至干净的RNase-Free的l.5mL离心管中。

(4)加入0.2mL的二氯甲烷，用旋涡混合器震荡15s，室温静置10min。

(5)3000rpm、4℃离心10min。

(6)小心地用移液器吸取水相并转移至1.5mL RNase-free的离心管中。

(7)加入与步骤(6)等体积的异丙醇，用旋涡混合器震荡4s以沉淀总RNA，室温静置30min。

(8)13000rpm、4℃下离心10min，弃上清。加入75％的酒精1mL，再次混匀。13000rpm、4℃下离心10min，弃上清。

(9)置于室温下干燥10min，加入12μL RNase-Free水溶解RNA并放置于冰上备用。

3、总RNA定量与纯度分析

使用Bio-Red紫外分光光度计测定总RNA在280nm和260nm处的光密度值。RNA的量按1OD_260nm-40μgRNA来计算，当OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.8-2.0时认为总RNA的纯度是可靠的，可用于下一步的实验。

4、lncRNA表达芯片分析

利用Arraystar公司的ArraystarHuman IncRNAArray检测肝癌组织和癌旁组织中lncRNA表达谱的差异。Arraystar IncRNA芯片设计探针为60nt长度的寡核苷酸，这些长寡核苷酸探针在高度严格的杂交条件下可以得到高灵敏度及特异性的理想实验结果。针对每条序列都设计了多条探针，增加了信号的可靠度。

5、数据分析

利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncRNA在癌与癌旁的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncRNA。

6、结果

结果显示，ENST00000505348.1基因在肝癌组织中的表达量显著高于癌旁组织中的表达量。

实施例2：QPCR测序验证ENST00000505348.1基因的差异表达

1、对ENST00000505348.1基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肝癌癌旁组织和肝癌组织各50例。

2、RNA提取

同实施例1。

3、逆转录

(1)反应体系：

RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃,5min，然后放在冰上冷却。

继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理。

(2)逆转录反应条件：25℃，5min；42℃，60min，70℃，5min，4℃保温60min。

(3)聚合酶链反应

引物设计：根据Genebank中ENST00000505348.1基因和GAPDH基因的序列设计QPCR扩增引物，由上海生物工程有限公司合成。具体引物序列如下：

ENST00000505348.1基因：

正向引物为5'-gcagtgcaggttaattcaatgcc-3'(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5'-ttactggttgccgttgtggc-3'(SEQ ID NO.3)。

GAPDH基因：

正向引物为5'-aatcccatcaccatcttccag-3'(SEQ ID NO.4)；

反向引物为5'-gagccccagccttctccat-3'(SEQ ID NO.5)。

配制PCR反应体系：

2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH₂O8.0μl。

PCR反应条件：95℃，10min；(95℃，15s；60℃，60s)×40个循环，60℃，5min延伸反应。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS22.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

如图1所示，与肝癌癌旁组织相比，ENST00000505348.1基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同芯片检测结果一致。

实施例3：ENST00000505348.1基因在肝癌细胞中的表达情况

1、细胞培养

人肝细胞系L02、人肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SNU499和97H(均购自美国ATCC)在含10％胎牛血清的RPMI1640或DMEM培养基于37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2、RNA提取

弃去完全培养基，用PBS清洗2次后用胰酶消化细胞，制成细胞悬液加入2mL离心管中，1200rpm离心8min，弃上清后加入1mL Trizol用移液器反复吹打15次以上，使细胞充分裂解。其余的操作步骤同实施例1。

3、逆转录

同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS22.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，与肝正常细胞相比，ENST00000505348.1基因在肝癌细胞SNU-499、Hep3B中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4：ENST00000505348.1基因抑制表达

1、细胞培养

步骤同实施例3。

2、siRNA设计

根据ENST00000505348.1基因的cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)设计特异性的ENST00000505348.1基因的siRNA序列，具体序列如下：

siRNA-1：

正向为5'-gucgauacuaaugguacautt-3'(SEQ ID NO.6)；

反向为5'-auguaccauuaguaucgactt-3'(SEQ ID NO.7)。

siRNA-2：

正向为5'-cuuuagauacuaccgguuatt-3'(SEQ ID NO.8)；

反向为5'-uaaccgguaguaucuaaagtt-3'(SEQ ID NO.9)。

siRNA-3：

正向为5'-gagauugucacuagaacautt-3'(SEQ ID NO.10)；

反向为5'-agguucuagugacaaucuctt-3'(SEQ ID NO.11)。

siRNA-NC：

正向为5'-uucuccgaacgugucacgutt-3'(SEQ ID NO.12)；

反向为5'-acgugacacguucggagaatt-3'(SEQ ID NO.13)。

3、转染

将肝癌细胞分为3组，分别为空白对照组(SNU-499)、阴性对照组(转染siRNA-NC)、实验组(转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)。使用Lip-3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。siRNA-NC和siRNA-Lnc的转染浓度均为0.5μg/ml。

4、QPCR检测ENST00000505348.1基因的转录水平

(1)RNA提取

同实施例3。

(2)逆转录

同实施例2。

(3)QPCR扩增

同实施例2。

5、统计学方法

实验按照重复3次来完成，结果数据是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS22.0统计软件来进行统计分析的，ENST00000505348.1基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图3显示，与非转染组和转染空白组相比，转染siRNA-Lnc组中ENST00000505348.1基因表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5：ENST00000505348.1基因对肝癌细胞增殖的影响

采用CCK8实验检测ENST00000505348.1基因对肝癌细胞增殖能力影响。

1、细胞培养

同实施例4。

2、转染

同实施例4。

3、各组处理的细胞经胰酶消化后重悬细胞、计数，调整细胞浓度为1×10⁵/ml按100μL/孔的密度接种于96孔板，即每孔细胞数为1×10⁴个。

4、待细胞到达相应的检测时间点(0d、24h、48h、72h)后，按10μL/孔加入CCK8试剂，微量振荡器振荡1min-2min；置于5％CO₂、37℃的细胞培养箱中孵育4h。

5、酶标仪读板，在490nm波长测定其吸光度(A)值。

6、统计学分析

实验按照重复3次来完成，采用SPSS22.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图4所示，与对照相比，实验组在转染siRNA-Lnc后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明ENST00000505348.1基因具有抑制细胞增殖的作用。

综上，本发明经过广泛而深入的研究，通过lncRNA芯片筛选得到具有潜在致癌活性的lncRNA，首次发现了肝癌中ENST00000505348.1基因呈现特异性高表达。实验证明，通过特异抑制ENST00000505348.1基因的表达水平或表达产物的活性，能够有效地抑制肝癌细胞的生长和侵袭，从而达到抑制肝癌的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广西医科大学

<120> 一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 785

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttgccttta atattttctt tgtgtcgata ctaatggtac attcttgaaa tctcatgcat 60

aagaaaaata aaatatacaa cttcctcata aatgtgtaga aacagtaatg ctcttctaca 120

atactattac aataaccctg gtcaaaaata acattgtact ttcaagtttg tcagaatctt 180

caactcatta ttgttcttgt tttagaattt acacaagaaa tctatcttta gatactaccg 240

gttaacttaa acaaatttat tcttaaatca atgagaacta tttcaagact tggtcagtaa 300

gtgttttgta tattcctctt cttatataca ccatccagaa acaaaaatgg aagcaaaagc 360

taaatttatt gtttgagatt gtcactagaa catatttata gaaaaacaat actaccatga 420

aatatacatt gcctagttta tatattaact attgaattat ttcaaaatta aatgttttga 480

ataagaaaat tgtcatttat tccaaataaa tatgataaaa gaaatattga actctcttag 540

tttttaatgt aacaaccttt ggataaccta tcttgttcaa ttttactata ttataaattt 600

aaaaatcatt ctaccttcaa ttctctatct tattaatgat aatcaattaa attcacaata 660

ttagttattt ttatatatga cttaaaatat tttgacatta aaataaccca atagaaaaaa 720

agctagttta tttaatgttt tcaaagaaat ttttatcatt tcaaactacc taattgtcaa 780

tctat 785

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagtgcagg ttaattcaat gcc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttactggttg ccgttgtggc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagccccagc cttctccat 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gucgauacua augguacaut t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

auguaccauu aguaucgact t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cuuuagauac uaccgguuat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uaaccgguag uaucuaaagt t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagauuguca cuagaacaut t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agguucuagu gacaaucuct t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.一种肝癌诊断用lncRNA生物标志物，其特征在于，所述lncRNA生物标志物为ENST00000505348.1基因，所述ENST00000505348.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种诊断肝癌的产品，所述产品为芯片、制剂和试剂盒中的任意一种，其特征在于，所述产品能够测定样本中如权利要求1所述的ENST00000505348.1基因的表达水平。

3.根据权利要求2所述的诊断肝癌的产品，其特征在于，所述芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于ENST00000505348.1基因的部分或全部序列。

4.根据权利要求2所述的诊断肝癌的产品，其特征在于，所述制剂或所述试剂盒包括ENST00000505348.1基因的特异性引物和探针。

5.根据权利要求4所述的诊断肝癌的产品，其特征在于，所述ENST00000505348.1基因的特异性引物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物和如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

6.根据权利要求2所述的诊断肝癌的产品，其特征在于，所述制剂或试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

7.一种预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，包括有效量的权利要求1所述的ENST00000505348.1基因和/或其表达产物的抑制剂。

8.根据权利要求7所述的预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。

9.根据权利要求8所述的预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述siRNA包括如SEQ ID NO.6所示的正向和如SEQ ID NO.7所示的反向组成的序列对、如SEQ ID NO.8所示的正向和如SEQ ID NO.9所示的反向组成的序列对、如SEQ ID NO.10所示的正向和如SEQID NO.11所示的反向组成的序列对中的任意一种。

10.根据权利要求7所述的预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其它药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。