CN113679735A - Slc7a11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SLC7A11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用。本发明基于分子生物学实验验证了SLC7A11为铁死亡信号通路的关键成员，并针对SLC7A11及相关信号分子通路，发现和设计相关的小分子抑制剂，干预肝癌细胞增殖凋亡；本发明通过动物模型实验验证了小分子抑制剂(SLC7A11的shRNA)敲低SLC7A11能够抑制HCC细胞的增殖和迁移，而SLC7A11的过表达可以显著挽救METTL14在HCC缺氧条件下诱导的肿瘤抑制作用，为临床上肝癌介入栓塞术后抑制HCC的复发转移提供了新的分子靶标。

Description

SLC7A11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用

技术领域

本发明涉及SLC7A11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用，属于分子生物技术领域。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，其典型特征是快速增殖和转移较早。巴塞罗那临床肝癌(BCLC)标准和中国原发性肝癌诊治指南(2017版)都推荐了不同阶段HCC的治疗方法。然而，临床上仍需要更多治疗方法，因为该疾病通常在中晚期被诊断出来，并且HCC患者的五年生存率仍不理想。

介入治疗已广泛应用于不可切除的HCC患者。然而，介入栓塞引起的缺氧状态可能促进HCC细胞的增殖和转移，其内在机制尚不清楚。因此，探索缺氧与HCC发展的分子机制对于推进未来的治疗至关重要。值得注意的是，异常的表观遗传变化会导致基因表达的严重破坏，从而促进HCC的发生和发展。

N6-甲基腺苷(m6A)RNA修饰已成为表观遗传调控机制的一个新维度，可在翻译前控制mRNA表达。在至少三分之一的哺乳动物mRNA中发现了 m6A。据估计，一个mRNA中平均有3-5个m6A修饰。值得注意的是，许多 m6A位点在小鼠和人类之间在进化上是保守的。多组分m6A甲基转移酶复合物(MTC)在mRNA修饰中执行m6A的沉积，其由异二聚体、甲基转移酶样3(METTL3)/甲基转移酶样14(METTL14)复合物、主要酶复合物和其他参与因素包括KIAA1429、WTAP和RBM15。就该复合体而言，METTL3是与甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合并催化甲基基团转移的催化亚基，而METTL14 通过稳定METTL3构象和识别底物RNA来负责m6A沉积。m6A修饰位点经常在3'非翻译区(3'UTR)和编码序列(CDS)中富集，在终止密码子区域周围富集特别高，其中包含经典的共有序列DRACH(D＝G、A或U；R＝G或A； H＝A、C或U).这种可逆的催化过程由m6A橡皮擦脂肪量和肥胖相关蛋白 (FTO)和alkB同源物5(ALKBH5)进行。m6A修饰的RNA可以通过m6A 阅读器蛋白进行识别，包括YT521-B同源(YTH)域家族蛋白 (YTHDF1–YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2)。其中，YTHDF2是第一个经过鉴定和充分研究的m6A阅读器蛋白，它通过其C端YTD结构域靶向 m6A，N端结构域负责将mRNA推向加工体以进一步降解。

最近的研究表明m6A参与了多种生理过程。作为MTC的另一个不可或缺的组成部分，METTL14已被证明在各种类型的癌症中上调。Weng等人报道，敲除METTL14可以显着抑制白血病干/起始细胞(LSCs/LICs)的自我更新。进一步的机制研究表明，其靶标mRNAMYB和MYC上m6A丰度的降低导致 mRNA稳定性和翻译的降低。据报道，METTL14还可以驱动EBV介导的肿瘤发生。然而，Chen等人发现METTL14通过靶向miR-37528抑制结直肠癌 (CRC)进展；Ma等人认为METTL14通过靶向pri-miR-12629抑制HCC转移。然而，METTL14在肝癌介入栓塞术后的肿瘤复发转移中的具体功能仍然难以捉摸。

铁死亡是以一种以脂质过氧化产物(MDA)和/或致死活性氧(ROS)增多、铁依赖性为主要特征的非凋亡性细胞死亡方式，在癌症治疗中显示出巨大的前景。由SLC7A11和SLC3A2组成的xc-系统的功能是输入胞外氧化形式的半胱氨酸、胱氨酸，输出胞内谷氨酸以保持氧化还原平衡。在一些癌症患者中检测到更高水平的SLC7A11，抑制SLC7A11会使肿瘤细胞对铁死亡敏感。Ungard等人发现乳腺癌细胞中SLC7A11的沉默延迟了癌症诱导的骨痛发作；Li等人预测SLC7A11的过表达与口腔鳞状细胞癌患者的复发呈正相关。所有这些结果表明xc-系统抑制剂可能作为潜在应用前景的抗癌剂。然而，我们对HCC中铁死亡调节的确切机制的了解仍不清楚，尤其是在缺氧条件下。m6A机制的破坏是否会导致铁死亡细胞死亡并促进HCC发病机制仍需要探索。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：肝细胞癌介入栓塞术后由引起的缺氧状态可能促进HCC细胞的增殖和转移等问题。

为了解决上述技术问题，本发明公开了SLC7A11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用，包括将SLC7A11抑制剂用于制备肝细胞癌介入栓塞术后抑制 HCC细胞的增殖和转移的药物中的应用。

优选地，所述药物包括医学上可接受的载体和有效量的活性成分，所述活性成分为SLC7A11抑制剂。

优选地，所述的SLC7A11抑制剂包括SLC7A11基因特异性的RNAi、 SLC7A11基因特异性的microRNA、SLC7A11基因的shRNA或SLC7A11基因的siRNA。

优选地，所述的SLC7A11抑制剂为SLC7A11基因的shRNA，所述shRNA 的序列为TTCTCCGAACGTGTCA CGTTTC。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明基于分子生物学实验验证了SLC7A11为铁死亡信号通路的关键成员，并针对SLC7A11及相关信号分子通路，发现和设计相关的小分子抑制剂，干预肝癌细胞增殖凋亡；

2.本发明通过动物模型实验验证了小分子抑制剂(SLC7A11的shRNA)敲低SLC7A11能够抑制HCC细胞的增殖和迁移，而SLC7A11的过表达可以显著挽救METTL14在HCC缺氧条件下诱导的肿瘤抑制作用，为临床上肝癌介入栓塞术后抑制HCC的复发转移提供了新的分子靶标。

附图说明

图1A：表示缺氧下调Huh7和HCCLM3细胞中的METTL14；

图1B：表示HIF-1α敲低对缺氧(Hypoxia)诱导的METTL14抑制的影响；

图1C：表示通过流式细胞术检测到的HIF-1α敲低对缺氧诱导的ROS积累的影响以及量化结果；

图1D：表示HIF-1α敲低对缺氧诱导的MDA积累的影响；

图1E：表示电子显微镜检测线粒体形态变化，其中，白色箭头指的是典型的线粒体；

图2A：表示Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/main.html)分析的“Guichard Liver”和“Guichard Liver 2”数据库和OncoLnc(http://www.oncolnc.org)分析的TCGA数据库的生物信息学分析/)关键字为“METTL14”，“肝细胞癌与正常分析”；

图2B：表示在Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/main.html)使用关键词“SLC7A11”、“肝细胞癌”分析了来自“Wurmbach Liver”、“Roessler Liver”和“Roessler Liver 2”数据库的生物信息学分析对比正态分析”；

图2C：表示METTL14在七种HCC细胞系(Huh7、HepG2、7721、HCCLM3、 MHCC97H、PLC/PRF/5、Bel-7402)中的蛋白表达模式，与通过蛋白质印迹检测的正常肝细胞系L02进行比较(下图)，相对METTL14蛋白质水平被量化(上图)；

图2D：表示与正常肝细胞系L02进行比较，分别通过qPCR和蛋白质印迹检测的七种HCC细胞系(Huh7、HepG2、SMMC-7721、HCCLM3、MHCC97H、 PLC/PRF/5、Bel-7402)中SLC7A11的mRNA和蛋白水平；

图2E：表示METTL14对缺氧条件下Huh7和HCCLM3细胞SLC7A11表达的影响，分别通过RT-qPCR和蛋白质印迹检测SLC7A11 mRNA和蛋白质水平；

图3A：表示SLC7A11 mRNA的示意图和5'UTR预测的“m6A”位点(图中圈出的碱基A)，“DRACH”中间的碱基A被T替换，以制备用于荧光素酶报告基因检测的突变质粒；

图3B：表示METTL14和METTL14-R298P突变体对HCCLM3细胞中SLC7A11表达的影响，分别通过qPCR和Western印迹检测SLC7A11的mRNA 和蛋白质水平；

图3C：表示DOT BLOT显示稳定表达宽型METTL14和 METTL14-R298P突变体的总m6A水平；

图3D：表示SLC7A11荧光素酶报告基因示意图；

图3E：表示确定了基于pGL3基本质粒的WT或MUT荧光素酶报告基因在METTL14转染的HCCLM3细胞中的相对活性(标准化为载体对照组)；

图3F：表示应用MeRIP分析和qRT-PCR来评估HCCLM3表达的宽型 METTL14或METTL14-R298P突变体中SLC7A11的m6A修饰，通过 m6A-IP/input和IgG-IP/input计算各组m6A的富集度；

图3G：表示宽型METTL14和METTL14-R298P突变体对HCC肿瘤生长的影响，裸鼠皮下注射稳定表达METTL14、METTL14-R298P或对照载体的 HCCLM3细胞，每周计算两次肿瘤生长；

图3H：表示在异种移植模型中过表达HCCLM3细胞(或阴性对照)的稳定宽型METTL14或METTL14-R298P突变体的肿瘤生长曲线；

图3I：表示通过蛋白质印迹检测异种移植物中COX2、SLC7A11和 METTL14的表达模式；

图3J：表示种移植物中METTL14分别和COX2、SLC7A11之间的相关性；

图3K：表示三种异种移植物的H&E染色切片；

图3L：表示免疫组织化学检测的异种移植物中COX2、SLC7A11和 METTL14的表达模式；

图4A：表示在用放线菌素D(标准化为0小时)处理后，在Huh7和 HCCLM3细胞中测定了mRNA衰减率；

图4B：表示RT-qPCR和蛋白质印迹显示沉默YTHDF2对Huh7和 HCCLM3中SLC7A11mRNA和蛋白质水平的影响；

图4C：表示转染了siYTHDF2的Huh7和HCCLM3细胞中WT或 MUT荧光素酶报告基因的相对活性(标准化为载体对照组)的测定结果；

图5A：表示根据制造商的说明通过流式细胞术进行ROS检测的定量分析结果；其中，Huh7和HCCLM3细胞用或不用10mM浓度的NAC处理36小时；

图5B：表示通过蛋白质印迹和qPCR分别检测Huh7和HCCLM3细胞中EMT 相关E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白和mRNA水平，其中，细胞用或不用10mM浓度的NAC处理36小时；

图5C：表示通过电子显微镜检测HCCLM3细胞中用/不用NAC或 shSLC7A11处理的线粒体的形态学改变，其中，白色箭头指的是典型的线粒体；

图5D：表示SLC7A11敲低对肿瘤生长的影响以及在5周的时间过程中检测的肿瘤体积生长曲线；

图5E：表示肿瘤切片的H&E染色图，显示为肿瘤结构；

图5F：表示免疫组织化学分析显示shSLC7A11组具有更高的COX2表达；

图6A：表示蛋白质印迹显示了Huh7和HCCLM3细胞中METTL14和 SLC7A11的表达模式，其中，稳定表达宽型METTL14或R298P突变体的细胞用SLC7A11过表达(转染)；

图6B：表示伤口愈合显示METTL14对照、METTL14过表达和 METTL14-R298P以及SLC7A11分别对缺氧条件下Huh7和HCCLM3细胞的迁移率的影响；

图6C：表示CCK-8测定说明了METTL14对照、METTL14过表达和 METTL14-R298P，加上SLC7A11在缺氧条件下Huh7和HCCLM3细胞的增殖趋势；

以上各图中，“NS”：表示不具有显著性差异(not significant)；*：表示p<0.05；**：表示p<0.01；***：表示p<0.001；****：表示p<0.0001。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

以下实施例中，所用到的具体实验方法如下所示：

(1)细胞培养及处理

七株人肝癌细胞系(Huh7、HepG2、7721、HCCLM3、MHCC97H、PLC/PRF/5 和Bel-7402)和一株正常人肝细胞株L02来自中山医院张士哲博士和甘伟博士，复旦大学(中国上海)。所有细胞系均在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco，Grand Island，NY，USA)中培养。DMEM的额外混合物是10％胎牛血清(FBS)、抗生素(青霉素(100U/ml)/链霉素(0.1mg/ml))。培养细胞需要5％CO₂、37℃的湿润环境。培养基每周更新两次。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)购自Apexbio(美国休斯顿)。

(2)转染和稳定细胞株

Lipofectamine 2000试剂(Life Technology，Thermo Fisher Scientific，DE，USA)用于进行瞬时转染。pcDNA3.1-METTL14、pcDNA3.1-YTHDF2、 pLKO.1-SLC7A11和pcDNA3.1-SLC7A11-His(+)购自Genechem(中国上海)。空载体用作阴性对照。根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000试剂 (Invitrogen)进行转染测定。本实验共使用5×10⁵个细胞。转染48小时后，通过RT-qPCR分析或蛋白质印迹验证转染效率。

(3)实时荧光定量PCR

根据制造商的说明，通过RNA纯化试剂盒(EZbioscience，USA)提取总 RNA。然后，使用4×Reverse Transcription Master Mix(EZbioscience)进行RT-PCR，使用无DNAase和RNAase的尖端(YueYiBioTech，上海，中国)。 SYBR Green PCR试剂盒(Yeasen，中国)用于qPCR。根据2^-ΔΔCt方法，将每个基因的表达水平标准化为GAPDH的表达水平，作为内部对照。METTL14、YTHDF2、SLC7A11、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和GAPDH 的引物(Sunya，中国)如下：

METTL14(F:5′-CATCAGGCTAAAGGATGAGTT-3′(SEQ ID NO：1)；R:5′-CTAACTTCATAATATCATCC-3′(SEQ ID NO：2))；

YTHDF2(F:5′-AGCCCCACTTCCTACCAGATG-3′(SEQ ID NO：3)；R:5′-TGAGAACTGTTATTTCCCCATGC-3′(SEQ ID NO：4))；

SLC7A11(F:5′-GTCTGGAGAAACAGCCAAGG-3′(SEQ ID NO：5)；R: 5′-CGGAGTTCCTCGAATAGCTG-3′(SEQ ID NO：6))；

E-cadherin(F:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′(SEQ ID NO：7)；R:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′(SEQ ID NO：8))；

N-cadherin(F:5′-CTGACAATGACCCCACAGC-3′(SEQ ID NO：9)；R: 5′-TCCTGCTCACCACCACT ACTT-3′(SEQ ID NO：10))；

Vimentin(F:5′-TCTACGAGGAGGAGATGCGG-3′；(SEQ ID NO：11)R: 5′-GGTCAAGACGTGCCAG AGAC-3′(SEQ ID NO：12))；

GAPDH(F:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′(SEQ ID NO：13)；R: 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′(SEQ ID NO：14))。

(4)细胞增殖实验

根据制造商的方案，通过Cell Counting Kit-8测定(Yeason，Shanghai，China)检测细胞增殖。根据制造商的方案，在每个孔中种植10000个细胞24小时或 12小时。检查点结束时，用10μl CCK8溶液检测每孔的OD值。在450nm和 600nm处用分光光度法测量溶液。

(5)蛋白免疫印迹

RIPA收集细胞，每组取总蛋白20μg进行电泳。将膜与5％脱脂牛奶在 22℃下孵育2小时，然后与一抗孵育。主要抗体如下：Actin(13E5,CST), METTL14(D8K8W,CST),YTHDF2(ab220163,abcam),SLC7A11(ab175186, abcam),E-cadherin(24E10,CST),N-cadherin(D4R1H)CST)、波形蛋白(D21H3, CST)和肌动蛋白(13E5,CST)在4℃下过夜。随后，在22℃温度下使用抗兔二抗2小时。使用化学发光ECL试剂盒(Tanon，上海，中国)观察蛋白质条带。

(6)划痕实验

为了评估细胞的迁移能力，进行了伤口愈合试验。如果需要，将NAC和/ 或pcDNA3.1-SLC7A11-His(+)(2μg)添加到孔中。细胞在37℃和5％CO₂条件下培养。用20-200μl移液器吸头进行划痕，随后用PBS洗涤板并更换为新鲜培养基。使用相差显微镜(佳能，日本)在划伤后0和48小时拍摄伤口愈合图像。

(7)活性氧ROS检测

为了评估细胞的迁移能力，进行了伤口愈合试验。如果需要，将NAC和/ 或pcDNA3.1-SLC7A11-His(+)(2μg)添加到孔中。细胞在37℃和5％CO₂条件下培养。用20-200μl移液器吸头进行划痕，随后用PBS洗涤板并更换为新鲜培养基。使用相差显微镜(佳能，日本)在划伤后0和48小时拍摄伤口愈合图像。

(8)荧光报告基因实验

根据制造商的说明(11402ES60，Yeasen)收集RNA。Huh7或HCCLM3 细胞接种在6孔板中，并用宽型SLC7A11响应荧光素酶报告构建体 (SLC7A11-WT)、突变体SLC7A11响应荧光素酶报告构建体(SLC7A11-MUT)、宽型或METTL14质粒转染，siYTHDF2，相应地。在转染后24h，将细胞裂解物与10μg/ml的萤火虫和TK分别孵育10分钟。通过双荧光素酶报告基因检测系统(Promega，Madison，WI，USA)和微孔板光度计(Promega)测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性被相应的海肾荧光素酶活性校正。

(9)甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)

MeRIP遵循制造商的说明(Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit，Cat.No.20164)。简而言之，分离出200μg的总RNA用于polyA+RNA (Promega)并进行定量。PolyA+RNA被分成大约100nt长的片段。在进行 m6A-IP之前，使用生物分析仪确保RNA片段化。之后，首先进行第一链cDNA 合成。qPCR如所述进行。

(10)RNA稳定性实验

如前所述进行RNA衰变测定。简而言之，将Huh7和HCCLM3细胞以 60％的汇合度接种在6厘米的平板中。24小时后，将每个6厘米的平板重新播种到三个6厘米的平板中。48小时后，在收集前的8小时、4小时、2小时和0小时加入放线菌素D至3mg/ml。通过柱上DNase-I消化步骤纯化总 RNA。RNA量由RT-qPCR确定。

(11)MDA实验

为了测试脂质过氧化，我们使用脂质过氧化(MDA)检测试剂盒(货号 MAK085，Sigma-Aldrich，美国)。该程序遵循制造商的说明。

(12)电镜拍照

为了获得线粒体在细胞中的位置，对不同干预的HCC细胞进行电子显微镜摄影。为了成像，如下制备细胞。样品在4℃下用1％锇酸固定1小时。之后，使用ddH₂O清洗样品。然后，样品用醋酸铀染色过夜。使用不同浓度的酒精使样品脱水。样品经EMBED 812EMBEDDINGKIT包埋，最后聚合成像。

(13)动物模型

使用不同的慢病毒感染野生型HCCLM3细胞株，具体使用的慢病毒种类有：SLC7A11-Control(无义序列)、SLC7A11-Knockdown(shRNA的序列为： TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC)(SEQ ID NO：15)；METTL14-Vector(无义序列)、METTL14-Overexpression、METTL14-R298P共五种慢病毒。根据说明书，准备好5×10⁵个HCCLM3细胞，使用额定MOI(滴度单位)的对应病毒感染细胞，并于37℃，5％CO₂，90％以上湿度的条件下培养。18小时后，使用嘌呤霉素进行稳转株的筛选(载体均带有表达GFP及嘌呤抗性的片段)。3天后在荧光显微镜下使用约488nm处的单个激发峰，发射峰波长为509nm的荧光观察稳转株的建立。确认几乎所有细胞均带有绿色荧光后，再次予以细胞扩增。

成功建立稳转株后，进行皮下瘤种植。本研究主要分为两个动物实验，分别有二组和三组不同类别的皮下瘤移植瘤模型。(1)：METTL14-Vector、 METTL14-Overexpression、METTL14-R298P三种移植瘤观察METTL14的m6A 功能对肿瘤生长的作用；(2)SLC7A11-Control、SLC7A11-Knockdown两种移植瘤观察SLC7A11对肿瘤生长的作用。

具体种植过程为：消化每种细胞，以3.5×10⁷个细胞溶解于100μl的PBS 中，并注射于裸鼠背侧靠右后皮下；7天后观察成瘤情况并进行下一步实验；约 5周后处死裸鼠，最终根据定期(每3天)测量结果对移植瘤进行计算并绘制肿瘤生长图。

(14)H&E染色和免疫组织化学

异种移植样品在4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich，DK-2860，丹麦)中固定过夜，并在切割6μm切片之前嵌入石蜡中。抗原修复在100℃的柠檬酸盐缓冲液中进行25分钟。将0.1％Tween20和2.5％BSA(Sigma-Aldrich)混合到样品中。一抗如下：METTL14(ab220030,Abcam,U.K.)、SLC7A11(ab37185,Abcam, U.K.)和COX2(ab179800,Abcam,U.K.)。应用适当的辣根过氧化物酶偶联二抗进行开发(ab205718，Abcam，英国)。

实施例1

缺氧在体外以HIF-1α依赖性方式抑制METTL14诱导的铁死亡：

为了确定缺氧条件下METTL14和RNA m6A修饰的作用，首先检测了 METTL14在含1％O₂(缺氧条件，Hypoxia)的Huh7和HCCLM3细胞系中的表达。结果表明，与对照组(常氧，Normoxia)相比，缺氧有效地降低了 METTL14并增加了两种HCC细胞系中的HIF-1α表达，如图1A所示。然后，采用shRNA敲低HIF-1α，结果表明对HIF-1α的抑制强烈阻止了缺氧诱导的METTL14下调，如图1B所示，这表明缺氧引发的METTL14抑制是HIF-1α依赖性的。铁死亡是一种受调节的细胞死亡形式，已被证明具有肿瘤抑制功能，可用于癌症治疗。ROS和MDA是铁死亡的公认指标。为了探讨缺氧对铁死亡的影响，通过流式细胞术测定ROS(活性氧)。结果显示抑制HIF-1α增强了 Huh7和HCCLM3细胞系中ROS的积累(p<0.0001)，如图1C所示。此外，MDA(脂质过氧化)测定显示，与对照组相比，HIF-1α敲低组的MDA含量更高(p<0.01)，如图1D所示。此外，众所周知，铁死亡可以诱导典型的形态变化，其特征是线粒体浓缩和破坏。一致地，与对照组相比，在实验中观察到敲低 HIF-1α显著诱导更小、更密集的线粒体膜受损，如图1E所示。以上实验结果表明缺氧以HIF-1α依赖性方式下调METTL14，并通过敲低HIF-1α可诱导 HCC细胞中的铁死亡。

实施例2

METTL14在HCC中负调节SLC7A11的表达：

为了探索METTL14调节铁死亡的潜在机制，使用多个数据库分析了 METTL14和SLC7A11的表达模式，该系统是介导铁死亡的系统xc-的核心成员。首先，在癌症基因组图谱(TCGA)和Oncomine数据库中分析了METTL14 在HCC患者与健康患者中的表达模式。与正常肝脏相比，METTL14在HCC 患者中的表达水平分别下调1.052倍(p＝7.32×10^-9)、1.059倍(p＝4.86×10^-4)；另一方面，METTL14表达较低的HCC患者的总生存期短于METTL14表达较高的患者，如图2A所示。此外，在Oncomine数据库“Wurmbach Liver”、“Roessler Liver”和“Roessler Liver 2”中进一步分析了SLC7A11在HCC患者和健康受试者中的表达。与健康受试者相比，HCC患者的SLC7A11的表达上调至 3.343倍(p＝6.18×10^-6)、1.943倍(p＝1.58×10^-4)、1.494倍(p＝1.47×10^-18)，如图2B所示。

在7种HCC细胞系中进一步分析了METTL14表达。与正常肝细胞系 L02相比，除HepG2外，Huh7、7721、HCCLM3、MHCC97H、PLC/PRF/5和 Bel-7402细胞系中METTL14蛋白降低，如图2C所示。

另外，除了HepG2和MHCC97H外，大多数检测到的HCC细胞系中SLC7A11的mRNA和蛋白质水平均显著上调，如图2D所示，表明METTL4 可能与SLC7A11表达呈负相关。重要的是，缺氧条件下过表达的METTL14可以在mRNA和蛋白质水平上显著下调SLC7A11的表达，如图2E所示。以上结果表明，METTL14负调节SLC7A11表达。

实施例3

METTL14在HCC中SLC7A11 mRNA的5'UTR处触发m6A甲基化：

为了验证SLC7A11和METTL14之间的具体关系，首先检查了RNA Base v2.0(http://www.sysu.edu.cn)，发现SLC7A11 mRNA的5'UTR内有几个潜在的 m6A位点，如图3A所示，这表明SLC7A11可能以依赖于m6A的方式由 METTL14调节。已经证明R298P突变大大降低了METTL14甲基化活性。因此建立了稳定的METTL14-R298P表达Huh7和HCCLM3细胞系，如图3B 所示。为了确定SLC7A11的m6A修饰是否由METTL14介导，首先通过 m6A斑点印迹法检测了阴性对照组和稳定的METTL14过表达组以及 METTL14-R298P组中的总m6A水平。正如预期的那样，m6A水平随着 METTL14的过表达而显著增加，但在两个HCC细胞系中因R298P突变而降低，如图3C所示。

为了探索SLC7A11上m6A修饰的本质，使用野生型(WT)和突变型 (MUT)质粒进行荧光素酶报告基因检测，如图3D所示。对于突变报告基因，胞嘧啶碱基(C)被设计为在几个预测的m6A位点替换腺苷碱基(A)以阻断 m6A甲基化的影响，而野生型报告基因包含完整的m6A位点。正如预期所见， METTL14过表达适度降低了宽型组的荧光素酶活性，但对突变对应物几乎没有影响，如图3E所示，表明SLC7A11调节受METTL14引导的m6A修饰的控制。

此外，通过MeRIP-qPCR测定检测到SLC7A11中m6A的富集。与IgG 对照组相比，在m6A特异性抗体处理组中检测到SLC7A11转录物的显著富集。此外，METTL14-R298P突变表达后由m6A修饰的SLC7A11水平显著降低，如图3F所示。因此，METTL14可能会影响m6A的整体水平，特别是 SLC7A11。

为了证实METTL14在体内的作用，通过将具有宽型METTL14或 METTL14-R298P突变体稳定过表达的HCC细胞(HCCLM3)皮下注射到裸鼠中来构建肿瘤异种移植模型。结果发现宽型METTL14过表达抑制了肿瘤发生，与对照组相比，肿瘤体积显著降低。同时，METTL14-R298P突变体的强制表达在异种移植小鼠中失去了肿瘤抑制作用，如图3G，3H所示。一致地，与对照和METTL14-R298P突变组相比，METTL14过表达组表现出较低水平的 SLC7A11和较高水平的COX2，这是异种移植物中铁死亡的金指标，如图3I 所示。并且还显示了异种移植物中METTL14和SLC7A11之间呈负相关， METTL14和COX2之间呈正相关，如图3J所示。此外，肿瘤切片的H&E染色表示为肿瘤结构，如图3K所示。通过免疫组织化学进一步研究了异种移植肿瘤切片中METTL14、SLC7A11和COX2的表达。与其他两组相比，METTL14 过表达组表现出较低的SLC7A11表达和较高的COX2表达，如图3L所示。

因此，以上结果表明METTL14通过在HCC中以m6A依赖性方式靶向 SLC7A11来发挥肿瘤抑制功能。

实施例4

METTL14诱导的SLC7A11 mRNA衰减依赖于m6A-YTHDF2：

找出SLC7A11的阅读器至关重要，因为m6A修饰的mRNA转录物依赖于阅读器蛋白在功能上参与生物过程。在实施例2中的结果表明METTL14过表达显著下调了Huh7和HCCLM3细胞系中的SLC7A11 mRNA(图2E)。接下来测试了m6A修饰是否影响SLC7A11的mRNA稳定性。qPCR表明，在放线菌素D存在下，METTL14的过表达显著增强了SLC7A11 mRNA的降解，如图4A所示。

YTHDF2(YTH域家族2)是一种公认的m6A阅读器蛋白，已被证明可以调节mRNA的稳定性。通过敲低YTHDF2的表达在mRNA和蛋白质水平上显著增加了SLC7A11的表达，如图4B所示，这表明YTHDF2在SLC7A11 调节中的潜在作用。此外，如前所述，荧光素酶报告基因检测是用含有野生型 (WT)或突变体(MUT)SLC7A11的质粒进行的。正如预期的那样，YTHDF2的敲低显著增加了宽型组的荧光素酶活性，但对突变组几乎没有影响，如图4C所示。

因此，以上实验结果表明m6A-YTHDF2进行METTL14诱导的 SLC7A11 mRNA降解。

实施例5

SLC7A11的敲低刺激铁死亡并在HCC中表现出抗肿瘤作用：

为了验证SLC7A11抑制是否可以模拟METTL14的肿瘤抑制功能，首先构建了慢病毒敲低SLC7A11的HCCLM3细胞(shRNA的序列为： TTCTCCGAACGTGTCA CGTTTC(SEQ ID NO：15))，并检测了SLC7A11敲低对铁死亡诱导的影响，如图5A所示，shSLC7A11强烈刺激了ROS的产生，而ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)在Huh7和Huh7中显著阻断了 HCCLM3细胞中shSLC7A11诱导的ROS积累以及EMT逆转，如图5B所示。此外，NAC治疗有效地消除了电子显微镜检测到的shSLC7A11诱导的线粒体收缩。与shSLC7A11组相比，shSLC7A11+NAC组的线粒体表现出相对更完整的膜和更大的尺寸，如图5C所示。此外，在裸鼠体内观察到同样的趋势。与对照组相比，SLC7A11的下调显著抑制了肿瘤生长，如图5D所示。肿瘤切片的H&E染色表示为肿瘤结构，如图5E所示。此外，免疫组织化学分析显示shSLC7A11组具有更高的COX2表达，如图5F所示。因此，通过抑制HCC细胞中的SLC7A11验证了抗肿瘤作用。

实施例6

外源性表达的SLC7A11消除了METTL14在HCC缺氧条件下诱导的肿瘤抑制作用：

通过进一步的实验检查了SLC7A11的抑制是否有助于METTL14的抗肿瘤作用。如图6A所示，在缺氧环境下，宽型METTL14而不是METTL14-R298P 突变体强烈抑制SLC7A11表达，而SLC7A11的过表达有效地消除了 METTL14在两种HCC细胞系中诱导的SLC7A11下调。正如预期的那样，由此产生的SLC7A11过表达明显消除了METTL14诱导的细胞迁移抑制，如图6B所示。此外，SLC7A11过表达还显著阻止了METTL14在Huh7和HCCLM3细胞中诱导的生长抑制，如图6C所示。以上实验结果表明SLC7A11 有效地参与了METTL14调节的生长和迁移。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> SLC7A11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catcaggcta aaggatgagt t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaacttcat aatatcatcc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agccccactt cctaccagat g 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgagaactgt tatttcccca tgc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtctggagaa acagccaagg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggagttcct cgaatagctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgagagctac acgttcacgg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggtgtcgag ggaaaaatag g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgacaatga ccccacagc 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctgctcac caccactact t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctacgagga ggagatgcgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtcaagacg tgccagagac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggtgaagac gccagtgga 19

<210> 15

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttctccgaac gtgtcacgtt tc 22

Claims (4)

1.SLC7A11基因在肝细胞癌介入栓塞术后中的应用，其特征在于，包括将SLC7A11抑制剂用于制备肝细胞癌介入栓塞术后抑制HCC细胞的增殖和转移的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括医学上可接受的载体和有效量的活性成分，所述活性成分为SLC7A11抑制剂。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的SLC7A11抑制剂包括SLC7A11基因特异性的RNAi、SLC7A11基因特异性的microRNA、SLC7A11基因的shRNA或SLC7A11基因的siRNA。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的SLC7A11抑制剂为SLC7A11基因的shRNA，所述shRNA的序列为TTCTCCGAACGTGTCA CGTTTC。

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